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Qenlacede los químicos de MadridREVISTA DEL COLEGIO Y ASOCIACIÓN DE QUÍMICOS DE MADRID N.º 41 | JUNIO 2017

CRISPRCrónica de una revolución genética

Entrevista a Elena Ibáñez Ezequiel:“Soy una auténtica defensora de la química verde”

La ciencia despierta en los institutos: iniciativas para fomentar las vocaciones

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El 5 de octubre un investigador ali-cantino, que apenas un año antesera un perfecto desconocido, pasó

la mañana en un plató de televisión es-perando el anuncio que a las 11:45 iba arealizar el Comité Nobel para dar a cono-cer el Premio Nobel de Química 2017. Lapresencia de Francisco Juan Martínez Mo-jica no era casual, todo parecía indicarque la Academia de Ciencias sueca iba apremiar el descubrimiento más especta-cular de la biología de los últimos años:el peculiar sistema de inmunidad bacte-riano conocido como CRISPR, en cuyo des-cubrimiento Martínez Mojica desempeñóun papel trascendental, que además seha convertido en una herramienta de mily una aplicaciones en biomedicina, en mi-crobiología, en la industria alimentaria yen la ingeniería genética en general.

Pero la Academia sueca es reacia alas presiones y a seguir el guion de lasdecisiones cantadas. La práctica unani-midad de la comunidad científica, quese decantaba por CRISPR como el másfirme candidato, jugó en su contra pero

nadie duda de que, antes o después,CRISPR recibirá su merecido galardón.La duda es saber cuándo y, sobre todo,quiénes serán los afortunados, porqueel número máximo de premiados estres, y hay una docena larga de nombres

que jalonan la historia del estudio y eldesarrollo de esta herramienta bacte-riana, convertida en el mecanismo másbarato, rápido, sencillo y eficaz de entraren el genoma de cualquier célula y edi-tarlo: silenciar, activar o corregir genes

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Vivimos una época hiperbólica. Todo se magnifica y se adjetivasin rubor. Cualquier cachivache con un chip se tilda deinteligente y se abusa tanto del término ‘revolucionario’ que yanadie le presta atención. Pero a veces hay descubrimientos tanimportantes y capaces de transformar la sociedad que bienmerecen el calificativo. La tecnología CRISPR, un mecanismomolecular que está invadiendo los laboratorios de genética detodo el mundo, es uno de esos contados casos. Se trata de unaherramienta que permite activar, silenciar o corregir los genesde cualquier célula de manera tan sencilla y eficiente que estáal alcance de cualquier laboratorio. Ya se atisban decenas deaplicaciones en todos los campos abiertos por la genética, desdela mejora de cultivos hasta el desarrollo de nuevos medios dediagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades. Y elpionero de esta revolución es, contra pronóstico, un español.

Una herramienta molecular que permite editar el ADNde la forma más rápida, sencilla, eficaz y barata

CRISPRCrónica de una revoluciónIgnacio Fernández Bayo

el núcleo

Francisco Martínez Mojica en su laboratorio.

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cleo con precisión. La revista Science declaró

CRISPR como el gran descubrimientodel año 2015 y el Premio Princesa deAsturias de ese año fue a parar a manosde Emmanuelle Charpentier y JenniferDoudna por su trabajo en el desarrollode esta herramienta.

Fuera quedó Martínez Mojica por lasencilla razón de que nadie en el jurado(ni en el mundillo científico español)parecía saber que el origen de esta revo-lucionaria técnica y sus primeros pasos,un cuarto de siglo atrás, llevaban sumarca. Solo a finales de 2015 se empezóa correr la voz de que el pionero de estatécnica de la que todo el mundo hablabaera un sencillo investigador de la Uni-versidad de Alicante. En enero de 2016,un artículo de Eric S. Lander en la revistaCell, publicado con el título “The Heroesof CRISPR”, contaba con detalle la his-toria del descubrimiento y colocaba lascosas en su sitio: Mojica dominaba lastres primeras páginas de las nueve delartículo. Y el microbiólogo alicantinose convirtió de pronto en una figuramediática.

Durante 2016 no paró de dar confe-rencias por toda España y de atender aperiodistas. Y su nombre empezó a entraren las quinielas de los Nobel; en las delgalardón de Medicina y Fisiología y, conmayores probabilidades, en las del deQuímica. En junio recibía el Premio ReyJaime I de Investigación Básica, y en estamisma primavera de 2017 ha sido reco-nocido con el Fronteras del Conocimientode la Fundación BBVA, en la categoríade Biomedicina, junto a Charpentier yDoudna.

Toda esta parafernalia apenas haconseguido cambiar su actitud, amable,modesta y tranquila y, aunque se decla-ra feliz por el reconocimiento de su tra-bajo, asegura que no se ve en el triun-virato que pueda alzarse con el Nobelporque hay mucha otra gente que haconseguido avances “más importantes”.Una declaración esperable en quienesoptan al galardón, que en su boca, poruna vez, suena fruto de la sinceridad.Dice de sí mismo que no es ningúngenio, sino, más bien, un obrero de lainvestigación que simplemente hace sutrabajo lo mejor que puede. Un detallesignificativo: asegura que no repite nun-ca una misma conferencia sino que pre-para cada una de forma específica y sequeja del agobio que esto supone por laproliferación de invitaciones que recibedesde que saltó a la fama. Otro: carecede teléfono móvil porque está siempre

localizable en el fijo de su despacho, sulaboratorio o su hogar.

