Dra. Norma Lpez Daz-Guerrero, Dra. Mara Concepcin Gutirrez Ruiz, Dra. Edith Corts Barberena,Dr. Alejandro Zentella Dehesa y Dra. Mina Konigsberg Fainstein

RESUMEN

Se evalu el dao al ADN en cultivos primarios de fibroblastos de pulmn provenientes deratones jvenes (2 meses) y viejos (13 meses), en presencia y ausencia de un reto por estrsoxidativo y se correlacion este dao con los niveles de las especies reactivas del oxgeno,para contribuir a la comprensin de la relacin que existe entre los niveles de especiesreactivas del oxgeno y el dao al genoma con el envejecimiento celular. Este es unfenmeno complejo que se ha tratado de explicar de diversas maneras, una es la teora delenvejecimiento por radicales libres, la cual propone que este fenmeno se debe a laacumulacin del dao provocado por las especies reactivas del oxgeno a lo largo de la vidadel organismo. Sin embargo, existen otras teoras diferentes que obvian el estrs oxidativoy tratan de explicar el envejecimiento basndose en cambios programados de la expresinde ciertos genes.

DeCS: ENVEJECIMIENTO CELULAR; DAO DEL ADN; ESPECIES DE OXIGE-NO REACTIVO; RADICALES LIBRES; ESTRS OXIDATIVO; FIBROBLASTOS;RATONES.

Los organismos vivos se encuentranconstantemente expuestos a especiesreactivas de oxgeno (ERO) por causa deagentes del medio ambiente como radiacio-nes, frmacos o incluso contaminacin, ascomo tambin a fuentes endgenas delmetabolismo celular como es la respiracinmitocondrial, entre otras. Se sabe que lasERO son indispensables para mantener lahomeostasis celular, para lidiar contra lasinfecciones1 y en los ltimos aos se ha

evidenciado su papel en respuesta a laestimulacin por factores de crecimientoque estn involucrados en la regulacinproliferativa.2,3 Sin embargo, si los nivelesde molculas oxidantes aumentan ms quesu contraparte de molculas y sistemasenzimticos antioxidantes, la clula se en-cuentra sometida a lo que se ha denomina-do estrs oxidativo. Como resultado de esteincremento en las ERO pueden ocurrir mo-dificaciones en las protenas, los lpidos yUniversidad Autnoma Metropolitana de IztapaUniversidad Nacional Autnoma de Mxico

DA O A L A D N Y N I V E L EE N FIBROBLASTOS DE RATOlapa, Mxico

S D E R A D I C A L E S L I B R E SNES JVENES Y VIEJOS

Rev Cubana Invest Biomed 2003:22(2):109-16109

el ADN. Cuando la concentracin de espe-cies oxidantes causa ms daos de los quela clula puede reparar, sobreviene la muer-te. Aun si existe un balance entre losoxidantes y los antioxidantes, pueden ocu-rrir daos puntuales que quedan sin repa-rar, pero que no alteran el metabolismo in-mediato de las clulas. En el caso del ADNesto puede ser de gran relevancia porquelos daos pueden acumularse y heredarsea las siguientes generaciones celulares dan-do lugar a genotipos alterados y clulasfuncionalmente deficientes.4,5

Se ha reportado que, comparadas conlas especies menos longevas, las mslongevas poseen niveles de estrsoxidativo ms bajo, que correlaciona conun menor dao.6 Asimismo, existe una grancantidad de estudios que relacionan la acu-mulacin de mutaciones y deleciones en elADN causadas por estrs oxidativo con elenvejecimiento, el cncer y la evolucin deenfermedades de la tercera edad.4,7,8 De he-cho, la teora de Harman del envejecimientopor radicales libres9 propone que este fe-nmeno se debe a la acumulacin del daoprovocado por las ERO a lo largo de la vidadel organismo. Sin embargo, existen otrasteoras diferentes que obvian el estrsoxidativo y explican el envejecimiento ba-sndose en cambios programados de la ex-presin de ciertos genes, que tambin cuen-tan con una gran cantidad de evidencia ex-perimental que las apoya.10,11 Por lo que esclaro que an perdura la controversia so-bre la importancia del dao oxidativo al ADNcomo elemento determinante para el enve-jecimiento celular.

De la teora propuesta por Harman,cabe esperar que las clulas provenientesde animales viejos posean mayor suscepti-bilidad a contraer y acumular dao al ADNal ser sometidas a estrs oxidativo, que lasclulas provenientes de animales jvenesexpuestos al mismo estrs. Es por ello que110en este trabajo se evalu el dao al ADNen cultivos primarios de fibroblastos depulmn provenientes de ratones jvenes(2 meses) y viejos (13 meses) en presenciay ausencia de un reto por estrs oxidativo yse correlacion este dao con los nivelesde especies reactivas de oxgeno.

