OBJETIVOS.

• Adquirir habilidades en el manejo del instrumento.

• Obtener experiencia en curvas de calibración para otras sustancias.

• Utilizar la curva de calibración de albúmina para determinar cuantitativamente la concentración en una muestra problema.

MARCO TEÓRICO.

La albúmina es la más abundante de las proteínas séricas. Su importancia en el funcionamiento del cuerpo es la habilidad para transportar substancias tales como medicamentos, antibióticos, bilirrubina y ácidos y sirve como almacén de proteínas de estructura necesarias para el crecimiento de los tejidos

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.. La espectrometría de absorción consiste en medir la fracción de luz de una determinada longitud de onda que atraviesa por la muestra. La muestra de una solución colorida no emite luz en sí, de modo que es necesario incluir una fuente luminosa adicional. La absorbancia de una muestra es proporcional a la cantidad total de material que absorbe la luz incidente. En forma experimental se puede demostrar lo siguiente A= abc en otras palabras, la absorbancia es directamente proporcional a:

A. masa constante que es propiedad del material en si, además de la longitud de onda de la medida, b. la longitud de onda de la trayectoria de la luz que atraviesa por la muestra, c. la concentración del material que absorbe luz.

A=abc entonces ley de Lambert Beer cuando la concentración (c) se expresa en (L mol-1 cm-1), y en este caso se le da el símbolo E que se llama coeficiente de extinción molar o absortividad molar, por tanto se tiene a (a dimensional) = E (L mol-1 cm-1) b (cm) c (L mol-1) o simplemente A = Ebc.

Curva de calibración.

Es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva. y, en consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo analito (o de algún otro con propiedades muy similares a éste). Para realizar la comparación se requiere utilizar métodos y equipos apropiados para la resolución del problema de acuerdo al analito que se desee determinar. La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en encontrar

la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable independiente, generalmente concentración del analito de interés) y una variable “y” (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuación y = mx + b.

La mayoría de las sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen color, incluyendo las proteínas, por lo tanto es necesario acoplar algún tipo de reacción química que involucre la aparición o desaparición de un cromógeno con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por tanto la técnica tendrá mayor sensibilidad.

El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos de la albúmina formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas, lo que facilita y proporciona lecturas más precisas de concentración.

PROCEDIMIENTO.

Rotular nueve tubos de ensayo y colocar las siguientes soluciones

TUBO. BLANCO. 1 2 3 4 5 X1 X2

Solución Patrón (mL)

------------ 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 -------- --------

Solución problema.

------------- -------- -------- -------- -------- -------- 0.2 0.6

Solución salina.

2.0 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 1.5 1.0

Biuret. 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar y dejar en reposoLu

ego

Colocar

en el fotocolorímetro la longitud

de onda de máxima

absorbancia

Registrar la

absorbanci

a para

cada

uno de los tubosY

calcular la

concentración de cada

tubo

aplicando la

formul

a (CiVi

=Cf

Vf) y

tabular los resultados de absorbancia y concentración.

DATOS.

[Albumina] = 8 mg/mL (volumen inicial)

Tabla 1: En la siguiente tabla se anotaron los datos para la preparación de solución blanca y muestra de albumina.

Tubos S/L de albumina (ml) Solución salina (ml) Biuret (ml) Vol. final

B --------- 2 2 4

1 0.1 1.9 2 4

2 0.3 1.7 2 4

3 0.5 1.5 2 4

4 0.7 1.3 2 4

5 0.9 1.1 2 4

X1 ? 1.5 2

X2 ? 1.0 2

Tabla 2- ensayo 1: Absorbancia obtenidas para las soluciones preparadas en cada tubo a una longitud de onda de 540 nm.

Tubos Absorbancia1 0,0352 0,1113 0,2144 0,2905 0,294

X1 -0,001X2 0,198

Tabla 2-ensayo 2. Absorbancia obtenidas de las 7 soluciones tratadas durante el ensayo.

Tubos Absorbancia1 -0,0152 0,0333 0,0604 0,2455 0,088

X1 0,001X2 0,001

RESULTADOS

CALCULOS PARA ENSAYO 1Para calcular la [albumina] final se utilizó la siguiente formula, al despejar esta ecuación obtenemos que, en donde:

C1= concentración inicial de cada solución (tubo 1, 2, 3, 4 y 5).