Otra muestra de que la fama no se leha subido a la cabeza es que rechazanumerosas peticiones que le llegan paraque se implique en investigaciones apli-cadas de CRISPR, en biotecnología concélulas eucariotas, como las humanas,donde se encuentran las principalesaplicaciones. “Si salen aplicaciones enbacterias, me apunto, porque lo contro-lo, pero cuando pasamos a seres com-plejos me siento fuera de lugar”, dice.Y subraya el poder de la investigaciónbásica, como la que él hace, para generaraplicaciones insospechadas, del que estecaso es buena muestra.

Su despacho, un cubículo de menosde 10 m2 en el campus de San Vicentedel Raspeig de la Universidad de Alican-te, no difiere mucho del de otros inves-tigadores y está inundado de papeles,libros y revistas. La única concesión per-sonal son unas viejas postales de colorsepia de la ciudad de Oxford, donde pasó

un par de años con una beca de inves-tigación. Entre el maremagnum de papelconserva un ejemplar de su tesis docto-ral, “es de las antiguas, en las que habíaque pegar las fotos y luego se te caían...”,dice mientras lo muestra. Y en ese libro,encuadernado al uso de la época, estáescrito el inicio de la historia del CRISPR.

Una salada sorpresa Sus directores de tesis, Francisco Rodrí-guez Valera y Guadalupe Juan Pérez,habían descubierto, a principios de losochenta en las salinas de Santa Pola,un microorganismo peculiar, la arqueaHaloferax mediterranei, que vive enambientes de alta salinidad, donde has-ta hacía pocos años se pensaba que nopodía haber vida. Una década después,seguían estudiando a este extremófilo(organismo capaz de vivir en un ambien-te extremo) para saber los mecanismosque le permiten evitar la pérdida deagua del interior de la célula que pro-voca, por osmolaridad, la alta concen-

Del ratón avatar a la edición in vivo

Según la Organización Mundial de la Salud, hay unas 7.000 enfermedades raras.Para ser catalogada como tal debe afectar a 5 personas por cada 10.000 habi-tantes, aunque en conjunto, el 7% de la población mundial padece alguna de

ellas. En la mayor parte de los casos, son enfermedades monogenéticas (originadaspor una alteración en un único gen), y con CRISPR podrá abordarse su prevencióny tratamiento en el futuro. En el caso del albinismo, la situación es más complicada,puesto que hay unos 20 genes implicados y 800 mutaciones diferentes, pero esono impide que pueda aplicarse CRISPR-Cas a su estudio. Es lo que hace Lluis Montoliudesde el Centro Nacional de Biotecnología y el Centro de Investigación en Red deEnfermedades Raras (Ciberer). Además de la conocida pérdida de coloración en lapiel y los cabellos, y los ojos rojos, el albinismo provoca una discapacidad visualsevera, visión nocturna reducida, limitado sentido de la profundidad y movimientoocular involuntario, aunque los síntomas varían de unos afectados a otros. Esta defi-ciencia visual se ha podido reproducir en los llamados “ratones avatar”, que portanla misma mutación genética que una persona con albinismo “y que nos va a permitirverificar qué es lo que pasa cuando se tiene esa mutación en ese gen determinado”,explica Montoliu.

Para generar el ratón avatar con la mutación específica del paciente, en este casocon albinismo, se debe contar con un sgARN o ARN guía, tal que reconozca especí-ficamente la zona donde se quiere intro-ducir la mutación específica. Para elloes necesario dar a la célula un moldeque sea exactamente igual a la zona decorte, a excepción de la mutación quese quiere introducir. “Es lo que se llamasistema de reparación dirigido porhomología”, explica Lluis Montoliu,“y es la base de la aplicación de los sis-temas CRISPR en biomedicina”.

Un ejemplo de enfermedad mono-genética es el de la deficiencia de piru-vato kinasa (PKD), presente en uno decada 20.000 habitantes, que origina una Lluis Montoliu.



tración de cloruro sódico en su exterior.“Me encargaron estudiar los mecanis-mos moleculares implicados en estaadaptación, los genes responsables y suexpresión génica —explica Mojica—.

Y para aprender las técnicas de estudiode la estructrura del ADN me fui unatemporada a la Universidad de París”.

El trabajo de secuenciación fue el pri-mero de este tipo que se hizo en Alicante

y era complicado. “Era una pesadilla, ycuando obtuvimos la primera secuencialimpia aquello fue una fiesta. Ahorasecuencias millones de pares de basespor lo que cuesta un bocadillo, peroentonces tenía un mérito bestial”.Y aquellos fragmentos de ADN pusieronde manifiesto la presencia de secuenciasque se repetían decenas, cientos deveces, de manera regular y que teníanla peculiaridad de ser palindrómicas; esdecir, que las bases (las cuatro letrascon las que se escribe el ADN) se leíanigual en ambas direcciones. Aquellapeculiaridad estaba incluida en su tesis,leída en 1993, y en ella concentró suatención posterior. Además, al hibridaresa región del genoma para detectar sise transcribían, se formaba un patrónde bandas extraño, como manchas.“Pensábamos que era porque el ARNtranscrito estaba degradado, pero enrealidad lo que indicaba es que teníamucha actividad”.

Tras presentar su tesis, Mojica decidiódedicarse a estudiar estas repeticiones.“Yo estaba muy intrigado. Que un micro-organismo se molestara en mantenerese patrón regular y repetirlo muchasveces tenía que tener una explicación,cumplir una función. Y me lancé amuerte para descubrirla”. Una de lasprimeras tareas fue buscar si había ante-cedentes de estas repeticiones, y enton-ces encontró un artículo de unos japo-neses publicado en 1987 sobre elgenoma de Escherichia coli, donde seña-laban que habían encontrado repeticio-nes del mismo tipo. Y lo mismo ocurrióen 1991 con un grupo alemán que lashabía visto en Mycobacterium. Ambosgrupos pasaron de puntillas sobre lapeculiaridad descubierta, al contrarioque el investigador español, convencidode que había un tesoro detrás de ella.

