cultivo de secreciones de heridas y oftálmicos
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Universidad Autónoma De YucatánCampus de Ciencias de la Salud
Facultad de Química
Lic. en Químico Farmacéutico Biólogo
Séptimo semestre
Laboratorio de Análisis microbiológicos
Reporte de la práctica No. 10: Cultivo de secreciones de heridas y oftálmicos
Profesora: ECQB. Enna Rosa Coello Mis
Alumno: Feliciano Raí Encalada Salazar
Mérida, Yucatán a 28 de octubre de 2016
REPORTE DE LA PRÁCTICA No. 10
Cultivo de secreciones de heridas y oftálmicos
OBJETIVOS
Identificar el agente causal de una infección ocular
Identificar el agente causal de una infección de heridas
INTRODUCCIÓN
La piel y las mucosas en los seres humanos son la primera protección contra los
microorganismos presentes en el medio ambiente. Las células epiteliales forman
una barrera física de múltiples capas celulares unidas estrechamente que, junto
con la producción de sustancias como la queratina, moco, defensinas y
catelicidinas, evitan la penetración de microorganismos a capas más profundas en
el cuerpo que permita su diseminación. Por ello, la pérdida de la integridad de
estas estructuras a causa de heridas deja susceptible al organismo a ser invadido
por microorganismos.1 Ciertos factores propios del paciente facilitan la evolución
de una infección de las heridas, como un sistema inmune debilitado, la edad,
enfermedades como la diabetes, el alcoholismo, el tabaquismo, el estrés,
desnutrición, entre otros. Sin embargo, no sólo estos factores son determinantes
en el desarrollo de una infección sino también, son importantes las características
de las bacterias, es decir, sus factores de virulencia como las proteínas de
adhesión, cápsulas, biofilms, producción de exotoxinas y endotoxinas, enzimas y
polisacáridos superficiales.2 Es importante distinguir tres términos en referencia a
la presencia de bacterias en la herida: 1) contaminación, las bacterias no
aumentan de número ni causan daño, 2) colonización, las bacterias se
multiplican pero no causan daño e 3) infección, las bacterias se multiplican,
interrumpen la cicatrización y causan daño.3
Las heridas se dividen en agudas y crónicas, y los síntomas y signos producidos
por la infección de éstas suelen ayudar a diferenciarlas. En el primer caso, hay
presencia de dolor, eritema, calor, hinchazón, secreción purulenta, fiebre, mal olor,
linfangitis, entre otros.3 Los microorganismos causantes de infección en este tipo
de heridas varían en su importancia en cada caso:
Heridas quirúrgicas: los patógenos dependen según la zona intervenida. Ej.
S. aureus, E. coli, Bacteroides fragilis, Klebsiella, Clostridium,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus, estafilococos coagulasa
negativos, Candida albicans.4
Quemaduras: los primeros días se aíslan bacterias grampositivas pero a
partir de la segunda semana predominan las gramnegativas. Ej. P.
aeruginosa, S. aureus, enterobacterias, Candida albicans, Aspergillus sp.5
Infecciones por mordeduras de animales: suelen ser polimicrobianas. Ej.
Pasteurella multocida, S. aureus, Streptococcus sp., Moraxella sp.,
Neisseria sp., B. fragilis, Fusobacterium, Capnocytophaga canimorsus,
Bartonella henselae, Francisella tularensis, Y. pestis.6
Por otro lado, en las infecciones en herida crónicas los cambios suelen ser sutiles,
como cambios de color de la herida, cambio de las características del exudado,
induración, formación de bolsas y puentes, etc.3 Aquí se incluyen las heridas en
los diabéticos:
En diabéticos: S. aureus, S. epidermidis, estreptococos, enterococos,
Proteus sp., E. coli, Klebsiella sp., P. aeruginosa, Peptostreptococcus sp.,
Clostridium sp., Propionibacterium sp., Bacteroides fragilis.7
Se emplean diversas muestras para aislar microorganismos. Se puede emplear
hisopado de la herida, sin embargo, la biota normal (ej. estafilococos coagulasa
negativos, Clostridium perfringens, Bacillus, Acinetobacter) puede contaminar la
muestra.8, 9 Se prefiere el raspado de heridas, biopsia de tejido o el aspirado del
líquido presente en la parte profunda de la herida.8
Las infecciones oculares son otras enfermedades de importancia, dentro de las
cuales están la conjuntivitis (S. aureus, H. influenzae, S. pneumoniae, P.
