crecimiento de tejidos normales y neoplásicos, in vitro...
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis de Posgrado
Crecimiento de tejidos normales yCrecimiento de tejidos normales yneoplásicos, "in vitro" : modificaciónneoplásicos, "in vitro" : modificación
en la reserva alcalina del medioen la reserva alcalina del medio
Ezeyza Cutó, Susana
1940
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Químicade la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Ezeyza Cutó, Susana. (1940). Crecimiento de tejidos normales y neoplásicos, "in vitro" :modificación en la reserva alcalina del medio. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0251_EzeyzaCuto.pdfCita tipo Chicago:
Ezeyza Cutó, Susana. "Crecimiento de tejidos normales y neoplásicos, "in vitro" : modificaciónen la reserva alcalina del medio". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires. 1940.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0251_EzeyzaCuto.pdf
Úhiversidad de Buenos Airesto
' Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y'Náturales,
r4.
C R E C I M I E N T 0
de
TEJI DOS NORMALES Y NEOPLA SICOS" I N V I T R 0 "
b Modificación e rv c ' de m d' .
SUSANAEZEYZA cmo
ïbsis para Optar al grado de Doctor en Química.
Efectuada en el Instituto de Medicina Experimental
Padrino de Ïbsis:
' I y Profesor Angel H. RoffoW: w4 .. ,' 2:);
un E:&Lfi%us su¿.1? l. sangran“
Director:
Doctor Luis M. Correa Urquiza,
l 9 4 O
A MIS PADRES
Deseo expresar mi sincero agradecimiento, al Doctor
Angel HoRoffo, Director del Instituto de Medicina Experimen
tal, a quien le debo la elección del tema, su dirección cien,
tifica y los elementosnecesarios para su realización,Al Doctor Luis M, Correa Urquiza, Jefe del laboratorio
Químioo,bajo cuya dirección fué realizado, quien por sus co
nocimientos e8pecializados en esta materia ha sido un inapre
ciable guia, asi comopor su interés para la realización deeste trabajo.
- S U M A R I 0
- CAPITULO I
msToR;AO.IOÓ’UO0.000,.000......‘OOOOCIOOOOO...GElemIDJmESOOOOO..0..........’..'...000......
- CAPITULO II
MODIFICACIONES DEL CRECIMIENTO CELULAR POR EFECTO QUIMIus.......‘I.......'..A)Generfllidad65.ooooooo-oooo¡noonooonoíoooco- 14B)Inf1uencia sobre el crecimiento celular de
substancias químicas.Extracto embrionariO'trefonaSO¡Dot-oo 25Desmonas.....o,..¡...s.1.m........r.. 30Plasma.oooooo¿0too-onwooïo0.11.06... 31Substancias estimulantes é inhibidoras 33Proteinas y substancias derivadas...¿ 38SH...0.0...'.........,....’.....Homonas..O.’.......fi................Vitaminas.c¡.....,......o.......‘.... 47Substanciascancerigenas...¡......... 51
- ggggTULo III
MODIFICACIONEfi DEL CRECIMIENTO CELULAR POR EFECTODE DIVERSOS ¿AACTORES QUIMICOS Y MODIFICACIONESQUIMICASPROÚUCIDAS POR EL CRECIMIENTO CELULAR:
Anaerobion-SIOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOIDOURespiraCiónooooooooo.coooooooocuoooóa 54Respiracióny glucolisis.....¡....... 54Cuocienterespiratorio.........¡..... 60Hidratosde carbono.................. 61PHoooiconooooaoonoooooo-IOOOOOOOUÜVOO 63Potenciales de oxi-reducción.....¡.¡. 70Presiónosmótica..................s.. 71TenSión superfiCialocoo-oiuoínooo-ouo 72CCleStÜrinaoooooooaoooooooocooooooooo 73Grasas.0OOOOCCOOOOOOO.¡CCOO-I'OOOOOIOI
- CAPITULO Iv
CEULIQR.OOOOOOOOOIQOOOIIIOOOOC
- 0;.21TU10 v_..
PARTE EXP * ' ’
mediode Modlglcaclonerde la reservgalcalinadel'. provoca os or e crecimiento e te 'idosmales y neopla81cos in Vltrg". J nor“
.0 Oi... OIIOIO. 000......00 I. ‘OOOOOWVan (“DIODOS I os valores e la reserva alcalina," 'por modifica01on de los compbnentesdel cultivo,,.,,85
ObserVQCiOHQSQOQJQOQOOOooo000000....ProtOCOIOS.ooooooonooooooooo00000000Interprgtación de los resultados....Discusionde los reeultados.........conCIUSioneSoOcoooo...ccoo-Lo‘o'o-vo-onoResúmende los protocolos;.........Grá‘ioORy fotografías
CAPITULO IH‘ISÏORIA
Data de años atras la aplicación de los métodos dinámicos ¿ue
permiten el estudio de las partes vivientes; en oposición a los
estéticos de la histología. Se estudiaba 1a regeneración de tea' fecundados...
jidos en heridas, evolucion de huevostx ‘ .1 Aunque el cul“
i tivo de tejidos es un método muydiferente, su origen aparece
, en los“trabajos hechos en tejidos al estado de sobrevida;En 1884 Wilhenlm Roux sigue la evolución de la placa medu
lar en tubo neural de embrión de pollo. Para ello ponia en so;
lución de ClNa un fragmento de embrión. Roux dió el nombre de
explantación a su método. "Tratábase de grupos de células de
"determinismo endógeno“tan fuerte que vivian y se multiplica
ban conforme el medio artificial les ofrecía un mínimo de condiciones favorables".
