Curso Básico de Biología Molecular de Plantas

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INDICE

1.- INTRODUCCIÓN: ADN Y GENES 1.1.- Definición de gen 1.2.- El ADN 1.2.1.- Estructura básica de la molécula de ADN 1.2.2.- Replicación del ADN 1.3.- Partes de un gen 1.4.- Transcripción, traducción 1.4.1.- Transcripción 1.4.2.- Regulación de la expresión génica 1.4.3.- Terminación 1.4.4.- Procesamiento del mensajero 1.4.5.- Traducción 1.4.6.- Modificaciones postraduccionales 1.5.- ¿Por qué aislar genes? 2.- METODOLOGÍA BÁSICA 2.1.- Concepto de clonación molecular 2.2.- Enzimas utilizadas en ingeniería genética 2.2.1.- Enzimas de restricción 2.2.2.- DNA Ligasas 2.2.3.- Otros enzimas 2.3.- Vectores 2.3.1.- Plásmidos 2.3.2.- Fagos 2.3.3.- Cósmidos 2.3.4.- BACs/PACs 2.3.5.- YACs 2.3.6.- Otros vectores 2.4.- Electroforesis 2.4.1.- Concepto 2.4.2.- Gel de Agarosa 2.4.3.- Gel de Acrilamida 2.5.- Hibridación 2.5.1.- Marcaje de moléculas de ácido nucleico 2.5.2.- Desnaturalización 2.5.3.- Hibridación 2.5.4.- Hibriación Southern 2.5.5.- Hibriación Northern 2.5.6.- Northern reverso 2.5.7.- Hibriación Western 2.5.8.- Hibridación de colonias bacterianas o calvas 2.5.9.- Slots and dot blots 2.6.- Secuenciación del ADN 3.- LIBRERÍAS DE DNA 3.1.-Concepto de librería 3.2.- Librerías genómicas 3.3.- Librerías de cDNAs 3.4.- Librerías de expresión 3.5.- Cribado diferencial 3.6.- Librerías de sustracción 3.7.- Normalización de librerías de cDNA 4.- PCR 4.1.- Concepto de PCR 4.2.- Aplicaciones 4.2.1.- Aislamiento de genes 4.2.2.- Secuenciación 4.2.3.- RT-PCR 4.2.4.- Real time Quantitative PCR

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4.2.5.- PCR inversa 4.2.6.- Genome Walking 4.2.7.- RACE 4.2.8.- Differential Display 4.2.9.- PCR-select cDNA subtraction 5.- GENÓMICA FUNCIONAL 5.1.- Proyectos Genoma 5.2.- Proyectos de secuenciación de ESTs 5.3.- Microchips de DNA 6.- GENÉTICA REVERSA 6.1.- Colecciones de mutantes 6.1.1.- Cribado de colecciones de mutantes 6.2.- Transposon tagging 6.2.1.- Concepto de elemento transponible 6.2.2.- Transposon tagging 6.2.3.- Enhancer y Gene traps 6.2.4.- Cribado de librerías de mutantes 6.3.- Targeting induced local lesions in genomes (TILLING)

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1.- INTRODUCCIÓN: ADN Y GENES 1.1.- DEFINICIÓN DE GEN El concepto de gen ha ido variando a lo largo del tiempo. La idea original del gen procede de los experimentos de Gregor Mendel, aunque él no los denominó genes, sino “factores”, y vendrían a ser los responsables de la transmisión de los caracteres de padres a hijos. Fue hacia 1950 en que se aportaron pruebas definitivas sobre la naturaleza molecular del gen. Por un lado se descubrió que los genes están constituidos por ADN. Por otro lado, se descubrió que ese ADN contenía la información necesaria para la síntesis de una cadena determinada de proteína. Así pues, la definición de gen pasó a ser “la cadena de ADN capaz de dirigir la síntesis de una proteína”. Posteriormente este concepto ha sido matizado. En primer lugar, se sabe que muchas proteínas están constituidas por más de una cadena polipeptídica y que cada una de ellas está codificada por un gen diferente. Por ello la definición pasó a ser: “la cadena de ADN capaz de dirigir la síntesis de un polipéptido”. A efectos de lo que nos interesa en este curso esta podría ser una buena definición. Sin embargo, hoy se sabe que no es del todo correcta ya que determinados genes son capaces de codificar más de un polipéptido, y por otra parte, un mismo polipéptido puede ser codificado por diferentes genes. Además, existen algunos genes que no codifican proteínas sino ARNs. Por último, dentro de lo que se entiende por gen no únicamente se incluyen las regiones que codifican para un polipéptido sino también aquellas que determinan en que tejidos, en que momentos, o en que cantidades se ha de producir el mismo. A pesar de ello nos quedaremos con la siguiente definición: “Fragmento de ADN que contiene toda la información necesaria para la síntesis de un polipéptido”. 1.2.- EL ADN 1.2.1.- ESTRUCTURA BÁSICA Como se ha comentado el ADN es la molécula que contiene la información genética y la sustancia de la cual están hechos los genes. Por eso, para comprender el funcionamiento de los genes se ha de conocer al menos su estructura básica. El ácido desoxirribonucleico es un polinucleótido, es decir, está formado por la unión de nucleótidos. Existen 4 nucleótidos diferentes: A, T, G y C. Cada nucleótido, a su vez, etá formado por una base nitrogenada, una pentosa (azúcar) y un grupo ortofosfórico, a través del cual se realizan las uniones entre nucleótidos. La unión del grupo fosfato tiene lugar en las posiciones 5’ o 3’ de la pentosa, lo cual hace que las cadenas estén orientadas. El orden en que se sitúan los nucleótidos se denomina secuencia del ADN. Esta sería la estructura básica del ADN, sin embargo, la mayor parte de las veces el ADN se encuentra formando una estructura más compleja que consiste en dos cadenas como la anterior que se enlazan una con otra de manera complementaria, es decir, que solo se aparean las bases A con T, y C con G. Estas dos cadenas, se enrollan una sobre otra, formando la famosa doble hélice. Medidas del tamaño de los fragmentos de ADN: número de pares de bases.

- pares de bases = pb - mil pares de bases = kpb - millón de pares de bases Mpb

1.2.2.- REPLICACIÓN DEL ADN Esta estructura es importante por una particularidad, y es que cada una de las cadenas puede servir como molde para reproducir la otra, y esto es lo que se produce durante la replicación. Cada vez que la célula se divide, todo el ADN es duplicado. Las dos cadenas se separan y cada una de ellas dirige la síntesis de la segunda. Esta reacción tiene lugar por medio de un enzima llamada ADN polimerasa.

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Por otro lado, otra particularidad del ADN es que si sus dos cadenas se separan, por ejemplo, por acción del calor, y luego se deja enfriar la solución, las cadenas pueden reasociarse, reconociendo la secuencia una de la otra. 1.3.- PARTES DE UN GEN Como se ha comentado antes los genes son segmentos de ADN capaces de dirigir la síntesis de proteínas determinadas, y ello lo hacen a través de un ARN intermediario. El siguiente diagrama muestra la forma en que la información genética se transmite desde el ADN hasta la proteína. Por lo tanto, estos segmentos de moléculas de ADN que son los genes han de contener las señales o información necesaria para realizar estos procesos. Estos segmentos se pueden dividir en diferentes partes según un criterio de funcionalidad. Básicamente, un gen estaría constituido por 3 partes:

1. Promotor: que establece cuándo y en qué cantidad se transcribirá el gen. 2. Región codificante: el fragmento de ADN que determina la secuencia de aminoácidos de la proteína

codificada. 3. Terminador : que contiene las señales que determinan el término del proceso de transcripción,

evitando que continúe hacia otros genes que se encuentran más adelante. Todas estas señales son "leídas" y decodificadas por interacciones establecidas por proteínas específicas.

Además, algunos genes contienen intrones. Los intrones son secuencias dentro de un gen que son eliminadas en el procesamiento del mensajero mediante un proceso denominado de splicing y que, por tanto, no están presentes en el mRNA. El número, tamaño y posición de los intrones varía de unos genes a otros.