aeruginosa), queratitis (S. aureus, Candida, Fusarium, Acanthamoeba), uveítis y
endoftalmitis. Se emplean hisopados de conjuntiva o raspados de las lesiones en
el caso de queratitis para el cultivo bacteriano.8
CASO CLÍNICO 1
Paciente de 12 años previamente sana, que consulta por pérdida brusca e
indolora de la visión, de 24 horas de evolución en ojo derecho (OD). Se observa
enrojecimiento y exudado ocular. Al fondo de ojos se observó edema de papila en
OD sin otras alteraciones. Se le solicitó tomografía computarizada (TC) de cerebro
que fue normal y a los 5 días apareció una estrella macular. Se envía al
paciente para toma de muestra de exudado ocular y cultivo bacteriológico. Al
interrogatorio refería tener un gato cachorro en su hogar, por lo que luego de
descartar otras causas, se sospechó una posible enfermedad por contacto con el
gato. Se le administró tratamiento con azitromicina, con resolución completa del
cuadro clínico.
METODOLOGÍA CASO CLÍNICO 1
RESULTADOS CASO CLÍNICO 1
En la observación directa de la muestra problema se observaron bacilos cortos
gramnegativos en muy bajas cantidades (Figura 1), fue requerido tomar múltiples
películas de la muestra para lograr su observación.
Figura 1. Bacilos cortos
gramnegativos en tinción de Gram directa
Se obtuvo crecimiento en el agar Sangre y agar MacConkey. En el agar Sangre
las colonias fueron medianas, blanco-grisáceas, húmedas, ligeramente elevadas
un aspecto de α-hemólisis. En el agar MacConkey se obtuvieron colonias
pequeñas, húmedas, ligeramente elevadas y con pigmento rojo (Figura 2). El
pigmento puede ser confundido con la fermentación de la lactosa, sin embargo, el
color rojo característico ayuda a diferenciarlo de las colonas rosas fermentadoras.
Figura 2. Colonias en agar Sangre (izquierda) y agar MacConkey (derecha). Obsérvese la
pigmentación roja de las colonias en agar MacConkey.
Se confirmó la morfología microscópica del microorganismo previamente
visualizado de forma directa, mediante la observación de las colonias crecidas en
los agares (Figura 3).
Figura 3. Bacilos cortos gramnegativos procedentes de los cultivos celulares
En la Tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas
realizadas a las colonias crecidas en los agares, sugiriendo la identificación de
Serratia marcescens. Se comparan los resultados con lo descrito para el
microorganismo en la literatura. En la Figura 4 se presentan las pruebas
bioquímicas.
Tabla 1. Resultados de las pruebas bioquímicas de la colonia aislada (Serratia
marcescens).
Prueba Resultado Literatura
KIA K/A K/A
TSI A/A A/A
Gas - +
H2S - -
Indol - -
Citrato + +
Ureasa - -
Motilidad - +
Ornitina descarboxilasa + +
Lisina descarboxilasa + +
Fuente: Koneman, E. et al. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color, 6ª ed.; Médica
Panamericana: Argentina, 2008.
Figura 4. Pruebas bioquímicas que indican la presencia de Serratia marcescens
DISCUSIONES CASO CLÍNICO 1
Un aspecto importante en la identificación de Serratia marcescens es la producción
de prodigiosina, un pigmento de color rojo característica de la especie junto con
Serratia rubias, que fue fácilmente observable en el agar MacConkey, aunque en
el agar Sangre no se presenta el cambio de coloración de las colonias. Algo
peculiar de este microorganismo en el agar Sangre es que se puede observar un
efecto similar a la α-hemólisis que puede ser producido por la presencia del
pigmento, sin embargo, no se debe de descartar una hemólisis, ya que esta
bacteria puede producir β-hemolisinas.10
Los signos y sintomatología producidos en el niño podrían indicar una
endoftalmitis, ya que se observa compromiso de la retina.8 Son diversos los
patógenos que se asocian a este padecimiento, como S. epidermidis, S. aureus,
Propionibacterium acnes, Candida no albicans, H. influenzae, E. coli, K.
