cultivo hiperintensivo de camarón blanco litopenaeus

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

UNIDAD SINALOA

“Cultivo hiperintensivo de camarón blanco (Litopenaeus vannamei), con cero recambio de agua, utilizando Bacillus licheniformis BCR 4-3 y

melaza”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRIA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

JOSÉ ÁVILA LEAL

GUASAVE, SINALOA, MEXICO; DICIEMBRE DE 2014

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Acuacultura del Centro

Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR),

Unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue

apoyado económicamente a través del Proyecto SIP multidisciplinario (con

número de registro 20130852). El alumno José Ávila Leal fue apoyado con una

beca CONACYT con clave CVU 482585.

El autor agradece el apoyo económico brindado por el Instituto Politécnico

Nacional como becario del programa de Beca de Estímulo Institucional de

Formación de Investigadores (BEIFI).

DEDICATORIA

A mis padres, José Ávila Hernández y Julia Leal Espinoza, por haberme dado la vida. A mi esposa Paola y mi hijo José Manuel, quienes son mi razón de vivir. A mis hermanos Verónica, Juan Carlos, José Fernando, Ana, Liliana y Dulce quienes han sido parte importante de mi vida. A todos y cada uno de los que me apoyaron en la realización de este trabajo.

AGRADECIMIENTOS

Primeramente agradecerle a Dios por darme la oportunidad de concluir esta meta. A mi esposa y mi hijo por darme su amor y apoyo incondicional en esta nueva etapa que elegimos juntos, los amo mucho. A mis padres y hermanos por todo su apoyo que me brindaron para que pudiera culminar. A los suegros Urbano y Martha que también fueron pieza importante de este logro. A mis directores de tesis el Dr. Antonio Luna González y el M. en C. Jesús Arturo Fierro Coronado, por la oportunidad que me brindaron de trabajar bajo su dirección. Por su valiosa guía, por su constante y paciente seguimiento compartiendo su tiempo y conocimiento de manera generosa durante el desarrollo del presente trabajo. A mi comité tutorial, formado por el Dr. Héctor Abelardo González Ocampo, el Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza y el Dr. Píndaro Álvarez Ruiz, por sus sabios consejos y sus atinados comentarios, críticas y sugerencias durante la realización de esta investigación. A la Dra. Ruth Escamilla Montes y a la M. en C. Ana Claudia Sánchez Ortiz, por su valiosa colaboración y paciencia al poner a mi disposición sus conocimientos y apoyarme en el laboratorio. A la Biol. Ely Sara López Álvarez y todo el equipo de técnicos que participaron de alguna manera. A todo el personal administrativo por su gran apoyo, Dorín, Faviola, Toño, Nereyda, Ricardo y Celestino. A todos mis amigos y compañeros, Teo, Tomás, Arturo Rubio, Carmen, Viridiana, Carina, Saraí, Blanca, Socko, Pati, Gaby, Anayeli, Violeta, por su amistad y por ese gran equipo que formamos. A Arturo León, Ismael, Toñita, Vanesa, Hiroshima y toda mi generación, quienes hicieron que este proyecto de vida fuera realidad. Con absoluta sinceridad, mi agradecimiento a todos y cada uno de los que mencioné y a todos aquellos que de momento se me escapan, ya que con su aporte hicieron posible este trabajo.

¡Muchas gracias!

I

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL .............................................................................................. I

ABREVIATURAS ............................................................................................... V

GLOSARIO ...................................................................................................... VII

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................ X

ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................... XI

RESUMEN ....................................................................................................... XII

ABSTRACT ..................................................................................................... XIV

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1

1.1. Los biorremediadores como agentes controladores de

enfermedades .............................................................................................. 2

1.2. Biorremediación del detritus orgánico ................................................... 2

1.3. Biorremediación de los compuestos nitrogenados ................................ 3

1.4. Bacterias ácido lácticas (BAL) ............................................................... 3

1.5. Bacilos ................................................................................................... 4

1.6. Sistema Inmune .................................................................................... 5

1.7. Enzimas de digestión ............................................................................ 7

1.8. Estrés en camarón ................................................................................ 7

1.9 Proteínas de choque térmico ................................................................. 8

2. ANTECEDENTES ....................................................................................... 9

2.1 . Principales mecanismos de acción de los microorganismos

probióticos .................................................................................................... 9

2.1.1.Colonización y adhesión en el tracto gastrointestinal.......................... 9

2.1.2.Producción de antibióticos/compuestos antivirales ........................... 10

2.1.3. Mejoramiento de las funciones inmunes .......................................... 10

2.2. Mejoramiento de la calidad de agua.................................................... 11

3. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 12

4. HIPÓTESIS ............................................................................................... 13

II

5. OBJETIVOS .............................................................................................. 14

5.1. Objetivo general .................................................................................. 14

5.2. Objetivos específicos .......................................................................... 14

6. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 15

6.1. Preparación de agua y montaje del sistema del cultivo ...................... 15

6.2. Colecta de camarones de granja (L. vannamei) ................................. 15

6.3. Extracción de ADN, PCR para gen GAPDH y detección de WSSV .... 15

6.3.1. Extracción de ADN .......................................................................... 15

6.3.2. PCR de control interno (GAPDH) .................................................... 16

6.3.3. Detección de WSSV ....................................................................... 16

6.4. Diseño experimental ........................................................................... 17

6.4.1. Bioensayo 1: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el

crecimiento y supervivencia de L. vannamei cultivado con alta densidad

y cero recambio de agua ............................................................................ 17


crecimiento, supervivencia, estrés, digestión y sistema inmune de L.

vannamei cultivado con alta densidad y cero recambio de agua ............... 18


crecimiento, supervivencia, estrés y digestión de L. vannamei cultivado

con alta densidad, cero recambio de agua y diferentes tasas de

alimentación ............................................................................................... 18

6.5. Determinación de materia orgánica..................................................... 18

6.6. Determinación del volumen de flóculos (FV) ....................................... 19

6.7. Análisis de genes ................................................................................ 19

6.7.1. Aislado de hemocitos y hepatopáncreas ......................................... 19

6.7.2. Extracción de ARN y retrotranscripción ........................................... 20

6.7.3. Expresión de genes mediante RT-PCR cuantitativo ....................... 20

6.8. Análisis estadístico.............................................................................. 26

7. RESULTADOS ......................................................................................... 27

III

7.1. Bioensayo 1: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el crecimiento

y supervivencia de L. vannamei cultivado con alta densidad y cero

recambio de agua ...................................................................................... 27

7.1.1. Incidencia inicial de WSSV .............................................................. 27

7.1.2. Tasa de crecimiento específico ........................................................ 27

7.1.3. Supervivencia .................................................................................. 28

7.1.4. Parámetros fisicoquímicos ............................................................... 28

7.1.5. Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos) ............ 29

7.1.6. Sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica ............ 30

7.2. Bioensayo 2: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el crecimiento,

supervivencia, estrés, digestión y sistema inmune de L. vannamei

cultivado con alta densidad y cero recambio de agua ............................... 31



7.2.3. Supervivencia .................................................................................. 32


7.2.5. Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos) ............ 33

7.2.6. Sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica ............ 33

7.2.7. Análisis de genes ............................................................................. 34


supervivencia, estrés y digestión de L. vannamei cultivado con alta

densidad, cero recambio de agua y diferentes tasas de alimentación. ...... 37



7.3.3. Supervivencia .................................................................................. 38


7.3.5.Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos) ............. 38

7.3.6.Determinación de bioflocs ................................................................. 39

IV

7.3.7.Análisis de genes .............................................................................. 40

8. DISCUSIÓN .............................................................................................. 43

9. CONCLUSIONES ..................................................................................... 50

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 51

V

ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico

ANDEVA Análisis de varianza

ARN Ácido ribonucleico

BAL Bacterias ácido lácticas

°C Grado Celsius

d Días

DE Desviación estándar

DMSO Dimetil sulfóxido

dNTP’s Desoxirribonucleótidostrifosfato

EE Error estándar

spp. Especies

Fig. Figura

FO Fenoloxidasa

g Fuerzas gravitacionales

GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

g Gramo

g/kg Gramo por kilogramo

h Hora

kb Kilobases

L. Litopenaeus

L Litro

L-Dopa L-dihidroxifenilalanina

µL Microlitro

µM Micromolar

µm Micrómetro

min Minuto

VI

mL Mililitro

mM Milimolar

mg/L Miligramo por litro

mg/mL Miligramo por mililitro

NH4 Amonio

nm Nanómetro

NO2 Nitrito

NO3 Nitrato

OD Oxígeno disuelto

Pb Pares de bases

‰ Partes por mil (salinidad)

PCR Polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la

polimerasa)

% Porcentaje

pH Potencial de iones hidrógeno

proFO Profenoloxidasa

s Segundo

SOD Superóxido dismutasa

TCE Tasa de crecimiento específico

t Tonelada

Tgasa Transglutaminasa

UFC Unidades formadoras de colonias

WSSV White spot syndrome virus (Virus del síndrome de la

mancha blanca)

VII

GLOSARIO

Ácidos nucleicos: Son macromoléculas formadas por la repetición de un

monómero llamado nucleótido, los cuales se unen entre sí por un grupo fosfato,

formando largas cadenas: ADN y ARN (siglas de uso generalizado para expresar

a los ácidos desoxirribonucleico y ribonucleico respectivamente).

Acuicultura: Conjunto de técnicas actividades cuyo objetivo es la cría en

cautiverio de organismos acuáticos (peces, moluscos, crustáceos, reptiles o

algas) cuyo mayor o menor carácter intensivo depende del grado de intervención

del hombre en los ciclos biológicos de los organismos en cuestión.

Amplificación: Se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia

del DNA mediante la técnica de PCR.

Antibiótico: Sustancia producida por un ser vivo o sintetizada artificialmente que

destruye o frena el desarrollo de otras células. Generalmente actúan sobre

bacterias, aunque también actúan contra ciertos hongos y contra virus de gran

tamaño, o contra células animales o vegetales.

Bacilo: Bacteria de forma cilíndrica alargada, como la de un pequeño bastón.

Bacteria: Organismo unicelular procariota, más grande que un virus, que se

presenta en varias formas (esférica, bastón o espiral). Algunas bacterias provocan

enfermedades, pero muchas son benéficas.

Bacterias ácido lácticas: Grupo de bacterias que fermentan carbohidratos dando

ácido láctico como producto principal. Se les emplea en la fabricación de yogur,

quesos, leche fermentada y embutidos.

Ciclo umbral (Cq): Ciclo en el que la fluorescencia de la muestra supera el

umbral. Se calcula en escala logarítmica y es empleado para la cuantificación

relativa de la expresión génica.

Citoplasma basófilo: Termino que se le da a las células que producen proteínas

en forma activa, tiene un núcleo de cromatina laxa con nucleolo evidente, y su

citoplasma debe tener polirribosomas en gran cantidad o un REG y un Golgi

desarrollados.

ADN polimerasa: Enzima que sintetiza una o varias cadenas hijas de ADN a

partir de una cadena complementaria. Puede participar en la reparación o

replicación del ADN.

VIII

Electroforesis: Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y

carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

Estrés: Es una respuesta inespecífica del organismo ante un estímulo

inespecífico (cualquier demanda específica que se le solicite). El estrés es

siempre una respuesta de carácter fisiológico, ante un agente estresor externo o

interno se produce una segregación de hormonas que producirán cambios a

distancia en diversas partes del organismo.

Gen: En biología molecular, segmento de ADN o ARN que normalmente

contiene una región promotora, una región que se transcribe y una región con

una señal de terminación de lectura.

Hemocitos: Son las células sanguíneas de los invertebrados y son producidas

por los tejidos hematopoyéticos.

Hemolinfa: Líquido interno y nutriente de los invertebrados que no contiene

oxígeno. Su composición varía mucho de una especie a otra. Puede ser de

diferentes colores o incluso incolora; los pigmentos pueden proceder de la

alimentación o de los procesos metabólicos y no tienen ninguna función biológica,

ya que el transporte de gases es independiente del aparato circulatorio.

Hospedante: Organismo capaz de contener un agente patógeno.

Patógeno: Es aquel elemento, medio u organismo capaz de producir algún tipo

de enfermedad o daño en el cuerpo de un animal, ser humano o vegetal, cuyas

condiciones estén predispuestas a las ocasiones mencionadas.

PCR: (Siglas del inglés Polymerase Chain Reaction o, en español, reacción en

cadena de la polimerasa). Es la metodología utilizada para producir múltiples

copias de fragmento de ADN molde, anillamiento con oligonucleótidos específicos

y extensión de los mismos por medio de una ADN polimerasa termotolerante.

Prevalencia: Se define como el número de casos de una enfermedad o evento en

una población y en un momento dado.