Tuboimitadores,entre ellos Born,y gracias a estas experiencias, se adquirió la noción de que las células pueden conservar su vitalidad "in vitro“.
Leo Loeb (1901) continuando sus estudios sobre regenera
ción de tejidos eneuentra diversos medios de cultivo.
Aunqueno realizado, se veia ya 1a necesidad de la tempe
ratura normal, de un medio que permita su invasión por las cé‘ lulas, de la asepsia. '
La noción de‘la importancia de la concentración del ion Hdel medio fue indicado por Hirsohfeld y Deetjen (19Ól) que prue—
ban que los linfocitos tienen si la aloalinidad no lo impide.Joly comprobó(1903) que habia mitosis en los glóbulos ro
jos de tritón, mostrando, que hay crecimiento de la masa a ex
pensas del medio. x
Tambien están los estudios de Haberland (1898), aunque por
un métodoalgo diferente, sobre mitosis de tejidos vegetales.En todos estos trabajos dispares estaban sentados los prin
cipios de esta técnica llamada primeramenteexplantación y luego cultivos de tejidos.
Y Ross Granville Harrison,basadob en ellos al estudiar la
génesis de fibras nerviosas "in vitro") es considerado su Oreader.H¿
.2
La resonancia de sus.axperienoias fué tan grande que seis
añoa.después el Congreso Americano de Medicina y Cirugía tenía
a la orden del dia el cultivo de tejidos.
Burrows (1910) tubo éxito con diversos tejidos,demostrandoasí que el métodoera general.
A Carrel se debe, además de gran número de estudios sobre
tejidos normales y cancerosos, el descubrimiento fundamental dela acción excito-fcrmatriz de trcfonas, únicas proteinas quepueden mantener indefinidamente la vida. En 1912 Carrel aisló
una cepa pura de fibroblastos ¿ue se hallaban aún con vida en
lQSOidfiplicando la vida del animal que les dió origen."Las células de homootermosson,pués’tan inmortales comolas de losinfusorios cultivados largos años por Woodruff". "Esta cepa de
fibroblastos representa la primer cepa pura de células que, porotra parte, no ha cambiadoni del punto de vista morfológico,ni del punto de vista de ritmo de crecimiento o caracteres biologicos durante este largo intervalo".
Comoel método es general existen hoy día numerosos inves
tigadores que lo aplican a sus especialidades. Debenrecordar
se los nombres de Fischer, Ebelin, Erdmann, Ehrlich, La escue
la de Lewis y Lewis lo aplica a la morfología e histogénosis;
Levaditi a 1a inmunidad, farmacología y bacteriologia; Polícard.
Lambert, Roffo, pr0piedades de las células oanoerizadas; Mende
léeff, Faure-Frómiatbioquímicabiofísica etc.En cuando a los tejidos cancerosos " se puede decir, que cada
'tumor cultivado ha marcadouna etapa en 1a historia de los cultivos
del cáncer“,Como precursor se considera a Vblpini, aunque no se sa
be si sus trabajos se han efectuado en verdaderos cultivos o so
lamente con tejidos al estado de sobrevida,Hasta el año 1916 eran
contados los tumores obtenidos, En ese año se cultivó el primero
de sarcoma fusocelular de rata y fué obtenido por Raffo,
“3-GENERALIDADES
ïecnica
Antes de iniciar nuestra exposicióm diremos que, al método delos cultivos de tejido "in vitro" no se le debe considerar co
mouna abtracción de la fisiología, sinó comouna ciencia inde
pendiente, para cuyo desarrollo ha sido necesario idear una tec
nica y con cuyo auxilio, siguiendo el método que exige pasar de
lo simple a lo complejo, habria de contribuir a dilucidar muchosproblemas de la Biologia.
Es quizás por ello que Stern dice a1 respecto refiriendo
sé a loslcultivos; "cada especialista desde su punto de vistave las ventajas que puede llevarle, para 1a solución de susproblemas, los estudios hechos sobre las células vivientes".
"La citología antigua, la histologia, 1a anatomía patológica,la biologia química, la medicina experimental han sido rejuvenecidas por la aplicación de este método".
áCultivar un tejido consiste, en tomar el órgano o tejido,cortado en trozos de uno a dos mm. (cuando mas pequeños se evi
ta mejor la necrosis) y colocarlo en mezcla de plasma y extrac
to embrionario u otro medio apropiado, en recipientes de formas y tamaños adaptados a la índole del trabajo. Y todo con la
mas rigurosa asepsia.