pneumoniae, P. aeruginosa, entre otros,11 sin embargo, Serratia marcescens no
está descrito como un agente común de esta patología. De hecho, esta especie
tampoco está considerada como un agente potencialmente patógeno en niños que
tienen convivencia con animales, contrario a Salmonella sp., Campylobacter jejuni,
F. tularensis, Leptospira sp., por mencionar algunos, por lo que una infección por
este patógeno puede considerarse raro.12 A pesar de que en la literatura no hay
mucha información relacionada con S. marcescens y la endoftalmitis, se ha
registrado un caso en la que una recién nacida de 37 semanas con endoftalmitis y
compromiso del SNC se aisló del LCR S. marcescens, indicando que la presencia
de hipopión rosado en ausencia de hifema sugiere la infección por esta bacteria. 13
Serratia marcescens está más asociado a infecciones oculares externas como
conjuntivistis, queratinitis, infecciones asociadas a la queratomía radial y con la
infección de la sutura luego de una queratoplastia penetrante.14, 15, 16 Los factores
de virulencia son los que ocasionan un daño en el sitio ocular, como la serralisina
que es importante en la generación de queratinitis,15 su capacidad de adherencia,
lipopolisacáridos hemolisinas, motilidad y la producción de proteasas.16
La presencia de S. marcescens en el interior del sitio ocular puede ser debido a
una diseminación hematógena de otro sitio de infección o la inoculación accidental
de la bacteria.
CASO CLÍNICO 2
Paciente diabético con complicaciones postoperatorias por amputación de la
extremidad inferior. Presenta edema, enrojecimiento y secreción líquida
abundante. Tratamiento con Sulfactam, Ampicilina Intravenosa y por vía oral. Se
solicita cultivo de exudación de herida. Proteus
METODOLOGÍA CASO CLÍNICO 2
DIAGRAMA ECOLÓGICO GENERAL
Tabla 1. Diagrama ecológico
Residuo Lugar de desecho
Placas de Petri con agar Esterilizar en autoclave por 15
min.
Desechar en bolsa roja para
RPBI´s
Pruebas bioquímicas Esterilizar en autoclave por 15
min.
Desechar en bolsa roja para
RPBI´s
Portaobjetos Recipiente rígido rojo para RPBI´s
Residuos de tinciones Recipiente para residuos de tinciones
Guantes Bolsa roja para RPBI´s
Cubrebocas Bolsa roja para RPBI´s
Papel estraza Bolsa roja para RPBI´s
RESULTADOS CASO CLÍNICO 2
En la tinción de Gram directa se observaron bacilos cortos gramnegativos en gran
cantidad, considerando que el medio no había sido incubado (Figura 5).
Figura 5. Bacilos cortos gramnegativos
observados en la tinción directa de la muestra
Se obtuvo crecimiento en los tres medios. En el agar Sangre se observó colonias
con bordes difusos, redondas, planas, incoloras, húmedas y se apreció
característicamente un crecimiento extendido en todo el agar, el llamado
fenómeno de swarming. En el agar MacConkey se observó un cambio de color del
medio de color cereza a amarillo, las colonias fueron redondas, medianas, planas,
húmedas e incoloras. Por último, se observó muy bajo crecimiento, siendo las
colonias puntiformes y no fermentadoras de manitol (Figura 6).
Figura 6. Colonias obtenidas en los
medios de cultivo. a) Agar MacCokey, b) Agar Sangre y c) Agar Sal-Manitol. Obsérvese el
movimiento en “swarming” de la bacteria en el agar Sangre
En el análisis de la morfología microscópicas de las colonias, se observaron
bacilos cortos gramnegativos similares a los observados en la tinción directa, sin
embargo, en se observaron bacilos gramnegativos pleomorfos procedentes de las
colonias crecidas en agar Sal-Manitol (Figura 7).
a) b)
c)
Figura 7. En la imagen de la izquierda se observan los bacilos gramnegativos con
morofología similar a lo visualizado en la tinción directa. Obsérvese en la imagen de la
derecha que hay presencia de bacilos largos gramnegativos (flecha azul) de las colonias
crecidas en agar Sal-Manitol.
En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas
realizadas a las colonias crecidas en los agares, sugiriendo la identificación de
Proteus mirabilis. Se comparan los resultados con lo descrito para el
microorganismo en la literatura. En la Figura 8 se presentan las pruebas
bioquímicas.