1.4.- TRANSCRIPCIÓN, TRADUCCIÓN 1.4.1.- TRANSCRIPCIÓN Se entiende por transcripción a la copia de la información de un gen desde el ADN de doble cadena a una molécula de ARN de cadena simple. Este proceso tiene lugar en el núcleo, y luego este ARN, denominado mRNA o ARN mensajero, es trasladado al citoplasma, donde se produce la síntesis de las proteínas. El proceso de transcripción consta de tres etapas: - Iniciación: es el proceso más complejo y más importante. Implica la separación de las dos cadenas de ADN y la unión de la ARN polimerasa, el enzima responsable de la síntesis del ARN. El inicio ha de realizarse en un lugar concreto, denominado promotor, y que viene determinado por la unión de ciertas proteínas denominadas factores de transcripción. - Elongación: una vez unida la ARN polimerasa comienza a unir NTPs en orden complementario al de la cadena de ADN, y siempre de 5’ a 3’. - Terminación: al final del gen existen unas señales que indican a la ARN polimerasa que debe soltarse y así finalizar la transcripción. Por tanto, aunque la transcripción la lleva a cabo la ARN polimerasa, ésta debe asociarse a una serie de proteínas que le indican donde y cuando empezar a copiar, donde acabar, y que permiten que el mRNA sea el adecuado. Estos factores de transcripción son muy importantes en la regulación de los genes. Algunos de estos factores únicamente actúan en respuesta a ciertos estímulos, que pueden ser, por ejemplo, ambientales. Estos factores denominados inducibles, son los responsables de la regulación de la actividad de los genes en respuesta a los estímulos, desarrollo, etc. Pueden actuar activando o reprimiendo la transcripción. Promotor: parte del gen que contiene todas las secuencias necesarias para la unión de la ARN polimerasa y los factores de transcripción.

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Promotor basal: una secuencia que es capaz de iniciar la síntesis de ARN pero que no contiene ninguna señal de regulación. Secuencias conservadas en los promotores básales de plantas TATA box: TATA -25 bp del inicio de transcripción Inicio TCATCA +1 1.4.2.- REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA No todas las proteínas se necesitan siempre, en todos los tejidos o en las mismas cantidades. Por tanto, los seres vivos han desarrollado sistemas para controlar la cantidad de cada proteína que sintetiza la célula. Pero, ¿Cómo lo hace la célula? El sistema más habitual es regulando la cantidad de mRNA que se produce. La cantidad de RNA que produce un gen en un momento dado depende de la facilidad con que la RNA polimerasa puede unirse al promotor e iniciar la copia. Esta unión puede verse facilitada, o dificultada por la presencia de determinadas proteínas unidas a localizaciones específicas del ADN en la zona del promotor. La presencia o capacidad de estas proteínas a unirse al promotor pueden depender de factores como estímulos externos, hormonas, nutrientes, luz..., con lo cual se consigue regular la transcripción de un gen. Una manera de estudiar estos factores es eliminando trozos del promotor y viendo como afecta a la transcripción. De esta manera se pueden definir las regiones o “cajas” del promotor importantes en su regulación. 1.4.3.- TERMINACIÓN Secuencia terminadora: Aquella que contiene la información necesaria para que la RNA polimerasa termine la transcripción. Secuencias conservadas en los terminadores de plantas Señal de poliadenilación AATAAA 10 a 30 bp del final. Sitio de poliadenilación CAATT(T/G) El sitio de terminación puede ser variable incluso dentro de un mismo gen, de manera que no todos los RNAs acaban exactamente en el mismo sitio, aunque la diferencia suele ser de unos pocos pares de bases. 1.4.4.- PROCESAMIENTO DEL MENSAJERO El RNA que se produce tras la acción de la RNA polimerasa no es el mismo que posteriormente se traducirá a proteína, sino que sufre una serie de modificaciones posteriores. El RNA original, producto de la RNA polimerasa recibe el nombre de hnRNA (heterogeneous nuclear RNA) mientras que el RNA después del procesamiento recibe el nombre de mRNA (messanger RNA). 1- 5’ capping: adición en el extremo 5’ del RNA de un nucleótido especial (metil-guanina) que protegeria al mRNA de la degradación. 2- 3’ poliadenilación: adición en el extremo 3’ de una “cola” de adeninas. No ocurre en todos los mRNAs, pero si en la mayoría. 3- Eliminación de intrones (splicing): la realiza el splicisoma, un complejo formado por unas 70 proteínas y numerosas RNAs. Los intrones poseen unas señales de secuencia que posibilitan que el splicisoma los reconozca y elimine. En general los genes que están evolutivamente relacionados tienen una organización de intrones/exones semejante. Incluso, en especies cercanas, se observa relación entre las secuencias de los intrones.

Sin embargo, estas señales a veces no son reconocidas siempre, de manera que según sea el splicing, un mismo gen puede codificar más de un polipéptido que pueden tener propiedades diferentes. A este fenómeno se le denomina splicing diferencial. Aunque no tan común como en animales, el splicing diferencial también existe en plantas. Un ejemplo: la rubisco activasa de dicotiledóneas.

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1.4.5.- TRADUCCIÓN El ribosoma se une al RNA mensajero. Los tRNAs reconocen la secuencia y unen el aminoácido a la cadena de polipéptido creciente. El ribosoma se mueve tres bases y se repite el proceso. 1.4.6.- MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES La síntesis del polipéptido no es siempre el final del proceso:

- La cadena de aminoácidos ha de adoptar la conformación adecuada - En algunos casos el polipéptido es cortado en subunidades - En muchos casos ha de unirse a otras cadenas o a otras moléculas. - Algunos aminoácidos pueden sufrir modificaciones, por ejemplo, fosforilación o glicosilación

1.5.- ¿POR QUÉ AISLAR GENES? Desde el inicio de la agricultura el hombre a intentado mejorar las plantas que cultivaba. Hasta hace relativamente poco tiempo la Mejora Genética se basaba en el encontrar nuevas combinaciones de alelos en una especie que dieran como resultado plantas con el fenotipo deseado. Las técnicas de Biología Molecular aplicadas al campo de la agricultura han revolucionado la Mejora Clásica por diversos motivos. Por un lado permiten crear nuevos alelos (mutagénesis) sin esperar a que estos se produzcan de manera natural. Pero por otra, permiten introducir en una planta aquellos genes que nos interesen incluso de otros organismos. Este mecanismo permite acortar significativamente el tiempo de muchas investigaciones que anteriormente requerían experimentos de larga duración, pues dependían de la fertilización convencional de las plantas, y esperar que éstas crecieran y formaran semillas en cuestión de meses. Algunas de las ventajas que se esperan de la Ingeniería Genética de Plantas: - aumentar productividad y reducir costes - innovaciones y mejoras en los alimentos - prácticas agrícolas más "ecológicas". Pero además la manipulación genética de plantas tendrá un impacto en otros sectores productivos: - floricultura y jardinería - industria química - industria farmacéutica Aunque no es la única, la punta de lanza y parte más espectacular de esta BT es la I.G. de plantas: la creación de plantas transgénicas a las que hemos introducido establemente ADN foráneo que puede ser no sólo de origen vegetal, sino de animales o de microorganismos. Normalmente, para que un gen pueda funcionar en la planta, hay que hacer in vitro una "construcción genética artificial": para ello se suele colocar delante de la parte codificadora que nos interesa una porción de ADN que permite esa expresión (promotores, intensificadores de la transcripción). Podemos incluso escoger nuestros promotores: algunos inducen la expresión en casi todos los tejidos de la planta, de forma continua (constitutiva); en cambio, otros logran que el transgén se exprese sólo en determinados órganos o tejidos, o bajo el efecto inductor de alguna sustancia química. Pero en cualquier caso, la posibilidad de realizar ingeniería genética en plantas depende, del descubrimiento y aislamiento de genes, o promotores, cuya introducción en una planta pueda producir una ventaja en el cultivo.

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2.- METODOLOGÍA BÁSICA 2.1.- CONCEPTO DE CLONACIÓN MOLECULAR Clonar consiste en producir un elevado número de copias de una misma cosa, en nuestro caso, genes, o sea, pedazos de ADN. Por lo tanto, cuando hablamos de clonación de genes estamos hablando de aislar genes y multiplicar el ADN que los codifica. ADN recombinante: Una molécula de ADN producida a partir de fragmentos que provienen de organismos diferentes o que en el organismo original se encuentran en diferente ordenación. Dado que el ADN de todos los organismos vivientes tiene una naturaleza química idéntica, no existen, en principio, limitaciones para recombinar el ADN de cualquier origen. La clonación de genes requiere de seis condiciones:

1- Un organismo huésped en donde se realice la multiplicación (también se puede realizar in vitro: PCR) 2- Un vector de DNA que se pueda multiplicar en el huésped 3- Una manera de unir el DNA de interés con el DNA vector 4- Una manera de introducir la combinación DNA-vector en el huésped 5- Una manera de seleccionar de entre todos los huéspedes que contienen DNA-vector aquellos que

tienen el DNA que nos interesa. 6- Un método para poder aislar el DNA-vector en cantidades suficientes para su estudio

2.2.- ENZIMAS UTILIZADAS EN LA INGENIERÍA GENÉTICA

Las técnicas de Ingeniería Genética se basan en la capacidad del investigador para manipular las moléculas de ADN. Para realizar estas manipulaciones el investigador utiliza enzimas que modifican de una u otra manera la molécula de ADN, o de ARN en algunos casos. Para ello se cuenta con un amplio repertorio. Los enzimas más utilizados y claves son los enzimas de restricción. 2.2.1- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Son enzimas aislados a partir de bacterias que tienen la capacidad de cortar las moléculas de ADN de doble cadena en lugares que presentan secuencias específicas. Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.

