Cromatografía líquida de alta eficacia

La cromatografía líquida de alta eficacia o high per-formance liquid chromatography (HPLC) es un tipo decromatografía en columna utilizada frecuentemente enbioquímica y química analítica. También se la denominaa veces cromatografía líquida de alta presión o cro-matografía líquida de alta resolución (high pressureliquid chromatography) (HPLC), aunque esta termino-logía se considera antigua y está en desuso. El HPLC esuna técnica utilizada para separar los componentes deuna mezcla basándose en diferentes tipos de interaccio-nes químicas entre las sustancias analizadas y la columnacromatográfica.

1 Principio

1.1 Cromatografía líquida de alta resolu-ción (HPLC)

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columnacromatográfica a través de la fase estacionaria (normal-mente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadascon ciertas características químicas en su superficie) me-diante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presióna través de la columna. La muestra a analizar es intro-ducida en pequeñas cantidades y sus componentes se re-trasan diferencialmente dependiendo de las interaccionesquímicas o físicas con la fase estacionaria a medida queadelantan por la columna. El grado de retención de loscomponentes de la muestra depende de la naturaleza delcompuesto, de la composición de la fase estacionaria yde la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a sereluido de la columna se denomina tiempo de retención yse considera una propiedad identificativa característica deun compuesto en una determinada fase móvil y estacio-naria. La utilización de presión en este tipo de cromato-grafías incrementa la velocidad lineal de los compuestosdentro de la columna y reduce así su difusión dentro dela columna mejorando la resolución de la cromatografía.Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol yel acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, ocompuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan ala separación de los compuestos.Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita esla variación en la composición de la fase móvil duranteel análisis, conocida como elución en gradiente. Un gra-diente normal en una cromatografía de fase reversa puedeempezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma li-neal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado

varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. Elgradiente separa los componentes de lamuestra como unafunción de la afinidad del compuesto por la fase móvil uti-lizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. Enel ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo loscompuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentra-ción de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbi-cos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. Amenudo, hace falta realizar una serie de pruebas previascon tal de optimizar el gradiente de forma que permitauna buena separación de los compuestos.

1.2 Tipos de HPLC

1.3 Cromatografía de fase normal

La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC(NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utiliza-do en el campo de la química, y se caracteriza por separarlos compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utili-za una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, yse utiliza cuando el compuesto de interés es bastante po-lar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la faseestacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medidaque aumenta la polaridad del compuesto y la interacciónentre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (encomparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de reten-ción.La fuerza de interacción no sólo depende de los gruposfuncionales del compuesto de interés, sino también enfactores estéricos de forma que los isómeros estructuralesa menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utili-zación de disolventes más polares en la fase móvil dismi-nuye el tiempo de retención de los compuestos mientrasque los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentarel tiempo de retención.La NP-HPLC cayó en desuso a los años setenta con eldesarrollo del HPLC de fase reversa o reversed-phaseHPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiem-pos de retención puesto que los disolventes próticos cam-biaban el estado de hidratación de la silica o alúmina dela cromatografía.

1.4 Cromatografía de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en unafase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridadmoderada. Una de las fases estacionarias más comunes