Estos cultivos mantenidos en estufa a la temperatura de
seable (los pertenecientes a animales de sangre fría a tempe
ratura ambiente) crecen. Observado al microscopio se ve como
a un circulo de tejido nuevo que rodea al trozo inicial. Del
centro a la periferia hay tres zonas: zona necrótica, zona fértil y zona de invasión. Las primeras corresponden al fragmento
de tejido, la tercera comprendelas células que se encuentranen el medio de cultivo y se designa algunas veces con el nom
bre de colonia. Las dos últimas deben su origen a la emigra
ción y a la proliferación. Cuandopredomina la emigración no
hay verdadero cultivo sino estado de sobrevida y subre auto
lisis rápida. Puede tambien darse el caso que haya división
celular pero que no se repita indefinidamente; solo se forman
.4Las nuevas células hasta que se agotan las reservas del fragmento Tambienesto se califica de sobrevida. El verdadero cultivo
existe cuando la multiplicación celular se hace a costa del me—dio.
Viven un tiempo variado según diversas causas, Para que pue
dan continuar con vida se transplantan, es decir, se toma una parte en la zona fértil y se traspasa a medionuevo de cultivo. Los
fifroblastos aislados por Carrel llevan mas de tres mil trasplantes en 18 años.
El cultivo "in vitro" y el crecimiento en trasplantes no son
similares pues el primero es cultivado en un medio no viviente;el segundo es un organismo vivo. No es comparable con el culti
vo de simples células (protozoarios) por diferencia de su formade alimentación.
Los medios de cultivos
Pueden ser: a) soluciones salinas. Comono es un medio nu
tritivo la proliferación dura poco y a expensas de la sobrevida
y no del verdadero crecimiento. Pero tiene gran utilidad porque
facilita la observación microscópica y para los estudios de em
briogenesis cuando se quiere mantener un órgano o un embrión en
tero con vida durante un tiempo limitado. b) sueros: sanguíneos,
linfáticos; hemolinfa, humor acuoso etc. c) Plasma coagulado porextrazto de tejido que es el verdadero medio de cultivo. Se uti
liza plasma homologoo heterologo; en cualquiera hay crecimiento.Las substancias contenidas en este extracto embrionario no son
tampocoespecificas y sirven para la nutrición, excitación delcrecimiento y coagulación del plasma. Son solubles y se obtienen
por maceración del embrión en soluciones salinas.
Tejidos cultivados
Los tejidos han sido actualmente casi todos
cultivados. a) vegetales. b) invertebrados: langostas, insectos,gusanos, etc. c) vertebrados: batracios, serpientes, peces, avesy mamíferos (gatos, perros, cobayos, ratas, monosetc.) d) Loshumanos pueden ser tomados de autopsias (S. Gandolfo) o biop
-5sias. Tejidos embrionarios y tumores, piel, fibroblastos, epile
lio pigmentario de la retina, cartílago, miocardio, ganglioslinfaticos, leucocitos de sangre normal y patológica.
Las dificultades técnicas para cultivarlos son variadas.
Contrariamente a lo que se pudiera creer, los vegetales son losmas difíciles de obtener. Sus células presentan una membranace
lular rígida que no permite al citoplasma manifestar toda su plasticidad morfogenética.
Los batracios,en cambio,son de fácil cultivo por su gran vitalidad y facultad de adaptación.
Los tumores son dificultosos. Cuandolos fibroblastos ais
lados por Carrel tenían ya doce años y los tejidos normales ha
bian sido casi todos cultivados, los de aquellos eran poco numerosos.
Los tejidos adultos no se consiguen facilmente.
Aplicaciones de los cultivos de tejidosA los más diversos estudios han sido sometidos los culti
vos: observaciones histológioas y químicas bajo la influencia o
no de agentes fisicos y químicos. Se emplean colorantes vitales,el oinematógrafo, aparatos de proyección que permiten medir el
crecimiento. La miorodisección, empleandomicromanipuladores,ofrece la posibilidad de localizar las intervenciones sobre lascélulas o sobre ciertos elementos.
Se han podido aislar cepas celulares por medios físicos,biológicos o mecánicos. Drewproteje Hg. el grupo de células
necesarias y mata las restantes con rayos ultravioletas.Es conveniente hacer notar que no es necesario utilizar mé
todos microquímiqos. En recipientes adecuados puede colocarse
cualquier cantidad de tejido y dejarlo actuar el tiempo conve
niente, mientras no muestre signos de degeneración: las modificaciones producidas por su actividad son asi facilmente apreciables.
El métodode los cultivos "in vitro" ha sido aplicado a la
.5histología y a la química en todos sus divisiones y ciencias de
rivadas: Química Biológica, Química Embriológica, Inmunidad, Far
macología, Toxicología, Bacteriología, Patología (cancer, lepra,etc.) y Fisiología. Veamosalgunas opiniones sobre su aplicación.
"El método de Harrinscn —Burrows - Carrel es el único que
nos permite cultivar los ultravirus, pues los métodosde bateriología corrientes han fallado hasta el presente". "Se esperaque en este sentido inagurado por Levaditi rinda servicios practicos". "Es el métodoelegido para el estudio de los sueros ci
totóxicos por que es el solo medio de eliminar toda influenciano citctrópica.
La aplicación de un suero "in vivo " se presta a confusión;
los efectos nocivos pueden deberse a simples trombosis capilareso a otras lesiones no específicas. Los cultivos constituyen un
reactivo muysensible a la acción de estos sueros".
Para la fisiología especial, la fisiología celular constituye la base; para la segunda de estas disciplinas los cult1yuade tejidos aportan las posibilidades infinitas de un métodoperfectamente adecuado".