HaeIII 5’GGCC 3’ -> 5’GG CC 3’

corte de extremo romo

5’.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3’ 3’.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5’

5’.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGG CCTAGCTGCAGCGATCGA.3’ 3’.GGGTTCGAACTATCGAAAGCC GGATCGACGTCGCTAGCT.5’

HindIII 5’AAGCTT 3’ -> 5’A AGCTT 3’

corte de extremo 3' cohesivo

5’.CCCAAGCTT GATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3’ 3’.GGGTTCGAA CTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5’

5’.CCCA AGCTT GATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3’ 3’.GGGTTCGA ACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5’

PstI 5’CTGCAG 3’ -> 5’CTGCA G 3’ corte de extremo 5' cohesivo

5’.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3’ 3’.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5’

5’.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCA GCGATCGA.3’ 3’.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCG ACGTCGCTAGCT.5’

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Otras interesantes propiedades de las enzimas de restricción son:

- En general, reconocen secuencias palindrómicas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección contraria.

- Dado que el enzima corta siempre en la misma secuencia diana, incluso las moléculas de ADN más

complejas, en los mismos sitios, generando fragmentos del mismo tamaño en cada digestión

- El tamaño de estos fragmentos estaría determinado por la distancia entre las dianas (pb)

- La frecuencia de corte de un enzima depende de la probabilidad dé que sé de la combinación de nucleótidos que reconoce como diana. Así pues, cuanto más larga sea la diana, menos probable es el corte.

De acuerdo con la manera en que el enzima corta, se distinguen tres tipos de enzimas de restricción: Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima. 2.2.1.- DNA LIGASA Las DNA ligasas catalizan la formación de un enlace fosfodiester entre el 5’ de un fosfato y el 3’ de un nucleótido. Se usa para unir covalentemente cadenas de ADN. Por ejemplo, un fragmento dentro de otro. La DNA ligasa usada más habitualmente es la T4 DNA ligasa, que requiere ATP como cofactor. La ligación de moléculas de ADN puede realizarse de múltiples maneras. Por ejemplo:

- Ligación intermolecular: entre dos cadenas distintas de ADN

- Ligación intramolecular: entre los dos extremos de la misma cadena de ADN, dando lugar a un círculo.

La ligación en principio se producirá o bien entre extremos romos o bien entre extremos de DNAs digeridos con el mismo enzima de restricción y que, por tanto, pueden aparearse. Sin embargo, en ocasiones, también puede producirse entre moléculas digeridos con enzimas diferentes si los extremos que generan son compatibles. Dos moléculas digeridas con el mismo enzima pueden unirse para formar un circulo, aunque pueden adoptar dos configuraciones diferentes según la orientación en que se unan. Si esto mismo lo hacemos con moleculas digeridas con dos enzimas adecuados, podremos controlar la orientación. En caso de no contar con enzimas adecuados para unir las moléculas que nos interesan aun así contamos con algunas posibilidades. Por ejemplo, el empleo de moléculas adaptadores. Esto es, pequeñas moléculas de ADN bicatenario que se unen a los extremos del ADN mediante ligasas y que tienen una diana de restricción que nos interesa. Otra posibilidad es la de añadir al extremo del ADN una “cola” de mononucleótidos en una de las moléculas de ADN, y del mononucleótido complementario en la otra. Esto se realiza mediante un enzima denominado polinucleótido transferasa terminal.

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2.2.3.- OTROS ENZIMAS

ENZIMA ACTIVIDAD Transcriptasa reversa Copia el RNA de cadena simple a DNA de cadena simple

RNAsaH Degrada el RNA en híbridos DNA-RNA DNA polimerasa Sintetiza DNA complementario de un DNA de cadena simple

DNA ligasa Une moléculas de DNA Fosfatasa alcalina Elimina el grupo fosfato del extremo 5’ del ADN

Polinucleótido quinasa Introduce fosfato en el extremo 5’ del ADN DNAsaI Hidroliza uniones fosfato de DNA doble cadena

Nucleasa S1 Degrada DNA de cadena simple Transferasa terminal Añade nucleótidos al extremo 3’ del ADN

RNA polimerasa Sintetiza RNA a partir de DNA doble cadena Taq DNA polimerasa Sintetiza DNA complementario a otro y es termoestable

Exonucleasa III Elimina nucleótidos progresivamente por el extremo 3’ 2.3.- VECTORES Vector de clonaje: un DNA de pequeño tamaño capaz de autoreplicarse conteniendo un DNA foráneo y de perpetuarse en células huésped. Como se ha mencionado antes la clonación de ADN depende de la disponibilidad de un vector que permita la amplificación en una célula huésped y la selección del fragmento que nos interesa. Tradicionalmente como huéspedes se han usado o bien bacterias, o bien, en algunos casos, levadura, por su facilidad de manejo y capacidad de amplificación. Las propiedades que se esperan de un buen vector de clonaje son:

1.- Debe de poder contener ADN extraño y aun así seguir reproduciéndose. 2.- Debe de permitir poder distinguir las bacterias o levaduras que contienen e vector con el fragmento

que nos interesa de las que no. Con estas características se han desarrollado diversas clases de vectores. Los más comúnmente utilizados son:

- Plásmidos - Bacteriofagos - Cósmidos - YACs - BACs - Otros

Tamaño máximo de los insertos en los distintos tipos de vectores - Plásmidos 10 kb - Bacteriofagos 20 kb - Cósmidos 47 kb - YACs 1000 kb - BACs 125 kb 2.3.1.- PLÁSMIDOS Características - huésped: bacterias, principalmente E.coli. - DNA circular extracromosomal - Tamaño entre 1 y 200 kb - Pueden añadirse funciones de selección como resistencia a antibióticos o de clonaje, como múltiples dianas de inserción. - Alto número de copias por célula: hasta 200 copias. El fragmento que se desea clonar y el plásmido son digeridos con el mismo enzima y ligados. El DNA así producido se introduce en bacterias que no contienen plásmido mediante el proceso denominado de transformación. Para ello se induce la formación de poros en las paredes de las bacterias bien mediante un aumento en la temperatura (choque térmico) o bien mediante un choque eléctrico (electroporación). Como el

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plásmido contiene genes de selección para resistencia a antibióticos, solo las bacterias transformadas podrán crecer en un medio selectivo con ese antibiótico. Finalmente, los plásmidos que contienen el inserto deseado (el DNA externo) son seleccionados mediante un segundo sistema de selección. Por ejemplo, la introducción del inserto produce la ruptura de un gen que da coloración a la bacteria. Este gen suele ser la beta-galactosidasa. Si el gen es activo, en presencia de una sustrato adecuado (X-gal) las colonias aparecen de color azul. 2.3.2.- BACTERIÓFAGO LAMBDA Una de las limitaciones de los plásmidos como vectores es que no permiten introducir fragmentos de gran tamaño debido a las limitaciones en el proceso de transformación. Por ello se desarrolló un segundo tipo de vector basado en el bacreriófago lambda. Un bacteriófago (fago) es un virus que infecta bacterias. Los fagos introducen el DNA en la célula huésped por si mismos, allí se multiplica y produce nuevos virus encapsidados que a su vez son capaces de infectar nuevas células. La ventaja de los fagos como vectores es que se les puede añadir DNA externo y aun así son capaces de multiplicarse. Los fragmentos del DNA del fago se ligan in vitro al fragmento de DNA de nuestro interés. Este DNA híbrido se une a las proteínas de la cápside del virus (también in vitro) y con ello se infecta las bacterias. Una ventaja respecto a los plásmidos es que puede contener fragmentos mayores de ADN. Su crecimiento se realiza sobre placas en las que se hace crecer simultáneamente la bacreria en la densidad adecuada de manera que a partir de cada fago se genera lo que se conoce como calva, una zona de cultivo de bacterias que ha sido lisada por los fagos y que contendra fagos idénticos, es decir, con el mismo fragmento de ADN que le hemos introducido. 2.3.3.- CÓSMIDOS Son una mezcla de plásmido y fago. Dentro de la bacteria se multiplican como plásmido y el proceso de ligación del DNA es el mismo que para un plásmido, pero pueden contener mayores insertos por que se introducen en las bacterias por transducción, como los fagos. Así pues permiten insertar hasta 48 kb. Sin embargo, tienen algunos problemas como recombinaciones o falta de estabilidad en las bacterias. 2.3.4.- BAC/PACs Los BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) se basan en el plásmido de E.coli denominado Factor F mientras que los PACs se basan en el bacteriófago P1. La ventaja respecto a los anteriores es que permite clonar hasta 350 kb los BACs y hasta 150 los PACs. Esta gran capacidad ha hecho que se utilicen en los proyectos secuenciación. El manejo es similar a los plásmidos ya que contienen similares genes de resistencia y selección. Una diferencia es que la transformación debe realizarse por electroporación. Otra diferencia es que el número de copias por célula es de 1 o 2, por lo que se requiere mayor numero de bacterias para el mismo número de moléculas de plásmido. 2.3.5.- YACs Contienen las señales necesarias para comportarse como un cromosoma en células de levadura. Pueden contener hasta 1000 kb de inserto. Contienen genes de selección. Se pueden replicar en bacteria como plásmidos cuando aun no tienen inserto. 2.3.6.- OTROS VECTORES Retrovirus Plásmido Ti Plásmidos especializados para transformar Agrobacterium e introducir ADN en plantas.