MTODOS

Cultivo celular

Los cultivos primarios de fibroblastosse han empleado como un buen modelo paraestudios de envejecimiento,12 en este casose decidi extraer fibroblastos de pulmnporque estos rganos se encuentran ex-puestos de manera constante a altas con-centraciones de oxgeno. Para obtener loscultivos se utilizaron ratones hembra dela cepa CD1. Se consideraron jvenes alos 2 meses de edad y viejos a los 13 meses.Los fibroblastos se obtuvieron siguiendola metodologa de Doyle.13 Los cultivos semantuvieron en medio Eagle modificadopor Dulbecco (DMEM) suplementado con15 % de suero fetal bovino inactivado(Hyclone), penicilina (100 U/mL),estreptomicina (100 mg/mL) y 1 % deaminocidos esenciales (Microlab). Las c-lulas se incubaron a 37 C, 5 % de CO2 y90 % de humedad, y se les cambi el mediocada tercer da. Las determinaciones se rea-lizaron cuando las clulas se encontrabanen fase de crecimiento logartmico.

Reto de estrs oxidativo

Para generar estrs oxidativo en lasclulas se emple H2O2 porque es un agen-te oxidante natural y es precursor de algu-nos de los radicales ms dainos como elradical hidroxilo (OH). En el caso de lasclulas que se utilizaron para cuantificar el

dao al ADN, se agreg una concentracinde 0,3 mM de H2O2 por 30 min a 37 C tantoa los cultivos provenientes de animales j-venes como de animales viejos. Mientrasque para la evaluacin de los niveles deradicales libres por citometra, se agreg lamisma concentracin de H2O2 pero los ni-veles de ERO se determinaron 15 y 30 minposteriores a la adicin.

Cuantificacin del dao al ADN. Electroforesisunicelular alcalina (ensayo cometa)

La electroforesis unicelular alcalina (en-sayo cometa) es una tcnica que permitecuantificar el dao al genoma de manera in-dependiente en cada clula de una pobla-cin, mediante la deteccin de rompimien-tos de cadenas sencillas de ADN.14 Para esteensayo se sembraron 5 x 104 clulas/cm2 encajas multipozo. A las 24 h se despegaronusando tripsina 0,1-EDTA, se centrifugarony el botn se resuspendi en 40 mL de PBS.Se prepararon microgeles en portaobjetosesmerila-dos con 3 capas de agarosa: la pri-mera capa fue de agarosa regular 1 %, lasegunda y tercera capas fueron de agarosade bajo punto de fusin 0,5 %. En la capadel medio se encontraban las clulas. Losgeles se despositaron en una solucin de lisis(NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM,NaOH 0,25 M, Tritn 1 %, DMSO 10 %,pH 10) durante 2 h a 4 C para precipitar lasprotenas. Posteriormente, se sumergieronen la solucin de electroforesis alcalina(NaOH 300 mM, Na2EDTA 1 mM, pH 13) enla cual permanecieron por 20 min antes decorrer la electroforesis a 300 mV y 25 mA,por 20 min. Una vez terminado el proceso,los geles se enjuagaron con solucin deneutralizacin (Tris 0,4 M, pH 7,4) 3 vecespor 5 min, se tieron con bromuro de etidio(0,1 g/mL) y se cuantific el dao al ADNcomo la longitud de la cola del cometa me-dida en mm, en un analizador de imgenesSinoptics.15 Los experimentos se realizaronpor triplicado en eventos independientes,de los cuales se cuantificaron 50 cometasde cada condicin experimental.

Niveles de ERO por citometra de flujo

El flourforo DCFH2 (diacetato dediclorodihidroflourescena) se ha utilizadoampliamente para cuantificar las ERO encultivos celulares porque al oxidarse se res-tablece la estructura electrnica de lafluorescena y fluoresce a 520 nm si se exci-ta a 480 nm. La intensidad de la fluorescen-cia que se observa en presencia delfluorforo se puede correlacionar con el con-tenido celular de radicales libres, incluidaslas especies reactivas de oxgeno, en espe-cial las derivadas del H2O2 como el OH.16Para detectar los niveles de radicales libresse sembraron 1 x 105 clulas/cm2 en cajasmultipozo, pasadas 24 h se despegaron yse resuspendieron en 1 mL de PBS que con-tena 4 mM de DCFH2. Se incubaron a tem-peratura ambiente y en oscuridad por 15 minpara cargar a las clulas con el fluorforo.Despus se centrifu-garon a 1 200 rpm por5 min para eliminar el DCFH2 no incorpora-do y se resuspen-dieron en 1 mL de PBS.Inmediatamente despus se cuantific laflourescencia en un citmetro de flujoFacsCalibur (Beckton Dickinson) excitan-do a 480 nm y analizando la intensidad defluorescencia a 520 nm. Los resultados seexpresan en histogramas en los cuales eleje de las X representa unidades arbitrariasde fluorescencia (UAF).