Primer: Es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que

sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Es una secuencia corta

de ácido nucleico que contiene un grupo 3’hidroxilo libre que forma pares de

bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la

adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde.

IX

Probiótico: Suplemento microbiano formado por un cultivo simple o mixto de

microorganismos seleccionados que son adicionados con el propósito de

manipular las poblaciones bacterianas presentes en los sistemas de producción.

Pool: Agrupación de líquido de diferentes muestras.

RT-PCR: Es una variante de PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada

en biología molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso

llamado “amplificación”. En la RT-PCR, sin embargo una hebra de ARN es

retrotranscripta en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada

transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional.

Síndrome: Cuadro clínico o conjunto sintomático que presenta alguna

enfermedad con cierto significado y que por sus características posee cierta

identidad.

Supervivencia: Término que hace referencia a vivir después de un determinado

suceso.

Virus: Agente infeccioso celular, con una organización muy simple, formada por

un complejo de proteína, la cápside y un solo tipo de ácido nucleico (ADN o ARN),

carece de metabolismo independiente y solo se puede replicar en una célula

hospedera.

X

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Tasa de crecimiento especifico de los cuatro tratamientos del experimento1…...………………………………………..………………..…..27

Figura 2. Supervivencia de L. vannamei de los cuatro tratamientos del experimento 1…………………………………………………………………28 Figura 3. Concentración de sólidos suspendidos totales, materia orgánica e Inorgánica experimento 1…………………………………………………...31 . Figura 4. Tasa de crecimiento especifico de los dos tratamientos del experimento 2 .....................................................................................................……32

Figura 5. Concentración de sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánicaexperimento 2.. ...................................................................... 34

Figura 6. Expresión de los genes del sistema inmune de L. vannamei del bioensayo 2... ....................................................................................... 35

Figura 7. Expresiónde los genes de estrés de L. vannamei del bioensayo 2... .... 36

Figura 8. Expresiónde los genes de digestión de L. vannamei del bioensayo 2... 36

Figura 9. Tasa de crecimiento especifico de los cinco tratamientos del experimento 3 ...................................................................................... 37 Figura 10. Concentración de Biofloc en los cinco tratamientos del experimento 3.. .................................................................................... 40

Figura 11. Expresiónde los genes de digestión de L. vannamei del bioensayo 3.. ........................................................................................................ 41

Figura 12. Expresiónde los genes de estrés de L. vannamei del bioensayo 3.. ... 42

XI

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Genes del sistema inmune y controles internos estudiados en L. vannamei ............................................................................................ 21

Tabla 2. Genes de estrés, digestión y controles internos estudiados en L. vannamei .......................................................................................... 22

Tabla 3. Eficiencias de amplificación en el bioensayo 2 ....................................... 23

Tabla 4. Eficiencias de amplificación en el bioensayo 3 ....................................... 23

Tabla 5. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 1 .......... 28

Tabla 6. Concentración de amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 1 ... 29

Tabla 7. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 2. ......... 31

Tabla 8. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 2. .............................. 32

Tabla 9. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 3. ......... 37

Tabla 10. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 3. ............................ 38

XII

RESUMEN

Se evaluó el efecto de B. licheniformis BCR 4-3 y melaza en la

concentración de desechos nitrogenados y supervivencia, crecimiento, respuesta

al estrés, digestión y sistema inmune de L. vannamei cultivado con alta densidad,

cero recambio de agua y diferentes tasas de alimentación. Se realizaron 3

bioensayos con tratamientos por triplicado. Bioensayo 1 (3.58 ± 0.77 g): I)

Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106

UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%).

Bioensayo 2 (1.77 ± 0.27 g): I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1

x 106 UFC/L) + melaza 80%. Bioensayo 3 (0.72 ± 0.21 g): I) 100% de alimento +

recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III)

100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV)

90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V)

80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%.

Se realizó un análisis de WSSV (PCR de punto final) al inicio de los

bioensayos y se determinó la tasa de crecimiento específico (TCE), supervivencia,

desechos nitrogenados y sólidos suspendidos totales (SST). También se

cuantificó (qPCR) la expresión relativa de genes de sistema inmune

[(profenoloxidasa, superóxido dismutasa, transglutaminasa y lisozima (bioensayo

2)], genes de estrés [(Hsp70 y Hsp90 (bioensayos 2 y 3)], genes digestivos

[(tripsina, quimotripsina y catepsina B (bioensayos 2 y 3)].

No hubo diferencias significativas entre tratamientos en el crecimiento y

supervivencia de los organismos en los tres bioensayos. Los SST y la materia

orgánica fueron altos pero no hubo un efecto negativo en la supervivencia y el

peso. En el bioensayo 1 no hubo diferencias significativas respecto a la calidad de

agua entre los tratamientos. En los bioensayos 2 (un control) y 3 (dos controles),

la concentración de amonio, nitritos y nitratos fue significativamente diferente

entre los tratamientos y los controles. En el bioensayo 2 no hubo diferencias

significativas en la expresión de proFO, TGasa, Hsp70 y Hsp90. Se observó una

sub-expresión significativa en los genes SOD, Lyz, tripsina y quimotripsina de los

organismos del tratamiento II con aditivos respecto al control sin aditivos. En el

bioensayo 3, la expresión de la catepsina B no mostró cambios significativos pero

XIII

sí los hubo en los genes de tripsina, quimotripsina y Hsp70 donde se observó una

sub-expresión en algunos tratamientos con aditivos respecto a los controles I y/o

II (con recambio y sin recambio de agua, respectivamente).

La bacteria B. licheniformis BCR 4-3 y la melaza disminuyeron el amonio,

los nitritos y los nitratos en los sistemas de cultivo del camarón blanco. Además,

se obtuvieron supervivencias altas y un crecimiento igual al de los camarones de

los grupos control. La sub-expresión de genes relacionados con el sistema

inmune como superóxido dismutasa y lisozima en los tratamientos con B.

licheniformis BCR 4-3 y melaza indica un buen estado de salud de los camarones

cultivados. También se observó una sub-expresión de las enzimas digestivas

(tripsina, quimotripsina y catepsina B en los tratamientos con B. licheniformis BCR

4-3 y la melaza. Sólo los camarones del control II (sin recambio de agua) del

bioensayo 2 estuvieron estresados ya que la expresión de la Hsp70 fue

significativamente mayor en comparación con los demás tratamientos.

XIV

ABSTRACT

The effect of B. licheniformis BCR 4-3 and molasses in the survival, growth,

concentration of nitrogenous wastes, stress response, digestion and immune

system of L. vannamei cultured with high density, zero water exchange and

different feed rates was evaluated. Bioassays with three treatments were

performed in triplicate. Bioassay 1 (3.58 ± 0.77 g): I) Control without additives; II)

Molasses (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 CFU/L); IV) B.

licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 CFU/L) + molasses (20-80%). Bioassay 2 (1.77 ±

0.27 g): I) Control without additives; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 CFU/L) +

80% molasses. Bioassay 3 (0.72 ± 0.21 g): I) 100% feed + water exchange every

5 days; II) 100% feed without water exchange; III) 100% feed + B. licheniformis

BCR 4-3 (1 x 106 CFU/L) + 80% molasses; IV) 90% feed + B. licheniformis BCR 4-

3 (1 x 106 CFU/L) + 80% molasses; V) 80% feed + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x

106 CFU/L) + 80% molasses.

An analysis of WSSV (two-step PCR) at the beginning of the bioassays was

performed and the specific growth rate (TCE), survival, nitrogenous wastes, and

total suspended solids (TSS) were determined. Also, the relative expression

(qPCR) of genes of the immune system [(prophenoloxidase, superoxide

dismutase, transglutaminase, and lysozyme (bioassay 2)], stress genes [(Hsp70

and Hsp90 (bioassays 2 and 3)], and digestive genes [(trypsin, chymotrypsin, and

cathepsin B (bioassays 2 and 3)] were determined.

There was no significant differences between treatments in the growth and

survival of organisms in the three bioassays. TSS and organic matter were high

but there was not negative effect on survival and weight. In bioassay 1 there were

no significant differences in water quality among treatments. In bioassay 2

(control) and 3 (two controls), the concentration of ammonia, nitrites, and nitrates

was significantly different between treatments and controls. In the bioassay 2 there

was no significant difference in the expression of proPO, TGase, Hsp70, and

Hsp90. Significant sub-expression was observed in genes of SOD, Lyz, trypsin,

and chymotrypsin in treatment II with additives as compared to the control without

additives. In the bioassay 3, the expression of cathepsin B was similar in all

treatments but trypsin, chymotrypsin, and Hsp70 where a sub-expressed in some

XV

treatments with additives as compared to controls I and/or II (with zero water

exchange and without water exchange, respectively).

The bacterium B. licheniformis BCR 4-3 and molasses decreased ammonia,

nitrites, and nitrates in farming systems of white shrimp. In addition, high survival

and growth of shrimp equal to the control groups were obtained. The sub-

expression of genes related to the immune system as superoxide dismutase and

lysozyme in treatments with B. licheniformis BCR 4-3 and molasses indicates

good health of farmed shrimp. A sub-expression of digestive enzymes (trypsin,

chymotrypsin, and cathepsin B in treatments with B. licheniformis BCR 4-3 and

molasses was observed. Only shrimp of control II (zero water exchange) of

bioassay 2 were stressed because Hsp70 expression was significantly higher as

compared to the other treatments.

1

1. INTRODUCCIÓN

En el mundo, la acuacultura ha crecido notablemente en los últimos 60

años, pasando de menos de un millón de toneladas en la década de 1950, a 51.7

millones de toneladas en 2006, con un valor de 78,800 millones de USD. A pesar

de que la producción por pesca de captura dejó de crecer en la década de 1980,

el sector acuícola mundial ha mantenido una tasa de crecimiento medio anual de

8.7% (excluyendo a China, con un 6.5%) desde 1970 (FAO, 2009).

El cultivo de camarón es uno de los sectores de la acuicultura con más

rápido crecimiento en Asia, Latinoamérica, y recientemente en África. La

sostenibilidad de la acuicultura del camarón se debe alcanzar con el

reconocimiento y mitigación de los efectos al medio ambiente y a la comunidad a

corto y largo plazos. Se debe mantener una viabilidad económica y biológica en el

tiempo y proteger los recursos costeros (Cuéllar-Anjel et al., 2010).

El cultivo hiperintensivo de camarones se caracteriza porque las

densidades de siembra superan los 100 organismos/m2 (Leyva-Ordaz et al.,

2010). Este sistema de cultivo, se realiza generalmente en áreas pequeñas (0.5 a

1 ha) para aprovechar al máximo la superficie de cultivo por lo que se hace

necesaria la adición de oxígeno al agua por medio de equipos de aireación, esta

va aumentando a medida que la biomasa de camarones aumenta, permitiendo

mejorar las condiciones de cultivo y optimizar la alimentación (Boyd, 1999).

En estos sistemas hay cero recambio de agua y se controla la entrada de

alimento, nutrientes y se favorece una acumulación de partículas floculadas

(bioflocs) conformada por agregados de algas, bacterias, protozoos, y otros tipos

de materia orgánica particulada, tales como heces y el alimento no consumido.

Cada floculo se mantiene unida en una matriz suelta de mucosidad que es

secretada por las bacterias, vinculados por microorganismos filamentosos, o

mantenido por atracción electrostática. La comunidad de partículas floculadas

también incluye animales como zooplancton y nematodos. Los flóculos en un

sistema típico de biofloc son bastante grandes, alrededor de 50 a 200 µm, y se

asentarán fácilmente en aguas tranquilas, estos ayudan en la mejora de la calidad

de agua y en la conversión alimenticia (Hargreaves, 2013). A diferencia de los

sistemas tradicionales de cultivo de camarón, estos sistemas dependen de la

2

comunidad microbiana para la remineralización y utilización de sustancias

dañinas, las cuales tienden a acumularse por la degradación del alimento y

deshechos de camarón (Ray et al., 2010).

Siendo un cultivo sin recambio de agua se reduce el riesgo de introducir

patógenos potenciales (Vinatea et al., 2010). Además la productividad natural de

los estanques mediante poblaciones bacterianas y otros microorganismos,

permite utilizar alimentos con menor concentración de proteínas ya que

la producción natural complementa la nutrición del camarón. Por lo anterior, el uso

de alimento bajo en proteína es más rentable y más amigable con el ambiente, ya

que la harina de pescado tiene un alto costo (Wasielesky et al., 2006).