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Baculovirus Infectan células de insecto. Su genoma (128 kb) es de doble cadena y codifica entre otros para una proteína, la polihedrina, que únicamente es necesaria para la diseminaciín en la naturaleza. Los vectores se basan en la cotransfectación de un pequeño plásmido conteniendo el gen de interés junto al genoma entero, que recombinan entre si, permitiendo que el gen introducido sustituya a la polihedrina. Se usan sobre todo para expresar proteínas en células eucariotas. Elemento transponible P El elemento P es un transposón de Drosophila (elemento móvil) capaz de cambiar de localización dentro del genoma. El gen exógeno se introduce en el transposón y se microinyecta en células de Drosophila, integrándose en el genoma. 2.4.- ELECTROFORESIS 2.4.1.- CONCEPTO La electroforesis es un método de separación de moléculas que se basa en hacerlas pasar por un material (gel) sometido a un campo eléctrico. Muchas de las moléculas orgánicas, como las proteínas o los ácidos nucleicos, están cargadas eléctricamente. El DNA tiene carga negativa debido a los grupos fosfato. El gel sirve como soporte de la separación y consiste en una sustancia polimerizada en forma de trama. Los más usados son la agarosa y la poliacrilamida. En el mismo se realizan unos agujeros o pocillos en donde se colocarán las muestras. Cuando se somete al gel a un campo eléctrico, el ADN tiende a desplazarse hacia el polo positivo, pero debe hacerlo a través de la trama del gel. Las moléculas pequeñas lo hacen más fácilmente que las grandes por lo que, por ejemplo, los fragmentos de ADN más pequeños se desplazan más rápido que los grandes. Esto permite separar los fragmentos de ADN por su tamaño. Si introducimos en el gel fragmentos de tamaño conocido podemos inferir el tamaño de los de la muestra. 2.4.2.- GEL DE AGAROSA La agarosa en polvo se introduce en una solución tamponadora y se calienta hasta que se disuelve. Entonces se deja enfriar un poco, se añade bromuro de etidio, que tiñe el ADN, y se coloca en el molde. Cuando se enfría el gel se endurece y puede colocarse en la cubeta de electroforesis, que es el aparato que cuenta con unos electrodos conectados a una fuente eléctrica. Las muestras de ADN se colocan en los pocillos. Se conecta la electricidad y se deja el tiempo necesario para la separación. El DNA se visualiza en presencia de luz UV gracias al bromuro de etidio. 2.3.5.- GELES DE ACRILAMIDA El principio es el mismo, la preparación similar. La diferencia es que han de ser mas finos y que producen una mayor resolución. Se pueden emplear también para proteínas. 2.5.- HIBRIDACIÓN 2.5.1.- MARCAJE DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO Se basa en el uso de polimerasas que actúen con dNTPs modificados de alguna manera detectable. Se pueden usar dNTPs radiactivos, conjugados a moléculas detectables mediante anticuerpos o a moléculas fluorescentes, etc.

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El marcaje radioactivo es uno de los que más se han utilizado y será el que use como ejemplo a continuación. Los ácidos nucleicos radioactivos pueden detectarse directamente en un contador de radioactividad o bien indirectamente sobre una placa fotográfica (autorradiografía). Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adición de fosfato radioactivo (fósforo 32) durante su síntesis. Así, si se añade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando está teniendo lugar la síntesis de DNA, el nuevo DNA será radioactivo. 32P3- -------> 32P-nucleótido -------> 32P-ácido nucleico Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato. El enzima polinucleótido quinasa quita específicamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5' del DNA. 32P-P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP + 32P-O-desoxiribosa-DNA Esta técnica es extremadamente útil y rápida ya que permite el marcaje de moléculas de DNA ya preformadas. Se han desarrollado nuevos métodos de marcaje de ácidos nucleicos que usan compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden detectarse por autorradiografía). Algunos de estos métodos casi igualan al radioactivo en cuanto a sensibilidad teniendo la ventaja añadida de que no generan desechos radioactivos. 2.5.2.- DESNATURALIZACIÓN Las dos cadenas del DNA están unidas por puentes de H que pueden romperse por acción del calor sin afectar los enlaces covalentes que unen a los nucleótidos. Por lo tanto, las cadenas de un DNA bicatenario pueden separarse por calentamiento, proceso conocido como fusión. Se denomina Tm (melting temperature) a la temperatura a la que el 50% de las cadenas están disociadas). Esta Tm, está en función del contenido en GC del DNA en cuestión ya que los pares de bases GC se unen por 3 puentes de H2, mientras que AT sólo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor será la temperatura de fusión. Si el DNA calentado se enfría lentamente, la doble cadena vuelve a formarse (el DNA se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA procedentes de fuentes distintas. Las cadenas del DNA también pueden separarse a temperatura ambiente cambiando las condiciones iónicas del medio. Al no estar implicada la temperatura, el proceso se conoce como desnaturalización. Sin embargo, el resultado final es el mismo; si las condiciones iónicas vuelven a lo normal se restablece de nuevo la doble hélice. De nuevo, la temperatura o la concentración iónica del medio condicionan la reacción de renaturalización. 2.5.3.- HIBRIDACIÓN La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios y por complementariedad de bases. Cuando una solución de DNA que ha sido calentada se enfría lentamente se produce la rehibridación dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociación ocurre sólo si las secuencias de bases son complementarias. Por lo tanto, la hibridación permite la formación de complejos bicatenarios no naturales de DNA:DNA y DNA:RNA. Este es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). Por ejemplo, se puede utilizar una sonda radioactiva para saber si en una mezcla desconocida existe algún fragmento complementario a la sonda. Para ello se usan membranas de nitrato de celulosa. Primero se une al filtro el DNA monocatenario y es entonces cuando se añade la sonda. Cuando la sonda no se hibrida con el DNA problema es arrastrada en los lavados. La radioactividad que permanece unida al filtro se mide posteriormente. La hibridación puede incluso realizarse después de la electroforesis. Las moléculas de ácido nucleico se transfieren a las membranas bien por capilaridad o aplicando corriente eléctrica y es entonces cuando se añade la sonda. La figura muestra el uso de sondas de ácidos nucleicos para la búsqueda de secuencias complementarias en una mezcla compleja. Los fragmentos de DNA se separan por electroforesis y después se transfieren a una membrana. La sonda, que es radioactiva, se unirá al fragmento(s) con el que tenga complementariedad y se detectará por autorradiografía. Southern: Hibridación de una sonda de DNA sobre DNA unido a una membrana. Northern: Hibridación de una sonda de DNA sobre RNA unido a una membrana.

