CUANTIFICACIN DE ADN GENMICO POR NANODROP Maura FiallosLaboratorio de Ingeniera Gentica, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos, Universidad Tcnica de Ambato Resumen En la prctica se cuantific por medio del Nanodrop la cantidad de ADN genmico de levaduras presente en las muestras de extraccin obtenidas mediante el mtodo de Hoffman. El equipo utilizado midi la concentracin de ADN en ng/l con una relacin 260/280 de entre 1.8 y 2.0 para especificar la pureza de la muestra ya que los cido nucleico se leen a 260nm y las protenas a 280 nm. Los valores obtenidos oscilan entre 2042.3 y 3383.9 ng/l que es una concentracin de excelente calidad para que ese ADN pueda ser utilizado en otros procedimientos de biologa molecular.Introduccin Ensayos biomoleculares se estn desarrollando continuamente que el uso de cantidades cada vez ms pequeos de material, que a menudo impide el uso de cubetas convencionales basados en instrumentos para la cuantificacin de cidos nucleicos para aquellos que pueden realizar la cuantificacin microvolumen. (Saltos, 2012)Reducir el volumen de muestra necesario para el anlisis espectroscpico tambin facilita la inclusin de nuevas medidas de control de calidad a lo largo de muchos flujos de trabajo molecular, incrementando la eficiencia y en ltima instancia conduce a una mayor confianza en los resultados posteriores. (Sgiker, 2010)El NanoDrop ND-2000 es un espectrofotmetro de espectro total (220-750nm) que mide concentraciones con 1 l de muestra, con gran exactitud y reproductibilidad. Utiliza una nueva tecnologa que usa la tensin superficial para mantener la muestra en su sitio y se eliminan las cubetas de mesura. Adems, el ND-2000 tiene la capacidad de medir muestras muy concentradas, sin necesidad de diluirlas (acepta 50X ms de concentracin que las medidas estndares con cubetas). Esta caracterstica lo hace idneo para medir la concentracin de cidos nucleicos y para determinar su cualidad. El software calcula automticamente la concentracin de los cidos nucleicos siguiendo la relacin:1 A260nm = 1 OD DNA = 50 g/ml1 A260nm = 1 OD RNA = 40 g/ml (Desjardins,Conklin, 2010) Debido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del ADN, esta molcula tiene absorbancia mxima a 260 nm. La prctica tiene como objetivo cuantificar el ADN presente en la muestras de levaduras a travs del espectrofotmetro NANODROP. (Saltos, 2012) Material y mtodos Nanodrop ADN genmico Agua ultrapuraPara la prctica se utiliz un Thermocientific Nanodrop 2000 (spectrophotometer-USA), para iniciar se descongelaron las muestras de ADN genmico y se limpiaron las superficies pticas superiores e inferiores del sistema de espectrofotmetro colocando primero agua destilada ultrapura invitrogen, se cerr el brazo de palanca, asegurndose que el pedestal superior entre en contacto con el agua destilada. Se abri el software NanoDrop y se seleccion la aplicacin de cidos nucleicos. Con la pipeta calibrada en 1l se coloc agua para realizar una medicin en blanco se baj el brazo de palanca y se seleccion "En blanco" en la aplicacin de cido nucleico. Una vez hecha la medicin en blanco se limpi las superficies pticas con un pao limpio, seco y sin pelusa y se eligi la constante para la muestra que fue ADN 50. Se empez a cuantificar colocando 1l en el equipo y midiendo la concentracin de ADN con resultados inmediatos en el software.Resultados

Figura#1: Equipo utilizadoFuente: laboratorio de Ingeniera GenticaElaborado por: Maura Fiallos