En busca de una funciónIntentó comprobar si regulaban la expre-sión de los genes. “Para conocer la funcióntienes que manipular y ver qué ocurre.Cogimos un trozo de ADN con agrupa-ciones de repeticiones y lo metimos enun plásmido recombinante y lo introdu-jimos en una bacteria. Y lo que vimos esque se morían, mientras que a las otrasbacterias control con el plásmido, perosin integrar la secuencia, no les pasabanada”. Dedujeron que había cierta incom-patibilidad entre los plásmidos con lasrepeticiones y el cromosoma de la bac-teria, que también tenía esas secuenciasy lo publicaron en Molecular Microbiology

anemia hemolítica, o lo que es lo mismo, provocada por una destrucción excesivade glóbulos rojos. “Se produce menos energía de la que necesita el glóbulo rojopara realizar sus funciones y mantener su estructura, y entonces el organismo losreconoce como deficitarios y los destruye”, explica José Carlos Segovia, jefe de laUnidad de Diferenciación y Citometría del Ciemat, y también del Ciberer.

En su laboratorio llevan veinte años trabajando en terapia génica, para corregiruna mutación preexistente. “Los sistemas de edición génica en general, y el CRIPSRen particular, nos aportan la posibilidad de controlar dónde queremos hacer lacorrección genética”, matiza Segovia. Y hay varias posibilidades. Una sería extraer lascélulas patológicas con la mutación, corregirla en el laboratorio y volver a introducirlas células en el paciente. Esto sería posible sobre todo en enfermedades hematológicas

por la facilidad de extracción de la mues-tra. “Ahora mismo lo que podemos decires que las herramientas funcionan, ycorrigen la mutación en el sitio adecua-do”, explica Segovia. Pero para trasladarloa la clínica se necesita optimizar el pro-ceso para llegar a estar en cifras adecua-das de células corregidas y, a largo plazo,Segovia piensa que es factible.

También se está desarrollando unaaproximación que permitiría la correc-ción de las mutaciones en el interior delpropio paciente, usando las llamadaspartículas adenoasociadas, partículas

virales en las que se ha modificado su genoma para eliminar su capacidad deinfectar y se les introduce el sistema CRISPR-Cas. Su capacidad para reconocercélulas específicas del organismo (hepáticas, musculares, de la retina, etc.)garantiza que librarán su contenido en el sitio adecuado. Esta estrategia permitiríala edición génica dentro del propio organismo. Además, según Montoliu, “no seintegran en el genoma, lo único que hacen es liberar su contenido dentro de lascélulas y van a corregir directamente lo que está mal”. Pese a todo, “el salto dela preclínica a la clínica tiene que ir asociado a un análisis de riesgos y beneficios”,matiza Montoliu. Alicia A. Cortés Q

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Francisco Martínez Mojica recibe el premio Rey Jaime I de Investigación Básica.

José Carlos Segovia.


en 1995, describiendo el fenómeno de losgrupos de repeticiones, pero sin ofreceruna explicación funcional, aunque “nosdijeron que sin ese detalle no podíanpublicarlo, así que incluimos la hipótesisde que podía estar relacionado con lasegregación de cromosomas durante lareproducción bacteriana”.

Tras un par de años en Oxford inves-tigando en otro tema, Mojica regresó aAlicante dispuesto a seguir la pista delas repeticiones. Para entonces, finalesde los noventa, ya se conocía una vein-tena de genomas bacterianos y Mojicapudo comprobar que en torno al 50%de ellos tenía estas secuencias (“casitodas las arqueas y muchas bacterias”),pero la búsqueda de su función conti-nuaba siendo infructuosa. En 2000publicó, nuevamente en Molecular Micro-biology, una descripción más detalladadel fenómeno, definió las característicasde la familia de secuencias y les pusoun nombre: SRSR (de Short Regularly Spa-ced Repeats), destinado a tener una efí-mera vida. Un grupo holandés prepa-raba otro estudio sobre el tema y queríaponer otro nombre. “Pensé que inten-taban ignorar mi artículo, pero final-mente, tras largo debate, decidimospactar un nuevo nombre. Esa nocheestuve dándole vueltas al asunto y mesalió CRISPR, que era la definición exac-ta de las características: Clustered Regu-larly Interspaced Short Palindromic Repeats(agrupación de repeticiones cortas palin-drómicas regularmente espaciadas)”. Elholandés le contestó por e-mail que le

parecía fantástico y así quedó definiti-vamente bautizado. “Años después medijo que creía que el nombre lo habíapuesto él, pero yo había guardado sumensaje de correo y le demostré queno era así”.

En su publicación, en 2002, los holan-deses identificaron cuatro genes aso-ciados a las secuencias CRISPR (los lla-mados cas1, cas2, cas3 y cas4) yhomólogos en diferentes especies. Nosabían para qué servían, pero eran unindicio más de funcionalidad; esa fun-cionalidad que Mojica llevaba casi unadécada persiguiendo y que seguía siendoesquiva a pesar de los variados experi-mentos que había llevado a cabo paradetectarla.