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Northern reverso: Hibridación de una sonda de “ARN marcado” sobre sondas de DNA. Western: Hibridación de un anticuerpo sobre proteína unida a una membrana. Far Western: Hibridación de una proteína sobre otra proteína unida a una membrana. 2.5.4.- HIBRIDACIÓN SOUTHERN Una sonda de ADN marcado (o ARN) se hibrida sobre ADN separado sobre electroforesis e inmovilizado en una membrana. El DNA fijado a la membrana puede ser genómico o puede ser de un vector digerido. Lo primero podemos usarlo para, por ejemplo, saber el número de copias de una secuencia en el genoma. Lo segundo para realizar un mapa de restricción de un plásmido. Como se ha comentado, la hibridación y desnaturalización dependen de la temperatura y de la concentración de sales, pero además, depende de otro factor, de la homología entre las cadenas, es decir, de cuantos nucleótidos complementarios presenten. Cuantos más, mas fuerte será la unión y más difícil de separar. Esto se puede aprovechar para controlar en una hibridación southern el % de similitud de la sonda con el DNA que queremos detectar. Modificaremos la temperatura y concentración salina de la hibridación y de los lavados para hacer la hibridación más o menos restrictiva. 2.5.5.- HIBRIDACIÓN NORTHERN El método es similar al Southern solo que en lugar de ADN digerido se corre en el gel ARN. De esta manera lo que se detecta es si el gen en concreto se esta transcribiendo o no. 2.5.6.- NORTHERN REVERSO En este caso lo que se fija al filtro es ADN pero no ADN genómico sino fragmentos de genes (sondas) y lo que se marca es ARN total que se copia a cDNA en presencia de nucleótidos marcados (ver más adelante RT-PCR). 2.5.7.- HIBRIDACIÓN WESTERN En este caso se emplean geles de acrilamida en los que se corren proteínas, que también se transfieren a una membrana. En este caso la hibridación se realiza con anticuerpos. 2.5.8.- HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS O CALVA S DE FAGOS Las bacterias o fagos se hacen crecer en una placa de petri, normalmente. Luego se transfieren a una membrana y las células o fagos se lisan, liberando el ADN, que luego se desnaturaliza. Tras esto se realiza la hibridación. 2.5.9.- SLOT AND DOT BLOTS El DNA o RNA no se separa por electroforesis antes de fijarlo a una membrana sino que una gota se deposita sobre la misma y luego se fija. 2.6.- SECUENCIACIÓN DEL ADN Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN, conocida como secuenciación de dicho ácido nucleico. El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi. Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos, dNTPs que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucleótido será imposible que se una otro nucleótido y la cadena terminará aquí. Abreviadamente, éste sería el método a seguir: Como la técnica se basa en la síntesis de ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita:

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• Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.

• Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena.

• desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. • didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación.

Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido. Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación del didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reacción de secuenciación se hace con un didesoxi de ADENINA , lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podrá continuarse la polimerización de nuevos nucleótidos, nos queda por tanto un pequeño fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN original, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva TIMINA. En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucleótidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situaciones tendremos TIMINA. Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto. Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí, dan la secuencia del ADN. Este método tiene la gran ventaja de poderse automatizar. El marcaje se realiza con fluorescencia y los geles se corren en aparatos que la detectan al mismo tiempo que se realiza la electroforesis.

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3.- LIBRERÍAS DE DNA 3.1.- CONCEPTO DE LIBRERÍA Una librería de DNA es una colección de clones de vectores que contienen fragmentos de DNA diseñada de tal manera que, mediante un determinado sistema de selección, se pueden llegar a separar los clones de interés. Así pues, una librería de ADN podría ser una colección de fagos que contienen una muestra representativa de fragmentos de un genoma (librería genómica) o una colección de bacterias que contienen plásmidos en los que se ha clonado una muestra significativa de los genes que se transcriben en un determinado tejido. Por tanto, para tener una librería deberemos tener: - Un sistema eficiente de clonaje de ADN, puesto que deberemos manejar un número considerable de

clones. - Un sistema de selección de los clones que nos interesan de entre toda la colección. - Un sistema para la obtención de una muestra representativa del ADN a estudiar. Según cual sea el propósito de nuestro estudio existen diversos tipos de librerías:

- Librerías genómicas: se elaboran a partir de ADN genómico de una especie que se digiere hasta un tamaño suficientemente pequeño para ser clonado en el vector de una manera mas o menos al azar. La detección se realiza mediante hibridación de sondas.

- Librerías de cromosomas específicos: como las anteriores pero a partir de ADN de determinados

cromosomas purificados. La detección se realiza mediante hibridación de sondas.

- Librerías de cDNA: se realizan a partir de mRNAs de un tejido particular. La detección se realiza mediante hibridación de sondas.

- Librerías de expresión: como el anterior pero el clonaje se realiza de tal manera que la bacteria es

capaz de transcribir y traducir la proteína codificada por el fragmento de ADN. La selección se realiza detectando la proteína en sí mediante anticuerpos, o bien alguna manifestación de su actividad.

3.2.- LIBRERÍAS GENÓMICAS Un problema típico de la Biología Molecular es que el investigador cuente con ADN de un gen en una determinada especie y desee aislar el mismo gen en otra especie. Una manera de hacerlo es mediante librerías genómicas. Las librerías genómicas requieren de un vector que permita el clonado de fragmentos relativamente grandes de ADN. Tradicionalmente se habían usado fagos, pero en la actualidad también se emplean BACs. Se aísla DNA genómico de la especie de interés y se realiza una digestión con un enzima de restricción adecuado de manera que genere fragmentos de tamaño medio adecuado para el vector seleccionado. Muchas veces se utilizan digestiones parciales. Esto además permite que los distintos clones puedan solaparse, permitiendo cubrir la totalidad del genoma. El DNA digerido se somete a electroforesis, se aíslan los fragmentos del tamaño adecuado, se ligan en el vector y se realiza su amplificación. De esta manera se generan colecciones de colonias de bacterias o de calvas de fagos cada una conteniendo un fragmento determinado del genoma. Para seleccionar el que nos interesa, dichas calvas o colonias se transfieren a una membrana sobre la que se extrae y desnaturaliza el ADN, que se fija a la misma. Dicha membrana se utiliza para hibridarla con la sonda del gen conocido. Si una secuencia suficientemente similar se encuentra en algún lugar de la membrana se producirá una hibridación que podrá ser detectada mediante autorradiografia, por ejemplo si se trata de sondas marcadas con radioactividad. Se denomina cribado (screening) al proceso de selección de un clon que nos interesa de todos los que forman una liberia. 3.3.- LIBRERÍAS DE cDNA Uno de los problemas que tienen las librerías genómicas es que debido al gran tamaño de los genomas es necesario un muy elevado número de clones para cubrirlas en su totalidad. Por otra parte, los genes contienen intrones que, muchas veces, pueden no interesarnos, y que complican el aislamiento de la región codificante. Estos problemas podrían resolverse si fuéramos capaces de clonar mRNAs. Seleccionaríamos un tejido en que la

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expresión de nuestro gen fuera elevada y construiríamos una librería con ellos. Este es el principio en que se basan las librerías de cDNA. La construcción de una librería de cDNA comienza con la extracción de mRNA de un determinado tejido u órgano. Este RNA se copia a DNA de cadena simple mediante la acción de la Transcriptasa Reversa. EL híbrido DNA-RNA es tratado con RNAsaH, que degrada el RNA, y finalmente se realiza la síntesis de la segunda cadena de DNA. De esta manera se obtienen colecciones de fragmentos de ADN complementarios a los mRNAs de un tejido (cDNA). Estos fragmentos se introducen en un plásmido (lo más usual) y se transforman bacterias. Se genera así una colección de clones que forman una librería que puede seleccionarse por hibridación, como en el caso de las librerías genómicas, o por otros métodos. 3.4.- LIBRERÍAS DE EXPRESIÓN Dado que en el caso de los cDNA los fragmentos corresponden a DNAs codificantes, se han diseñado estrategias en las que la selección no se realiza por hibridación sino mediante la producción de proteínas codificadas por el plásmido. En estos casos los vectores se diseñan de tal manera que el cDNA posee una región promotora procariota en 5’ que dirige la síntesis de mRNA que, si la pauta de lectura lo permite, será traducido a proteína. Así, en principio, las colonias de bacteria (levadura, células de insecto…) producirían la proteína codificada por cada cDNA. El cribado en estos casos puede realizarse mediante anticuerpos. Otra posibilidad es que el cribado se base en algún ensayo biológico. En estos casos se habla de librerías de expresión. 3.5.- CRIBADO DIFERENCIAL Sirve para comparar patrones de expresión en tejidos diferentes o en el mismo tejido en condiciones diferentes. 3.6.- LIBRERÍAS DE SUSTRACCIÓN En ocasiones no nos interesará tener una librería completa de cDNAs sino que preferiremos que solo contenga ciertos cDNAs y no otros. Una librería de sustracción es aquella que contiene cDNAs correspondientes a mRNAs presentes en un tejido pero no en otro. Por lo tanto, necesitamos un paso en el que se eliminen los mRNAs presentes en ambos tejidos. Se preparan librerías de cDNA de ambos tejidos. Se prepara un pool de DNA de cada librería y la del dador se digiere con un enzima que libere los insertos (EcoRI, por ejemplo) y la sustraída se digiere con AluI o RsaI, generando fragmentos cortos. Se mezclan ambas poniendo la segunda en un exceso de 50 veces. Se calienta y se dejan renaturalizar lentamente. Los fragmentos resultantes se clonan en un plásmido en la diana EcoRI. 3.7.- NORMALIZACIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNA Se calcula que una célula puede estar transcribiendo más de 10.000 genes al mismo tiempo y que la abundancia de los mensajeros puede variar del orden de 1 a 200.000 copias de mRNA por célula. Por regla general, se supone que en un momento dado en una célula habrán unos 10 a 20 genes que se transcribenm mucho, unos cientos que se transcriben de manera moderada y unos miles que se transcriben poco o muy poco. En esta situación, si quisieramos tener al menos un clon de cada gen, el número total de clones a analizar debería ser de cientos de miles. Por eso es interesante que las librerias sean normalizadas, es decir, que se haya reducido su redundancia. El método más usado para ello está basado en las propiedades de reasociación de las moléculas de ADN de doble cadena. Básicamente, aquellas moléculas más abundantes hibridaran antes que las menos abundantes. Si una muestra de ADN de doble cadena es desnaturalizado (cDNAs por ejemplo) y se deja renaturalizar en las condiciones adecuadas limitantes, solo las moléculas más abundantes habrán podido encontrar “pareja”. Los cDNAs correspondientes a genes poco abundantes quedarán como cadenas simples. Si esta muestra la digerimos con una DNAsa que solo reconozca DNA de doble cadena, digeriremos los cDNAs de genes abundantes, reduciendo su representación, y aumentando, por tanto, la de los genes poco expresados. Se inactiva la DNAsa y se realiza un nuevo ciclo de PCR para completar las dobles cadenas.