Los microorganismos son de mucha importancia en acuacultura, ellos se

desarrollan en sedimentos y en aguas de cultivo afectando muchos aspectos de la

vida en el ambiente acuático; ya sea produciendo o consumiendo oxígeno, como

alimento para organismos de mayor tamaño, como recicladores de nutrientes y

como patógenos potenciales para los organismos en cultivo (Gatesoupe, 1999).

1.1. Los biorremediadores como agentes controladores de

enfermedades

En los últimos años, ha crecido el interés en el biocontrol de patógenos en

acuicultura, usando microorganismos antagonistas en lugar de los antibióticos

(Westerdahl et al., 1991; Maeda, 1994; Abraham et al., 2001). La mayoría de los

microorganismos utilizados como probióticos que han sido propuestos como

agentes de control biológico en la acuicultura, pertenecen a la bacteria del ácido

láctico (Lactobacillus), Vibrio (Vibrio alginolyticus), Bacillus, levaduras y hongos

(Intriago et al., 1998; Singh et al., 2001).

Los microorganismos benéficos pueden ser inoculados dentro de los

sistemas de cultivo de camarón para reducir el número de patógenos como V.

harveyi, V. parahaemolyticus y V. splendens (Jameson, 2003).

1.2. Biorremediación del detritus orgánico

La materia orgánica disuelta y en suspensión contiene principalmente

cadenas de carbono y está disponible para microorganismos y algas. Un buen

biorremediador debe contener microorganismos que sean capaces de limpiar el

agua de materia orgánica. Adicionalmente, la materia orgánica ayuda a que los

3

microorganismos se multipliquen rápidamente y tengan una buena capacidad

enzimática. Por ejemplo miembros del genero Bacillus, como Bacillus subtilis, B.

licheniformis, B. cereus y B. coagulans, son bacterias adecuadas para la

biorremediación del detritus orgánico. Sin embargo, éstas no están normalmente

presentes en las cantidades requeridas en la columna de agua ya que su hábitat

natural es el sedimento. Cuando los bacilos son adicionados al agua en

cantidades suficientes compiten con la flora bacteriana presente por la materia

orgánica disponible, utilizando el exceso de alimento y las heces del camarón

(Sharma, 1999). Como parte de la bio-aumentación, los bacilos pueden ser

producidos, mezclándolos con arena o arcilla y difundidos para ser depositados

en el fondo del estanque (Singh et al., 2001).

Lactobacillus también es usado junto con Bacillus para descomponer el

detritus orgánico. Estas bacterias producen una variedad de enzimas que rompen

las proteínas y azúcares del detrito, los cuales son tomados como fuentes de

energía por otros organismos. La remoción de grandes cantidades de compuestos

orgánicos reduce la turbidez del agua (Haung, 2003).

1.3. Biorremediación de los compuestos nitrogenados

Los desechos nitrogenados en exceso (amonio y nitritos) producen un

deterioro de la calidad del agua ya que la hace tóxica a peces y camarones. La

principal fuente de amonio son las excreciones de los camarones y el flujo de

sedimento derivado de la mineralización de la materia orgánica y la difusión

molecular del sedimento reducido, aunque la fijación del nitrógeno por las

cianobacterias y la deposición atmosférica son ocasionalmente importantes

(Ayyappan & Mishra, 2003).

La nitrificación bacteriana es el método más práctico para la remoción de

amonio de los sistemas acuícolas cerrados (Ayyappan & Mishra, 2003).

1.4. Bacterias ácido lácticas (BAL)

En el tracto gastro-intestinal de animales terrestres se destacan los

Lactobacillus, que pertenecen a las BAL, y son reconocidas como probióticos

(Ivar, 2005). Las BAL, y en particular el género Lactobacillus, son parte de la flora

microbiana natural que se encuentran acompañando al camarón en todos sus

4

estadios de vida. Muchas de estas bacterias tienen potencial para usarse como

probióticos en la acuacultura (García, 2003).

1.5. Bacilos

Los bacilos son bacterias Gram positivas (+) que forman esporas y

producen un amplio rango de compuestos antagónicos a patógenos. Este tipo de

microorganismos están disponibles como probióticos comerciales para la

acuacultura. Algunas especies, como Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis, que

aparecen naturalmente en ambientes de agua dulce y marina, son encontrados en

forma natural en el intestino de camarón. El género incluye microorganismos

aerobios estrictos y anaerobios facultativos. Muchas otras especies están

distribuidas en la naturaleza y se hallan en la mayor parte de las muestras de

suelos, agua y polvo (Decamp et al., 2006). Donde B. licheniformis es una

bacteria distribuido ampliamente como un organismo saprofito en el medio

ambiente. Esta especie es un anaerobio facultativo, lo que puede permitir que

crezca en nichos ecológicos adicionales. Cierto cepas de B. licheniformis son

capaces de desnitrificación. Los organismos saprofitas deben utilizar una variedad

de compuestos nitrogenados como nutrientes para el crecimiento y el

metabolismo. B. licheniformis posee la capacidad de adquirir el nitrógeno de

proteínas exógenas, péptidos, aminoácidos, amonio, nitrato y nitrito. Este bacilo

secretada enzimas que hidrolizan polisacáridos, proteínas, lípidos y otros

nutrientes (Rey et al., 2004).

El crecimiento de los microorganismos heterótrofos puede ser estimulado

modificando la relación carbono-nitrógeno en el agua a través de la modificación

del contenido de carbohidratos en el alimento o por la adición de una fuente

externa de carbono como la melaza, de modo que las bacterias puedan asimilar el

amonio de residuos para la producción de nueva biomasa (Avnimelech, 1999;

Ekasari et al., 2014). La característica principal de la melaza es que contiene un

alto nivel de energía aprovechable. En los últimos años se ha encontrado

aplicaciones dentro de los cultivos en granjas camaroneras tanto como aditivo al

alimento balanceado como sustrato para la obtención y fijación de cepas

bacterianas debido a que es rica como fuente de carbono necesaria dentro del

ciclo vital de ciertos tipos de bacterias. La implementación del uso de probióticos

dio paso a la utilización de fuentes de carbono entre ellas la melaza ya que

5

presenta ventajas económicas y nutricionales frente a otros medios de cultivo

comerciales, (Fajardo & Sarmiento, 2007)

1.6. Sistema Inmune

La función del sistema inmune es mantener la individualidad biológica, por

ello, su principal actividad es diferenciar y eliminar todo material extraño de sus

tejidos (Vargas et al., 1996).

El sistema inmune de los crustáceos está basado en efectores celulares y

humorales, los cuales se conjugan para eliminar microorganismos potencialmente

infecciosos. Los hemocitos constituyen la fracción celular de la hemolinfa y son

cruciales en las reacciones inmunitarias siendo capaces de realizar procesos de

fagocitosis, encapsulación, formación de nódulos y de citotoxicidad. En los

crustáceos la circulación es abierta y la hemolinfa es un análogo de la sangre y la

linfa de los vertebrados. La hemolinfa presenta un color azul verdoso a causa de

la hemocianina (proteína respiratoria abundante en la hemolinfa de todos los

crustáceos (Söderhäll & Cerenius, 1992).

La respuesta celular del sistema inmune del camarón

Hemocitos

Los hemocitos de crustáceos llevan consigo la fagocitosis, remueven

partículas extrañas y agentes infecciosos (Raa, 1996). Para identificar y clasificar

los hemocitos se han utilizado diferentes criterios: morfológicos, antigénicos y

funcionales. Básicamente se han descrito tres tipos hemocitarios. Encontramos a

los hemocitos hialinos (H), que no poseen gránulos; los hemocitos

semigranulosos (SG), con gránulos pequeños; y los hemocitos granulosos (G)

cargados de gránulos grandes (Johansson et al., 2000)

Hemocitos Hialinos

Presentan un delgado citoplasma basófilo, un núcleo amplio y céntrico. Son

células que se adhieren y se extienden fácilmente, no contienen gránulos densos.

En el cangrejo de río, los hemocitos hialinos se caracterizan por la ausencia de

gránulos pero contienen inclusiones citoplasmáticas, estas células son capaces

de fagocitar e intervienen en la coagulación (Johansson & Söderhäll, 1989; Raa,

1996; Söderhäll & Cerenius, 1992).

6

Hemocitos Semigranulosos

Poseen un núcleo esférico o en forma de herradura y muchos gránulos

pequeños de forma redondeada. En los camarones, estas células intervienen en

la fagocitosis, encapsulación y en la liberación de la profenoloxidasa proPO

(melanización). Además en este tipo de hemocitos se sintetizan las peneidinas,

péptidos antimicrobianos (Dextoumieux et al., 2000). Tienen moderada

refringencia cuando se observan al microscopio de contraste de fases.

Hemocitos Granulosos

Se caracterizan por ser células grandes. Poseen grandes gránulos, alta

relación citoplasma-núcleo y excéntrico, inclusiones citoplamáticas. Estos

hemocitos almacenan las enzimas que constituyen el sistema proPO en los

crustáceos a un nivel más alto que los semigranulosos. Estas enzimas son

liberadas por exocitosis cuando estos hemocitos son estimulados por la

peroxinectina y la proteína fijadora de β-glucanos (Smith & Söderhäll, 1983). Al

igual que los hemocitos SG estos sintetizan y almacenan peneidinas

(Dextoumieux et al., 2000).

La respuesta humoral del sistema inmune del camarón

La respuesta humoral es un mecanismo capaz de inhibir el crecimiento

bacteriano en plasma, de inhibir la actividad enzimática y de liberar sustancias

causantes de lisis celular, aglutininas y precipitinas (Bachére et al., 2000).Tales

sustancias son:

Péptidos antimicrobianos

Lisozima

Lectinas

Peroxidasa

Radical anión superóxido

Genes relacionados con la respuesta inmune

La expresión de genes relacionados con el sistema inmune en el camarón

blanco como profenoloxidasa (proFe), transglutaminasa (TG), crustina (CR),

7

peneidina 3a (PEN), lisozima (LIZ) y superóxido dismutasa (SD) en L. vannamei,

proporcionan información importante sobre la activación del sistema inmune y su

modulación siendo una guía para la toma de muestras en tejidos u órganos (Wang

et al.,2007).

1.7. Enzimas de digestión

La degradación química de los alimentos se realiza gracias a la acción de

enzimas digestivas procedentes principalmente de la glándula del intestino medio

o hepatopáncreas. Este órgano tiene tres funciones principales: secreción y

síntesis de enzimas digestivas, retención temporal y cíclica de reservas y la

absorción de nutrientes producto de la digestión (Gibson & Barker, 1979).

La tripsina, quimotripsina y catepsina B son tres de las enzimas

proteolíticas más abundantes en hepatopáncreas de los decápodos. Sin embargo,

el alimento es uno de los factores determinantes en la síntesis de estas enzimas

(Le Moullac, 1994). Aunque la información sobre la expresión de genes digestivos

en el camarón blanco no es abundante, existen algunos trabajos que resaltan su

importancia en camarones (Muhlia-Almazán & García-Carreño, 2002; Sánchez-

Paz et al., 2003).

1.8. Estrés en camarón

Durante el cultivo de camarón las variables ambientales juegan un papel

determinante en la eficiencia del cultivo en términos de supervivencia y calidad de

producto. Lo anterior se debe a que el cultivo típicamente se realiza en estanques

de tierra que están expuestos a los cambios ambientales relacionados con el

clima de la entidad, influyendo directamente sobre la condición fisiológica de los

organismos. La temperatura es un factor determinante para organismos

poiquilotermos (Bayne, 1976), ya que influye en la velocidad de procesos

fisiológicos, provocando variaciones en el metabolismo y por consiguiente, en las

necesidades energéticas, la condición, el estado de salud y el crecimiento.

Adicionalmente, a diferencia de otros factores, tiene la capacidad de penetrar

barreras físicas y puede tener efectos dramáticos sobre la estructura de

macromoléculas (Hickey & Singer, 2004).

La acción combinada de temperaturas altas sostenidas (por arriba de

33°C), niveles de oxígeno por debajo de los 3 mg/L, pH desbalanceados y altos

8

niveles de desechos nitrogenados provocan condiciones de estrés, que afectan

negativamente en el crecimiento, alimentación, frecuencia de muda y

metabolismo. La situación se agrava, si el oxígeno desciende por debajo de los 2

mg/L, cuando los organismos se acercan a su nivel crítico, presentándose

mortalidad en el estanque.

1.9 Proteínas de choque térmico

Las proteínas de choque térmico (HSPs, por sus siglas en inglés) son

proteínas ampliamente conservadas, conocidas por su rápida respuesta a estrés

por cambios medio ambientales (temperatura y pH) (Qian et al., 2012).