EurekaLos anglosajones tienen un término paraexpresar los hallazgos inesperados:serendipity, que se traduce como casua-lidad o carambola, pero expresa algomás que fortuna, porque incluye unacierta perspicacia para vislumbrar elsignificado o intuir la importancia delfenómeno imprevisto detectado. Eso eslo que diferenció a Mojica de los gruposjaponés y alemán que habían encon-trado previamente las repeticiones. Élsupo ver que aquello tenía que ser unfenómeno muy especial. Y su constanciaen pos de la explicación tuvo finalmentesu recompensa. La clave no estaba enlas secuencias CRISPR ni en los genescas asociados, sino en el interespaciado,en la secuencia de ADN encajada entre

dos repeticiones. Es lo que se conocecomo espaciador.

Estas secuencias se estaban usandopara diferenciar distintas cepas dentrode especies bacterianas, porque cadacepa tenía las mismas pero había dife-rencias entre unas cepas y otras. Mojicay su grupo estudiaban estas secuenciaspara comprobar su diversidad, hastaque saltó la chispa. “Vimos que unacepa de E. coli tenía un espaciador queera idéntico a una parte del ADN deun fago (un virus que ataca a una bac-teria) denominado P1, que habitual-mente la infecta. Y también sabíamosque esa cepa en particular era resistentea ese virus”, explica. La idea de queaquello podía ser una especie de siste-ma inmune bacteriano adquirido (porcontacto con el virus), algo insospe-chado y nunca descrito en la litera-tura científica, surgió de inmediato.Y empezó una búsqueda de secuen-cias de espaciadores en bacterias yvirus, aprovechando que por enton-ces, a principios de siglo, la fiebre dela secuenciación genómica estabadisparada y se añadía nueva infor-mación continuamente.

Pese a todo, no era un trabajo sencillo.“Recuperé todo lo que había secuencia-do de genomas de bacterias, localicé


CRISPR contra el cáncer

El equipo que dirige Sandra Rodrí-guez-Perales en el Centro Nacionalde Investigaciones Oncológicas ha

conseguido reproducir la translocaciónentre los cromosomas 11 y 22, lo quesupone un movimiento de grandes can-tidades de ADN. El resul-tado de la translocaciónes la fusión de dos genesque de otra manera esta-rían muy alejados en elgenoma, generando unnuevo oncogén, en estecaso, el desencadenantedel sarcoma de Ewing.“Estamos aprovechandola capacidad multiplexing,de editar varias regionesdel genoma al mismotiempo, del sistema

CRISPR para inducir dos roturas en doscromosomas diferentes y así poder recreartranslocaciones cromosómicas asociadasa distintos tipos de cáncer”, explica. Paraaumentar la eficacia, han combinado elcomplejo RNA-Cas9 con una secuenciacorta de ADN que grapa los dos cromo-

somas que rompió elsistema CRISPR.

“Esta estrategia faci-litará la creación demodelos de cáncer concélulas madre humanasy la edición genómicade precisión para la bús-queda de nuevos fár-macos o terapias celu-lares” concluye. “La granventaja de CRISPR esque evita mucho tiem-po y mucho dinero al

generar un modelo transgénico modifi-cado genéticamente en un laboratorio.El abanico de posibilidades que te abrees infinito”, comparte Ignacio García-Tuñón, investigador del Centro de Inves-tigación del Cáncer de Salamanca (CIC).

La aplicación más esperada de CRISPRes la de revertir las mutaciones genéticasque genera el cáncer para poder usarlocomo terapia génica en clínica. El grupode García-Tuñón ha logrado inactivarmediante CRISPR/Cas9 la proteínaBCR/ABL, responsable de la leucemia mie-loide crónica (LMC), que se caracteriza por

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Sandra Rodríguez.

Ignacio García-Tuñón.


agrupaciones de repeticiones, extrajelos espaciadores con Word (el procesa-dor de textos) y empecé uno por uno aprobar si se parecían a alguna secuenciadepositada en las bases de datos públi-cas. Así fuí encontrando que un espa-ciador era idéntico a un virus, y luegootro, y miraba 40 genomas y aparecíanunos cuantos más..., siempre secuenciasde plásmidos o virus que infectaban ala especie”, dice. Y también observaronque las cepas con esos espaciadoreseran resistentes y las que se infectabanno los tenían.

Para demostrar la hipótesis experi-mentó quitándole a las bacterias E. colicon las que trabajaba esa información,esperando que perdieran su resistenciaal virus, pero observó desolado queseguía siendo resistente. También inten-tó convertir otras cepas en resistentestransfiriéndoles el sistema y tampocofuncionó. Pese a todo, estaba tan con-vencido de la idea que escribió un artículodiciendo que se trataba de un sistemainmune y lo envió a varias revistas, entreellas Nature y PNAS, pensando que lasevidencias bastarían para darle credibi-lidad, pero todas las revistas se lo devol-vieron pidiendo pruebas experimentales,esas que intentaba sin éxito obtener conE. coli en el laboratorio. Finalmente, elartículo apareció en 2005 y, como suponíaMojica, el tiempo le dio la razón, de lamano de otros investigadores. Intuyén-dolo, le dijo a su mujer la noche de agostode aquel 2003 en que se encendió la luzen su mente: “He descubierto algo tan

importante que supondrá un Nobel...,para quien lo demuestre”.

Primera aplicaciónLa demostración no tardó en llegar, y dela mano de su primera aplicación prác-tica. A pesar de las reticencias de lasrevistas por publicar una hipótesis quecarecía de apoyo experimental, la idease difundió y acabó llegando a la industriaalimentaria. La empresa francesa RhodiaFood, adquirida más tarde por la danesa

Danisco, encargó al microbiólogo fran-cés Philippe Horvath el desarrollo de unsistema eficaz de identificación de cepasde Streptococus thermophilus, un micro-organismo empleado en la elaboraciónde productos lácteos, como yogur y que-so, que con frecuencia se infectaba porun fago y echaba a perder la materiaprima. Algunas cepas eran resistentesa la infección y se trataba de identifi-carlas para usarlas en los procesosindustriales.

