cromatografía de gases
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Método utilizado para el análisis de sustanciasTRANSCRIPT
CROMATOGRAFIAPrincipio Básico
Separación de mezclas por interacción diferencial de sus componentes entre una FASE ESTACIONARIA (líquido o
sólido) y una FASE MÓVIL (líquido o gás).
CROMATOGRAFIAModalidades y Clasificación
FM = Líquido
FM = Gás
CromatografíaLíquida
CromatografíaGaseosa (CG)
En CG la FEpuede ser:
Sólida
Líquida
CromatografíaGás-Sólido (CGS)
CromatografíaGás-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFÍA GASEOSAAplicabilidad
Qué mezclas pueden ser separadas por CG ?
Mezclas cuyos constituyentes sean
VOLÁTILES (“evaporables”)
(para cualquier mezcla de sustancias que pueda ser “arrastrada” por un flujo de gas en el que
se pueda disolver - por lo menos parcialmente)
DE FORMA GENERAL:CG es aplicable para la separación y análisisde mezclas cuyos constituyentes tenganPUNTOS DE EBULLICIÓN de hasta 300oCy que sean térmicamente estables.
O Cromatógrafo a Gás
1
2
3
4
6
5
1 - Balón de Gás y Controles de Presión.2 - Inyector (Vaporizador) de la muestra.3 - Columna Cromatográfica y Horno de la Columna.4 - Detector.5 - Electrónica de Tratamiento (Amplificación) de Señal.6 - Registro de la Señal (Integrador o Computador).
Observación: en rojo: temperatura controlada
INSTRUMENTACIÓNGas de Arraste
Fase Móvil en CG: NO interacciona con la muestra - apenas la transporta a través de la
columna. Usualmente nos referimos a ella como GAS DE ARRASTEGAS DE ARRASTE
Requisitos:
INERTE No debe reaccionar con la muestra, la fase estacionaria u otras superfícies del
instrumento.
PURO Debe ser libre de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria.
Impurezas típicas en gases y sus efectos:
oxida / hidroliza algunas FE
incompatibles con ECDH2O, O2
hidrocarburos ruido a la señal de FID
INSTRUMENTACIÓNInyector Convencional
Los dispositivos de inyección (INYECTORES o VAPORIZADORES) deben proveer medios de introducción INSTANTÁNEA de la muestra en
la columna cromatográfica
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2
3
45
6
1 - Septa;2 - Entrada de gas de arrastre;3 - “Liner” (mezclador);4 - Columna5 - Purga del gas de arrastre;6 - Válvula de control de purga.
INSTRUMENTAÇÃOMicrojeringas para Injección
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
cuerpo (pirex)
aguja (inox 316)
Microjeringa de 10 L:
Microjeringa de 1 L (sección ampliada):
cuerpo
guia
êmbolo
aguja
INSTRUMENTACIÓNParámetros de Inyección
TEMPERATURA DEL INYECTOR Debe ser lo suficientemente elevada para que la muestra se vaporize inmediatamente, sin descomposición
Regla General : Tinj = 50oC por encima de la temperatura de ebulição del componente
menos volátil
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra
COLUMNAMuestrasGaseosas
MuestrasLíquidas
empacada = 3,2 mm (1/4”)
0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L
capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L
Sólidos: convencionalmente se disuelven en un solvente adecuado y se inyectan en solução
INSTRUMENTACIÓNColumnas: Definiciones Básicas
EMPACADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 mRellena con un sólido pul-verizado (FE sólida o FE líquida depositada sobre las partículas del relleno)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
Paredes internas recubier-tas con una película fina (en m) de FE líquida o
sólida
COLUMNAS CAPILARESDefiniciones Básicas
Tubo fino de material inerte con FE líquida o sólida depositada sobre las paredes internas.
MATERIALDEL
TUBO
ø = 0,1 mma 0,5 mm
L = 5 ma 100 m
sílica fundidavidro pirexAcero inox.
NylonSilcosteel
Las columnas de sílica son revestidas externamente con una capa de polimero (poliimida) para aumentar su resistencia mecánica y
química
Columnas Capilares x Empacadas:
CA
PIL
AR
ES L = N Columnas mas eficientes
FC = 1 ... 10 mL.min-1 Control más difícil
Vi Dispositivos especiales de inyección
Famílias de Colunas Capilares :
PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas
SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas com material de recheio similar ao das colunas empacotadas
WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada // entrecruzada) sobre las paredes internas.
