CROMATOGRAFIA CIRCULAR EN PAPEL DEEXTRACTO DE COLORANTES VEGETALES

Antonio Quirante Candelaquiran@yahoo.es

A)Introducción

El objetivo de esta actividad es describir un procedimiento sencillo de separación cromatográfica en papel de filtro y posterior detección de extractos o muestras vegetales combinando una separación cromatográfica simple y efectiva con el tratamiento de la imagen digital del cromatograma y posterior detección cuantitativa de la misma con ayuda de una fotorresistencia

B) Preparación de la muestra

Se trituran 2-3 gramos de material vegetal a estudiar (jugos o cortezas de frutos, pétalos de flores, etc.) en el fondo de un vaso de 100 cc. al que se añaden 5 cc. de alcohol y 3 gotas de ácido clorhídrico diluído. Se deja reposar media hora y se separa la parte sólida filtrando el líquido si fuera preciso.

C) Realización de cromatografía circular.

Con el extracto líquido anteriormente preparado se marca en el centro de un trozo cuadrado de papel de filtro de 8 x 8 cm. aproximadamente una una mancha circular de muestra de pequeñas dimensiones. Repitiendo la operación después de evaporado el disolvente puede conseguirse una mancha suficientemente concentrada de pequeñas dimensiones.

Se coloca el papel de filtro sobre un vidrio de reloj, haciendo coincidir la mancha con la vertical del centro del mismo. El centro de la mancha se atraviesa con un hilo de coser que proporciona un contacto entre la mancha y el fondo del vidrio de reloj. Una vez montado este dispositivo se vierte una pequeña cantidad de líquido eluyente en el fondo del vidrio de reloj y se deja fluir por capilaridad el líquido eluyente desde el fondo del vidrio al centro de la mancha y dispersarse después circularmente por el papel de filtro obteniéndose el correspondiente cromatograma circular tal como se muestra en la siguiente figura

Figura 1.- Esquema del dispositivo para la obtención de un cromatograma circular. A) líquido eluyente; B) papel de filtro; C) mancha; D) cromatograma obtenido

La siguiente figura corresponde al desarrollo de un cromatograma circular obtenido con una muestra de extracto alcohólico de pétalos de flores desarrollada con una mezcla alcohol-agua-HCl

Figura 2.- Ejemplo de cromatograma circular : A) frente de eluyente. 1,2 y 3: especies separadas

D) Revelado y tratamiento de la imagen cromatográfica

En algunos casos la coloración de algunos componentes es observable directamente por la coloración que presentan en el espectro visible. En otros hay que recurrir a algún procedimiento de revelado más o menos selectivo que permite la visualización de los componentes separados. Muchas sustacias vegetales absorben en el espectro UV y, en algunos casos, muestran fluorescencia en el visible por lo que la mera exposición a una fuente de luz UV ( de la zona próxima al visible) hace visible la existencia de bandas no observadas directamente.

En otros casos cambios ácido-base pueden alterar o hacer aparecer coloraciones en el cromatograma o en la fluorescewncia observada, lo que aumenrta la efectividad de la cromatografía. En el caso de los flavonoides la respuesta a la luz UV y sus cambios con el pH se utilizan de forma rutinaria en la clasificación estructural de los mismos.

La siguiente figura muestra las imágenes de un cromatograma circular de una muestra de extracto alcohólico de pétalos de corrihuela en distintas condiciones de observación

E) Medidas cuantitativas sobre el cromatogramaPara la estimación cuantitativa del color o del grado de absorción de la luz en el caso de reacciones en papel de filtro realizamos las siguientes operaciones sobre la imagen digital

1) Sobre la imagen trasladada a entorno Paint seleccionamos y copiamos un rectángulo que

comprenda una banda rectangular desde el centro al extremo del cromatograma

2)Se copia el rectángulo seleccionado en un nuevo documento Paint

3) Se coloca una fotorresistencia sobre la imagen del cromatograma y se toman los valores de la fotorresistencia al ir variando la posición del cromatograma con el cursor de desplazamiento horizontal de imagen. Se introducen en una hoja de cálculo una tabla de valores con los datos de posición horizontal en una columna y de la lectura de la fotorresistencia en otra

F) Corrección de la intensidad de una banda circularCuando es posible obtener una respuesta instrumental cuantitativa de una señal cromatográfica correspondiente a una mancha extendida sobre una superficie la intensidad correspondiente a la mancha se determina por la integral