V1= volumen inicial de [albumina] = 8 mg/mL

V2= volumen final de cada solución de [albumina]= 4 ml.

C2 = concentración final de cada solución (tubo 1, 2, 3, 4 y 5).

C1*V1=C2*V2

• Tubo 1

C2= (8mg/ml * 0.1 ml) /4mlC2= 0.2 mg/ml

• Tubo 2

C2= (8mg/ml * 0.3 ml) /4 mlC2=0.6 mg/ml

• Tubo 3

C2= (8mg/ml * 0.5 ml) /4mlC2=1mg/ml

• Tubo 4

C2= (8mg/ml * 0.7 ml) /4mlC2=1.4 mg/ml

• Tubo 5

C2= (8mg/ml * 0.9 ml) /4 mlC2=1.8 mg/ml

Tabla 3- ensayo 1: absorbancia y concentración.

Tubos Absorbancia Ml Concentración Mg/Ml1 0.035 0.22 0.111 0.63 0.214 14 0.291 1.45 0.294 1.8

Grafica 1 absorbancia Vs concentración.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20

0.050.1

0.150.2

0.250.3

0.35f(x) = 0.1745 x + 0.0145

GRAFIACA ENSAYO 1

Valores YLinear (Valores Y)

CONCENTRACION

ABSO

RBAN

CIA

Para la solución problemas: Para hallar la concentración de X1 y X2 se tiene:

C2X = AX/An * Cn

Sln X1

C2X1 = AX1/A3 * C3

C2X1 = 0.001 / 0.088 * 1.8

C2X1 = 0.02045

Sln X2

C2X2 = AX1/A3 * C3

C2X2 = 0.001 / 0.088 * 1.8

C2X2 = 0.02045

Es necesario conocer la concentración 1 de las dos soluciones X para se utiliza la ecuación tradicional

Sln X1

C1X1 = C2 * V2/ V1

C1X1 = 0.02045 mg /ml * 4 ml / 0.2 ml

C1X1 = 0.409 mg /ml

Sln X2

C1X2 = 0.02045 mg /ml * 4 ml / 0.6 ml

C1X2 = 0.1363 mg / ml

Utilizando el gráfico también puede hallarse la concentración C2 para las soluciones X.

De igual forma se procedió para el ensayo 2 calculando las concentraciones finales para cada absorbancia obteniendo la tabla siguiente:

Tabla 4 ensayo 2. Concentración y absorbancia, calculadas y obtenidas paras las soluciones

Tubos Absorbancia Ml Concentración Mg/Ml1 -0,015 0.22 0,033 0.63 0,060 14 0,245 1.45 0,088 1.8

Grafica 2

0 0.20.40.60.8 1 1.21.41.61.8 2-0.050

0.050.1

0.150.2

0.250.3

f(x) = 0.1045 x − 0.0223000000000001

GRAFICA ENSAYO 2

Valores YLinear (Valores Y)

CONCENTRACION

ABSO

RBAN

CIA

Grafica 1. Muestra los resultados obtenidos en el segundo ensayo, como se puede observar existe un dato que no se acerca a la línea de tendencia, por esta razón no se obtiene el tipo de grafico esperado (línea recta). Este tipo de errores son muy frecuentes en la experimentación, ya sea que sede por un mal funcionamiento del instrumento de trabajo o por cusa humana.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Las proteínas son biopolímeros (macromoléculas orgánicas), de elevado peso molecular, constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (Y), etc. Estos elementos químicos se agrupan para formar unidades estructurales (monómeros) llamados AMINOACIDOS, a los cuales podríamos considerar como los "ladrillos de los edificios moleculares proteicos". Estos edificios macromoleculares se construyen y desmoronan con gran facilidad dentro de las células, y a ello debe precisamente la materia viva su capacidad de crecimiento, reparación y regulación.Después de haber realizado las respectivas mediciones de absorbancia, es decir, la cantidad de luz absorbida en función de la longitud de onda utilizada, a través de espectroscopia de absorción en el ultra violeta visible (300nm-800nm), la cual se basa en la interacción de la radiación electromagnética con la materia, permitiéndonos identificar las sustancias químicas y determinar su concentración. Fue elaborada la curva de calibración (grafica 1), al finalizar la tramitancia (fracción de luz incidente que es transmitida por la disolución), la cual permite conocer la relación existente entre la absorbancia y la concentración de proteínas que hay en la muestra principalmente compuesta por una concentración de solución patrón, albúmina y solución salina. La curva de calibración dice que la absorción de radiación a una longitud de onda determinada en este caso 540nm, es directamente proporcional a la concentración del analito representada en la grafica en la relación lineal entre la absorbancia y la concentración; comprobando así la ley de Lambert Beer donde la magnitud de la absorción de luz está relacionada directamente con la concentración de la sustancia absorbente, es decir, a mayor concentración de la muestra mayor es la absorbancia de la luz de esta. Debido a esta relación, de la gráfica es posible calcular la concentración de dicha sustancia, a partir de la intensidad de luz absorbida, hallándole la pendiente de la recta.