Tabla 2. Resultados de las pruebas bioquímicas de la colonia aislada (Proteus mirabilis).
Prueba Resultado Literatura
KIA K/A K/A
TSI K/A K/A
Gas - +
H2S + +
Indol - -
Citrato + +/-
Ureasa + ++
Motilidad + +
Ornitina descarboxilasa + +
Lisina descarboxilasa - -
Fuente: Koneman, E. et al. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color, 6ª ed.; Médica
Panamericana: Argentina, 2008.
Figura 8. Pruebas bioquímicas que indican la presencia de Proteus mirabilis
DISCUSION ES CASO CLÍNICO 2
Los resultados en las pruebas bioquímicas fueron los esperados casi en su
totalidad para la identificación de Proteus mirabilis, se observa una variación en el
resultado de la producción de gas, aunque, como se ha mencionado, es posible
que no haya sido visualizado la producción de gas, siendo una característica hasta
cierto punto subjetiva. Así mismo, en la literatura se menciona que es posible que
P. mirabilis fermente la sacarosa y presente una prueba de citrato negativo,
aunque la probabilidad de que ocurra esto es del 0.0015, valor que se puede
considerar despreciable y con ello raro, pero es importante considerarlo al
momento de su identificación.17 Por otra parte, el medio Sal-Manitol está elaborado
para permitir el crecimiento de cocosgrampositivos e inhibir a bacterias
gramnegativas, sin embargo, se observó crecimiento de éstas últimas en el medio.
No se encontró en la literatura el registro del crecimiento de P. mirabilis en este
medio, pero sí que esta bacteria es usada como control positivo para la eficacia en
la inhibición de bacterias gramnegativas. En cambio, E. coli puede crecer
parcialmente en el medio a las 72 hrs de incubación.18 Es posible que el medio
tenga deficiencia de componentes inhibidores permitiendo el crecimiento de
bacterias gramnegativas.
P. mirabilis es reconocido por su capacidad de causar infecciones urinarias y de
heridas.8 En una revisión de la literatura realizada por Beltrán y colaboradores,
encontraron que, en tres estudios de 1990, 1994 y 1998, Klebsiella sp. y Proteus
sp. fueron los bacilos gramnegativos que presentaron un mayor predominio en los
aislamientos de infecciones en el pie del diabético, presentándose una mayor
prevalencia de Proteus sp. en el estudio de 1998,19 observándose la importancia
de esta patógeno en el transcurso de los años en estas infecciones. Un estudio
realizado en Jalisco de 2004 a 2007, en el que se estudiaron 79 infecciones de pie
diabético, se encontró que la bacteria más importante fue S. aureus (22.85%),
seguido de E. coli (13.33%), S. epidermidis (11.42%) y Proteus sp. (11.42%),
siendo el género de interés para este caso la tercera causa de infecciones en el
diabético.20 Múltiples factores en los pacientes diabéticos favorecen la infección de
heridas. En primer lugar, una úlcera causada por traumatismos es la puerta de
entrada para diversos patógenos. Segundo, la enfermedad provoca alteraciones
en el organismo, como la disminución de la respuesta leucocitaria facilitando la
infección, la pérdida de la sensibilidad evitando acciones que eviten el progreso de
la infección y las altas concentraciones de glucosa proporciona el nutrimento
esencial a las bacterias.21 Sin embargo, los factores de virulencia del
microorganismo son esenciales para producir una infección. Uno de estos es la
metaloproteasa ZapA que destruye las defensinas de la piel, degrada el colágeno
y laminina de la matriz e interviniendo en la reacción inflamatoria al hidrolizar la
bardicinina, componentes esenciales en el manteamiento de la esterilizada de la
piel.15 Otros factores que no necesariamente estén estrechamente relacionados
con la capacidad de producir infección inicial en heridas son fimbrias, flagelos,
lipopolisacáridos, gelatinasa, hemolisinas, ureasa y producción de biofilms,22 que
quizá tengan mayor importancia en la complicación de la infección.
CONCLUSIONES
Serratia marcescens es el agente causal de la infección ocular en el niño,
sin embargo, su colonización en el sitio interno es considerado raro.
Proteus mirabilis es el agente causal de la infección en la herida del
paciente diabético, es una de los patógenos más comunes en este grupo de
personas.
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