Horvath estaba en esa onda. Su tesishabía versado sobre la identificación decepas bacterianas por el estudio de susdiferencias genéticas. A finales de 2004encontró las secuencias clave que dife-renciaban a las cepas resistentes de lasque no lo eran. La idea que Mojica llevabadefendiendo ya un par de años, y quevería finalmente la luz en forma de paperapenas unos meses después, empezabaa aflorar también en su cabeza. Y parademostrarla puso en marcha una inves-tigación más profunda con sus colegasRodolphe Barrangou, que trabajaba paraDanisco en EE. UU., y el canadiense Syl-vain Moineau, un reconocido especialistaen fagos que llevaba una década estu-diando los que infectan a S. termophilus,e incluso secuenciando el genoma dealguno de ellos.

“Comprobamos que cuando S. ter-mophilus sensibles quedaban expuestasa fagos (cuyo genoma habíamos secuen-ciado anteriormente) la mayor parte de


un crecimiento incontrolable de las célulassanguíneas mieloides. El responsable esuna translocación entre los cromosomas9 y 22 que da lugar al llamado cromosomaFiladelfia, que genera una proteína defusión llamada BCR/ABL. Lo primero quehicieron fue introducir el oncogén en lalínea celular llamada Boff-p210 para luegoatacarlo con el sistema CRISPR. “No corre-gimos la traslocación pero introducimosmutaciones de manera que el gen ya nocodifica la proteína maligna y no se pro-ducen los efectos indeseados” dice García-Tuñón. Y añade que “se podría extraer lamédula del paciente, editarla in vitro conel sistema CRISPR, seleccionarla y volvera introducírsela. Estaríamos hablando deun autotrasplante con sus propias célulascorregidas”.

En estos momentos, en China, haysiete ensayos clínicos puestos en marcha

en esta línea, dos de ellos en fase dereclutamiento de pacientes, donde seestá utilizando células inmunes modi-ficadas mediante CRISPR. En todos ellosse está inactivando el gen PD-1, uno delos genes que controlan la actividad decélulas inmunes como los natural killerso linfocitos T, disminuyéndola, para evi-tar daños en tejidos sanos. Las célulastumorales usan este mecanismo paraescapar de la actividad del sistemainmune. Al inactivar este gen y evitarque la proteína se exprese, las célulasinmunes reaccionan con mayor eficacia.“Esta estrategia ya está aprobada enEE.UU., pero todavía no han reclutadopacientes porque todavía están en lasúltimas fases de aprobación”, nos expli-ca José Carlos Segovia, jefe de la Uni-dad de Diferenciación y Citometría delCiemat. Alicia A. Cortés Q

Genes cas: codifican las proteínas Cas, encargadas de cortar el ADN.

Leader: secuencia situada junto a la última repetición que participa en la incorporación de nuevos espaciadores.

Repeticiones: secuencias de ADN que se repiten muchas veces y que son palindrómicas.

Espaciadores: secuencias de ADN entre dos repeticiones y que son copias de trozos de ADN de virus.

CRISPR como sistema inmune bacteriano

Célula procariotaCas1

Cas2

Elementos del sistema CRISPR-Cas

A B C D C D C D C D C

Si el sistema CRISPR está activo,se transcribe la informaciónde las repeticiones y los espaciadores,generándose moléculas de ARNdenominadas crRNA, que circulanpor la célula como vigilantes.

Cuando un virus de alguno de los tipossemejantes a los crRNA introduce su ADN

en la célula bacteriana, la molécula reconoceal intruso y provoca la intervención de las

proteínas Cas que cortan el material genéticodel virus y lo eliminan.

A

B

C

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Adquisición de inmunidad. Cuando un virus entra en la célula, las proteínas Cas1 y Cas2 cortan un trozo del ADN intruso del virus y se genera una nueva secuencia CRISPR. La última repetición se duplica y se abre un espacio entre medias donde se inserta el nuevo espaciador.

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las bacterias morían, pero unas pocasse volvian resistentes. Tras aislarlas yanalizarlas, descubrimos que nuevassecuencias habían aparecido en su sis-tema CRISPR, y que procedían del geno-ma del virus”, explica por e-mail Moi-neau. El trabajo, publicado en 2007 enScience, demostraba que CRISPR era unsistema inmune bacteriano adquirido.Y para la industria láctea, el hallazgofue la solución a un grave problema.

“Ellos consiguieron lo que yo llevabaintentando, dándome cabezazos contrala pared, durante muchos años. La razónde que no lo consiguiera, como supe des-pués, es que las bacterias E. coli con lasque yo trabajaba tenían el sistema repri-mido. Si se me hubiese ocurrido trabajarcon otras bacterias... Ellos tuvieron lasuerte de que en S. termophilus el sistemaestá siempre activo”, dice Mojica.

Revolución microbiológicaLa fiebre CRISPR se empezó a extenderpor todo el mundo. Un grupo encabe-zado por el holandés John van der Oosty el estadounidense Eugene Koonin,traspasó un sistema CRISPR completode una cepa de E. coli a otra y desvelóbuena parte del proceso, la participaciónde diferentes genes cas y la transcripcióndel sistema a un tipo de ARN especial,denominado crRNA, formado por lasecuencia final de la repetición de unlado, el espaciador y la secuencia inicialde la repetición del otro lado.