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2 1 PRINCIPIO

de este tipo de cromatografía es la silica tratada conRMe2SiCl, donde la R es una cadena alquil tal comoC18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor pa-ra las moléculas de naturaleza apolar, mientras que lasmoléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.El tiempo de retención aumenta con la adición de disol-vente polar a la fase móvil y disminuye con la introduc-ción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografíade fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo de-nomina HPLC sin ninguna especificación adicional. Lacromatografía de fase reversa se basa en el principio delas interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzasde repulsión entre un disolvente relativamente polar, uncompuesto relativamente apolar, y una fase estacionariaapolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto ala fase estacionaria es la disminución del área del segmen-to apolar del analito expuesto al disolvente. Este efectohidrofóbico está dominado por el aumento de la entropía,y la consecuente disminución de la energía libre, asociadacon la minimización de la interfase compuesto-disolventepolar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición dedisolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coefi-ciente de partición de forma que el compuesto se muevepor la columna y eluye.Las características del compuesto de interés juegan unpapel muy importante en la retención. En general, uncompuesto con una cadena alquil larga se asocia con untiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobi-cidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandespueden ver reducida la interacción entre la superficie delcompuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retenciónaumenta con el área de superficie hidrofóbica que sueleser inversamente proporcional al tamaño del compuesto.Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamen-te que sus isómeros lineales puesto que la superficie totalse ve reducida.Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras mo-dificaciones de la fase móvil pueden afectar la retencióndel compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgá-nicas provoca un aumento lineal en la tensión superfi-cial, y como que la entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada precisamente por la tensión su-perficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempode retención.Otra variable importante es el pH puesto que puede cam-biar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, lamayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfatode sodio para controlar el valor del pH. Estos tamponescontrolan el pH, pero también neutralizan la carga o cual-quiera resto de silica de la fase estacionaria que haya que-dado expuesta y actúan como contraiones que neutralizanla carga del compuesto. El efecto de los tampones sobrela cromatografía puede variar, pero en general mejoranla separación cromatográfica.Las columnas de fase reversa se echan a perder con me-nor facilidad que las columnas de silica normales. Aun

así, muchas columnas de fase reversa están formadas porsilica modificada con cadenas alquil y no se deben uti-lizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstaspodrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las co-lumnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pe-ro no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácidoporque puede corroer las partes metálicas del aparato deHPLC.

1.5 Cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular, también cono-cida como cromatografía por filtración en gel, separa laspartículas de la muestra en función de su tamaño. Gene-ralmente se trata de una cromatografía de baja resoluciónde forma que se suele utilizar en los pasos finales del pro-ceso de purificación. También es muy útil para la deter-minación de la estructura terciaria y la estructura cuater-naria de las proteínas purificadas.La cromatografía de filtración molecular es un métodode cromatografía en columna por el cual las moléculasse separan en solución según su peso molecular, o másprecisamente, según su radio de Stokes.En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en lar-gos polímeros entrecruzados que forman una red tridi-mensional porosa. A los fines prácticos, la columnas seempaquetan con pequeñas partículas esferoidales forma-das por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia,estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros estal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no po-drán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las sufi-cientemente pequeñas) podrán pasar libremente. Los po-ros quedan conectados formando una malla o red, lo cualdetermina una serie de caminos a ser recorridos por lasmoléculas que acceden al interior de esta.

1.6 Cromatografía de intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, la retenciónse basa en la atracción electrostática entre los iones ensolución y las cargas inmovilizadas a la fase estaciona-ria. Los iones de la misma carga son excluidos mientrasque los de carga opuesta son retenidos por la columna.Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resi-nas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de ce-lulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio detamaño de poro controlado. En general los intercambia-dores iónicos favorecen la unión de iones elevada cargay radio pequeño. Un incremento en la concentración delcontraión (respecto a los grupos funcionales de la resina)reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pHreduce el tiempo de retención en las cromatografías deintercambio catiónico mientras que una disminución delpH reduce el tiempo de retención en las cromatografíasde intercambio aniónico. Este tipo de cromatografía esampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: pu-

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rificación de agua, concentración de componentes traza,Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chroma-tography of proteins, High-pH anion-exchange chromato-graphy of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

1.7 Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad delas sustancias biológicamente activas de formar com-plejos estables, específicos y reversibles. La formaciónde estos complejos implica la participación de fuerzasmoleculares como las interacciones de Van der Waals,interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo,interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entrelas partículas de la muestra y la fase estacionaria.