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4.- PCR 4.1.- CONCEPTO DE PCR La PCR se basa en el uso de DNA polimerasas. Como ya se ha comentado este enzima es capaz de convertir una molécula de DNA de cadena doble en dos moléculas idénticas de doble cadena también. Para ello necesita que el DNA se desnaturalice, unos oligonucleótidos que actúen como iniciadores y los nucleótidos precursores. Si se coloca todo esto en un tubo en las condiciones adecuadas, la reacción tiene lugar. ¿Cuál es entonces la innovación de la PCR? 1.- El empleo de oligos específicos. El oligonucleótido iniciador se une al DNA a copiar por apareamiento de bases. Si el oligo se diseña con una secuencia específica, la parte del DNA que copiará la polimerasa será la que se encuentre después de esa secuencia. Si se diseñan dos de estos oligos a ambos extremos de la secuencia que nos interesa, y que hibriden en las cadenas contrarias, la polimerasa amplificara específicamente la zona entre ambos lugares de hibridación. 2.- Si lo anterior se repite cíclicamente, lo que tendremos es una amplificación espefícica y exponencial del fragmento de ADN situado entre ambos iniciadores. Así pues, una reacción típica de PCR consistiría en lo siguiente: Se mezclan en un tubo DNA, oligos, dNTPs y la polimerasa con la combinación de sales adecuada, y se somete a los siguientes ciclos de temperatura: 1.- Desnaturalización: unos 94ºC. El DNA se desnaturaliza. 2.- Anillado: la temperatura se reduce a, por ejemplo 55ºC. Los oligos se unen al DNA en los lugares específicos. 3.- Extensión: típicamente a 72ºC, que es la temperatura óptima de la Taq polimerasa,. Se produce la síntesis del ADN. Estos tres ciclos se repiten unas 30 veces. En cada ciclo una molécula de ADN se convierte en otras dos, únicamente en el fragmento entre los dos oligos.

Gracias al gran poder de amplificación, el uso de la PCR permite obtener cantidades manejables de DNA (teóricamente tanto como queramos) a partir de, en caso extremo, una única molécula de ADN inicial. Problema: la polimerasa más utilizada hasta el desarrollo de la PCR era la DNA polimerasa I. Este enzima se inactiva a temperaturas altas, por lo que si se empleara para la PCR habría que adicionar enzima en cada ciclo, lo cual sería económicamente inviable. El éxito de la PCR se debe en parte al descubrimiento de determinadas polimerasas capaces de aguantar las altas temperaturas. La primera fue la Taq polimerasa, pero actualmente se conocen otras. 4.2.- APLICACIONES DE LA PCR 4.2.1.- AISLAMIENTO DE GENES La PCR puede sustituir en algunos casos al cribado de librerías. El factor limitante es que precisa de secuencias conocidas para diseñar oligonucleótidos. Si lo que queremos, por ejemplo, es ampliar un gen de una especie que ya se conoce en otra, podemos intentar diseñar unos oligos en las zonas más conservadas del gen conocido, y utilizarlos en una PCR con el DNA de la especie nueva.

4.2.2.- SECUENCIACIÓN

Una de las razones más comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho más sencillo y rápido que la clonación en células. Por otro lado, la propia reacción de secuenciación puede realizarse mediante una modificación de la reacción de la PCR en la que se usa un único oligo.

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4.2.3.- RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

Es un método que permite amplificar gran cantidad de un fragmento de ADN a partir de un mensajero o cualquier otro RNA. Se compone de dos ciclos: 1- Transcripción reversa: la RT genera una cadena de DNA simple complementaria a los RNAs presentes en la muestra. 2.- PCR: el uso de iniciadores específicos que amplifican por PCR un fragmento a partir del DNA de cadena simple anterior. El RNA puede obtenerse por cualquiera de los métodos conocidos. La RT también necesita, como las DNA polimerasas, de un oligo iniciador. Este puede ser específico o inespecífico, como poliT o una mezcla más o menos al azar. 4.2.4.- REAL TIME QUANTITATIVE PCR Uno de los problemas de la RT-PCR respecto a, por ejemplo el Northern, es que no es cuantitativo, es decir, no refleja fielmente el grado de expresión de los genes, por lo que no permite comparar muestras. Existen métodos para hacer la RT-PCR más cuantitativa. Uno de ellos es la PCR competitiva, que consiste en añadir cantidades conocidas de sonda a la muestra o realizar una doble PCR con un gen de interés y otro de expresión constitutiva. Sin embargo, no siempre resulta fácil hacer estas comparaciones. Un método más preciso, pero también más sofisticado es el de la Real Time Quantitative PCR. Este método se basa en la detección de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto de PCR producido. El método se basa en el uso de tres iniciadores. Dos de ellos corresponderán a los normales de una reacción de PCR. El tercero hibridaría entre los dos anteriores y contiene dos nucleótidos modificados. En 5’ se le añade un fluorocromo (normalmente 6-carboxyfluoresceina 6-FAM) y en cualquier T del iniciador se le añade 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA). El 6-FAM emite fluorescencia detectable por un sensor adecuado, pero cuando una molécula de TAMRA esta cerca dicha fluorescencia es inhibida. Por tanto, el iniciador no emite fluorescencia. Sin embargo, cuando la Taq polimerasa realiza la copia y llega al primer, su actividad exonucleasa lo degrada, separando el 6-FAM del inhibidor y produciendo fluorescencia, que resultará proporcional a la cantidad de producto generado. Dicha fluorescencia puede ser medida en cada ciclo en un aparato adecuado, y si se emplean los controles adecuados, esto permite comparar muestras. 4.2.5.- PCR INVERSA Sirve para amplificar las regiones flanqueantes a una conocida. Se basa en el corte y ligación para generar moléculas circulares, que luego se amplifican por PCR normal.

4.2.6.- GENOME WALKING Es un método basado en la PCR que permite amplificar regiones de genoma contiguas a una de secuencia conocida. Se basa en la digestión al ADN genómico con un enzima de restricción de extremos cohesivos y la posterior ligación de un adaptador a los extremos de manera que la secuencia ese adaptador sirva de iniciador de una posterior PCR, junto con iniciadores específicos de la región conocida. 4.2.7.- RACE PCR Es un método basado en la PCR que permite completar la secuencia de un cDNA. 4.2.8.- DIFFERENTIAL DISPLAY Es un método basado en la RT-PCR para detectar genes que se expresan especialmente más o menos en un tejido respecto a otro.