9

2. ANTECEDENTES

En la actualidad se ha incrementado la búsqueda de microorganismos

probióticos con el fin de mejorar los cultivos de organismos acuáticos, bajo el

término de “cultivos amigables” con el ambiente (Gatesoupe, 1999). Los diversos

probióticos estudiados para su uso en acuacultura incluyen tanto bacterias Gram

(-) como bacterias Gram (+), bacteriófagos, levaduras y algas unicelulares. En

particular, los probióticos se han utilizado con éxito en un amplio número de

invertebrados (Gómez-Gil et al., 2000; Riquelme et al., 2000). Entre los

principales mecanismos descritos que usan los aislados probióticos para

beneficiar al hospedador, se encuentran:

2.1 . Principales mecanismos de acción de los microorganismos probióticos

2.1.1. Colonización y adhesión en el tracto gastrointestinal

La habilidad de las bacterias para adherirse y sobrevivir en el mucus

entérico es decisiva en el establecimiento de la microbiota intestinal. La capacidad

de adherencia es una característica que es aprovechada de igual manera tanto

por las bacterias probióticas como por las patógenas. En el caso de las

probióticas, éste ha sido uno de los criterios más importantes para su selección y

aplicación en acuicultura (Salminen et al., 1996; Nikoskelainen et al., 2003),

mientras que para las patógenas la habilidad para adherirse, se relaciona con la

virulencia y se considera como el primer paso para una infección (Bengmark,

1998). En acuicultura, la información disponible indica que las bacterias aisladas

de animales cultivados o de su entorno tienen mayor capacidad de adhesión al

mucus gastrointestinal y a los tejidos. Por otro lado las bacterias foráneas que

suelen ser transitorias, por lo que surge la necesidad de que sean continuamente

administradas, ya sea como suplemento en el alimento o a través del agua de

cultivo (Ringø & Gatesoupe, 1998; Villamil et al., 2003). Además, se ha

documentado que aislados microbianos de un organismo pueden colonizar otras

especies cultivadas, indicando así la versatilidad de algunas bacterias para la

colonización del tracto digestivo (Ringø, 1999).

10

2.1.2. Producción de antibióticos/compuestos antivirales

La selección de microorganismos con actividad probiótica también se

puede determinar por la capacidad de generar productos extracelulares (ECPS)

que pueden inhibir o matar otras bacterias potencialmente patógenas (Vázquez et

al., 2006). Hjelm et al. (2004) demostraron que bacterias del Género Roseobacter

tienen un gran potencial como probióticos en el cultivo del rodaballo

(Scophtahlmus maximus) del cual fueron aisladas. Su capacidad probiótica se

basó en la actividad antibacteriana contra bacterias patógenas de peces marinos

V. anguillarum y V. splendidus.

Los probióticos no solo tienen capacidad antibacteriana, también se ha

descrito actividad antiviral de algunos aislados como Pseudomonas sp., Vibriospp.

y Aeromonas sp., contra el virus de la necrosis hematopoyética (IHNV) (Kamei et

al., 1988). Maeda et al. (1997) aislaron una cepa de Pseudoalteromonas undina,

que presentó efectos antivirales e incrementó la supervivencia en camarón

(Penaeus sp.) y dorada (Sparus aurata) infectados experimentalmente con el virus

de la necrosis neuro Sima-aji (SJNNV), Baculovirus e Iridovirus.

2.1.3. Mejoramiento de las funciones inmunes

Como se mencionó con anterioridad el sistema inmunológico no específico

puede ser estimulado por probióticos. Lo anterior ha quedado demostrado con la

administración oral de la bacteria Clostridium butyricum a la trucha arco iris, la

cual mejoró la resistencia a la vibriosis, aumentando la actividad fagocítica de

leucocitos (Sakai et al., 1996). Balcázar (2003), demostró que la administración de

una mezcla de cepas bacterianas (Bacillus y Vibrio sp.) influyó positivamente en el

crecimiento y la supervivencia de juveniles del camarón blanco y presentó un

efecto protector contra V. harveyiy WSSV. Chiu et al. (2007), demostraron que es

posible eliminar V. alginolyticus en infecciones experimentales con camarón

blanco cuando se alimenta con Lactobacillus plantarum debido al aumento

significativo de la actividad fenoloxidasa (PO), el estallido respiratorio y la

superoxido dismutasa (SOD), así como la transcripción del ARNm de la

peroxinectina (PE) y la profenoloxidasa (proPO).

Sotomayor et al. (2009) determinaron que los productos extracelulares de

la cepa probiótica P62 (Vibrio) estimulan la actividad de la amilasa en L.

vananmei; sin embargo, cuando se aplicaron las células al camarón, éstas

11

estimularon la actividad enzimática de la amilasa y la tripsina. Estos resultados

confirman lo reportado por Cecile (2006) en Artemia franciscana expuesta a ECPs

(productos extracelulares) del probiótico PSA, donde observaron una estimulación

de la actividad enzimática.

2.2. Mejoramiento de la calidad de agua

Verschure et al. (2000) reportaron que el empleo de Bacillus sp. mejora la

calidad del agua, la supervivencia y crecimiento de juveniles de Penaeus

monodon.

La calidad del agua puede ser mejorada con la adición de probióticos, en

especial del genero Bacillus sp. La explicación se basa en que las bacterias Gram

(-) son muy eficientes en la remineralización de la materia orgánica.

Kim et al. (2005) observaron, al igual que Laloo et al. (2007) el mismo

fenómeno en B. subtillus, B. cereus y B. licheniformis, atribuyendo este efecto a

mecanismos de bioacumulacion, bioasimilacion y nitrificación. Donde

comprobaron que tienen la capacidad de disminuir las concentraciones de nitritos,

nitratos y amonio en el agua de cultivos de peces ornamentales.

12

3. JUSTIFICACIÓN

Por ser una importante fuente de alimento a nivel mundial, la acuacultura

debe cambiar sus estrategias de manejo a nuevos métodos de cultivo con mínimo

o cero recambios de agua, esto para mitigar el impacto ambiental y prevenir las

enfermedades en los organismos en cultivo.

En los cultivos hiperintensivos con cero recambios de agua, es

recomendable el uso de microorganismos benéficos como los bacilos ya que

mejoran la calidad del agua, la supervivencia y el crecimiento de los organismos,

como es el caso del camarón blanco. Además, se reducen los costos de

operación con la producción de biomasa microbiana, aportando alimento natural a

los cultivos, además existe un mayor control de las variables bióticas y abióticas

(ambientales).

13

4. HIPÓTESIS

La adición de Bacillus licheniformis BCR 4-3 y melaza en los sistemas de

cultivo hiperintensivo de camarón blanco a altas densidades y con cero recambio

de agua disminuyen la concentración de amonio, nitritos y nitratos. Lo anterior

permite cultivar sin afectar la supervivencia, el crecimiento y la fisiología de los

organismos.

14

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

Determinar el efecto de B. licheniformis BCR 4-3 y melaza en la

concentración de desechos nitrogenados (amonio, nitritos y nitratos),

supervivencia, crecimiento, respuesta inmune, respuesta al estrés y digestión de

L. vannamei cultivado con altas densidades y con cero recambio de agua.

5.2. Objetivos específicos

5.2.1. Determinar el efecto de B. licheniformis y melaza en la supervivencia,

crecimiento y concentración de desechos nitrogenados en el agua de L.

vannamei cultivado con alta densidad y con cero recambio de agua.

5.2.2. Analizar el efecto de B. licheniformis y melaza en la respuesta al estrés,

digestión y sistema inmune de L. vannamei cultivado con alta densidad, cero

recambio de agua y diferentes porcentajes de alimento.

15

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Preparación de agua y montaje del sistema del cultivo

Se utilizó agua hipersalina (90-100‰) previamente tratada con cloro (10%)

durante 24 h. Posteriormente se puso aireación con piedras difusoras por 24 h

para eliminar el cloro presente por volatilización. El agua se preparó en un tinaco

con agua hipersalina filtrada con una malla de algodón de 20 µm y se ajustó la

salinidad con agua dulce libre de cloro.

Para el cultivo se utilizaron tinas de plástico (120 L de capacidad) con 80 L

de agua a 30‰. Se colocaron mangueras y piedras difusoras previamente

lavadas en una solución diluida de ácido muriático.

6.2. Colecta de camarones de granja (L. vannamei)

Se colectaron de 200 a 600 camarones (0.2 a 2.0 g) para cada uno de los

bioensayos. Los organismos se colectaron de la granja Cuate Machado, ubicada

frente a playa Las Glorias (25°19’6.14” N 108°29’37.87” O), municipio de

Guasave, Sinaloa, y fueron transportados al Laboratorio de Acuacultura del

CIIDIR-IPN en recipientes de plástico con agua de los estanques de cultivo y

aireación continua. En el laboratorio se aclimataron los organismos colocándolos

en tinas de plástico previamente montadas y se disminuyó o aumentó la salinidad

(2‰/h), según lo necesario. Los animales se mantuvieron a temperatura ambiente

(23-30 ºC) y con aireación constante.

6.3. Extracción de ADN, PCR para gen GAPDH y análisis de WSSV

6.3.1. Extracción de ADN

La extracción del ADN se realizó en tubos Eppendorf de 1.5 mL a partir de

100 mg de tejido de músculo abdominal-pleópodos y branquias de camarón,

utilizando 500 L DNAzol® (Invitrogen). Las muestras, se maceraron con un pistilo

y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se

centrifugaron a 10 000 x g, durante 10 min. Se recuperaron 350 L del

sobrenadante. Se agregaron 250 L de etanol absoluto frío, se mezcló por

inversión y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 min, mezclando

periódicamente. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 5 000 x g,

16

durante 5 min y se decantó el sobrenadante. La pastilla se resuspendió en 500 L

de etanol al 75 % frío y se centrifugó a 13 000 x g durante 3 min. Se decantó el

sobrenadante y la pastilla formada se secó a temperatura ambiente.

Posteriormente, se añadieron a cada tubo 30 L de agua ultrapura. Finalmente,

se agitaron las muestras en un vórtex y se centrifugaron a 5 000 x g durante 30 s.

Las muestras se almacenaron a –20 °C. Para cuantificar y determinar la calidad

del ADN, se utilizó un nanofotómetro IMPLEN® con lecturas a 260/280 y 260/230

nm. Se realizaron diluciones para llevar los ADN’s a una concentración de 100

ng/µL.

6.3.2. PCR de control interno (gen GAPDH)

Para confirmar la calidad de la extracción de ADN, se realizó la

amplificación del gen que codifica la enzima gliceraldehído-3-fosfato

deshidrogenasa (GAPDH). Este gen funciona como un control interno del ADN

genómico del camarón. La reacción de PCR se llevó a cabo con los primers

reportados por Tang et al. (2000) (GAPDH298F 5’ TCA CCG TCT TCA ACG AGA

TG 3’ y GAPDH298R 5’ ACC CTC CAG CAT CTC GAA CT 3’) que amplifican un

fragmento de 298 pb. La mezcla de reacción y el programa utilizado fue el mismo

que para el PCR del WSSV. Los fragmentos amplificados se visualizaron de la

misma forma que para WSSV. Variando únicamente la temperatura de alineación

de primers (55 °C).

6.3.3. Detección de WSSV

Se determinó si los camarones eran portadores del WSSV, mediante una

PCR sencilla y una PCR anidada, al inicio de cada bioensayo.

Los oligonucleótidos que se utilizaron en la PCR sencilla fueron, WSSV out

1 (sentido): 5’-ATC ATG GCT GCT TCA CAG AC-3’ y WSSV out 2

(contrasentido): 5’-GGC TGG AGA GGA CAA GAC AT-3’, y para el anidado

WSSV in 1 (sentido): 5’-TCT TCA TCA GAT GCT ACT GC 3’ y WSSV in 2

(contrasentido): 5’-TAA CGC TAT CCA GTA TCA CG 3’, que amplifican un

fragmento de 982 pb y 570 pb, respectivamente (Kimura et al., 1996). La reacción

de PCR se realizó en tubos de 0.2 mL e incluyó 18.8 µL de agua ultrapura; 2.5 µL

de buffer de reacción 10X; 1.0 L de MgCl2 (50 mM); 0.5 µL de dNTPs (10 mM);

0.5 µL de cada oligo (10 µM cada uno; Sigma-Genosys); 0.2 µL de Taq

17

polimerasa (5 U/µL; Biolasa) y 1 L de ADN total para un volumen total de 25 L.

La amplificación se realizó en un termociclador BIOER LifePro® usando el

siguiente programa: desnaturalización inicial (95 C, por 4 min), seguido de 35

ciclos de 45 s a 94 C, 45 s a 58 C, 1 min a 72 C, y una extensión final a 72 C,

por 4 min. Para la PCR anidada se disminuyó a 45 s el tiempo de polimerización a

72 °C. Los fragmentos amplificados se visualizaron bajo luz UV en un gel de

agarosa al 0.8%, teñido con bromuro de etidio (10 mg/mL).