COLUMNAS CAPILARESColumnas Capilares: Inyección
1
2
3
45
6
1 - Septa;2 - Entrada de gas de arraste;3 - “Liner” (mezclador)4 - Columna Capilar5 - Purga de gas de arraste;6 - Válvula de control de purga.
Baja capacidad de procesamiento de muestra (sub-microlitros)
Inyección directa con microjeringa muy difícil !!!
Inyectores con división (“splitters”) Sistema neumático que elimina una fracción de la muestra
inyectada
- Menor sensibilidad (gran parte de la muestra es eliminada)
- División de la muestra raramente es uniforme (fracción purgada de los constituyentes menos volátiles es siempre
menor)
- Ajuste de la razón de división es más una fuente de error
INSTRUMENTACCIÓNHorno De la Columna
Características Deseables de un Horno:
AMPLIO RANGO DE TEMPERATURA DE USO Por lo menos de Tambiente hasta
400oC. Sistemas criogênicos (T < Tambiente)
pueden ser necesarios en casos especiales.
TEMPERATURA INDEPENDIENTE DE LOS DEMAS MÓDULOS No debe ser afectado por la temperatura del inyector y detector.
TEMPERATURA UNIFORME EN SU INTERIOR Sistemas de ventilación interna muy eficientes para mantener la temperatura homogénea en todo el horno.
INSTRUMENTACIÓNHorno de la Columna
Características Deseables de un Horno:
FÁCIL ACCESO A LA COLUMNA La operación de cambiar de coluna puede ser frecuente.
CALENTAMIENTO Y ENFRIAMIENTO RÁPIDO Importante tanto en los análisis de rutina y durante el desarrollo de metodologias analíticas nuevas.
TEMPERATURA ESTABLE Y REPRODUCIBLE La temperatura debe mantenerse con exactitud y precisión de ± 0,1°C.
En los cromatógrafos modernos (después de 1980), el control de la temperatura del horno es totalmente controlado por microprocesadores.
INSTRUMENTACIÓNProgramación Lineal de Temperatura
Mezclas complejas (constituyentes con volatilidades muy diferentes) separados
ISOTÉRMICAMENTE:
TCOL BAJA:
- Componentes mas volátiles son separados
- Componentes menos volá-tiles demoran en eluir,
saliendo como picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mas volá-tiles no son separados
- Componentes menos volá-tiles eluyen mas
rápidamente
FASES ESTACIONARIASConceptos Generales
LÍQUIDOS Depositados sobre la superficie de: só-lidos porosos inertes (columnas empacadas) o de
tubos finos de materiales inertes (columnas capilares)
FElíquida
SOPORTESólido inerte
poroso
Tubo capilar de material inerte
SÓLIDOS Columnas rellenas con material finamente granulado (empacadas) o depositado sobre la
superficie interna del tubo (capilar)
Para minimizar la perdida de FE líquida por volatilización, normalmente es:
Entrecruzada: las cadenas
poliméricas son químicamente unidas entre si
Químicamente ligadas: las cadenas poliméricas son fijadas “presas” al
soporte por uniones químicas
FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal
SELECTIVA Debe interactuar diferencialmente con los componentes de la muestra.
Regla general: la FE debe tener características similares a la de los solutos a ser separados (polar,
apolar, aromático ...)
FE Selectiva: separación
adecuada de los constituyentes de la muestra
FE poco Selectiva: mala resolución
AMPLIA RANGO DE TEMPERATURAS DE USO Mayor flexibilidad en la optimización de la separación.
BUENA ESTABILIDAD QUÍMICA Y TÉRMICA Mayor durabilidad de la columna, no reaccione con los componentes de la muestra
POCO VISCOSA Columnas mas eficientes (menor resistencia a la transferencia del analito entre las fases)
DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO DE PUREZA Columnas reproducibles; ausencia de picos “fantasmas” en los cromatogramas.
FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
SILICONAS (polisiloxanos) Es la FE más empleada en CG. Cubre amplio rango de pola-ridades y propiedades químicas diversas.
Si
CH3
H3C
CH3
O Si
R1
R2
O Si
CH3
CH3
CH3n
R1, R2 = qualquier
radical orgánico
- La Unión Si-O es extremadamente estable = elevada estabilidad térmica y química de las FE.
- Las Siliconas son fabricadas en gran escala para diversas aplicaciones = minimización del costo del producto + tecnología de producción y purificación
ampliamente estudiada y conocida.