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4.2.9.- PCR-SELECT cDNA SUBTRACTION Suppression subtractive hybridization (SSH) Es un método que permite seleccionar mRNAs que son más abundantes en una muestra que en otra. Para ello se utiliza el RNA muestra y el RNA control. Se sintetizan cDNAs de ambos. En el caso de la muestra se realiza por duplicado y utilizando inciadores diferentes en cada caso. El control se sintetiza sin iniciadores o con unos distintos. Se mezclan cDNAs control y muestra, las dos réplicas por separado, poniendo el control en mucha mayor abundancia. Se desanaturalizan y se dejan reasociar. Podremos tener homodimeros, heterodimeros o cadenas simples. El segundo paso consiste en mezclar las dos hibridaciones y dejar que hibriden de nuevo. Las cadenas simples se reasociaran. Aquellas que tengan los dos inciadores diferentes, uno a cada extremo, solo podran provernir de esta hibridación y son, básicamente, los mRNAs que buscamos. Se les añaden adaptadores para completar las cadenas y se realiza una PCR. Los inciadores estan diseñados de tal manera a que a una temperatura determinada de anillamiento los iniciadores se hibridan consigo mismos e impiden la acción de la PCR. De tal manera, solo los cDNAs mixtos se amplificarán exponencialmente, mientras que las moléculas con un solo iniciadorlo harían linealmente. Finbalmente se clonan en plásmidos.

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5.- GENÓMICA FUNCIONAL 5.1.- PROYECTOS GENOMA La secuenciación de un genoma completo obviamente permite descubrir la secuencia de todos los genes. Sin embargo, el trabajo no es tan sencillo. Por una lado, a partir de la secuencia cruda hay que identificar los genes, cosa que no siempre es obvia. En segundo lugar, una vez identificados los genes hay que conocer como se regulan y para que sirven. Por tanto, si bien la obtención del genoma completo es de grandísima ayuda, no lo es todo. 5.2.- PROYECTOS DE SECUENCIACIÓN DE ESTs Un EST (Expressed Sequence Tag) no es más que una secuencia parcial de un cDNA clonado. Por lo tanto, un proyecto de secuenciación de ESTs consistirá en la obtención de un número elevado de secuencias parciales a partir de una colección de cDNAs clonados, o sea, a partir de una librería de cDNAs. Como a librería de cDNAs, los ESTs serán una representación de los genes que se están transcribiendo en un tejido, en un momento determinado en una especie concreta. Particularidades:

- Normalmente se secuencian una sola vez, por lo que no son secuencias 100 % libres de errores. - Son redundantes, es decir, aquellos genes que más se transcriben son los que más secuencias

presentan. (existen métodos para reducir la redundancia). ¿Para que sirven?

- Saber que genes se transcriben en un determinado momento - Saber si nuestro gen se transcribe en un tejido. - Descubrir genes o confirmar posibles genes descubiertos en un proyecto genoma. - Confirmar los límites de un gen y sus intrones. - Secuenciar genes (en especies donde no se tiene el genoma completo)

Particularidad: Hemos visto que las librerías de cDNA se realizan a partir de cDNA sintetizado usando poliT como iniciador de la transcriptasa reversa. Esto no siempre tiene que ser así. Por ejemplo, si nos interesa un gen en concreto podemos usar un iniciador específico de ese gen. También podemos usar iniciadores al azar, o más o menos al azar. Esto quiere decir que no siempre los ESTs han de representar las secuencias de los extremos del RNA. Además, la transcriptasa reversa puede no copiar completamente el mRNA con lo que las secuencias 5’ no siempre corresponden al extremo del mensajero. Esto, que en otras circunstancias puede ser malo, en el caso de los ESTs no necesariamente ya que nos permite tener secuencias parciales a lo largo de todo el gen, con lo que se pueden solapar y obtener una secuencia mucho más completa del mismo. 5.3.- MICROCHIPS DE DNA La técnica de microchips (o microarrays) de DNA es un método que lo que pretende es identificar genes que se transcriben más o menos en una determinada circunstancia respecto a otra. Por ejemplo, todos los genes de hoja de arroz que se inducen por calor. Por lo tanto, en sus objetivos no es diferente a, por ejemplo, un northern, un differential display o una librería de sustracción. La diferencia radica en que en el caso de microchips el número de genes que se estudia en un solo experimento es muchísimo mayor (potencialmente, se pueden estudiar todos los genes). La técnica de los microchips está basada en la existencia de bancos de ESTs. Si uno secuencia el número suficiente de cDNAs en un número suficiente de tejidos podría, en teoría, aislar DNA de cada uno de los genes de un organismo, DNAs que podrían usarse como sondas. Si uno pudiera inmovilizar estas miles de sondas sobre un filtro podría marcar mRNA mediante transcriptasa reversa y nucleótidos marcados, e hibridar esas sondas, apareciendo cuales y cuanto se transcriben en ese tejido concreto. Esta es la base del microchip solo que:

- Las sondas no se fijan sobre una membrana sino sobre un vidrio - Las cantidades de sonda utilizadas son mínimas para reducir el espacio - Los mRNAs se marcan con fluorescencia - Se realizan dos hibridaciones simultáneas con RNAs marcados con distinta fluorescencia, esto

permite comparar la expresión de los genes en dos condiciones diferentes.

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Los microordenamientos (microarrays) son soportes sólidos sobre los que se han fijado pequeñas cantidades de ADN cuya secuencia es específica para un gen distinto de modo que cada punto en el microordenamiento corresponde a un gen determinado. La información genética es copiada en el núcleo celular en forma de ARN mensajero (ARNm) y transferida luego a los ribosomas, partículas citoplásmicas en las que tiene lugar la síntesis de proteínas. Para establecer qué genes se “encienden” (es decir inician o aceleran la síntesis de la proteína que codifican) ante cierta respuesta biológica o situación metabólica, los microordenamientos de ADN se hibridan (esto es, se aparean a través de bases complementarias) en forma simultánea con dos colecciones de ARNm obtenidas del mismo organismo, una en ausencia y otra en presencia del estímulo. Estas dos poblaciones de ARNm están unidas a dos sustancias fluorescentes distintas (fluoróforos). El ARNm hibridado (cuya secuencia es complementaria a la secuencia de los genes) se visualiza bajo un microscopio por su emisión fluorescente. De acuerdo con las relaciones entre los dos tipos de emisión fluorescente, puede determinarse si un determinado ARNm se ha transcripto más o menos o si el nivel de su transcripción no se ha modificado. Ello permite establecer qué genes están involucrados en cada situación experimental. En la figura se muestra un microordenamiento conteniendo las secuencias de 11.500 genes que ha sido hibridado con poblaciones de ARNm de plantas de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y después (fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas señalan a los genes que se han expresado en respuesta al patógeno. Un punto rojo (flechas) significa “expresión incrementada”, un punto amarillo “igual expresión”, uno verde “expresión disminuida” y uno negro “ausencia de expresión”. La imagen muestra que unos setenta genes han variado su nivel de expresión luego del ataque del patógeno. Esta información será usada luego para comprender los mecanismos de defensa involucrados. El análisis se realiza mediante computadoras que identifican los genes candidatos y proveen toda la información disponible sobre los mismos. El microordenamiento ha sido impreso en vidrio cuyo tamaño real es de 22 x 40mm. El inserto muestra una ampliación de tres bloques del microordenamiento conteniendo 360 genes cada uno. Existen variaciones de este método. Por ejemplo, en lugar de usar soportes de vidrio se pueden usar soportes de nylon e hibridarlos con sonds marcadas radioactivamente. La ventaja es el precio, pero la desventaja es que no permiten dobles marcajes y que los puntos no pueden ser tan pequeños, por lo que se precisa mayor espacio para estudiar el mismo número de genes. Otra variación del método consiste en que en lugar de fijar ADN en el vidrio, se utilizan oligos, es decir, pequeñas cadenas de ADN, que se sintetizan en el mismo porta y cuya secuencia puede ser diseñada a gusto del consumidor.