6.4 Diseño experimental

Se utilizaron camarones con un peso de 0.2 a 2.0 g. Los camarones se

cultivaron en tinas de 120 L con 80 L de agua de mar filtrada con 30‰ (20 µm).

Se realizaron tres bioensayos que tuvieron una duración de 35, 35 y 50 días,

respectivamente.

No se realizaron recambios de agua ni limpieza de las tinas, sólo se

recuperó el volumen de agua evaporada. En los bioensayos se determinó la

temperatura, salinidad, pH y oxígeno disuelto (cada dos días). Los nitritos, nitratos

y amonio se determinaron cada 7 días. La supervivencia se registró diariamente y

el peso de los organismos al inicio y final de cada bioensayo.


crecimiento y supervivencia de L. vannamei cultivado con alta densidad y

cero recambio de agua

El bioensayo consistió de 4 tratamientos con 10 camarones por tina por

triplicado: I) control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3

(1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%).

Con una duración de 35 días. Las bacterias se inocularon en el agua al principio

del bioensayo (día 0) y cada 7 días. La melaza se ajustó de acuerdo a las

biometrías de los camarones quienes fueron pesados individualmente cada 10

días y a los resultados de calidad de agua. El porcentaje de la melaza se aplicó

en relación al peso del alimento dado diariamente.

La supervivencia se determinó diariamente. El peso de los organismos al

inicio y final del bioensayo. Se determinó materia orgánica al final del bioensayo.

18


crecimiento, supervivencia, estrés, digestión y sistema inmune de L.

vannamei cultivado con alta densidad y cero recambio de agua


triplicado: I) control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) +

melaza 80%. Con una duración de 35 días. La bacteria se puso en el agua al

principio del bioensayo (día 0) y cada 4 días. La melaza se puso diario. El

porcentaje de melaza se aplicó en relación al peso del alimento suministrado.

La supervivencia se determinó diariamente y el peso de los organismos al

inicio y final del bioensayo. Se determinaron los sólidos suspendidos totales y

materia orgánica e inorgánica al final del bioensayo. Se evaluó el nivel de

expresión de genes de estrés, digestión y del sistema inmune al final del

bioensayo.


crecimiento, supervivencia, estrés y digestión de L. vannamei cultivado con

alta densidad, cero recambio de agua y diferentes tasas de alimentación


triplicado: I) 100% de alimento+ recambio de agua cada 5 días; II) 100% de

alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3

(1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1

x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x

106 UFC/L) + melaza 80%. Con una duración de 50 días.

Se inoculó el B. licheniformis BCR 4-3 cada 4 días en los tratamientos

correspondientes y se adicionó melaza hasta el día 17. El porcentaje de la melaza

se aplicó en relación al peso del alimento dado diariamente. Se determinó el

volumen de flóculos (FV) cada 3 días. Se determinaron la supervivencia,

crecimiento, calidad de agua y expresión de genes de estrés y digestión.

6.5 Determinación de materia orgánica

Para la determinación de materia orgánica, se tomaron muestras de agua

(100 mL) de los tratamientos para analizarlos por filtración con filtros Whatman

(GF/C, 4.7cm de diámetro). Para obtener un peso constante se colocaron en una

mufla a 550 ºC durante 20 min, posteriormente las muestras de agua se filtraron

19

bajo vacío a través de los filtros. Los filtros con las muestras se colocaron en un

horno a 60 ºC por 48 h para obtener el peso seco (peso del filtro menos la

muestra seca). A continuación, se pesaron y se incineró la materia orgánica a 550

ºC en la mufla durante 20 min. Finalmente, los filtros se pesaron de nuevo para

obtener la materia orgánica por diferencia con el peso seco.

6.6. Determinación del volumen de flóculos (FV)

El flóculo se determinó cada 3 días utilizando conos Imhoff. Se tomó la

muestra de agua (1 L) y se colocó en el cono, donde se sedimento durante 30

min. El índice de volumen de flóculos (FVI) se define como el volumen de flóculos

en mililitros por litro de agua después de 30 min de sedimentación (Avnimelech &

Kochba, 2009).

6.7 Análisis de genes

6.7.1. Aislado de hemocitos y hepatopáncreas

Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune se extrajo la

hemolinfa de dos camarones por replica (seis por tratamiento) con jeringas para

insulina (27 G x 13 mm) de la parte ventral del primer segmento abdominal. La

jeringa se cargó con un anticoagulante (SIC- EDTA, Na2) (NaCl 450 mM, KCl 10

mM, Hepes 10 mM + EDTA, Na2 10 mM, pH 7.3, 850 mOsm/kg), las cuales se

colocaron en hielo (Vargas-Albores et al., 1993), en una proporción 2:1 (2

volúmenes de SIC-EDTA por cada volumen extraído de hemolinfa, 600 µL de

anticoagulante/300 µL de hemolinfa). Inmediatamente después de ser extraída la

muestra de hemolinfa, ésta se colocó en tubos Eppendorf de 1.5 mL pre-enfriados

en hielo. Se separaron los hemocitos del plasma centrifugando a 800 x g, por 10

min a 4 °C. El plasma se eliminó y el paquete celular se lavó con 250 µL de

anticoagulante frio. Se centrifugo nuevamente a 800 x g, por 10 min a 4 °C y se

desechó el sobrenadante. Al paquete celular se le adicionaron 300 µL de Trizol®

frío (4 °C) y se almacenaron a -80 °C.

Para determinar la expresión de genes digestivos y estrés se tomaron

muestras individuales del hepatopáncreas de dos camarones por cada replica

(seis por tratamiento) tomando en promedio 30 mg de tejido este fijó

individualmente en Trizol® (600 μL) y almacenados a -80 °C hasta su uso.

20

6.7.2. Extracción de ARN y retrotranscripción del ARNm

Se utilizaron los hemocitos guardados a -80 °C en Trizol®. El ARN total fue

extraído de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen) y guardado a -80 °C

hasta su uso en la RT-PCR. La concentración y pureza del ARN total se

determinó midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un nanofotómetro

(IMPLEN®). Posteriormente se trató el ARN con ADNsa 1 (1 U/ μL, Sigma®).

La extracción de ARN total de hepatopáncreas se realizó con Trizol

siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen) y guardado a -80 °C hasta su uso

en la RT-PCR. La concentración y pureza del ARN total se determinó midiendo la

absorbancia a 260/280 nm en un nanofotómetro (IMPLEN®). Posteriormente se

trató el ARN con ADNsa 1 (1 U/ μL, Sigma®).

Se utilizó la transcriptasa reversa (Improm II, PROMEGA®) para sintetizar

la primera hebra (ADNc) con el primer oligo dT20 a partir de 500 ng de ARN total a

42 ºC por 60 min. El ADNc se resuspendió en 80 µL de agua ultrapura y se

almacenó a -80 ºC para su uso en las reacciones de PCR en tiempo real.

6.7.3. Expresión de genes mediante RT-PCR cuantitativa (RT- qPCR)

Para el análisis de genes del segundo bioensayo, se cuantificó la expresión

de algunos genes de sistema inmune en hemocitos (profenoloxidasa,

transglutaminasa, superóxido dismutasa y lisozima) así como genes de estrés

(Hsp70 y Hsp90) y digestivos (tripsina y quimotripsina) en hepatopáncreas. En el

tercer bioensayo se cuantificó la expresión de genes de [estrés (Hsp70) y

digestivos (tripsina, quimotripsina y Catepsina B)] en hepatopáncreas.

Para normalizar la expresión de los genes de interés, se evaluó la

expresión de los genes β-actina, EF1α, L-21 y 40S-S24 como genes de referencia

(Wang et al., 2007, 2010). Los genes que se utilizaron para evaluar la expresión

se muestran en las tablas 1 y 2.

21

Las amplificaciones se realizaron en el equipo CFX96 Touch Real-Time

System (Bio-Rad®) y se utilizó el software CFX Manager (Bio-Rad®) versión 3.0

para la obtención de los datos.

Tabla 1. Genes del sistema inmune y controles internos estudiados en L.

vannamei (Wang et al., 2010; Stephens et al., 2012).

Gen Secuencia del oligo

β-actina

(Control interno)

Sentido

Contrasentido

5’-CCACGAGACCACCTACAAC-3‘

5‘-AGCGAGGGCAGTGATTTC-3‘

EF1α

(Control interno)

Sentido

Contrasentido

5’-GTTGACTTGAAGGGCAATG-3‘

5’-CTTCTTGGCTTCGATTCTG-3‘

Profenoloxidasa (proFO)

Sentido

Contrasentido

5’-GAGATCGCAAGGGAGAACTG-3’

5’-CGTCAGTGAAGTCGAGACCA-3’

Superóxido Dismutasa

(SOD)

Sentido

Contrasentido

5’-ATCCACCACACAAAGCATCA-3’

5’-AGCTCTCGTCAATGGCTTGT-3’

Transglutaminasa (Tgasa)

Sentido

Contrasentido

5’-CCTCAGGATCTCCTTCACCA-3’

5’-TTGGGAAAACCTTCATTTCG-3’

Lisozima

(Lyz)

Sentido

Contrasentido

5’-GAAGCGACTACGGCAAGAAC -3’

5’- AACCGTGAGACCAGCACTCT-3’

22

Tabla 2. Genes de estrés, digestión y controles internos estudiados en L.

vannamei (Wang et al., 2010; Stephens et al., 2012; Álvarez-Ruiz, datos no

publicados).

Gen Secuencia del oligo

β-actina

(Control interno)

Sentido

Contrasentido

5’-CCACGAGACCACCTACAAC-3‘

5‘-AGCGAGGGCAGTGATTTC-3‘

EF1α

(Control interno)

Sentido

Contrasentido

5’-GTTGACTTGAAGGGCAATG-3‘

5’-CTTCTTGGCTTCGATTCTG-3‘

L-21 (Control interno)

Sentido

Contrasentido

5’-GTTGACTTGAAGGGCAATG-3’

5’-CTTCTTGGCTTCGATTCTG-3’

40S-S24 (Control interno)

Sentido

Contrasentido

5’-CAGGCCGATCAACTGTCC-3’

5’-CAATGAGAGCTTGCCTTTCC-3’

Hsp70

Sentido

Contrasentido

5’-GGCAAGGAGCTGAACAAGTC-3’

5’-TCTCGATACCCAGGGACAAG-3’

Hsp90

Sentido

Contrasentido

5’-TGGGCTTCTACTCCGCCTACC-3’

5’-ACGGTGAAAGAGCCTCCAGCA-3’

Tripsina

Sentido

Contrasentido

5’- TCCAAGATCATCCAACACGA-3’

5’-GACCCTGAGCGGGAATATC-3’

Quimotripsina

Sentido

Contrasentido

5’- GGCTCTCTTCATCGACG-3’

5’- CGTGAGTGAAGAAGTCGG-3’

Catepsina B

Sentido

Contrasentido

5’-GGATGTAACGGAGGCTTC-3’

5’-CTGTATGCTTTGCCTCCA-3’

23

Se estandarizó la cantidad de primers a utilizar para la cuantificación de la

expresión relativa de cada gen. Se realizó un pool tomando 3 µL de cada una de

las muestras (un camarón) de ADNc. Posteriormente se realizaron 5 diluciones

seriadas (1:5, 10 µL de pool de ADNc/40 µL de agua ultrapura y 1:10, 50 µL de

pool de ADN/450 µL de agua ultrapura). Se determinó la eficiencia de la reacción

construyendo para cada gen de interés una curva estándar a partir de los valores

de ciclo umbral (Cq) de las diluciones seriadas (trilplicado) utilizando las

condiciones de amplificación que más adelante se detallan. Se realizó un análisis

de regresión lineal simple, se determinó el coeficiente de correlación (R2) y a

partir de los valores de la pendiente se calculó la eficiencia de reacción para cada

gen de estudio. Para valores de eficiencia menores de 90% se repitió el

procedimiento de estandarización aumentando (de 0.7 a 1.0 µL) la cantidad de

primers (10 µM c/u). La eficiencia y R2 finales obtenidas para cada uno de los

primers se muestran en las tablas 3 y 4.

Tabla 3. Eficiencias de amplificación en el bioensayo 2.

Gen Eficiencia (%) R2

β-actina 90.5 0.986

EF1α 99.8 0.997

ProFO 94.1 0.997

SOD 100 0.996

TGasa 100 0.990

Lyz 98.9 0.998

Hsp70 100 0.992

Hsp90 92.3 0.992

Tripsina 96 0.998

Quimotripsina 90.4 0.990

Tabla 4. Eficiencias de amplificación en el bioensayo 3.