- Practicamente cualquier radical orgánico o inorgánico puede ser unido a la cadena polimérica =
FE “ajustables” a separaciones específicas + facilidad de inmobilización por entrecruzamiento y unión
química a el soporte
Separación de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin
Columna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m)
TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)
Gas de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID
Muestra: 2L de solución de los pesticidas.
17 min
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
Separación de piridinas-FE = 100 % CNpropilsilicone
1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina
3 minColumna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m)
TCOL:110oC (isoterma)
Gas de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID
Muestra: 0,1L de solución 1-2% de las piridinas en 3-metilpiridina
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
INSTRUMENTACIÓNDetectores
Dispositivos que examinan continuamente el material eluido, generando una señal cuando se da el paso de una sustancia que no es el gas de
arrastre
Gráfico Señal x Tiempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada sustancia separada aparece
como un PICO en el cromatograma.
DETECTORESClassificação
UNIVERSALES:Generan señal para cualquier
sustancia eluida.
SELECTIVOS:Detectan sólo sustancias
con determinada propriedadfísico-química.
ESPECÍFICOS:Detectan sustancias que
tengan determinado elementoo grupo funcional en sus
estructuras
DETECTORESDefiniciones Generales
Dispositivos que generan una señal eléctrica proporcional a la cantidad eluida de un analito
~ 60 detectores ya usados em CG
~ 15 equipan a cromatógrafos comerciales
4 responden a la mayor parte de las aplicaciones
TCDDetector de
CondutividadTérmica
FIDDetector porIonización de
Llama
ECDDetector porCaptura deEletrones
MSDetector
Espectrométrico de Masas
INSTRUMENTACIÓDetectores
Más Importantes:
DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES
(ECD) Supresión de corriente causada por la absorción de electrones por los eluidos altamente eletrofílicos.
DETECTOR DE CONDUTIVIDAD TÉRMICA
(TCD) Variación de la condutividad térmica del gas de arrastre.
DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA (FID) Variación del voltaje por los iones generados durante la combustión de los eluidos en una llama de H2 + ar.
REGISTRODE
SEÑAL
ANALÓGICORegistradores XY
DIGITALIntegradores
Computadores
DETECTORESDetector de Conductividad Térmica
PRINCIPIO Variaciónde la conductividad térmica de un gas cuando ocurre la elución de un analito.
Celda de Detección del TCD:
12
35
4
i
1 Bloque metálico
2 Entrada de gas de arraste
3 Salida del gas de arraste
4 Filamento metálico
5 Alimentación de corriente eléctrica
La razón de transferencia de calor entre un cuerpo caliente y un cuerpo frio depende de la
conductividad térmica del gas en el espacio que separa los cuerpos
Si la conductividad térmica de un gas disminuye, la cantidad de calor transferido
también disminuye
DETECTORESTCD: Aplicaciones
1 Separación y cuantificación de compuestos que no generan señal en otros detectores (gases nobles, gases
comunes)
2 Por ser un detector no-destructivo, puede ser usado en CG preparativa o detección secuencial con dos detectores
en “tandem”
Columna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)
Gás de Arraste: He @ 3 ml.min-1
TCOL: 40°C Detector: TCD
1 N2 2 CH4
3 CO2 4 n-C2
5 NH3 6 n-C3
7 i-C4 8 n-C4
Separación de Gases Comunes y Hidrocarbonos:
DETECTORESDetector por Ionización de Llama (FID)
PRINCIPIO Formación de iones cuando un compuesto es quemado en una Llama de hidrogeno y oxigeno
El efluente de la columna es mezclado con H2 y O2, y es
quemado. Como en una Llama de H2 + O2 no existen
iones, ella no conduce la corriente eléctrica.
Cuando un compuesto orgânico eluye, tambiém es quemado. Con una suave
combustión se forman iones, la Llama pasa a conducir la
corriente eléctrica
DETECTORESDetector por Ionizacíon de Llama
COLETOR
FLAME TIP
BLOCO
AR
H2
COLUNA
El aire y el H2 se difunden para el interior del colector, donde se
mezclan con el efluente de la columna y se combustionan:
Una diferencia de potencial eléctrico se aplica entre el tip de la llama y el coletor - cuando se forman iones en la Llama, fluye
una corriente eléctrica:
DETECTORESCaracterísticas Operacionales del FID
SELEcTIVIDAD Selectivo para sustancias que contienen enlaces C-H en su estructura química.