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6.- GENÉTICA REVERSA 6.1.- COLECCIONES DE MUTANTES Hasta ahora los métodos explicados de descubrimiento de genes se basan en primero encontrar el gen y luego demostrar su función. Una alternativa a este sistema consiste en lo contrario, primero ver una función y después clonar el gen. Es lo que se conoce como genética reversa. Existen varios tipos de genética reversa. Por ejemplo, cuando las librerías de expresión se criban buscando actividad de proteínas en realidad podría considerarse como tal. Sin embargo cuando hablamos de plantas normalmente entendemos por genética reversa la generación de gran número de mutantes de los que seleccionaremos aquellos cuyo fenotipo sea de nuestro interés. Una vez seleccionado, iremos a buscar el gen que produce la mutación. Existen varias maneras de generar mutantes, por ejemplo, mediante radiaciones ionizantes, ultravioleta, EMS o inserción de transposones o T-DNA, etc. Los sistemas de mutagénesis química (EMS) o física (radiaciones) son más sencillos, pero generan mutaciones puntuales, y la única manera de encontrar el gen mutado es mediante mapeo y paseo cromosómico. Además, dichas mutaciones no pueden ser revertidas. La inserción de transposones y T-DNA tienen la ventaja de que la propia secuencia del elemento puede ayudarnos a localizar el gen mutado. En el caso de los transposones, estos además, en determinadas circunstancias, pueden escindirse y revertir la mutación, lo cual es una prueba concluyente de la relación mutación / fenotipo. El uso de transposones para identificar genes se denomina transposón tagging, y el uso de elementos de inserción en general se denomina gene tagging. 6.1.1.- CRIBADO DE LIBRERÍAS DE MUTANTES Una manera de recabar información sobre la función de un determinado gen es ver que pasa cuando se inactiva, es decir, mutarlo. No existe una manera sencilla de mutar un gen de una planta pero si que se han desarrollado métodos que permiten seleccionar mutantes de genes determinados a partir de colecciones de líneas mutadas. Para ello primero se genera un número suficiente de líneas de inserción (con transposones o T-DNAs insertos), en principio, al azar por todo el genoma. A partir de aquí se pueden realizar dos estrategias: Cribado por PCR Se extrae DNA genómico de cada una de las líneas y se emplea para una reacción de PCR en la que uno de los iniciadores es del gen que nos interesa y el segundo corresponde al transposon o T-DNA. Para reducir el número de reacciones se pueden hacer “pools” de DNAs. De esta manera únicamente aquellas plantas que tengan la inserción cerca del lugar de anillado del primer específico generarán una banda. A partir de aquí se puede identificar de que planta original proviene la banda y generar mutantes de nuestro gen. Transposon insertion site sequencing En este caso también se extrae DNA de cada línea, pero no se generan pools sino que se secuencia de cada línea el fragmento de DNA junto al lugar de inserción. Con estas secuencias se genera un banco. Si nos interesa encontrar un mutante de nuestro gen solo tenemos que comparar la secuencia del mismo con el del banco. Si tal mutante existe, encontraremos una secuencia 100% (o casi) homóloga a nuestro gen y podremos recuperar la planta de la cual proviene. 6.2.- “TRANSPOSON TAGGING” 6.2.1.- CONCEPTO DE ELEMENTO TRANSPONIBLE Los elementos transponibles o transposones son fragmentos de ADN que tienen la capacidad de moverse de un lugar a otro del genoma. Si cuando se insertan lo hacen dentro de un gen, pueden producir mutaciones en el mismo. Los transposones codifican una proteína denominada transposasa que es la responsable del “salto”. La transposasa reconoce los extremos de la secuencia del transposón (que son muy conservados), escinde el elemento y lo inserta en otro lugar del genoma. Los transposones se presentan en un número elevado de copias

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en los genomas, pero no todos están en forma activa. Algunos pueden haber perdido la transposasa. Sin embargo, aun sin transposasa, si conservan los extremos, pueden saltar, si alguna otra copia es capaz de sintetizar transposasa. 6.2.2.- TRANSPOSON TAGGING Se han clonado y secuenciado numerosos elementos transponibles. Dado que el único requerimiento para el “salto” es que los extremos estén conservados, se puede sustituir el interior por cualquier secuencia o gen que nos interese. Por ejemplo, si queremos trabajar en maíz podemos modificar un transposón de maíz introduciéndole una secuencia que no esté presente en su genoma. Este transposón modificado se introduce en el maíz junto con una gen artificial que contiene la transposasa bajo el control de un promotor, de manera que la podamos activar a voluntad. Cuando transposasa y transposon modificado están juntos, el transposón saltará a nuevos locus, algunos de los cuales pueden producir mutaciones. Una vez seleccionada la mutación, podremos encontrar el gen responsable empleando como sonda la secuencia que no se encuentra en el maíz, bien elaborando una librería y por cribado, bien por PCR inversa, por ejemplo. Una modificación del transposón tagging es que en lugar de un transposón modificado se use un T-DNA que se introduzca en la planta mediante infección con Agrobacterium. Ambos sistemas tienen ventajas y desventajas. En general, la introducción de T-DNAs en las plantas es más sencillo y además, se integran en mayor número de copias, con lo cual es mas probable que generen una mutación. Esto, que por un lado es una ventaja, también puede ser una desventaja puesto que si hay más copias, luego es mas complicado identificar cual de ellas es responsable de la mutación. Pero por otro lado, los transposones tienen otras ventajas. Los transposones suelen insertarse como copias simples mientras que los T-DNA a menudo generan reordenamientos o se integran en tandems. Además, los transposones pueden escindirse mientras que los T-DNAs quedan permanentemente en el lugar donde se han insertado. 6.2.3- ENHANCER Y GENE TRAP Ambas son modificaciones del sistema de transposon tagging mediante las cuales no se pretende detectar fenotipos mutantes sino que lo que se busca es detectar promotores, o elementos de un promotor que se activen en tejidos determinados o bajo determinadas circunstancias. Los transposones (o T-DNA) son modificados convenientemente para producir la actividad de un gen reportero en el caso de que el elemento se inserte dentro o cerca de un promotor. Al igual que el anterior, el elemento modificado se introduce en el genoma, se moviliza, y se generan colecciones de líneas las cuales son examinadas en este caso buscando actividad del gen reportero. Diferencias respecto al transposon tagging:

- Puede detectar genes que si se mutan son letales. - Puede detectar genes de función redundante.

Tipos de construcciones empleadas en Transposon tagging Elemento donador de transposasa No contiene ningún gen marcador, solo produce mutación por su propia inserción. Enhancer trap reporter genes Contienen un promotor mínimo que solo se expresa en el caso de que el elemento se inserte tras elementos cis de un promotor. Promotor trap Solo contiene el gen reportero por lo que únicamente se activa cuando se inserta detrás de un promotor completo. Exon trap Semejante al anterior pero el gen reportero contiene aceptores de splicing al inicio, de manera que si se inserta dentro de un gen puede generar proteínas de fusión con el gen reportero. Genes reporteros habituales en plantas son; β-glucuronidase (GUS) Green fluorescent protein (GFP)

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Las construcciones llevan además genes que permiten seleccionar aquellas líneas que contienen transposones. Por ejemplo, en el caso anterior, el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPTII) que confiere resistencia a la kanamicina. 6.3.- TARGETING INDUCED LOCAL LESIONS IN GENOMES (T ILLING) Es un sistema para generar y aislar mutantes en genes determinados que se basa en el uso de la mutagénesis química. El sistema del TILLING funciona de la siguiente manera:

1- Se somete a una línea a mutagénesis con EMS. 2- Se regenera un número suficiente de líneas para cubrir el número de mutantes en todo el genoma que

nos interese. 3- Se extrae DNA genómico de cada línea. 4- Se diseñan iniciadores alrededor de la zona que nos interesa obtener mutantes (1 kb de distancia) 5- Los DNAs se agrupan en pools de 8 a 12 y se realiza la PCR. 6- Los fragmentos obtenidos se desnaturalizan al calor y se dejan renaturalizar de nuevo.. Pueden ocurrir

dos cosas: a. Si no hay mutación en ninguna línea todas las moléculas se reasociarán 100% b. Si hay alguna mutación se producirán moléculas híbridas en las que al menos un par de bases

no quedarán apareados. 7- Un análisis por HPLC permite distinguir ambos casos y seleccionar las líneas que contienen

mutaciones en nuestro gen. 8- Se secuencia el producto de PCR y se determina la mutación.

El uso de la mutagénesis química tiene ventajas y desventajas respecto a los sistemas de inserción: Ventajas:

- No requiere el uso de plantas transgénicas - Es más sencillo. - La dosis es más regulable. - Genera una colección de mutantes del mismo gen - Genera mutaciones irreversibles - Aplicable a cualquier gen o secuencia - Aplicable a cualquier planta - Permite la automatización

Desventajas: Genera múltiples mutaciones por lo que el proceso de asociar mutación con fenotipo es más complejo. Una mejora del método consiste en el uso de la endonucleasa Cel I. Este enzima corta una de las cadenas de ADN cuando hay un desapareamiento. Si la PCR se realiza con un iniciador marcado esto nos permitiría localizar el punto de la mutación sin necesidad de secuenciar. Además, como la mutagénesis por EMS produce casi siempre transiciones, es decir cambios C/G a T/A, conociendo la localización y la secuencia original, se puede deducir la secuencia mutada.