Gen Eficiencia (%) R2

β-actina 99 0.997

EF1α 94.4 0.998

L-21 94 0.996

40S-S24 100 0.997

Tripsina 90.1 0.997

Quimotripsina 100 0.996

Catepsina B 90 0.993

Hsp70 100 0.995

24

Para verificar la ausencia de dimeros de primers se realizó un análisis de la

curva de disociación (Melt step). Para ello se incrementó la temperatura de 65 a

95 °C, con un aumento de 0.5 °C cada 5 s.

Para el análisis de expresión de genes en los tratamientos, las

amplificaciones se llevaron a cabo en placas de 96 pozos con un volumen de

reacción final de 15 µL conteniendo 7.5 µL de PCR Master Mix 2x (3 µL de buffer

de reacción 5x; 1.5 µL de MgCl2 25 mM; 0.3 µL de dNTPs 10 mM; 0.75 µL de

EvaGreen 20x, BIOTIUM®; 0.15 µL de Go Taq; 1.8 de agua ultrapura), 0.7 a 1.0

µL de primers (sentido y contrasentido, 10 µM c/u, SIGMA), 1.5 a 1.8 µL de agua

ultrapura y 5 µL de templado (ADNc).

Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización a 95 °C por 3

min. Seguido de 40 ciclos a 95 °C por 10 s, 60 °C por 15 s, 72 °C por 30 s y 79

°C 5 s para adquirir la fluorescencia. Después de la amplificación se realizó una

curva de disociación (Melt step) registrando la fluorescencia cada 0.5 °C desde 65

hasta 95 °C. Se incluyó un ajustador por triplicado (lisozima en bioensayo 2 y

EF1α en bioensayo 3) en cada placa de análisis de genes, como un factor de

corrección de los valores de Cq de las muestras debido a pipeteo y variación de

lectura de una corrida a otra.

El número de copias del gen blanco y los valores de Cq se relacionan

inversamente, por lo que una muestra que contiene un mayor número de copias

del gen diana tendrá un menor valor de Cq (ciclo umbral) que el de una muestra

con un menor número de copias del mismo gen.

El nivel de expresión del ARNm de los camarones en los tratamientos con

aditivos fue determinado usando la fórmula de Pfaffl y fue normalizado con el

grupo control sin aditivos (como un calibrador con nivel de expresión de

1) (Pfaffl, 2001).

25

La fórmula para calcular la expresión es la siguiente:

Expresión relativa = E gen blanco ΔCq gen blanco (control-muestra)

E gen referencia ΔCq gen referencia (control-muestra)

Dónde:

Egen diana= Eficiencia del gen blanco o target.

Egen referencia= Eficiencia del gen referencia o control endógeno.

ΔCq gen blanco (control-muestra)= Cambio en los valores de los ciclos

umbral (Cq) del gen blanco entre la muestra calibradora (control) y la muestra

referencia o experimental.

ΔCq gen referencia (control-muestra)= Cambio en los valores de los ciclos

umbral (Cq) del control endógeno entre la muestra calibradora (control) y la

muestra referencia o experimental.

26

6.8. Análisis estadístico

Los resultados de supervivencia se sometieron a un análisis de varianza

(ANDEVA) de una vía, previa transformación de los porcentajes de supervivencia

por medio de arcoseno √%/100 para normalizar su distribución (Ostle, 1965).

Para comparar los datos obtenidos en cuanto a TCE, calidad de agua,

sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica y expresión de genes

del sistema inmune, estrés y digestión se llevó a cabo una prueba de normalidad

(Kolmogorov-Smirnov o Shapiro-Wilk) y homocedasticidad (Bartlett).En caso de

ser necesario, los datos se normalizaron transformándolos a log10.

Posteriormente, se realizó un ANDEVA de una vía para detectar diferencias entre

tratamientos (p<0.05) y una prueba de Tukey (Prueba de Diferencia Significativa

Honesta, DSH) para identificar la naturaleza de esas diferencias (p<0.05).

27

7. RESULTADOS

7.1. Bioensayo 1: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el crecimiento y

supervivencia de L. vannamei cultivado con alta densidad y cero recambio

de agua

7.1.1. Incidencia inicial de WSSV

Los resultados obtenidos mediante la PCR anidada mostraron que un 50%

de los organismos utilizados en el bioensayo estaban infectados con WSSV al

inicio.

7.1.2. Tasa de crecimiento específico

La TCE (%/d) de los camarones en los cuatro tratamientos fue la siguiente:

I) 2.79 ± 0.29; II) 2.84 ± 0.17; III) 2.82 ± 0.11; IV) 3.22 ± 0.06 (Fig. 1). No hubo

diferencias significativas respecto al crecimiento entre los tratamientos (p>0.05).

Figura 1. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei en el bioensayo 1. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%). Se indican los promedios ± EE.

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

I II III IV

TCE

(%/d

)

Tratamientos

28

7.1.3. Supervivencia

La supervivencia al final del bioensayo se muestran en la Figura 2, donde

el tratamiento I) (control) muestra una supervivencia del 96.66%. El tratamiento II)

mostró una supervivencia de 83.33%. El tratamiento III) tuvo una supervivencia de

93.33%. En el tratamiento IV) se obtuvo una supervivencia de 100%.

Figura 2. Supervivencia de L. vannamei en el bioensayo 1. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%). Se indican los promedios ± EE.

7.1.4. Parámetros fisicoquímicos

Los parámetros fisicoquímicos (Tabla 5) se mantuvieron dentro de los

intervalos óptimos para el cultivo de camarón blanco (Brock & Main, 1994). La

temperatura mostró valores promedio de 26 °C. La salinidad se mantuvo en el

intervalo de 30.1 y 31‰. El oxígeno disuelto se mantuvo entre 5.19 y 5.49 mg/L.

El pH mostró valores promedio entre 8.27 y 8.36.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

I II III IV

Sup

erv

ive

nci

a (%

)

Tratamientos

29

Tabla 5. Temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en el bioensayo 1.

Tratamientos ºC ‰ OD (mg/L) pH

I

26.66 ± 1.89 30.22 ± 0.64 5.49 ± 0.63 8.29 ± 0.11

II

26.44 ± 1.85 30.24 ± 0.66 5.29 ± 0.55 8.27 ± 0.10

III

26.26 ± 1.96 30.19 ± 0.55 5.36 ± 0.41 8.36 ± 0.09

IV

26.38 ± 1.93 30.11 ± 0.32 5.19 ± 0.56 8.30 ± 0.08

Intervalo óptimo 23-30 15-35 4.0-10.0 8.1-9.0

Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR

4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-

80%). Se indican los promedios ± DE.

7.1.5 Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos)

Durante el bioensayo 1, la concentración promedio de amonio mostró

valores entre 1.281 y 2.066 mg/L, por encima del límite permitido (0.1-1.0). El

tratamiento I) (control) mostró una concentración de amonio de 2.066 ± 1.07 mg/L,

el tratamiento II) de 1.679 ± 0.85 mg/L, el tratamiento III) de 1.736 ± 0.98 mg/L y el

IV) de 1.281 ± 0.86 mg/L. Los valores de nitritos estuvieron dentro del límite

permitido, por debajo de los 0.5. Por tratamiento se encontró que en el tratamiento

I) la concentración fue de 0.004 ± 0.19 mg/L, II) 0.003 ± 0.28 mg/L, III) 0.034 ± 0.22

mg/L y IV) 0.006 ± 0.19 mg/L. En cuanto a los nitratos, estuvieron dentro del

intervalo óptimo. El tratamiento I) presentó 0.058 ± 0.01 mg/L, el tratamiento II)

0.045 ± 0.01 mg/L, el III) 0.160 ± 0.06 mg/L y el IV) 0.231 ± 0.10 mg/L (Tabla 6).

30

Tabla 6. Concentración de amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 1.

Tratamientos Amonio (mg/L) Nitritos (mg/L) Nitratos (mg/L)

I 2.07 ± 1.07 0.004 ± 0.19 0.06 ± 0.01

II 1.77 ± 0.85 0.003 ± 0.28 0.05 ± 0.01

III 1.74 ± 0.98 0.034 ± 0.22 0.16 ± 0.06

IV 1.33 ± 0.86 0.006 ± 0.19 0.23 ± 0.10

Intervalo óptimo 0.1 - 1.0 < 0.5 0.4 - 0.8

Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR

4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-

80%). Se indican los promedios ± DE.

7.1.6 Sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica

La concentración final de los SST varió entre 0.279 y 0.523 mg/L, donde el

I) 0.279 ± 0.01; II) 0.523 ± 0.11; III) 0.436 ± 0.10; IV) 0.504 ± 0.10. La

concentración de materia orgánica estuvo entre 0.095 y 0.231 mg/L, donde el I)

0.095 ± 0.01; II) 0.178 ± 0.03; III) 0.178 ± 0.05; IV) 0.231 ± 0.06, mientras que la

de materia inorgánica estuvo entre 0.184 y 0.346 mg/L, donde el I) 0.184 ± 0.01;

II) 0.346 ± 0.08; III) 0.258 ± 0.05; IV) 0.274 ± 0.04. No hubo diferencias

significativas entre los tratamientos (p>0.05) (Fig. 3).

31

Figura 3. Sólidos suspendidos totales y concentración de materia orgánica e inorgánica en el bioensayo. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) Melaza (20-80%); III) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L); IV) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza (20-80%). Se indican los promedios ± EE de cada tratamiento.


supervivencia, estrés, digestión y sistema inmune de L. vannamei cultivado

con alta densidad y cero recambio de agua


Los resultados obtenidos mediante la PCR anidado indicaron que un 60%

de los organismos experimentales estaban infectados con WSSV al inicio del

experimento.


La TCE (%/d) en el control y en tratamiento fueron las siguientes: I) 2.97 ±

0.14; II) 2.69 ± 0.38 (Fig. 4). No hubo diferencias significativas respecto al

crecimiento entre los tratamientos (p>0.05).

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

I II III IV

Sólid

os

susp

en

did

os

tota

les,

Mat

eri

a

org

ánic

a e

ino

rgán

ica

(mg/

L)

Tratamientos

Sólidos suspendidos totales

Materia inorgánica

Materia orgánica

32

Figura 4. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.


La supervivencia al final del bioensayo fue del 100% en ambos

tratamientos.


Los parámetros fisicoquímicos (Tabla 7) se mantuvieron dentro de los

intervalos óptimos para el cultivo de camarón blanco, excepto el oxígeno disuelto

según (Brock & Main, 1994).La temperatura mostró intervalos de 23 y 24 °C. La

salinidad se mantuvo en 29.81 y 29.9 ‰. El oxígeno disuelto se mantuvo entre

3.53 y 3.69 mg/L. El pH mostró valores promedio de entre 8.33 y 8.43.


Tratamientos ºC ‰ OD (mg/L) pH

I

23.71 ± 3.67 29.81 ± 1.96 3.53 ± 0.49 8.43 ± 0.10

II

24.20 ± 3.44 29.90 ± 1.86 3.69 ± 0.65 8.33 ± 0.12

Intervalo óptimo

23-30 15-35 4.0-10.0 8.1-9.0

Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) +

melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

I II

TCE

(%/d

)

Tratamientos

33

7.2.5 Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos)

Durante el bioensayo 2 la concentración promedio de amonio mostró

valores entre 0.660 y 5.479 mg/L, donde el control estuvo por encima del límite

permitido (0.1-1.0). El tratamiento I (control) mostró una concentración de amonio

de 5.479 ± 5.50mg/L y el tratamiento II de 0.660 ± 0.70 mg/L. Los valores de

nitritos estuvieron dentro del límite permitido, por debajo de 0.5 en los tratamientos

I 0.061 ± 0.08 mg/L y II 0.005 ± 0.003 mg/L. En cuanto a los nitratos, estuvieron

dentro del intervalo óptimo. El tratamiento I presentó 0.170 ± 0.039 mg/L y el

tratamiento II 0.043 ± 0.02 mg/L. Hubo diferencias significativas entre tratamientos

en los tres parámetros (p<0.05) (Tabla 8).

Tabla 8. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 2.


I 5.50 ± 5.50 0.061 ± 0.08 0.17 ± 0.39

II 0.66 ± 0.70 0.005 ± 0.003 0.04 ± 0.02


Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) +

melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.