1.8 Cromatografía líquida de alta efica-cia en condiciones desnaturalizantes(DHPLC)

Se trata de un método que se emplea para el rastreo demutaciones (ya casi totalmente en desuso debido al augede la secuenciación), que permite detectar la presencia devariaciones en el ADN aunque no se determinan especí-ficamente cuáles. En este caso, se utiliza la técnica cro-matográfica para la detección de heterodúplex de ADN,en lugar de utilizar un gel para correr las moléculas deácidos nucleicos.El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentandola temperatura normalmente) una muestra que contengatanto el ADN problema como un ADN control, que noes más que el mismo ADN problema pero en su versiónsilvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede arenaturalizar (disminuyendo la temperatura), de mane-ra que aquellas cadenas de ADN que vuelvan a unirsecon sus respectivas complementarias (cadena “a” silves-tre con cadena “b” silvestre; o bien cadena “a” mutantecon cadena “b” mutante) no presentarán diferencia con elestado original; sin embargo, si por ejemplo una cadena“a” silvestre híbrida con una cadena “b” mutante, aque-lla región (más o menos amplia) en la que exista muta-ción no complementará, formándose un bucle u horquilla,es decir, una región en la que las bases nitrogenadas noson complementarias y no establecen las uniones carac-terísticas por puentes de hidrógeno en la doble hélice deADN. Dichas estructuras son los denominados heterodú-plex (dúplex de ADN híbridos). Estos heterodúplex mi-gran de forma diferente a los homodúplex en la columnade cromatografía de fase reversa(al igual que lo hacen enun gel de agarosa o acrilamida). La separación se realizaen condiciones desnaturalizantes variables, detectándoselas moléculas de ADNmidiendo la absorbancia a 260 nm.Esto origina un pico de elución a un tiempo característico.A medida que se incrementan las condiciones desnatura-lizantes los heterodúplex migran por delante de los homo-dúplex, apareciendo los picos correspondientes a hetero-

dúplex antes en el gráfico resultante, el cromatograma. Deesta manera, como los heterodúplex se desnaturalizan atemperaturas distintas a los homodúplex, ambas molécu-las dan lugar a picos de elución distintos.Previo al proceso inicial de desnaturalización se suele lle-var a cabo una PCR para la amplificación del ADNmoldeen fragmentos de unas 150-450 pb.Con este sistema pueden detectarse fácilmente sustitucio-nes de una base, inserciones o deleciones, con un cos-te reducido y de manera rápida (aproximadamente 16minutos).[1]

2 Parámetros

2.1 Diámetro interno

El diámetro interno de una columna de HPLC es un as-pecto crítico que determina la cantidad de muestra quese puede cargar a la columna y también influye en su sen-sibilidad. Las columnas de diámetro interno más grande(>10mm) se utilizan normalmente en la purificación decompuestos para su utilización posterior. En cambio, lascolumnas de diámetro internomenor (4-5mm) se utilizanen el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracteri-zan por el aumento la sensibilidad y la minimización delconsumo de disolventes que conllevan. Estas columnasse suelen denominar columnas de rango analítico y nor-malmente están asociadas a un detector UV-VIS. Aparte,existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar,con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principal-mente en espectrometría de masas.

2.2 Medida de las partículas

La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con unafase estacionaria unida al exterior de partículas esféricasde silica. Estas partículas pueden tener diferentes medi-das, siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas.Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie yuna mejor separación, pero la presión que se requiere porobtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma in-versamente proporcional al cubo del diámetro de la partí-cula. Esto significa que disminuir la medida de las partí-culas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna,pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factorde ocho.

2.3 Tamaño de poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcio-nar una mayor superficie. Los poros pequeños proporcio-nan unamayor superficie mientras que los poros demayormedida proporcionan una cinética mejor, especialmentepara los compuestos de tamaño más grande; por ejemplo,

4 6 REFERENCIAS

una proteína que sea ligeramente más pequeña que el ta-maño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrácon facilidad.