En la química embriológica y en el estudio del cáncer ha
tenido esta técnica una gran aplicación.En la farmacología su utilidad ha sido más discutida.
"Los cultivos de tejidos presentan un gran interés por quepermite conocer mejor-las reacciones de diferentes tejidos".
"No se puede dudar de la eficacia de la técnica de los cul
tivos de tejidos para traernos pruebas indiscutibles en cuanto
a las acciones farmacodinámicas", dice Stern.
Varios autores han ensayado por este medio el efecto de diversas substancias.
Sin embargolos resultados que se obtienen "in vitro" no
pueden en ninguna forma generalizarse, pues la experiencia indica a menudohechos paradojales con lo que sucede "in vivo".
El mismoStern encuentra alguna objeciones.
“Ciertas substancias introducidas en el sistema general no
.7
pueden concentrarse suficientemente al nivel de un proceso localtal comoun cáncer. Las solubles son inmediatamente excretadas
mientras las insolubles son fijadas y retenidas en todo el cuer
po por las células del sistema reticulo endotelial y la concentración a que es necesario llegar para bloquear ese sistema puede
Ser fatal para el sistema defensor."
Pero el problema es más complejo: las células normales no
tienen la mismaresistencia. Por ej. frente a los iones Pb y Cu
los fibroblastos sarcomatosos (sarcoma de Jersen) son un poco
más sensibles que los fibroblastos ordinarios, (cardíacos), menos que los fibroblastos de riñon e higado con respecto al Cu
pero ligeramente más que estos para el Pb;afcon esto se ve quela metaloterapia debe ser verdaderamente _selectiva para alcanzar las células que se quieren destruir".
DISQHELQE_DEL_MEEQDQ
(A) Su gran ventaja, su gran conquista consiste en haber
se hecho posible trabajar con tejidos aislados y vivos, substrayendo la investigación biológica de la complejidad de la in
vestigación "in vivo", que en sus conclusiones debe tener siempre presente las influencias recíprocas del organismoen total.
"Por primera vez en fisiología, expresando los términoscrecimiento estímulo e inhibición encuéntrase en frente a fac
tores dosables. El elemento vivo, la célula, comoel elemento
químico abre un horizonte, donde no hay solamente conjeturas".(Sterrs).
Carrel dice que el método hace posible reducir ciertos fe-°
nómenos a sus términos más simples, ya que puede ser estudiada
y por un‘período largo de tiempo, las influencias, entre si,
de tipos conocidos de células, y la acción sobre estas de substancias determinadas. Ofrece, pues, posibilidades para el estudio de ciertos problemas que no lo tienen cualquier otro método
de investigación.Ademásintrodujo dos hechos esencialmente nuevos: la inmor
talidad y la especificidad morfológica de la mayorparte de las
‘8
células separadas del organismo. Los fibroblastos aislados en
Enero de 1912 por Carrel, vivenOaún, salvando así 1a objeciónde Harrison quien opinaba,en l9l3,que no se podia hablar de
inmortalidad pues no habían llegado a la edad límite del ani
mal correspondiente.
La experimentación "in vitro" ha hecho posible,por la pro
piedad de las células, que estan puedan sobrevivir separadas del
organismo 6 despúes de la muerte del animal, dependiendo eso pe
riodo de tiempo del ambiente y de la clase de células.
Se ha discutido que el organismo no es una "simple adición
de sus elementos sino un conjunto armónico". "Sin las influen
cias vasculares y nerviosas se introduce una serie de errores
que incapacitan para comprender el ser viviente organizado y
complejo".
Pero,replica Stern, las acciónes generales o especificasde la inervación o vasoularizaoión pueden ser reemplazadas por
las condiciones fisico-químicas del medio. Estos medios pueden
prepararse conteniendo substancias químicas diversas, vitaminas,hormonas, etc.
Aún asi, dice Craoiun,no eSÏSÉÉEÉÉra cada instante un medio igual a ese que las partes vecinas crean a un organismo dado. Si así fuera la célula aislada 6 en sociedad viviría exactamente. Pero son tan delicadas las condiciones de ese medio
(interior) que escapan al investigador. No existen mas que en
el lugar natural asignado a cada elemento por la realización
del plan morfológico."El cultivo "in vitro" se ha colocado dentro del cuadro
de estas previsiones""El métgdg nos permite apreciar solamente La parte celu
l r de fenómen del ou la rt t r i ular h l
nervio n ued er o cid n l e er’ "
plementarias "in vivo". Pero nadie dejará de notar la importan
oia,para el estudio de un proceso, de estas etapas parciales ocomponentesintercelulares. Apareciendo las modificaciones
7
histológicas y químicas fuera de la influenoiencia vascular ynerviosa? se puede poner en evidencia,por esta manera,los pro
cesos que la células pueden sufrir por ellas mismas, o bien poracción intercelular looal“.Se puede localizar asi el origen deciertos fenómenos y es aquí en donde los cultivos son un método de elección.
B) La discusión ha llegado aún más lejos, sosteniendo al
gunos autores que las condiciones de vida "in vitro" cambian
totalmente las propiedades histológicas de los tejidos.
Según‘fleyer,"in vitro" el crecimiento no parece que llegue
a formar tejido real, no hay producción de substancias intercelular "in vivo" los fibroblastos (lo cita comoejemplo) se
transforman en cartílagos y huesos, en cultivos se multiplicanen el mismonivel de¿- diferenciación,que es el mismoaparentemente al que estaban al explantarloá.