7.2.6 Sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica

La concentración final de los SST fluctuó entre 0.723 y 1.211 mg/L. El

tratamiento I (control) mostró una concentración de 0.723 ± 0.04mg/L y el

tratamiento II de 1.211 ± 0.28 mg/L. El promedio de materia orgánica varió entre

0.386 y 0.668 mg/L, mientras que la materia inorgánica estuvo entre 0.337 y 0.543

mg/L (Fig. 5).

b

a

b

a a

b

34

Figura 5. Sólidos suspendidos totales y concentración de materia orgánica e inorgánica del bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

7.2.7 Análisis de genes

Los resultados muestran que la expresión de los genes

profenoloxidasa,transglutaminasa, Hsp70 y Hsp90 no fue significativamente

diferente entre los tratamientos (p>0.05). Por otro lado, la expresión de los genes

superóxido dismutasa, lisozima, tripsina y quimotripsina fue significativamente

mayor en el tratamiento II respecto al tratamiento I (Figs. 6, 7 y 8).

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

I II

Sólid

os

susp

en

did

os

tota

les,

Mat

eri

a

org

ánic

a e

ino

rgán

ica

(mg/

L)

Tratamientos

Sólidos suspendidostotales

Materia orgánica

Materia Inorgánica

35

Figura 6. Expresión relativa de los genes del sistema inmune de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

I II

Exp

resi

ón

re

lati

va d

e S

OD

Tratamientos

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

I II

Exp

resi

ón

re

lati

va d

e T

Gas

a

Tratamientos

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

I II

Exp

resi

ón

re

lati

va d

e p

roFO

Tratamientos

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

I II

Exp

resi

ón

re

lati

va d

e l

iso

zim

a

Tratamientos

a a

b

b

36

Figura 7. Expresión relativa de genes de estrés de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

Figura 8. Expresión relativa de genes digestivos de L. vannamei en el bioensayo 2. Tratamientos: I) Control sin aditivos; II) B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

0

0.5

1

1.5

2

I II

Exp

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lati

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0

Tratamientos

0

0.2

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1.2

I II

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lati

va d

e H

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0

Tratamientos

0

0.2

0.4

0.6

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1

1.2

1.4

I II

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re

lati

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sin

a

Tratamientos

0

0.2

0.4

0.6

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1

1.2

I II

Exp

resi

ón

re

lati

va d

e

qu

imo

trip

sin

a

Tratamientos

a

a

b

b

37

7.3 Bioensayo 3: Efecto de B. licheniformis BCR 4-3 en el crecimiento,

supervivencia, estrés y digestión de L. vannamei cultivado con alta

densidad, cero recambio de agua y diferentes tasas de alimentación.


Los resultados obtenidos mediante la PCR anidado muestran que el 60%

de los organismos experimentales estaban infectados con WSSV al inicio del

experimento.


La TCE (%/d) en los tratamientos del experimento 3 fue como sigue: I) 5.73 ±

0.22; II) 5.57 ± 0.14; III) 5.79 ± 0.14; IV) 5.58 ± 0.39 y V) 5.24 ± 0.51 (Fig. 9). No

hubo diferencias significativas respecto al crecimiento entre los tratamientos

(p>0.05).

Figura 9. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei en el bioensayo 3. Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

I II III IV V

TCE

(%/d

)

Tratamientos

38


La supervivencia al final del bioensayo 3 fue del 100% en todos los

tratamientos.


Los parámetros fisicoquímicos registrados en los tratamientos del

bioensayo 3 (Tabla 9) se mantuvieron dentro de los intervalos óptimos para el

cultivo de camarón blanco (Brock & Main, 1994).


Tratamientos T ºC S (‰) OD (mg/L) pH

I 23.43 ± 2.45 30.93 ± 1.22 6.46 ± 0.59 8.34 ± 0.09

II 23.29 ± 2.13 30.00 ± 0 6.20 ± 0.61 8.37 ± 0.06

III 23.57 ± 2.00 30.00 ± 0 5.87 ± 0.56 8.31 ± 0.06

IV 23.30 ± 2.08 30.00 ± 0 6.24 ± 0.39 8.35 ± 0.05

V 23.71 ± 2.18 30.00 ± 0 6.13 ± 0.48 8.40 ± 0.05

Intervalo óptimo 23-30 15-35 4.0-10.0 8.1-9.0

Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento+ B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.

7.3.5. Parámetros de calidad de agua (amonio, nitritos y nitratos)

Durante el bioensayo la concentración promedio de amonio mostró valores

entre 0.739 y 3.249 mg/L. El tratamiento I mostró una concentración de amonio

dentro de los niveles óptimos. En contraste, el resto de los tratamientos estuvieron

por encima de lo recomendado. Los valores de nitritos y nitratos estuvieron dentro

del límite permitido (Tabla 10). Se encontraron diferencias significativa en los tres

parámetros entre los tratamientos con respecto al control I) con recambio de agua

(p<0.05)

39

Tabla 10. Amonio, nitritos y nitratos (mg/L) en el bioensayo 3.


I 0.74 ± 0.59 0.06 ± 0.05 0.22 ± 0.35

II 3.25 ± 3.26 0.16 ± 0.15 0.50 ± 0.49

III 1.56 ± 1.81 0.26 ± 0.16 0.73 ± 0.40

IV

2.61 ± 2.84 0.21 ± 0.16 0.72 ± 0.41

V 2.50 ± 3.36 0.22 ± 0.17 0.71 ± 0.41


Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± DE.

7.3.6. Determinación de bioflocs

La concentración final de bioflocs varió entre 1.09 y 21.50 mL/L. El

tratamiento I mostró una concentración de 1.09 ± 0.43 mL/L, tratamiento II de

21.14 ± 2.21 mL/L, tratamiento III 20.08 ± 3.77 mL/L, tratamiento IV 21.50 ± 3.23

mL/L y el tratamiento V 18.34 ± 3.12 mL/L (Fig. 10).

b

a

a

a a

a

c

c

c

b

c

d

b

c

d

40

Figura 10. Concentración de bioflocs en el bioensayo 3. Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

7.3.7. Análisis de genes

La expresión relativa del gen de Catepsina B no presentó diferencias

significativas (p>0.05) entre los tratamientos. Por otro lado, la expresión de los

genes de tripsina, quimotripsina y Hsp70 mostraron diferencias significativas en los

tratamientos 2, 3, 4 y 5 respecto al tratamiento I (control con recambio de agua)

(Figs. 11 y 12).

0

5

10

15

20

25

I II III IV V

Bio

flo

cs (

mL/

L)

Tratamientos

a

b b

b

b

41

Figura 11. Expresión relativa de genes digestivos de L. vannamei en el bioensayo 3. Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

0

0.5

1

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I II III IV V

Exp

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I II III IV V

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Tratamientos

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I II III IV V

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e

trip

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a

Tratamientos

a

c

abc abc

ac

a ab

ac

c bc

42

Figura 12. Expresión relativa del gen de estrés de L. vannamei en el bioensayo 3.Tratamientos: I) 100% de alimento + recambio de agua cada 5 días; II) 100% de alimento sin recambio de agua; III) 100% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; IV) 90% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%; V) 80% de alimento + B. licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + melaza 80%. Se indican los promedios ± EE.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

I II III IV V

Exp

resi

ón

re

lati

va d

e H

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0

Tratamientos

a

b ab ab

ab

43

8. DISCUSIÓN

Bioensayos 1 y 2 (artículo 1)

El cultivo superintensivo de camarón con cero o mínimo recambio de agua

es amigable con el medio ambiente ya que previene las enfermedades en el

mismo sistema y en las poblaciones de camarón silvestre. Además, se evita la

descarga de aguas ricas en nutrientes a los cuerpos de agua costeros

(Wasielesky et al., 2006). Por otro lado, con cero o escaso recambio de agua se

promueve la formación de bioflocs (autótrofos o heterótrofos). La producción de

bioflocs en sistemas heterótrofos se puede aumentar gracias al incremento en la

proporción C/N en los sistemas de cultivo (Avnimelech, 2006; Crab et al., 2007).

En el presente estudio, además de no recambiar agua y aplicar melaza

para permitir la formación de bioflocs, se aplicaron bacterias benéficas (B.

licheniformis BCR 4-3) en algunos de los sistemas de cultivo de camarón para

disminuir la concentración de desechos nitrogenados. Según Villamil et al. (2009),

la adición de probióticos permite el establecimiento de la microbiota intestinal e

incrementa el peso, la supervivencia, la resistencia a infecciones y la respuesta

inmune de los organismos cultivados. Además, los probióticos mejoran la calidad

de agua.

En el primer bioensayo no hubo diferencias significativas en el peso de los

organismos y la supervivencia fue alta. Sin embargo, el mejor tratamiento (100%

de supervivencia y la mayor TCE) fue donde se aplicó B. licheniformis BCR 4-3 y

melaza. Es importante señalar que la calidad del agua de los cultivos intensivos

no sólo está determinada por la composición de la comunidad microbiana sino

también por parámetros fisicoquímicos de la misma tales como salinidad,

temperatura, concentración de oxígeno y pH, así como otros factores estocásticos

que pueden favorecer la entrada y proliferación de algunos microorganismos

(Verschuere et al., 1997; 2000a; Villamil et al., 2003). En el bioensayo 1 los

parámetros mencionados estuvieron dentro de los límites permitidos para el

cultivo de camarón (Brock & Main, 1994). El objetivo principal de la utilización de

probióticos fue disminuir el amonio y los nitritos. Al respecto, no se presentaron

diferencias significativas entre los tratamientos en la concentración de nitritos y

nitratos, los cuales estuvieron dentro de los límites óptimos para el cultivo de

camarón. Por otro lado, en la concentración de amonio tampoco se observaron

diferencias significativas. Sin embargo, el amonio estuvo por encima del intervalo

44

permitido en todos los tratamientos, sin embargo se observó una reducción de

aproximadamente 40% en el tratamiento IV (bacilos más melaza) respecto al

control, lo que concuerda con lo reportado por Weber et al. (2013), quien utilizó

tres cepas de Bacillus sp. en un cultivo de camarón para reducir el amonio entre

un 50 y 87%.

Los sistemas de cultivo hiperintensivos se caracterizan por generar

grandes cantidades de sólidos suspendidos totales (SST) y lodos en el fondo de

los sistemas de cultivo (Torres-Beristain, 2005; Vinatea et al., 2010; Coyle et al.,

2011). Ray et al. (2010) mencionan que las concentraciones altas de SST pueden

ocluir las branquias de los camarones y afectar su crecimiento. En el presente

estudio la mayor concentración SST (523 mg/L) se dio en el tratamiento con

melaza y bacilos pero estuvo dentro del intervalo permitido ya que según

Schveitzer et al. (2013) la concentración de TSS en los sistemas de cultivo debe

estar entre 400 y 600 mg/L. Por otro lado, el control de los SST es importante ya

que el aumento de los SST conlleva un aumento de la materia orgánica, la cual,

según Ferreira et al. (2011) promueve el desarrollo de especies del género Vibrio,

muchas de las cuales son potencialmente patógenas.

En el segundo bioensayo se tomó el mejor tratamiento (B. licheniformis

BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + 80% melaza) del primer bioensayo. No hubo

diferencias significativas entre tratamientos respecto al crecimiento y la

supervivencia (100 %). La salinidad y el pH estuvieron dentro de los valores

óptimos en los dos tratamientos (Brock & Main, 1994); sin embargo, el oxígeno

disuelto y la temperatura estuvieron por debajo del intervalo óptimo, lo que implica

cierto grado de estrés. Respecto a los desechos nitrogenados (amonio, nitritos y

nitratos), éstos disminuyeron significativamente en el tratamiento II (bacilos más

melaza) respecto al control, lo que concuerda con lo reportado por Weber et al.

(2013), quien utilizó tres cepas de Bacillus sp. en un cultivo de camarón para

reducir el amonio. Silva et al. (2013) mencionan que el aumento considerable del

nitrógeno y el fósforo no son asimilables por el camarón (L. vannamei) y son

tóxicos. Confirmando lo anterior, Chen et al. (2012) mencionan que una alta

concentración de desechos nitrogenados interfiere con la respuesta inmune del

camarón (L. vannamei).

En los sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica no hubo

diferencias significativas, pero la concentración final de los SST fue 0.723 (control)

45

y 1211 mg/L (tratamiento II), muy por arriba de las concentraciones permitidas

(400-600 mg/L) según Schveitzer et al. (2013), quienes mencionan que en

concentraciones por encima de 800 mg/L, observaron una mortalidad alta en L.

vannamei cultivado en un sistema hiperintensivo. De manera similar, Hopkins et

al. (1993) mencionan que en cultivos intensivos sin intercambio de agua, la alta

concentración de sólidos se relaciona con la mortalidad de los camarones por el

aumento en la oclusión de las branquias.

En el segundo bioensayo no hubo diferencias significativas entre los

tratamientos en la expresión de los genes profenoloxidasa y transglutaminasa.