2.4 Presión del sistema

La presión de las bombas es variable según el modelo yfabricante, pero su rendimiento se mide en su habilidadpara generar un flujo constante y reproducible. La presiónpuede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmós-feras). Los aparatos más modernos de HPLC incorporanmejoras para poder trabajar a presiones más altas y, porlo tanto, poder utilizar partículas de tamaño más peque-ño en las columnas (< 2 micrómetros). Estos nuevos apa-ratos, denominados ultra performance liquid chromato-graphy (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100MPa de presión (unas 1000 atmósferas). (Hay que teneren cuenta que las siglas UPLC son una marca registra-da de Waters Corporation aunque a veces se utilizan deforma general para designar este tipo de aparatos).

3 Fabricantes de aparatos deHPLC

• HITACHI

• KONIK GROUP

• Agilent Technologies % (antiguamente Hewlett-Packard)

• Beckman Coulter, Inc. %

• Dionex Corporation %

• Eksigent Technologies %

• Gilson, Inc. %

• Micro-Tech Scientific %

• PerkinElmer, Inc. %

• Proxeon Biosystems A S/ %

• Shimadzu Scientific Instrumentos %

• Thermo Electron Corporation %

• Waters Corporation %

• Knauer%

• JASCO%

• YOUNG LIN%

• Varian

4 Fabricantes de columnas deHPLC y accesorios

• Merck/ EMD

• KONIK GROUP

• Macherey Nagel GMBH & CO. KG %

• Agilent Technologies *Beckman Coulter, Inc. %

• Dionex Corporation %

• Gilson, Inc. %

• Hitachi %

• Isolation Technologies %

• Micro-Tech Scientific %

• Phenomenex %

• Proxeon Biosystems A S/ %

• Shimadzu Scientific Instrumentos

• Sielc

• Supelco

• TEKNOKROMA %

• Thermo Electron Corporation %

• Tosoh Corporation %

• Waters Corporation %

• Sugelabor S.A. %

• Kromasil %

5 Véase también• Cromatografía

• Cromatografía de intercambio iónico

• Cromatografía de exclusión molecular

• Cromatografía líquida: Teoría y aplicaciones. I. Ka-time, O. Katime, D. Katime. Editorial Universidadde Guadalajara, México 1998

• Csaba Horváth, inventor de la HPLC

6 Referencias[1] Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) “High

capacity and low cost detection of prion protein gene va-riant alleles by denaturing HPLC”. Jorunal of Neuroscien-ce Methods, 139:263-269

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7 Enlaces externos• Silica hielos for liquid chromatography

• HPLC Find

• LC Resources ChromFAQ

• Chromatography Forum

• marketoverview//search.php?language=e&market=lc&showtree=yesOverview ofoff HPLC Suppliers

• Novasep

• HPLC Resources

• HPLC Primero

6 8 TEXTO E IMÁGENES DE ORIGEN, COLABORADORES Y LICENCIAS

8 Texto e imágenes de origen, colaboradores y licencias

8.1 Texto• Cromatografía líquida de alta eficacia Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquida_de_alta_

eficacia?oldid=76947325 Colaboradores: Kernel panic, Boticario, RobotQuistnix, Yrbot, BOT-Superzerocool, GermanX, Pacomeco, Bo-ja, CEM-bot, F.A.A, Thijs!bot, Xoacas, Mpeinadopa, JAnDbot, TXiKiBoT, Centricon, VolkovBot, Technopat, Matdrodes, BlackBeast,Muro Bot, SieBot, Loveless, BOTarate, Nubecosmica, Ppuentes, StarBOT, Fanattiq, Atila rey, Kadellar, SilvonenBot, WikiYorsH, Die-gusjaimes, Andreasmperu, Luckas-bot, Ortisa, Xqbot, Rubinbot, Hdlopez80, TobeBot, RedBot, Ripchip Bot, Humbefa, EmausBot, Savh,Grillitus, Gibert10, CocuBot, MerlIwBot, UPO649 1112 rarrhor, UPODMG 1213 lmorgue, UPO649 1213 mavilfer, Addbot, Alhiman2,Sofiaa molina y Anónimos: 55

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