para esta práctica se tuvieron en cuenta una serie de limitaciones relacionadas con la ley de Lambert Beer, ya que esta solo describe bien el comportamiento de soluciones diluidas a una concentración inferior a 10 mM, debido a que a mayores concentraciones las distancias entre la moléculas disminuyen y empiezan a afectarse electrostáticamente afectando su capacidad de absorción; además esta ley no se cumple cuando el analito se asocia, disocia o reacciona en el disolvente para dar lugar a un producto que presenta un espectro de absorción diferente

En la práctica fue utilizado el reactivo de Biuret el cual detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida como lo es la solución de albumina. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. Se usó el ensayo de Biuret como método colorimétrico, por el cual se determinó la concentración de proteínas de la muestra de albumina mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 560 nm.

En las soluciones tratadas, los diferentes tonos violetas observados, se deben a que la concentración de albumina en cada solución variaba, apreciándose un color violeta más intenso en los tubos 5 y 6, en los cuales al haber alta concentración de albumina pudo darse pie a la formación de mayor cantidad de complejos de coordinación, incidiendo este hecho efectivamente en la coloración, así como el la absorción de luz, es decir, a medida que se incrementa el número que complejos de coordinación se aumenta la capacidad de absorber luz en la estructura proteica, ya que al ser transparente dejaría pasar la luz fácilmente, pero al ser coloreada captura, absorbe o retiene cantidades de luz significativas para su reconocimiento y cuantificación. En los resultados obtenidos en el laboratorio nos arrojó un coeficiente de relación al 98.5 % lo que da a entender que existe relación muy alta entre los valores de absorbancia y concentraciones.

CONCLUSIONES

A través de de la ley de Lambert-Beer podemos relacionar la cantidad de luz absorbida por una sustancia a una determinada longitud de onda con su concentración.

Gracias a la coloración con biuret se pudo medir la cantidad de luz por las estructuras proteicas.

CUESTIONARIO

• ¿Por qué las proteínas se pueden determinar cuantitativamente con el método de Biuret?

RTA/ porque se da la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados.

• En qué condiciones se deben preparar las soluciones de albumina para hacer la determinación de proteínas?

R/ Las soluciones de albumina se deben preparar agregándoles solución salina a bajas concentraciones ya que estas ayudan a la solubilidad de la albumina en el agua.

• ¿Qué es una curva estándar y para que se utiliza?RTA/ A curva estándar es una herramienta cuantitativa de la investigación, un método de trazar análisis datos que se utilizan para determinar concentración de una sustancia, particularmente proteínas y DNA. Puede ser utilizado en muchos experimentos biológicos. Es una curva que se construye a partir de diferentes concentraciones de un analito y su respuesta frente a una reacción. Este gráfico tiende a ser lineal, mientras progrese según la ley de Lambert Beer.

• ¿Qué leyes fundamentan la determinación cuantitativa de una proteína? Descríbalas.

La ley de Beer-Lambert la cual relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.

• Método del Biuret: En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución de albúmina.

Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)

• Método de Lowry: Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra Consiste en dos reacciones:

1. Reacción de Biuret2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin generando un color azul.

• ¿Cuál es la semejanza y diferencia entre la ley de Lambert y Beer?RTA/ Las semejanzas que existen entre la ley de Lambert y Beer es que ambas tienen como objeto de estudio la cantidad de luz que se transmite a través de una sustancia química. Estas leyes se diferencian en que la ley de lambert relaciona la cantidad de luz absorbida con la longitud del medio, mientras que la ley de beer relaciona la cantidad de luz absorbida con la concentración de la sustancia.