Por otro lado, se observó una sub-expresión significativa en los genes SOD y

lisozima en el tratamiento II respecto al control. Los resultados contrastan con los

reportados por Kim et al. (2014), quienes estudiaron, en un sistema

hiperintensivo, la expresión de seis genes del sistema inmune en postlarvas de

camarón blanco, incluido el de la profenoloxidasa. Los autores mencionan que los

parámetros fisicoquímicos y la concentración de SST estuvieron dentro de los

intervalos óptimos para el cultivo de camarón blanco. En el trabajo mencionado,

se encontró un aumento significativo en los niveles de expresión del ARNm y

atribuyen el aumento a los bioflocs, particularmente a la gran cantidad de

bacterias presentes en los mismos y que sirven de alimento para el camarón. La

pared celular de microorganismos como bacterias y levaduras contiene moléculas

(lipopolisacáridos, peptidoglucanos y betaglucanos) que pueden activar el sistema

inmune (Johansson & Soderhall 1985; Kanost & Gorman 2008; Labbe & Little

2009; Rao, Ling & Yu 2010). El sistema profenoloxidasa (FO) juega un rol

importante en la inmunidad innata de los crustáceos, particularmente en la

cicatrización de las heridas y la defensa contra los patógenos (Pang et al., 2011).

Además, diversos autores han sugerido que la activación y regulación del sistema

profenoloxidasa tiene funciones de reconocimiento y comunicación celular entre

los hemocitos (Söderhäll, 1982, 1992).

La transglutaminasa se encuentra en el interior de los hemocitos hialinos

del camarón y se libera al plasma por daño tisular o como una repuesta de los

hemocitos ante la presencia de lipopolisacáridos de bacterias Gram (-) o β-1,3-

glucanos de hongos (Martín et al., 1991; Yeh et al., 1998; Montaño-Pérez et al.,

1999). La enzima no solamente está implicada en la coagulación de la hemolinfa,

46

sino que protege al camarón contra infecciones bacterianas y virales y regula

otros genes del sistema inmune como la crustina y lisozima (Fagutao et al., 2012).

La función de la SOD es eliminar los radicales libres del oxígeno mediante

la conversión de éstos en peróxido de hidrógeno y oxígeno. Posteriormente la

GPx transforma el peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno mediante catálisis. En

el presente estudio se encontró una sub-expresión del gen de la SOD en el

tratamiento con bacilos y melaza respecto al tratamiento control. No hay reportes

sobre la expresión del gen SOD en camarones cultivados en sistemas

hiperintensivos con bioflocs.

La lisozima es una enzima hidrolítica lisosomal que pertenece al sistema de

péptidos antimicrobianos y es un componente importante del sistema de defensa

del camarón contra bacterias Gram negativas (Wang et al., 2010). En este trabajo

se hizo el análisis de la actividad de la lisozima en hemocitos dando como

resultado una sub-expresión significativa del gen en el tratamiento II (B.

licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/L) + 80% de melaza) respecto al control. No

hay reportes sobre la expresión de la lisozima en camarones cultivados en

sistemas hiperintensivos con bioflocs.

Con base en lo discutido anteriormente, es posible que las condiciones de

cultivo (temperatura y oxígeno disuelto subóptimos y alta concentración de SST)

hayan afectado la respuesta inmune de los camarones.

Este es el primer reporte sobre la expresión de genes de las proteínas de

choque térmico (HSP) en camarones cultivados en sistemas hiperintensivos con

bioflocs. Las HSP, también conocidas como proteínas de estrés, son un conjunto

de proteínas altamente conservadas, de amplia distribución en la naturaleza

(Roberts et al., 2010 ). Las HSP sirven como reguladores de la función normal de

las células, ayudando en el plegamiento adecuado, montaje y transporte de

proteínas nacientes ( Gething & Sambrook, 1992 ). Del mismo modo, también

funcionan como defensas celulares, previenen la desnaturalización de proteínas y

ayudan en el replegamiento y eliminación de las proteínas desnaturalizadas por

estrés biótico y abiótico (Sanders, 1993; Feder & Hofmann, 1999). En el segundo

bioensayo no hubo diferencias significativas en la expresión de los genes Hsp70 y

Hsp90. Los resultados sugieren que los camarones no estaban estresados a

pesar de la temperatura y oxígeno disuelto subóptimos y la alta concentración de

SST.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1532045612000671#bb0175




47

En el segundo bioensayo, la expresión del ARNm de la tripsina y quimotripsina

fue sub-regulada significativamente en el tratamiento II respecto al grupo control.

Las enzimas mencionadas son proteinasas (endopeptidasas) serinas (Sánchez-

Paz et al., 2003; Muhlia-Almazán & García-Carreño, 2002) además son las

principales enzimas digestivas del camarón blanco (Muhlia-Almazán & García-

Carreño, 2002). No hay reportes sobre la expresión de genes de enzimas

digestivas en camarones cultivados en sistemas hiperintensivos con bioflocs.

Bioensayo 3 (artículo 2)

El cultivo del camarón blanco es muy importante en el noroeste de México;

sin embargo, los problemas causados por patógenos como WSSV y Vibrio

parahaemolyticus han mermado la producción. Por lo anterior, los cultivos

hiperintensivos se tornan relevantes, especialmente en las maternidades donde

se pretende crecer los camarones hasta aproximadamente 2 g antes de

sembrarlos en los estanques semi-intensivos de engorda. En los cultivos

hiperintensivos con cero o escaso recambio de agua, los bioflocs (productividad

natural) puede servir como alimento y para mantener la calidad del agua y la

salud de los camarones cultivados (Crab et al., 2007; Crab et al., 2010; Xu & Pan,

2012). De acuerdo a lo anterior, en este trabajo se realizó un cultivo hiperintensivo

con cero recambio de agua, aplicación de melaza (sólo los primeros 17 días) y

bacilos en el agua, y diferentes porcentajes de alimentación diaria. La

supervivencia fue del 100% en todos los tratamientos y no hubo diferencias

significativas en el crecimiento en peso, a pesar de que en los tratamientos IV y V

se alimentó con sólo el 90 y 80% de la ración de alimento (formulado),

respectivamente. Los resultados son consistentes con los obtenidos por Panjaitan

(2010) quien cultivó Penaeus monodon en un sistema intensivo sin recambio de

agua, con adición de melaza y diferentes porcentajes de alimentación, observó

que es posible reducir la ración de alimento (formulado) diario hasta en un 25%

sin afectar el crecimiento. Lo anterior lo atribuyó a los flóculos que sirvieron de

alimento natural. De la misma manera, Becerra-Dórame et al. (2012) mencionan

que en el cultivo hiperintensivo de L. vannamei, con cero recambio de agua y

aplicando melaza, los flóculos, junto con el alimento formulado, mejoraron el

crecimiento y la supervivencia.

48

Los parámetros fisicoquímicos excepto la temperatura estuvieron dentro de

los límites permitidos según lo señalado por Brock & Main (1994). La adición de

melaza para aumentar la relación C/N y promover el desarrollo de bioflocs fue

eficaz en el mantenimiento de niveles bajos de nitritos y nitratos en todos los

tratamientos; sin embargo, la concentración de amonio estuvo por encima de lo

permitido con excepción del control I con recambio de agua (agua clara). Por otro

lado, en los tratamientos con aditivos (III, IV y V) la concentración de amonio fue

significativamente menor que el control II (sin aditivos y sin recambio de agua)

donde los camarones se alimentaron con el 100% de la ración de alimento. Estos

resultados concuerdan con la predicción teórica hecha por Avnimelech (1999) y

los resultados prácticos obtenidos por otros investigadores (Samocha et al. 2007;

Arnold et al., 2009; Ballester et al., 2010). Cabe señalar que la acumulación de

nitratos se observó en los tratamientos II, III, IV y V con bioflocs (sin

recambio). Lo anterior indica que las bacterias nitrificantes estaban presentes en

los bioflocs y ambos procesos de eliminación de desechos nitrogenados

(heterótrofos y autótrofos) pueden haber ocurrido en el sistema de

cultivo. Además, el pH se mantuvo alrededor de 8.3 en todos los tratamientos, lo

que indica que probablemente predominó el sistema autótrofo ya que la melaza

promueve el sistema heterótrofo y ésta se dejó de dar en el día 17. Becerra-

Dorame et al. (2012) mencionan que el pH disminuye en los sistemas heterótrofos

debido a la liberación de CO2 a la columna de agua por parte de las bacterias

heterótrofas. Ballester et al. (2010) mencionan que en un cultivo hiperintensivo de

Farfantepenaeus paulensis con bioflocs (heterótrofo), el pH fluctuó entre 6.4 y

7.7.

En los sólidos suspendidos totales, materia orgánica e inorgánica no hubo

diferencias significativas entre los tratamientos sin recambio pero si la hubo con

respecto al control I con recambio de agua. La concentración final de los SST en

los tratamientos sin recambio estuvo muy por arriba de las concentraciones

permitidas (400-600 mg/L) según Schveitzer et al. (2013), quienes mencionan que

en concentraciones por encima de 800 mg/L, observaron una mortalidad alta en L.

vannamei cultivado en un sistema hiperintensivo. De manera similar, Hopkins et

al. (1993) mencionan que en cultivos intensivos sin intercambio de agua, la alta

concentración de sólidos se relaciona con la mortalidad de los camarones por el

aumento en la oclusión de las branquias.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2109.2012.03115.x/full#are3115-bib-0003




49

La tripsina y la quimotripsina son endopeptidasas serinas (Sánchez-Paz et

al., 2003; Muhlia-Almazán & García-Carreño, 2002) que tienen un rol fundamental

en la digestión del camarón blanco (Muhlia-Almazán & García-Carreño, 2002). En

el bioensayo 3, la expresión del ARNm de la tripsina y quimotripsina fue sub-

regulada significativamente en los tratamientos IV y V respecto al control con

recambio de agua. En cuanto al control sin recambio de agua, la quimotripsina

mostró una sub-expresión significativa en el tratamiento IV (bacilos, melaza y 90%

de la ración de alimento). De manera similar, en la tripsina no hubo diferencias

significativas pero la sub-expresión fue notable en los tratamientos IV y V. Al

parecer en los tratamientos mencionados la sub-expresión de las enzimas tuvo

que ver con una menor cantidad de proteína de la dieta y de los bioflocs ya que,

como se mencionó anteriormente, predominó el sistema autótrofo. Al respecto,

Becerra-Dorame et al. (2012) mencionan que la mayor actividad de la tripsina en

el cultivo heterótrofo del camarón blanco está relacionada con la concentración

elevada de proteína de los bioflocs.

Las proteínas de estrés por calor (HSP) son un conjunto de proteínas

altamente conservadas, de amplia distribución en la naturaleza, que responden

rápidamente cuando hay estrés ambiental (Roberts et al., 2010; Qian et al. 2012).

Las HSP participan en funciones celulares esenciales como metabolismo,

diferenciación celular, crecimiento celular y en la apoptosis (Ranford et al., 2000;

Multhoff, 2006; Qian et al., 2012). Las HSP no solamente se expresan cuando hay

un estrés por calor, sino que también se sintetizan cuando hay radicales libres del

oxígeno, drogas antiinflamatorias, metales pesados, desnutrición e infecciones

virales y bacterianas (Gehrmann et al., 2004; Multhoff, 2007; Asea et al.,

2008). En este trabajo se registró una sub-expresión de Hsp70 en el tratamiento

IV respecto al control II (sin recambio de agua, sin aditivos y alimentados con el

100% de la dieta). Los resultados muestran claramente que los camarones del

control II estaban más estresados que los de los otros tratamientos. Además,

también es importante considerar que posiblemente existió cierto grado de estrés

por la baja temperatura y oxígeno y la alta concentración de SST.


50

9. CONCLUSIONES

1.- La bacteria B. licheniformis BCR 4-3 y la melaza disminuyeron el

amonio, los nitritos y los nitratos en los sistemas de cultivo del camarón blanco.

Además, se obtuvieron supervivencias altas y un crecimiento igual al de los

camarones de los grupos control.

2.- En los tratamientos con B. licheniformis BCR 4-3 y melaza y el control,

se observó la misma expresión en los genes proFO y TGasa y una sub-expresión

en la SOD y lisozima en el tratamiento con aditivos, lo cual indica un buen estado

de salud.

3.- Se observó una sub-expresión de las enzimas digestivas (tripsina,

quimotripsina y catepsina B en los tratamientos con B. licheniformis BCR 4-3 y la

melaza respecto al control.

4.- Los camarones del control II (sin recambio de agua) del bioensayo 3

estaban estresados ya que la expresión de la Hsp70 fue significativamente mayor

en comparación con los demás tratamientos.

51

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cultivo hiperintensivo de camarón blanco litopenaeus

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