Tabla#1Resultados de concentracin y purezaCdigoConc. (ng/l)260/280260/280

CC0382042.31.831.97

CC0373383.91.891.49

22742499.92.011.89

CC0393333.01.781. 66

Fuente: laboratorio de Ingeniera GenticaElaborado por: Maura Fiallos

La concentracin y pureza del ADN fue obtenida mediante espectrofotometra, a una absorbancia de 260 nm donde se encontraron valores altos de ADN como se observa en la tabla #1, lo que asegura una extraccin adecuada del mismo, confirmando la efectividad del mtodo de Hoffman ya que se dice que una buena concentracin de ADN para ensayos moleculares como PCR oscilan entre los 2000 y 4000 ng/l en cuanto a la pureza de la muestras se puede observar que los valores se encuentran entre el 1.8 y el 2 que se exige para asegurar que lo que se est cuantificando es ADN puro, sin presencia de ARN, protenas o carbohidratos, a excepcin de la segunda relacin 260/280 en la muestras CC037 y CC039 que muestran contaminacin por protenas o carbohidratos pero la primera relacin estn dentro del rango por lo que se generaliza diciendo que el ADN obtenido es de buena calidad, alta concentracin y pureza.Cuestionario 1. Indique otra manera de cuantificar la concentracin de ADN.Electroforesis en gel de agarosa:La calidad de las molculas extradas se analiza por electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polisacrido altamente purificado derivado del agar. Se utiliza para separar macromolculas tales como cidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolucin que la poliacrilamida pero una gran rango de separacin, tal que pueden ser separadas molculas de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las concentraciones de agarosa). El tamao del poro del gel puede ser predeterminado ajustando su concentracin en el gel; entonces a mayor concentracin menor tamao de poro. El rango de trabajo es aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene una buena separacin (resolucin) de grandes fragmentos de ADN (510kb) y con uno 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeos (0.21kb).El ADN esta homogneamente cargada de forma negativa a pH neutro, por lo que la relacin carga: masa es constante. Su velocidad de migracin del ADN en la matriz de agarosa est determinada por varios parmetros propios de la molcula. (Universidad Nacional de Quilmes, 2010)2. Qu indican los valores de pureza mayores y menores al rango ptimo (1,8-2)?Cualquier valor considerablemente por debajo de lo establecido es indicio de contaminacin por protenas y/o carbohidratos mientras que en el caso contrario valores mayores a 2 indican contaminacin por ARN (Saltos, 2012)3. Qu indica el la relacin entre la absorbancia a 260nm/230nm?El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mnima) est influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra en relacin a los 260nm de absorbancia de los cido nucleicos. (Acosta, 2013)Conclusin Se realiz la cuantificacin del ADN en el Nanodrop donde se obtuvieron valores altos de concentracin de ADN de entre un rango de 2000 a 3400 ng/l lo cual da la idea de una correcta extraccin del material gentico y eficaz para realizar otros procesos moleculares como PCR. En cuanto a la pureza de las muestras se estableci empleando los rangos 260/280 nm donde los valores de 1.8 a 2.0 son considerados como ADN puro para el rango libre de protena, carbohidratos o ARN. En las muestras obtenidas solo 2 mostraron en la segunda relacin valores menores a 1.8 lo que dio la idea de una ligera contaminacin por protenas o carbohidratos. En general la cuantificacin se encuentra entre los rangos esperados concluyendo que se obtuvo ADN genmico de alta calidad.Bibliografa Universidad Nacional de Quilmes, 2010. Introduccin a la Biologa Molecular y Celular TP5: Extraccin de ADN disponible en: https://ibcmunq.files.wordpress.comSaltos N, 2012. Extraccin de ADN genmico y amplificacin de la regin ITS por PCR en el ascomicete marino disponible en: http://repositorio.ug.edu.ecAcosta S, 2013. Biomasa: extraccion & cuantificacion de acidos deoxyribonucleicos (adn) totales disponible en: http://www.uprm.eduSgiker, 2010. Universidad del Pas Vasco Purificacin y cuantificacin de productos de PCR Disponible en: http://www.ehu.eus/documentsDesjardins P,Conklin D, 2010. NanoDrop microvolumen cuantificacin de cidos nucleicos diponible en: http://www.jove.com/