El siguiente paso, dado también en2008, lo protagonizó de nuevo SilvainMoineau: “nuestro grupo mostró, por

primera vez, el necesario papel de losllamados motivos PAM, que flanqueanla región genómica diana del sistemaCRISPR-Cas. Dado que el genoma bac-teriano ha adquirido la secuencia delvirus y tiene un mecanismo para reco-nocer y destruir esa secuencia, debíahaber un mecanismo que evitara suautodestrucción y estaba formado poresas pequeñas secuencias que diferen-cian el espaciador del genoma vírico”.Según Mojica, “estos motivos los bauticéyo como Protospacers Adjacent Motifs(PAM) y están constituidos por muypocas bases, incluso solo dos”. Se tratade un elemento esencial, ya que, segúnMoineau, determinan si las proteínasCas actúan o se inhiben. Y también indi-can dónde se va a producir el corte, atres nucleótidos de la secuencia PAM.

La principal incógnita que quedabapendiente era determinar cuál era la dia-na del sistema; es decir, cómo se producíala destrucción del intruso. Para LucianoMarraffini y Erik Sontheimer, de la North-

western University, estaba claro que lasproteínas Cas actuaban cortando el ADN.En 2008 demostraron que el sistema fun-cionaba no solo con virus, sino tambiéncon plásmidos que invadieran la célula,lo que sugería que estaban en lo ciertoy lo publicaron ese mismo año. Inclusodijeron ya que podrían utilizarse paracortar ADN en células eucariotas, el pasoque llevaría a CRISPR/Cas9 a la revolu-ción en la que se encuentra inmerso.

Una vez más, Silvain Moineau diootro paso adelante, al demostrar lo queMarraffini y Sontheimer habían pro-puesto. Su grupo, al que se había incor-porado el español Alfonso Magadán,publicó su trabajo en Science en 2010.“Demostramos de forma convincenteque el sistema CRISPR-Cas cortaba ladoble cadena de ADN y que la proteínaque hacía el corte era la Cas5 (llamadadespués Cas9). Quedaba claro que habíaun mecanismo que podía dirigirse acualquier secuencia de ADN e inducirel corte de la doble hélice, lo que era


Modelos animales y control de plagas

Hasta la fecha, el ratón es el biomodelo para humanosmás utilizado, por su sencillo manejo y la facilidad conque se pueden generar individuos con un gen inactivado.

Según explica Pablo Bermejo, investigador del Instituto Nacionalde Investigaciones Agronómicas, se hace mediante una técnicallamada recombinación homóloga sobre células madre totipo-tentes, que son las capaces de generar todos los tipos celulares

del organismo. Las células modi-ficadas genéticamente se inser-tan en un embrión y se obtieneuna quimera, cuyas células pro-vienen en parte del embrión yen parte de las células insertadas.Para conseguir un individuo enel que todas sus células portenla variación genética hay que cru-zar el ratón quimera con uno nor-mal. Esta técnica solo es posibleen ratón y rata.

Para animales de granja, la única posibilidad es combinarla recombinación homóloga con la clonación, la misma técnicaque se utilizó para crear a la oveja Dolly. Se genera la mutacióndeseada en fibroblastos, un tipo de células adultas y se tras-planta su núcleo modificado a un óvulo, que dará lugar a unindividuo con todas sus células modificadas. “El problema esque la clonación es ineficiente y los fibroblastos no son comolas células madre, que se modifican bien y son inmortales”,puntualiza Bermejo.

CRISPR posibilita la generación de modelos animales gené-ticamente modificados en especies muy diferentes, cuandoantes estaba limitado a ratas y ratones. “Lo que ha pasado conCRISPR es que ya no necesitas células madre o fibroblastos, lohaces de golpe, directamente sobre el embrión, inyectando loscomponentes de CRISPR para generar el knock-out”, dice Bermejo.Y es que el ratón no es siempre el mejor modelo, por la diferenciade tamaño con los humanos. En ciertos casos, el modelo deelección es el cerdo, por ejemplo, que proporciona datos másextrapolables a humanos. Además, no siempre todas las proteínashumanas están presentes en el ratón, como ocurre con la mem-

CRISPR/Cas9 como editor genómico

Cas9 gARN

dsADN

Nuevo ADN

ADN donadorInserción/deleción

A1

A2

A1B1

B2 C

Unión de extremos no homólogos.

A2 Disrupción del gen: como consecuencia no se expresa.

B1 Unión dirigida por homología.

B2 Edición de una base o pequeñas inserciones. Así se corrigen mutaciones o se generan modelos de estudio como ratones avatar).

C Multiplexing: dos sistemas CRISPR-Cas9 que reconocen dos zonas del ADN diferentes.

Para hacer ediciones del ADN más complejas, incluso hasta translocaciones.

Pablo Bermejo.

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como el santo grial de la ingeniería gené-tica”, dice Moineau.

También en 2010 entró en escenaEmmanuelle Charpentier. Esta micro-bióloga y bioquímica francesa, que porentonces estaba en la Universidad deUmea (Suecia), y Jörg Vogel, microbió-logo alemán del Instituto Max Planck,descubrieron un tipo de ARN, el ahoraconocido como tracrRNA, que era muyactivo y que se transcribía desde unaregión del genoma muy cercana al sis-tema CRISPR. Y, además, que tenía 25bases complementarias a las de las repe-ticiones, lo que les permitió afirmar queeran una parte esencial del sistema.

