Félix Osorio Sandra Astrid 18 de Diciembre del 2014Biología Molecular

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DESNATURALIZANTE DE ALTO RENDIMIENTO

Introducción

La cromatografía líquida es un método físico de separación basado en la distribución de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra móvil. Esta última, en dicha técnica, es un líquido que fluye a través de una columna que contiene la fase fija, la cual es un sólido inerte.

Con el fin de aumentar la eficacia en dichas separaciones, se han llevado a cabo diversas modificaciones al método original. De esta manera surge la técnica de cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento, la cual trabaja con el incremento en la presión requeridas para la optima separación de las moléculas, utiliza la variante de fase reversa de la cromatografía líquida de alta eficiencia y, como su nombre lo indica, la desnaturalización de la muestra a analizar mediante temperatura.

Desarrollo

Obtención de ADN y amplificación por PCR

Antes de llevar a cabo la cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento se debe tratar la muestra para la obtención del DNA de la célula de interés. Posteriormente, para obtener la secuencia de DNA de interés, se realiza un PCR para amplificar dicha secuencia de DNA.

Desnaturalización y Renaturalización

Una vez obtenida la secuencia de DNA de interés, se lleva a cabo la exposición de los fragmentos mutados de dicha secuencia, esto a través de la desnaturalización y renaturalización del material genético.

Para este proceso se utiliza la variación de temperatura, sabiendo que las hebras de DNA a altas temperaturas (95°C por 5 minutos) se separan. Para la renaturalización, la muestra se enfría en hielo (10 minutos).

Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento

Está detectará las mutaciones dependiendo de los fragmentos de los genes obtenidos en el PCR y posterior a la desnaturalización y renaturalización, esto a partir de los tipos de reaparamientos que se hayan llevado a cabo por las hebras de DNA.

Las moléculas quedarán atrapadas en la fases solida fija, y posteriormente serán extraídas. Este proceso dependerá de la temperatura que posea la molécula.

Félix Osorio Sandra Astrid 18 de Diciembre del 2014Biología Molecular

Posteriormente, se realiza un cromatograma, en el cual se pueden leer los correspondientes resultados.

Análisis

La sensibilidad y especificidad de DHPLC superan el 96%. Estas características y su bajo costo hacen DHPLC una de las herramientas más poderosas para la resecuenciación de los genomas humanos y de otras especies. Aparte de su aplicación al análisis mutacional de genes candidatos, DHPLC ha demostrado un papel decisivo en la aclaración de la evolución humana y en el mapeo de genes. Empleando condiciones completamente desnaturalizantes, la utilidad de DHPLC ha sido extendida a la determinación del genotipo de los polimorfismos conocidos mediante la utilización de la capacidad de para obtener moléculas de ADN monocatenario de tamaño idéntico que difieren en un solo base.

Conclusión

La cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento provee al investigador una herramienta de separación a través de métodos físicos para la evaluación del material genético.

Si bien, este método sigue conservando el fundamento de la cromatografía original, con el tiempo se ha ido adecuando a las necesidades de los investigadores. Así surgiendo la parte de "desnaturalizante", que ofrece una nueva herramienta al investigador.

Por este método se pueden obtener resultados que por otro tipos de pruebas sería imposible obtener, o si bien se obtienen, muestran una baja eficiencia.

Así queda demostrado que la líquida desnaturalizante de alto rendimiento es y seguirá siendo, hasta que no se encuentren otros métodos más eficaces, un método de gran importancia en el diagnostico biomolecular.

Referencias

Bing Y, S. N. (2006). DNA Mutation Detection Using Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC). Human Genetics.

Oefner, W. X. (2001). Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review. Human Mutation.

Victor Cohen, J. S. (2006). Evaluation of Denaturing High-Performance Liquid Chromatography as a Rapid Detection Method for Identification of Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Nonsmall-Cell Lung Cancer. Wiley InterScience.