CULTIVO CELULAR

APLICACIONES EN MEDICINA

Centro Comunitario de Sangre y

Tejidos del Principado de

Asturias.

Unidad de Ingeniería Tisular

Sara Llames

CULTIVO CELULAR: mantenimiento, proliferación y/o

diferenciación de células in vitro en un medio artificial.

REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO

DE CULTIVO:

Asepsia: cabina de flujo, esterilizador

Incubador

Nevera/congelador

Baño agitador

Centrifuga

Microscopio Invertido

MEDIO DE CULTIVO:

proporciona a las células los nutrientes necesarios.

BASAL: medio definido, adecuado al tipo celular.

SUERO: fuente de proteínas, minerales, lípidos,

hormonas, mitógenos.

ANTIBIÓTICOS

ADITIVOS: hormonas, factores de crecimiento, etc.

MEDIO DEFINIDO: sin suero, componentes conocidos,

reproducible.

MEDIO INDEFINIDO: con suero, variación entre lotes.

CONDICIONES DE CULTIVO:

pH: 7.4, tamponamiento 5% CO2

temperatura: 37ºC

humedad: 90-95% INCUBADOR

CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:

Bacteriana

Fúngica

MICOPLASMA

CULTIVO DE CONDROCITOS

Britterg y colaboradores 1994, condrocitos humanos

autólogos cultivados para el tratamiento de lesiones

completas de cartílago articular.

Desde 1997 condrocitos comerciales. Elevado coste.

Unidades hospitalarias de cultivo celular.

PROCESAMIENTO Y CULTIVO:

Fragmentación mecánica (bisturí)

Digestión enzimática (colagenasa)

Cultivo en presencia de suero autólogo

CONTROLES:

Bacteriológicos

Micoplasma: ELISA, PCR, Fluorocromo

Cultivo infectado por

micoplasma Cultivo negativo

Producción de matriz cartilaginosa

Tinción

Safranina

Tinción Azul Alcián Inmunodetección de

Colágeno II

Estudio de normalidad celular

Cariotipo Bandas G Hibridación Genómica

Comparada.

Viabilidad Celular

Azul Tripán

TRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓN

Transplante: suspensión celular en

DMEM sin rojo fenol.

Congelación para uso posterior.

CULTIVO DE QUERATINOCITOS

PIEL ARTIFICIAL

CULTIVO DE EPITELIO AISLADO

Digestión

enzimática

Biopsia del

paciente Fragmentación

mecánica

Células aisladas

de piel + 3T3

radiados

Cultivo primario de

queratinocitos

Células del cultivo

primario + 3T3

radiados

Cultivo secundario de queratinocitos

Transporte y trasplante

LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:

Fragilidad

Dispasa daña la membrana basal

Formación de ampollas

Infección

Antisépticos

Resultados clínicos pobres

Escasa disponibilidad

Coste elevado

Modelo de piel artificial completa destinado al

tratamiento definitivo de grandes lesiones

epiteliales

Epidermis

Dermis

INGENIERÍA TISULAR

Biopsia

de piel

Fragmentación

mecánica

1ª Digestión

T/E

Células aisladas de

piel + 3T3 radiados

Cultivo de

queratinocitos

2ª Digestión

colagenasa

Cultivo de

fibroblastos

Cultivos Primarios

Cultivo de

fibroblastos

Cultivo de

queratinocitos

Plasma

humano

Dermis artificial basada

en plasma humano Piel cultivada

Cultivo Secundario

PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA

TRASPLANTE

Biopsias procesadas

(patologías)

0

2

4

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8

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12

Nº

de

pac

ien

tes

Año 2000 Año 2001 Año 2002 Año 2003 Año 2004

(agosto)

Quemados Nevus Úlceras CutáneasEICH Neurofibromatosis EpidermolisisTx familiar Retracción Fascitis Necrot.Mucosa oral