La revolución finalEn 2011, en Vilna (Lituania), el bioquí-mico Virginijus Siksnys llevó a cabo unexperimento de especial interés: trans-firió el sistema CRISPR-Cas de Strepto-coccus a E. coli y comprobó que le conferíainmunidad frente al fago lambda. “Fueun paso importante porque demostró

que podías transferir el sistema com-pleto CRISPR-Cas de forma funcionalentre organismos muy distantes evo-lutivamente, de un grampositivo comoS. thermophilus a E. coli, que están máslejos entre sí que un humano y la célulaeucariota más lejana”, dice Mojica. Ade-más, Siksnys demostró que podía cam-biar la secuencia del espaciador in vitroe incluso reprogramar Cas9 para quecortara por un lugar determinado reco-locando la secuencia PAM.

En marzo de 2011, Charpentier cono-ció, en un congreso en Puerto Rico, a Jen-nifer Doudna, una experta en biologíaestructural y ARN de la Universidad deBerkeley, que había estado utilizandocristalografía y microscopía crioelectró-nica para determinar la estructura delos componentes de un sistema CRISPR.Tras decidir trabajar juntas, y en paralelocon Siksnys, acumularon nueva infor-mación: que Cas9 cortaba ADN purificadoin vitro, que podía ser programado conARN diseñado en laboratorio, que tanto

crRNA como tracrRNA eran necesariospara que Cas9 hiciera su labor, y queambos tipos de ARN podían fusionarsecomo una guía simple en una nuevamolécula denominada sgRNA, la formaen que se aplicaría el sistema para laedición de genomas. “Los dos grupospublicaron sus artículos por separado(en junio y septiembre de 2010), en losque identificaban lo que hacía falta paraconseguir un corte programado de ADN.Para ello, se sintetiza la secuencia, de20 bases, se une a un fragmento de repe-tición y se combina con Cas9. Una partees la guía y la otra la tijera. El motivoPAM que se necesita en la secuencia dia-na puede cambiar según el Cas9 que uti-lices, los hay que reconocen CAT, CTT,GAA..., en el caso de Streptococus pyogenes(con el que trabajaban Charpentier yDoudna) es GG”, dice Mojica.

Aquello supuso el inicio de la apli-cación del sistema a la programaciónde todo tipo de aplicaciones, que sehan ido multiplicando en los cinco añostranscurridos desde entonces, a partirde tres formas de actuación. SegúnMojica, “lo que hace el sistema Cas9 esproducir el corte, lo que prepara elterreno para que alguno de los sistemasde reparación de la propia célula loarregle. Hay dos sistemas: el Unión deextremos no homólogos, que simplementevuelve a pegarlo, pero normalmenteeliminando o metiendo algunas basesnuevas, con lo que el gen deja de serfuncional, se silencia. Esto, además depermitir dejar fuera un gen que puedeestar produciendo una alteración, per-


brana que rodea al óvulo: está compuesta de tres proteínas enratón y de cuatro en humanos.

CRISPR, también ha supuesto un gran avance en la investi-gación agronómica porque permite realizar mejoras genéticasen animales de consumo. Con este sistema, se pueden replicaralelos interesantes de una raza de vacas en otra que no los tiene.Por ejemplo, ciertas variantes del gen de la miostatina, una pro-teína relacionada con el desarrollo muscular, dan lugar a unmayor desarrollo muscular, característica deseable en animalesdestinados a la producción de carne. “El problema de esto es lalegislación. Actualmente no se permite el consumo de animalesgenéticamente modificados”, apunta Bermejo. Pero la gran ven-taja de CRISPR es que se puede reproducir exactamente el mismoalelo que ya existe de forma natural o generar otro diferente sindejar rastro en el genoma, de manera que sería imposible dis-tinguir si se ha producido espontáneamente o no. “Actualmenteestá prohibido en la Unión Europea, pero en EE. UU. ya hanaprobado el consumo de salmón transgénico”.

Donde hay menos trabas legislativas es en productos bio-tecnológicos. Los animales modificados genéticamente pueden

utilizarse como biofactorías, porque se consigue aumentar lageneración de sustancias de interés, como un factor de coagu-lación, respecto a su producción in vitro con células modificadas.Se han generado cabras modificadas genéticamente para pro-ducir proteínas de interés en la leche que se utilizan para tratarcoagulopatías y angioedema. Otra alternativa sería la utilizaciónde bacterias modificadas para generar la proteína con la secuenciade aminoácidos adecuada, pero que no son capaces de colocarlos residuos de azúcar, muy importante para la función de laproteína, como lo haría una célula humana. Todo esto ya sehacía antes, pero con CRISPR se ha facilitado y abaratado.

Otra de las aplicaciones de CRISPR es el control de vectores detransmisión de enfermedades, como el mosquito del géneroAnopheles en el caso de la malaria. Se puede modificar para generarinfertilidad y controlar así la población, o introducir genes deresistencia a Plasmodium, el responsable de la enfermedad, paraque el mosquito deje de transmitirla a humanos.Ya se está traba-jando en estas dos opciones y parece que son viables técnicamentehablando, como se puede comprobar en recientes artículos publi-cados en PNAS y Nature Biotechnology. Alicia A. CortésQ

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Emmanuelle Charpentier (izquierda) y Jennifer Doudna convirtieron CRISPR/Cas9 en un editor genómico.

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mite estudiar la funcionalidad de losgenes de una forma mucho más rápidaque hasta ahora. En el caso de procesoscomplejos, multigénicos, esto era casiinabordable”.

