CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN O CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRANTE

La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes presentes en una misma muestra, de diferentes tamaños. El método está basado en la circulación de una fase móvil que arrastra a la mezcla de compuestos a separar, a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación. Se utiliza un equipo GPC el cual permite la separación de componentes de una mezcla polimérica, por componentes y por distribución de pesos moleculares, en medidas tanto absolutas como relativas.

CARACTERÍSTICAS

La fase estacionaria es inerte, por lo que la columna no se desactiva. La muestra no interacciona químicamente con la fase estacionaria, ni con la

fase móvil. Los solutos son generalmente sustancias de peso molecular elevado,

dependiendo de su medida y estructura, éstos se retienen o se eluyen a través de la columna.

PROCEDIMIENTO

Se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados, agarosa, poliacrilamida, etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado. Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular. Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero y las otras quedan en los poros.

APLICACIONES

Determinación del peso molecular de proteínas: al existir una relación lineal entre el volumen de elución relativo de una sustancia y el logaritmo de su masa molecular en un intervalo considerable de masas moleculares, pueden graficarse dichos valores para una determinada columna de filtración con gel empleando macromoléculas de masas moleculares conocidas y así determinar la masa molecular de una sustancia desconocida por su posición en la curva.

Es un procedimiento frecuentemente utilizado en los laboratorios de biociencia para caracterizar proteínas purificadas y recombinantes.

Esta técnica también es utilizada para medir el peso molecular o para resolver mezclas de monómeros, oligómeros y agregados de orden más elevado. Al utilizar este método, el peso molecular se calcula creando una curva de calibración de proteínas globulares estándar y luego se compara el tiempo de elución de una muestra con los estándares.