Cultivos CelularesMtodos y Tcnicas de Estudio en Biologa Celular

Objetivos-Equipo bsico de un laboratorio de cultivo celular-Cultivos primarios y lneas estables-Preparacin del medio de cultivo-Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad-Rutina en el mantenimiento de la lnea celular estable-Congelacin y almacenamiento de las lneas celularesPuntos que deben ser asimilados

Equipo Bsico de un laboratorio de Cultivo CelularCampana de flujo laminarBao termostatizadoIncubador CO2Autoclave5. Nevera y Congelador6. Microscopio Invertido7. Micro centrifuga8. Depsito de Nitrgeno lquido

AutoclaveCualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada

Tanque de Nitrgeno lquidoCongelacin de lneas estables

Campana de Flujo LaminarEsterilidad!! (no evita contaminacin un mal uso)

Incubador CO2Atmsfera controlada con elevada humedad y tensin de CO2

Micro CentrifugaSuspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos)

Microscopio InvertidoSeguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicacin, contaminacin.Control sobre cambios morfolgicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

Botellas y Placas de Cultivo

Puntos ImportantesEsterilidadAsepsiaHbito de trabajo

Cultivos Primarios(El principio de la historia.....) A- Aislamiento del tejido B- Diseccin/disgregacin C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario) Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor.

Preparacin cultivos

Cultivos secundarios y lneas estables

Si uno o varios tipos de clulas de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario.La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinar qu clulas se desarrollarn.Las lneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y seleccin de cultivos secundarios. Tambin se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.

Seleccin de la lnea estable

Lneas celulares establesControl del entorno celular

Homogeneidad celular

Conocimiento del tipo celular

Economa

VentajasDesventajasFalta de diferenciacin

Inestabilidad de la lnea (mutaciones DNA)

Medios de Cultivo: Medios BaseMedios base: Eagles Basal Medium, Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), RPMI1640, etc.Contienen: Hidratos de Carbono, cidos grasos esenciales y otros lpidos, aminocidos, sales minerales, oligoelementos.

*Cada lnea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio

Medios de Cultivo: AditivosAntibiticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos)Tampn pH: Hepes, bicarbonato, etc.Indicador pH.Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%).Aditivos especficos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.

Tamponadores de pHHepes Buffer tamponador que acta de manera muy eficiente en el rango 7,2-7,6

*Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del pH

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-

* Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)

Propiedades fsico-qumicos del MedioCO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-]pH.............................................................(7.0-7.7)Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/KgViscosidad................................................ Suero Temperatura............................................. 37C (mamfero)(aves: 38,5C; epitelio de ratn: 33C; insectos: 28C)

Test de medio completo con sueroPreviamente a la realizacin de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles.

Posible ContaminacinNiveles de Proliferacin Celular (eficiencia)

Eleccin del medio de cultivo adecuado a cada lnea celularSe deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la eleccin del medio ms adecuado a las caractersticas de nuestra lnea.

Las pruebas consisten en la realizacin de diferentes curvas de crecimiento

Conceptos bsicos en el mantenimiento de una lnea estableSubcultivoConfluenciaTiempo de duplicacinCriogenizacinCiclo celular: Fases G1,S,G2,M y G0

Qu son y cmo se realizan los subcultivos?Objetivos: Propagacin de la lnea celularProduccin de clulas para la experimentacin

Usualmente se realizan al llegar a confluencia.

Evitar que el medio de cultivo est agotado.

Curva de Crecimiento (lneas estables): Fases del cultivoFase de latencia (perodo lag). Fijacin al sustrato e inicio del ciclo celular.Fase de crecimiento exponencial. El nmero de clulas se duplica aproximadamente cada 24 horas.Fase de confluencia. Las clulas del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibicin por contacto; suspensin: consumo del medio).Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las clulas entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las clulas en cultivo.

Subcultivos Celulares

Protocolo Subcultivo Depende de las caractersticas de la lnea celular con la que se esta trabajando.

Clulas en suspensin

Clulas adheridas al substrato

Clulas Adheridas Para realizar el subcultivo de clulas adheridas se debe proceder al levantamiento de las mismas:

Tripsinizacin.

Levantamiento Mecnico (raspado).

En clulas en suspensin es suficiente con realizar una dilucin en medio nuevo (o bien adicin de medio tras centrifugacin).

La Fase ExperimentalObjetivos: Investigacin de un fenmeno biolgicoEstudio de las bases moleculares de una patologaInvestigacin de los mecanismos empleados por los frmacosEstudio de la toxicidad de determinados compuestosInvestigacin de la estructura y funcin de macromolculas y orgnulos celulares

La Fase ExperimentalPlanteamiento:

Se cultivan en frascos separados las clulas control y las clulas problema. Se adiciona un compuesto o se cambian las condiciones experimentales del frasco problema y se mantiene la incubacin durante un tiempo (minutos a das). Finalmente se determinan las diferencias entre las clulas tratadas (problema) y las no tratadas (control).En determinadas ocasiones no se realiza un tratamiento en paralelo de clulas en diferentes frascos, sino un tratamiento secuencial de las clulas control (antes y despus de ciertas condiciones).

La Fase ExperimentalInvestigacin:

Es la fase en la que utilizando una tcnica experimental determinamos algn fenmeno celular. Podemos estudiar el efecto de una hormona sobre la localizacin de protenas celulares mediante microscopia confocal (clulas vivas), podemos determinar mediante RT-PCR o western blot la expresin de un determinado gen o hacer un estudio completo de la expresin gnica mediante protemica y/o genmica (clulas muertas).

La Fase ExperimentalTransfeccin: Introduccin de DNA externo con un vector de expresin.TIPOS: Transitoria o estable.MTODOS: ElectroporacinFosfato clcicoLipofeccinMicroinyeccin