El otro sistema de reparación celulares el Sistema de reparación directa porhomología. “En este caso se produce elcorte de la doble cadena de ADN, perose introduce también un molde pararepararlo, una secuencia que compartealgunas bases con la región donde seproduce el corte. Eso permite meter enmedio lo que se quiera. El sistema de

reparación hace una recombinación.Eso es editar, y permite cambiar la infor-mación de un gen para que funcionecorrectamente. Este molde se sintetizaen el laboratorio y solo necesita que losextremos sean iguales a los de ambaspartes del corte”, explica Mojica. Porúltimo, añade, “se puede anular la capa-cidad de corte de Cas9 y, aunque no secorta el ADN, se puede estimular la acti-vidad de un gen, encenderlo, llevandouna proteína de actividad catalítica, omodificadores epigenéticos que modu-lan la expresión del gen”.

El futuro de esta tecnología estáescribiéndose día a día, porque milesde laboratorios de todo el mundo estántrabajando, tanto para conocer conmayor detalle aún su funcionamiento,como aplicándolo a nuevos procesosde interés científico, sanitario, agrarioo industrial. Al fin y al cabo esta revo-lución no ha hecho más que empezar.Y en el horizonte se vislumbra el señue-lo del Nobel para algunos de los prota-gonistas de esta historia. Demasiadospretendientes para un pequeño resqui-cio de gloria. Q

Mejora genética de plantas

La mejora genética de plantas de interés agronómico haexistido desde que comenzó la agricultura para conse-guir, por ejemplo, plantas resistentes a enfermedades

o frutos de maduración homogénea. Otra de las característicassometida a mejora genética es el grado de ramificación. “Ladomesticación del maíz supuso seleccionar plantas con menosramas. Ahora sabemos que lo hicieron, sin saberlo, seleccio-nando versiones hiperactivas de un gen que suprime la rami-ficación”, explica Pilar Cubas,investigadora del CentroNacional de Biotecnología(CNB). En el caso del tomate,una menor ramificaciónhace que la planta pongatoda su energía en generarfrutos más grandes. Por elcontrario, en el caso de lapatata interesa mayor rami-ficación, lo que significa máspatatas, porque los tubércu-los nacen de los estolones oramas subterráneas.

La mejora genética, hastahace poco, se realizaba seleccionando los individuos conlos rasgos de interés surgidos por mutación espontánea alazar. También se puede inducir la mutagénesis con rayos Xo productos químicos como el etilmetanosulfonato. Peroconseguir que un gen determinado quede mutado en todosy cada uno de los cromosomas (que en muchas plantas sunúmero es de 4, como en la patata, o 6, como en el trigo, enlugar de 2 juegos como en los animales) mediante mutagé-nesis al azar es muy difícil. Después hay que buscar entremiles de plantas para dar con la que tiene la característicadeseada, si es que existe, explica Cubas. Como este procesoes muy laborioso y costoso, y las empresas de semillas seconcentran en unas pocas variedades ya mejoradas, se empo-brece la diversidad de la agricultura en detrimento de lasvariedades locales.

“Si la tecnología se hace más sencilla y accesible y desapa-recen las barreras de regulación actuales, los laboratorios deinvestigación y las pequeñas empresas de mejora podránayudar a las variedades tradicionales”, explica Diego Orzaez,investigador del Instituto de Biología Molecular y Celular dePlantas. El sistema CRISPR es la mejor baza para conseguir

este objetivo porque, al dirigirse a una secuencia específica,facilita la mutación de todas las copias del gen.

Lo interesante de trabajar con plantas es que, aunque sehaya introducido el sistema CRISPR/Cas9 en el genoma de laplanta para conseguir la mejora deseada, se puede obtenercon dicha mejora pero sin el transgén. Esto se consigue segre-gando sexualmente la construcción CRISPR/Cas9; es decir,seleccionando en la siguiente generación aquellas plantashijas que han heredado la mejora pero no el transgén. “Estric-tamente hablando, no hay manera de distinguirla de una ori-ginada de forma natural”, puntualiza Cubas. De manera queel resultado es igual al obtenido por los métodos de mejoratradicionales, pero, al ser dirigido, la fase de escrutinio de can-tidades ingentes de plantas y la incertidumbre de si se encon-trará la variante deseada o no se reducen enormemente.

También el uso del sistemaCRISPR/Cas9 facilita la muta-ción en bloque de un con-junto de genes que tengansecuencias idénticas, comopor ejemplo las gliadinas, unconjunto de proteínas quecausan la celiaquía. Si el ARNguía reconoce una secuenciade ADN común a todas ellas,se podrán inactivar todas ala vez.

La mejora genética tam-bién se puede aplicar a laproducción biotecnológica

de compuestos de interés no alimentario. Por ejemplo,ZMapp™, el fármaco experimental que se empleó en la crisisdel ébola, estaba compuesto de tres anticuerpos producidosde manera recombinante en una planta del mismo géneroque la del tabaco, que permite la producción de grandes can-tidades del producto. Lo que pretenden el grupo de Orzaezes la mejora genética de estas plantas-biofactoría. “CRISPRnos abre un abanico de posibilidades que antes no teníamos”,dice. Un ejemplo sería la modificación de los genes que con-trolan la glicosilación (la adición de grupos azúcares) a lasproteínas recombinantes, determinante para su función. Lasplantas glicosilan de manera diferente a los humanos y conCRISPR las plantas glicosilan para que la proteína final, tantola secuencia como los azúcares, sea idéntica a la que hubieraproducido una célula humana. Alicia A. Cortés Q

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Pilar Cubas.

Diego Orzaez.


de los químicos de madrid - cnb - centro nacional de ......cular de la biología de los últimos...

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