Las diferencias son tan grandes, para el autor, comopara poder afirmar que parecen tener un tipo de crecimiento pro
pio y las ODServacionesde ellos obtenidos.aplicables con mucha cautela solamente a las condiciones vivas.
Según Champylas células de 1a zona de invasión no recuer
dan en nada al tejido inicial. Policard no ha podido observar
la producción ni aún la persistencia de los glomérulos y de las
estructuras epiteliales que caracterizan el parenquinarenal.Para el mismoChampylas células harían "in vitro" su on
togéneais en sentido inverso, tenderian a volver al estado em
brionario, llamando a esto fenómeno, desdiferenoiaoión."Se debe admitir según la hipótesis de Champy,quelos ele
mentos cultivados "in vitro" siguen tres etapas, es decir,quela desdiferenciación es la vez: 12) intercelular° desaparición
de la polaridad funcional, desaparición del condriomaespecífi
co, de miofibrillas; 22) tisular: desaparición de estructuras;59) blastodérmicas: desaparición de la función epitelial y re
torna al estado pre-epitelial".Craciun no admite este retorno a caracteres embrionarios,.
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Porque cambie la morfología de esos elementos no es razón para
atribuirles retorno a ese estado. Hayuna desdiferenciaciónpero en una dirección propia de los tejidos cultivados. Cier
tas estructuras desaparecen ó se simplifican, pero tambien hay
aparición de otros caracteres: nefrocitosis, ameboismo,fagbsitosis. Y repitiendo la opinión de Hacker dice: “cada elemen
to, además de su estado habitual Z, hereda la posibilidad depresentarse bajo las formas Z' Z" Z"' que aparecen cuando elambiente sufre transformación.
Para Craciun "Los cultivos representan una tal anomalía,determinando una morfología particular y es un fenómeno de
adaptación al medio".
Yaestos caracteres propios les da un nombreapartezcata plasia.
Pero existen una cantidad de observaciones que limitan
las opiniones anterioreso,
Con el perfeccionamiento de la técnica muchas de estas
anomalías han desaparecido. Fischer con poco o sin extracto
embrionario obtuvo reaparición de caracteres que denotaban
especificidad celular. Tambientrabajando a baja temperatura
se consiguieron crecimientos más lentos, pues a las condiciones de intensa multiplicación era debida la variación del
tejido. Por este medio Menegauxy 0diette obtuvieron que los
ostecblastos,que no se distinguian de los fibroblastos de oc
razón,en condición de cultivos normales, dejaran ver producciónde oseina. Los tejidos epiteliales muestran no solo membranas
sino tambien signos de organización, de tubos, aoini, queratinización etc.
Contrariamente a los fenómenos de desdiferenciación se ha
podido ver diferenciación celular. Carrel y Ebeling, Fischer yMaximovhan comprobadola transformación de linfocitos y monc
citos en fibroblastos con producción de fibras conjuntivas;
Shipley, la hamatopoiesis.
Cuandopudieron aislarse cepas puras de tejido epitelial la
desdiferenoiación no se confirmó. El mismoChampyanota que:"Las células epiteliales guardan sus caracteres en presencia
de cierta proporción de células conjuntivas. La presencia deun tejido antagónico determina la disposición en tubos de un
cultivo renal".Resumiendoestos hechos Craciun y refiriendose a la ola
sificación de Champyya citada, opina que, la primer etapa es
un hecho indudable; la segunda la desdiferenciación o catapla
sia aparece de una manera menos obligatoria, depende de las
condiciones del medio, acciones interoelulares, abundancia de
trefonas, ritmo de crecimiento sobre-vida más o menos larga.
En la tercera etapa, los hechos negativos priman sobre los poSitiVOS .
La embriología ha dado una nueva interpretación a la lla
mada desdiferenciación. En 1918 Spemanndescubrió que la región
del labio dorsal del blastóporo era un diferenciador u organizador. Injertando un pedazo de él en otro embrión causaba la
formación en el huesped de los primeros órganos axiales. Ini
ciaba la autodiferenciación y células que por si mismasno podrían modificarse se diferenciaban irreversiblemente.
Antes de la gastrulación el destino de las células no es
tá determinado. Un trozo de epidermis1que normalmente formaría
el cordón nervioso ectodermal,puede ser intercambiado por epidermis ordinaria. La piel cambiará en cordón nervioso y el cor
dón nervioso en piel. Estas transformaciones no se producen des
pués de la gastrulación. Aunqueno hay diferenciacióngactúa el
proceso invisible que rige a las células.Otros órganos se diferencian a causa del anterior organi
zan a su vez estructuras cercanas. Son organizadores dc segundogrado ej. la estructura axial ejerce efecto en el desenvolvimiento de la viscera taraoica y abdominal.
A cierta altura del desarrollOphay órganos que contienen
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dentro de ellos mismostodos los factores para el desenvolvi
miento. El tiempo debe ser importante y en cierta etapa puede
un órgano(o parte de ¿1)depender del organizador de segundo grado y en otro autodiferenciarse.
Existe tambien un proceso llamado de doble seguridad.