Anlisis estadstico

Para el anlisis estadstico de los re-sultados obtenidos por el ensayo cometa111

ms de dao en las clulas de ratones vie-jos. Al tratar a las clulas con H2O2 se en-contr que las clulas provenientes de ani-males viejos presentan 80 % ms dao queel determinado en las clulas que provie-nen de animales jvenes (fig. 1). Un puntode vista ms interesante es comparar demanera independiente el dao que se pro-duce en cada tipo celular. En el caso de lasclulas de animales viejos se observ un

Lon gitu d delcom etam (( m )

150

100

50

0

S in H O con 0,3 nM H O

2 2

2 2

C lu las de ratones jvenes C lu

S in H

* * *112que la curva del histograma D (clulas deratones jvenes) est ms desplazada ha-cia la derecha que el histograma C (clulasde ratones viejos). Por otro lado, es eviden-te que los eventos en los histogramas noestn distribuidos de manera homogneaen los 2 paneles. Esto es consistente entodos los experimentos realizados, dondese observa que la fluorescencia de las clu-las provenientes de ratones jvenes no se

Fig. 1. Dao al ADN cuantificado por ensa-yo cometa. El dao sobre el ADN se ex-presa como la longitud de la cola del come-ta dado en mm. Cada barra representa elpromedio del anlisis de 150 clulas tra-tadas en 3 experimentos independientes.las de ratones vie jos

O con 0,3 nM H O2 2

2 2

*se utiliz la prueba no paramtrica deKruskal-Wallis seguida del anlisis devarianza de Tamhane. Mientras que la prue-ba t de Student se us en los experimentosde citometra. El nivel de significacin entodos los casos fue de p< 0,05.

RESULTADOS

Dao al ADN. Ensayo cometa

Los resultados de los ensayos come-tas realizados a las clulas provenientes deratones jvenes y de ratones viejos sin eltratamiento de H2O2 muestran una diferen-cia estadsticamente significativa, con 30 %

incremento de 120 % en el dao causadopor el perxido, mientras que en las clu-las de animales jvenes el aumento fuesolo de 60 %.

Niveles basales de ERO

En la figura 2 se muestran los resulta-dos de citometra de flujo. En los paneles Ay B, a manera de control, se encuentran lasclulas sin el fluorforo, por lo que la in-tensidad de la fluorescencia detectada a520 nm se debe a la autofluorescencia inna-ta de las clulas. Los paneles C y D mues-tran a las clulas preincubadas nicamentecon el DCFH2, sin agregar H2O2, lo que indi-ca los niveles basales de ERO. Se observa

distribuye de igual manera que la fluores-cencia de las clulas de los ratones viejos.

Niveles de ERO inducidos por H2O2

A los 15 min despus de la adicin deH2O2, se cuantific la intensidad de la fluo-rescencia y se encontr un corrimiento ha-

cia la derecha de las curvas de los histogra-mas E y F en relacin con sus respectivoscontroles, C y D, debido a la adicin de H2O2.El promedio del aumento de la intensidadde fluorescencia de 3 experimentos inde-pendientes, en el caso de las clulas de ra-tones viejos, corresponde a 37 %, mientrasque el incremento correspondiente a las

Fig. 2. Estrs oxidativo valorado con DCFH2. Los paneles de la izquierda corresponden a los histogramas obtenidos con las clulas provenientesde ratones viejos, mientras que los de la derecha corresponden a los histogramas de clulas de ratones jvenes. En los histogramas A y B semuestran los histogramas obtenidos nicamente con el fluorforo DCFH2. En los paneles C y D se observan los histogramas 15 min despusde que se agreg el H2O2. Las lneas continuas representan la intensidad de fluorescencia (IF) de los controles sin H2O2 , lo que demuestra comose corri la IF en las clulas tratadas. Las condiciones experimentales estn descritas en la seccin de metodologa. El porcentaje de cambio enla intensidad de fluorescencia es el promedio de 4 experimentos realizados de manera independiente.113

clulas de ratones jvenes es de 45 %, locual result no ser estadsticamente signi-ficativo. Se cuantific la fluorescencia alos 30 min desde la adicin del perxido,y no se encontr diferencia en los histo-gramas ni en la intensidad de la fluores-cencia con respecto a los datos encon-trados a los 15 min.