(como virtualmente todas las sustancias analizables por CG son
orgánicas, la práctica del FID es UNIVERSAL)
Compuestos que NO producen respuesta al FID:
Gases nobles
H2, O2, N2
CO, CO2, CS2
CCl4, peralogenados
NH3, NxOy
SiX4 (X = halogenos)
H2O
HCOOH, HCHO *
SENSIBILIDAD / LINEALIDAD QMD típicas = 10 pg a
100 pg con linealidad entre 107 e 108 (pg a mg)
DIC
DCT N2
CH4
CO2
O2
DETECTORESDetector de Captura de Electrones - ECD
PRINCIPIO Supresión de um flujo de electrones causado por su absorción por especies electrofílicas
Un flujo contínuo de electrones lentos es
estabelecido entre un ánodo (fuente radiactiva -emisora) y un catodo.
Al paso de una sustancia electrofílica algunos
electrones son absorvidos, resultando en
una supresión de corriente eléctrica.
12
3
4
5
1 Anôdo (fonte radioativa - emissora)
2 Saída de gases 3 Catodo
4 Cavidade 5 Coluna cromatográfica
DETECTORESDetector de Captura de Electrones - ECD
DETECTORESECD: Aplicações
Contaminantes en aire atmosférico - detección paralela FID + ECD
FID
ECD
1, 2, 3 - Hidrocarburos aromáticos
4, 5, 6 - Hidrocarburos clorados
ANÁLISIS CUALITATIVOConceptos Generales
Fuentes de Informaciones Cualitativas
RETENCIÓN Uso de datos de Tr de un analito para su identificación
DETECCIÓN Detectores que brindan informacion estructural de las sustancias eluídas
Identificación individual de las especies contenidas en una
muestra
Determinación de la identidad de la muestra adecuadamente
hecha
Aplicaciones Cualitativas
de la CG
Para análisis cualitativo confiable por CG es recomendable la combinación de datos provenientes de por lo menos dos fuentes
ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención
t’R = fInteracciones analito / FE
Presión de vapor del analitoCondiciones operacionales (TCOL, FC ...)
Fijas las condiciones operacionales, el tiempo de retención de un analito es una constante
MUESTRA
PATRÓN
Comparação de cromatogramas
da amostra e de uma
solução padrão do analito suspeito
Comparación del t’R usando dopage (“spiking”)
de la muestra con un analito sospchoso: aumento de la confiabilidad de la identificación.
Muestra compleja: incertidumbre de los t’r medidos pueden llevar
a una identificación errónea
La comparación con un cromatograma de la
muestra dopada permite una
identificación más confiable del compuesto
desconocido
ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención
ANÁLISIS CUALITATIVOMétodos de Detección Cualitativos
Métodos de detección que brindan información cualitativa sobre los analitos eluídos:
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM)
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)
Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção
ANÁLISE QUALITATIVAEspectro de Massas
m/Z = 118
m/Z = 80
m/Z = 79
- CO
- (CO + H)
m/Z = 90
20 40 60 80100
120
0
m / Z
ANÁLISE QUALITATIVAAcoplamento CG - EM
Sistema de Controle e Aquisição de Dados:
É MANDATÓRIO que sistemas CG-EM sejam totalmente controlados por microcomputador.
Sistema de Controle e Aquisição de Dados:
1 Gerencia e monitora o funcionamento dos módulos de CG e EM.
2 Coleta e arquiva espectros de massa em intervalos regulares de tempo e constroi o cromatograma.
3 Após a corrida, compara espectros coletados com bases de dados para identificação dos eluatos.
COMPUTADORES RÁPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM DE DADOS
ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: Geração do Cromatograma
Espectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo
Geração do cromatograma a partir dos espectros:
CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = To-tal Ion Chromatogram)
Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas varrida é somado e plotado em
função do tempo, gerando o cromatograma.
MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)
Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentação da espécie de interesse. Gera-se o cromatograma
plotando-se o número de íond detectados com a massa desse fragmento em função do tempo.
TICUniversal
Similar a DIC
SIMSeletivo
Maior Sensibilidade
ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: TIC x SIM
Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME
TICAparecem os picos correspondentes a todas substâncias
eluídas
SIM (m/z = 149)Cromatograma
construido a partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando
fragementos com massa = 149 (ftalatos:
plastificante)