El globo del ojo puede inducir un cristalino en epidermis ex
traña. Pero en otros anfibios se forma en ausencia de él, es
decir,no depende del organizador de segundo grado; es en estecaso autodiferenciador. Probablemente se encontrará con mayor
estudio que las células se transforman en lo que deben ser ba
jo la influencia de tres o más causas oontribuidoras. El doble
aseguramiento debe corresponder a un proceso de seguridwi demodo,que el embrión pueda completarse si una de esas causasfalla.
En muchoscasos esta desdiferenciaoión,ó la carencia depoder diferenciador "in vitro" de ciertos tejidos,podria atribuirse,no a las condiciones metafísiológioas de vida inherentes a ese método,sinó a que dl tejido de por si (y ya en el
mismoembrión) no tiene poder autodiferenciador.
Y asi se encuentran tejidos autodiferenciadores en cultivos y
otros que carecen de esa propiedad.
Este poder es diferente según el tejido.
El riñon produce glomérulos, capilares,según Reinhov. Elcartílago tiene buena diferenciación (Strangeways).Los nacimientos de los miembrostanto"in vitro" comoen tras
plante tienen poco desarrallada esta facultad; pero el ojo lo
posee notablemente, produce todos los constituyentes normalesaunque sin crecer mucho (Strangeways y Fell).
Lo mismo como "in vivo" se encuentran organizadores de se
gundo grado y estructuras que dependen de ellos, los cultivos
podrían retrogradar, no por defecto de mótodo,sinó por no estar presente esa influencia. Y efectivamente vemosque se pue
de evitar la desdiferenciación por medio de otro tejido que
actúa comoorganizador, pues los cultivos,en ciertos casos,pueden influirse entre si actuando comoorganizadores de segundo
- 13
grado. Ya se oitaron algunos casos. El epitelio y el tejido
conectivo de_eüapas post-enbrionaria vuelven a estado embrionario; estando los dos presentes en un mismocultivo 1a diferenciación se mantiene. Si muere el conectivo la desdiferen
ciación del tejido epitelial aparece (Champy).Drewcon riñon de laucha obtuvo un tejido indiferencia
do,pero agregando células conectivas al cultivo. adquiere suscaracteres.
Finalmente los cultivos han sido utilizados para estudiarel período medio de autodiferenciación o morfogénesis irrever
sible. Cultivos de ciertas regiones de un tejido,a distintasetapas pueden revelar si ha sido determinado.
-14
C A P I T U L 0 II
MQDIFICACIQNES QE; CRECIMIENTO CELULAR P03 EFECTQ DE SUBS
TANCLAE QUIMICAEA)General-¿gadgetwwwtencial de crecimiggtg_g_;njlgeggijgiyezaaa sob;g_glugrggimign:tg;
VELQCIDAQ DE CRECIMIENTQ
En primer lugar es natural.;pre
guntarse, si la velocidad de crecimiento, encontrado para el
embrión entero y en condiciones normales, se mantiene en partes
aisladas y creciendo "in vitro". Pequeñostrozos crecen, en cultivos, proporcionalmente al crecimiento del organismoen totalo 1a velocidad de crecimiento depende del embrión?". Needham.
Esta pregunta ha sido resuelta por Cohny Murray al esta
blecer que el factor de crecimiento reside, en gran parte, no
en la integridad del embrión, sino en las células . Con cora
zón-de embrión de pollo de diferentes edades, midiendo el crecimiento a las veinte y cuatro horas de sembrado y por medio
de distintos cálculos por ej. dividiendo el area de crecimiento
por el fragmento original, encontró una curva que era paralela
a la de Minot. (Previamente, Murray, estableció en el embrión
la curva de Minot, para medida de velocidad de crecimiento enun organismo.)
Olivo y Slavick, 0da y Kamontambién con corazón, Norman
con higado, confirmaron todo lo anterior. La única excepción
la presenta el bazo, que tiene mayor velocidad cuando más edadtiene el embrión del cual se extrae el trozo. Pero este punto
requiere una nueva investigación.
SQBREVIDA
“Otra manera de estudiar la naturaleaa del im
pulso de crecimiento, dice Needham,seria determinar la vita
lidad, para cultivos "in vitro", de células de embriones
-15...
muertos en tiempos definidos”.
DeSpués de 78 horas de la muerte del animal, los teji
dos de los fetos de conejos y conejito de la India eran cultivables. Esperiencia de Bianchini y Evangetisti. Otro, Bucciante incubó huevos de gallina de 6 a 12 días dejándolos
luego a 02 y 159. Encontrá que las células epiteliales eran
cultivables "in vitro" después de 25 dias, leucocitos e higado solo retenian vitalidad de tres a cuatro dias y losotros tejidos ocupabanposiciones intermedias.
Needhamproponía en 1951 lo dicho anteriormente y agre
ga "puede ser que se encontrara que, cuanto más joven es el
embrión sus células componentes permanezcan mas tiempo via
bles después de su muerte como ser completo“.