DISCUSIN

La teora del envejecimiento por radi-cales libres9 propone que los daos que segeneran por accin de las ERO se acumu-lan a lo largo del tiempo, y que esto da lugaral deterioro conocido como envejecimien-to. Los resultados de este trabajo muestranque existe un mayor dao basal en el ADNproveniente de animales viejos que en elADN de animales jvenes. Sin embargo, esdifcil precisar el tipo especfico de daoque se refleja en los ensayos cometas. Porun lado puede ser que sea el resultado decortes o rompimientos en el ADN, o bien,que se trate de daos estructurales en lacromatina que relajan o aflojan la estruc-tura general de esta. La magnitud del daobasal que se observa en las clulas de ani-males viejos, lleva a pensar que el dao quese observa pueda ser una alteracin en lacromatina. Un cambio de este tipo podramodificar la transcripcin del materialgentico y explicar el deterioro funcio-nal que se percibe en los animales vie-jos como propone la teora de Harman.Por otro lado, un dao explicado porrompimientos en la cadena de ADN de30 %, ser demasiado importante comopara que una clula pudiera seguir fun-cionando de manera normal.

Los experimentos de citometra de flu-jo muestran que aparentemente existe una114mayor cantidad de ERO, de manera basal,en las clulas provenientes de animales j-venes que de animales viejos. Esto pudieradeberse a una mayor actividad del metabo-lismo celular y una cadena respiratoriafuncionalmente ms activa. Cuando se agre-g H2O2 a los cultivos primarios, no se en-contr una diferencia estadsticamente sig-nificativa en los niveles de ERO produci-dos por el perxido en las clulas prove-nientes de animales y las de animales vie-jos. Esto sugiere que el mecanismo dedestoxificacin rpida para este tipo de ra-dicales en ambos tipos celulares sea muysimilar. No es posible asegurar de qu ma-nera el estrs oxidativo est afectando alADN y qu tipo de dao es el que se obser-va; sin embargo, resulta claro que los ani-males viejos son ms susceptibles al daopor perxido que los jvenes. Retomandolos resultados de los cometas, estos sugie-ren que el dao que se acumula en elgenoma a lo largo del tiempo no son rompi-mientos directos en la cadena de ADN sinodaos al nivel de la estructura de lacromatina, y se integran con los resultadosobtenidos por citometra con respecto a losniveles de ERO; es posible pensar que cuan-do un organismo envejecido se enfrenta aun reto de estrs oxidativo, el deterioro quese manifiesta no se relaciona de manera di-recta con el dao preexistente en el ADN,sino con la capacidad que tiene este orga-nismo de manejar el estrs oxidativo al quese enfrenta, y ms an, con los mecanis-mos de reparacin con los que se cuentapara poder resarcir el dao generado porlas ERO. Estos resultados coinciden con losde otros investigadores5,17,18 quienes han pro-puesto que ms que la acumulacin de dao,el fenmeno del envejecimiento est dado poruna prdida en los sistemas antioxidantes yen la capacidad reparativa de las clulas.

621.13. Doyle A, Griffiths JS, Newwell DG. Cell and ti

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rogel electroforetic technique for the detection of ADNes 1994;271:243-52.AGRADECIMIENTOS

Al MSc. Manuel Castillo por su valiosaayuda con la parte estadstica. Este trabajo es a-

poyado por el CONACyT con el proyecto No.400200-5-J34194-M, asimismo el citmetrode flujo forma parte del apoyo No. F282-M-9208 de CONACyT y de FOMES-98-35-28

SUMMARY

The ADN damage was evaluated in primary cultures of lung fibroblasts from young (2 months) and old (13months) mice in the presence and absence of a challenge presented by oxidative stress. This damage wascorrelated with the levels of the reactive oxygen species to contribute to the understanding of the relationexisting between the levels of reactive oxygen species and the damage caused by cellular aging to thegenoma. This is a complex phenomenon that has been tried to explain by different ways. One of them isthe theory of aging caused by free radicals, which proposes that this phenomenon results from theaccumulation of the damage caused by the reactive oxygen species during the organisms life. However,there are other theories that rule out the oxidative stress and try to explain aging on the basis ofprogrammed changes occurring in the expression of certain genes.

Subject headings: CELL AGING; DNA DAMAGE; REACTIVE OXYGEN SPECIES; FREE RADICALS;OXIDATIVE STRESS; FIBROBLASTS; MICE.

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Recibido: 28 de septiembre de 2001. Aprobado: 15 de diciembre de 2002.Dra. Norma E Lpez Guerrero. Departamento de Ciencias de la Salud, Divisin de Ciencias Biolgicas y dela Salud, UAM-Iztapalapa. A.P. 55-535. C.P 009340, Mxico, D.F. Tel 5804 4732, Fax: 5804 4727.116