I = S R ds (1)donde R es la respuesta cuantitativa instrumental en cada punto y ds es un elemento de área en un entorno de ese punto. En el caso de la cromatografía circular podemos tomar como elementos de superficie coronas circulares elementales de área

ds = 2xdx (2)donde x es el radio medio de la corona circular. La contribución a la intensidad de este elemento de superficie valdrá

dI = 2Rxdx (3)Si en un sistema de ejes coordenados representamos los valores de x,y,R este elemento de intensidad puede considerarse como el volumen limitado por el elemento de área 2rdr y la ordenada vertical R extendida a los extrremos de este elemento de superficie, tal como muestra la siguiente figura

Figura 3.- Representación gráfica de la intensidad de un elemento de área en cromatografía circular

La intensidad total correspondiente al área circular total de una banda vendrá dada por

I = 2 S Rxdx (4)

Expresión que permite relacionar la respuesta a lo largo de una coordenada con la intensidad total de la mancha circular. Si la banda a estudiar es simétrica respecto a su máximo es posible expresar la intensidad total de esta forma equivalente

I = 2xm S Rdx =2xm A (5)

Donde xm es la coordenada x correspondiente al centro de la banda (valor máximo) y A es el área de la banda lineal que por revolución a lo largo del eje OR determina el valor de la intensidad total.

Si por último tenemos en cuenta que el área de una banda cuadrática simétrica está relacionada con la semianchura de banda s y con el valor máximo de respuesta en el pico de banda (RM ) por la expresión

A = RM s (6)Obtenemos la siguiente expresión para la intensidad de la banda circular

xm RM s (7)

G) Tratamiento de datos. Los datos registrados directamente del cromatograma sobre posición de la fotorresistencia sobre el cromatograma y valor de la respuesta de resistencia obtenida deben modificarse adecuadamente para tener en cuenta los siguientes efectos

1) Transformación de valores del desplazamiento horizontal en valores de Rf2) Respuesta del polímetro para una señal en blanco3) Corrección circular

La primera de estas correcciones se lleva a cabo dividiendo el desplazamiento horizontal de la posición del cromatograma por el desplazamiento del frente eluyente. Cuando alguno de los componentes avanza con el frente y dan respuesta apreciable la posición de dicho frente es inmediatamente localizable. Si no es este el caso es preciso hacer visible con algún trazo la posición del frente antes de su secado. Si llamammos D al desplazamiento y Df al desplazamiento del frente la transformación de desplazamiento horizontal por valores de Rf vendrá dada por

rf = D/Df

La segunda de estas correcciones se realiza sustituyendo la respuesta directa de la fotorresistencia por la diferencia entre dicho valor y el valor que proporciona el polímetro para r f = 1. Si llamamos R al valor de la resistencia en cada punto del cromatograma y Rb a al respuesta del polímetro para un blanco (r f > 1) el valor de la respuesta corregida, Rc, vendrá dada por

Rc = R - Rb

La tercera corrección se hace efectiva multiplicando el de la respuesta obtenida en el apartado anterior por el valor del rf correspondiente a cada desplazamiento horizontal. El valor obtenido tras esta corrección, Rcc, vendrá dada por la expresión

Rcc = Rc * rf

La representación gráfica de Rcc frente a r f responderá de esta forma a una señal que depende de la concentración de la sustancia y de la sensibilidad de la respuesta, y de la que se han excluido efectos distorsionantes de la respuesta a un blanco y debilitamiento circular.

La siguiente tabla muestra el desarrollo de este tratamiento de datos para la experiencia correspondiente a la imagen con luz UV de una cromatografía circular en papel de filtro de un extracto en medio alcohol – HCl de piel de ciruela

D R r D R r f f Rc rRc rf f Rcc0 238 0,00 34 0,00 0,0057 238 0,16 34 0,16 5,3092 249 0,25 23 0,25 5,78115 253 0,31 19 0,31 5,97154 256 0,42 16 0,42 6,73174 273 0,48 -1 0,48 -0,48195 298 0,53 -26 0,53 -13,85204 308 0,56 -36 0,56 -20,07215 312 0,59 -40 0,59 -23,50240 307 0,66 -35 0,66 -22,95262 303 0,72 -31 0,72 -22,19283 288 0,77 -16 0,77 -12,37310 280 0,85 -8 0,85 -6,78322 280 0,88 -8 0,88 -7,04340 277 0,93 -5 0,93 -4,64355 274 0,97 -2 0,97 -1,94366 272 1,00 0 1,00 0,00

La siguiente figura muestra la representación gráfica de Rcc frente a r f como resultado de los datos experimentales y el tratamiento de datos indicado

-30,00

-25,00

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20