ROFFO,(23Jéuatro años antes,en 1927 ya habia efectuado
una investigación sobre esta misma idea de Needham.Dice,
"comopodrá apreciarse por los resultados obtenidos,la muer
te del sujeto no es sino un fenómenoaparente,prolongandose
la vida de los tejidos en un período de varios dias hastaque se inician los fenómenosde autolisis. Si se llevan es
tos tejidos a un medionutritivo adecuado,antes de que este periodo comience,no solamente manifiestan signos de vi
da sino que continuan reproduciendose. El potencial de cre
cimiento se puede equiparar al que presentan los tejidos
tomados en.e1 organismo recientemente muerto,el que ha sido
sembradosimultaneamente para contralorear las experiencias".Estas se efectuaron en la siguiente forma: los tejidos
(de pollo) se conservan,después de muerto el anima1,en dife
rentes condiciones que más adelante se detallan, durante var
riado tiempo; y luego se siembran comparando su crecimiento
de 48 horas con los controles con tejidos de mismotiempo
de cultivo,pero provenientes de animales recientemente sacrificados. Los resultados fueron:
1233121.128.ds. ¿5.5122
-16
corazón en Ringer y a 0%permaneciendo 14 días en esas condi
ciones,crece algo
corazón en Ringer y a Eaipermaneciendo 9 días en esas condiciones,crececorazón conservado dentro animal 202,10 dias en esas condi
ciones,crece algopiel conservado dentro animal 209,5 dias en esas condiciones,crece
bazo conservado dentro animal 209,9 dias en esas condiciones,crece
estos 3 tejidos conservado dentro animal 08,25 dias en esas
condiciones,crece algo
1191.128._d.e_2.51225_d.e_agus;
corazón y bazo,sin sacarlos del anima1,a 09,en esas condi
ciones; aún muestran signos de crecimiento a los 11 dias.
En las mejores condiciones experimentales,es decir, con
scrvando los tejidos en el mismoorganismo,”experiencia quese encuentra más en relación con lo q1e sucede en 1a natura
leza" y a baja temperatura,09,los tejidos de embriones de 15
dias conservan su poder de crecimiento hasta los 23 dias; los
de pollo de 2 días de nacidos solamente hasta los 11, 10 que
está de acuerdo con lo que suponía Needham.
Después de 25 dias de muerto el animal,el desarrollo
del tejido es igual en intensidad al que dan los de uno recientemente sacrificado.
El corazón y,1uego el bazo manifiestan una Supervivencia
mayor comparativamente aan 1a.pic1.
ROEFO(24L0nvestigó también,"si la influencia de los líquidos conservadores isotónicos eran capaces de intensifi
car los resultados obtenidos,con la simple conservación sinagregado de líquido alguno".
'Corazán, bazo y piel de edbriones de pollo de 15 días
selponen en líquido conservador y dia a día se quita un trozo
á?y se siembra.
Crecen bien hasta con 10 dias de permanencia en solución fi
siológica: lCrecen bien hasta con 15 dias de permanencia en liquido de
Ringcr.
Crecen bien hasta con ll dias de permanencia en Locke Lewis
" ' " " 15 " " " " solución
Biedermann.
Crecen bien hasta con 10 dias de permanencia en plasma
De las experiencias se observa que los tres órganos en
un mismolíquido resisten el mismotiempo. Solamente la piel,
en la solución de Aman,pierde la propiedad de crecer en me
nos dias que el bazo o corazón.
Los órganos mantenidos en liquidos no conservan su po
tencial de crecimiento arriba de 17 días: en el animal 23.
Más que a la composición quimica de los liquidos,hay
que relacionar este últrmo resultado a fenómenode ósmosis
“Los órganos sumergidos sufren la inundación del cuerpo ce
lularalo que altera la composiciónprotoplasmatica"."Sonestos factores que no se producen cuando la conservación
dc los tejidos se hace en el animal mismo".
EQTEEQIAL QB CRECIMIENTQ.
Cuanto más joven es un tejido
más probabilidades tienen todas sus esPecies celulares decrecer. En los tejidos viejos solo lo hacen los ccnjuntivos."Hay pués un factor éndógeno muy importante que se podria
llamar potencial de crecimiento. Este potencial es diferentepara todos los tejidos de origen epitelial o conjuntivo".Los epitelios pierden más pronto que los conjuntivos la fa
cultad de proliferar "in vitro" especialmente si este pro
1ifera primero; por eso el crecimiento acaba muchasveces
por ser conjuntivo, crece mas abundantemente que los otrostanto "in vivc‘ comoen cultivo. Solamente evitando cuidado
-18
samente todo resto de él, se han podido obtener culturas pu
ras de iris o cartilagos; lo mismopara elementos nerviosos,
células endoteliales del higado y osteoblastos.Los tejidos epiteliales y conjuntivos son entre si an
tagónicos.
Fischer cultivando sobre algodón, en medio líquido,transporte un grupo más o menos grande de células según las
dimensiones del hilo que corta y las traSplantá: observaque los muypequeños grupos de células no son fértiles.
En cultivos renales - trabajo de Policard - los islo
tes de parenquima,aislados,viven, pero no son centros decrecimiento. Para Fischer y Harrison “las células emigradas en último lugar son grandes elementos de vitalidad muy
reducida que quedan siempre independientes".
Todos estos hechos tienden a demostrar que las céluá
las de metazoarios no son independientes, que la unidad
biológica es el grupo de células, no la célula y tambiénexplica porqué no se puede obtener cultivos_como en bac
teriologia ,a partir de un solo elemento.
TRAUMATISMQ ( 9 )
Si se corta un trozo de cultivo que
ya no crece,o se saca una parte del centro, aparecen nuevascélulas. "Sin que se agregue ningún producto artificial elsolo hedho de sacar un trozo pequeño de tejido provoca la
regeneración de un cultivoz; un crecimiento que no tendrialugar sin la intervención operativa".
Fischer y Parker han establecido que la mayoría de las
mitosis se efectuan en los bordes de los cultivos y que no
creen que sea debido a mejores condiciones de nutrición de
las células periféricas con resPecto a las centrales.
"De que depende esta diferencia de la frecuencia de ladivisión celular del borde y del centro del cultivo"? se l
pregunta Fischer y opina: que el borde no es sino el borde
-19...
de una herida y por lo tanto existe en los cultivos posibilidad de crecimiento ilimitado y las condiciones de esto
último son las mismas que las de regeneración de una herida.
Si en los cultivos la proliferación continúa por existir
borde fresco de herida, en el organismo se termina cuandohan reparado el defecto.
Fischer efectuó cortes en el centro de un? cultivo;
el número de mitosis es practicamente igual entonces en elborde exterior e interior y mayor que en las demáspartes
y se demuestra así lo dicho que obedece a las mismas leyes
que la cicatrización de heridas. "La única diferencia con
siste en que el crecimiento del borde interior dura solo
tanto tiempo cuanto existe este borde y se termina exactamente comoen el organismo cuando la herida se haya cerrado".
-fiiise agrega. a un cultivo que crece lentamente gotasde: solución de Tyrode,con el cual se lavó otro reciente
mente oortado,aumenta el crecimiento,lo que demuestra quela herida moviliza substancias que tomanparte en 1a rege
neración y hay razones para no suponer esta substancia de
tipo nutritivo.Hay observaciones "que hacen pensar que la destrucción
de células produce materias que estimulan ciertos procesos
del metabolismoen las células intactas, algo parecido alproceso catalitioo. Ello significa queno solo las célulasheridas empiezana crecer sino tambien otras intactas situadas mas lejos. Estas substancias estimuladoras del crecimien
to provocan, por lo tanto, una aceleración de división celular y un rejuveoimiento de las células".
Cree Fischer que 1a intensidad de crecimiento y la re
generacióngen las condiciones experimentales dadas,scn el resultado directo de la herida y que no es indispensable para
esa regeneración la presencia de células tisulares o leucoci#95.
‘m‘
.Las células tumorales tienen con respecto a las normap
les lassiguienies diferencias;a) las del centro se encuentran cn permanente destrucción,lo que no ocurre con las normales. La destrucción "in vitro" es en algunos casos tan rá
pida que impide su cultivo. b) Una herida no se cicatriza,
lo que se efectua en una cultivo.normal. "Parece también que
el crecimiento reparador se efectua en el cultivo carcinoma
toso en otro lugar y no en el borde de la herida. c) En los
cultivos tumorales la diferencia de mitosis entre la perife
ria y centro no es grandé,pues hay necrosis,lo que forma nue
vos bordes de herida; se obServa,en gran número, células necrosadas cercadas por las sanas. d) En las culturas tumorales
hay diez veces más mitcsis que en las normales, pero desdeel punto de vista de la extensión local,es menoren los primeros a causa de la poca duración de las células.
El crecimiento ilimitado de las células tumorales según
Fischer, "ha sido provocado inicialmente,por el mismoproceso fisiológico que la regeneración limitada del tejido nor
mal;" son células tan lábiles que reaccionan con divisiónante factores que no influyen en las normales;" "obedecen alas mismas leyes que rigen el crecimiento normal.“
No son células exogenas, las mismas reglas rigen latransplantación de los dos tipos celulares y ni por medios
químicos ni inmunoquímicossehha podido establecer diferencias con las normales.
Otros autores opinan lo,mismc que Fischer. Lubarsch di
ce "al cortar el tejido explantado, se hiere. Esta en diferentes oondiciones de 1a herida ordinaria del organismo",
está privada de la influencia nerviosa y de todas aquellasde la corriente sanguíneay linfática; recibe su nutricióndel medio inmovil.
-21u
"Hormonasde heridas (neoronas) emanandode células mar
ginales cortadas del fragmento, probablemente aumenta la es
timulación que causa la actividad de las células (en el cultivo)". Erdmann.
"Es probable que la concentración de necronas en el ju
go embrionario comoalrededor del fragmento explantadc, Seael efectivo factor de crecimiento y por lo tanto el probable
crecimiento "in vitro"séa pasivo; el proceso de crecimiento.consistiCía. en división celular forzada, las mismasque henmos tratado de aparecer probable para las condiciones prevalecientes "in vitochen el foco.
La similitud entre lo que Se supone acontece “in vivo"en y alrededor del foco y lo que se ha visto sucede "ithi
tro", aparece tan grande,que uno esta tentado de llamar alos cultivos un foco artificial". Meyer.
Fardon y Sullivan (40 con cultivos embrionales no.1a
vados obtuvieron mayor migración de células y mayor creci
miento que con tejidos lavados varias veces en soluciones
salinas. Opinanque,para valorar las substancias estimulantesrespecto a su poder promotor de crecimiento, deben siempre
lavarse los tejidos.No se sabe, dicen, si estas substancias estïiulgdgranmson
secretadas comoresultado de la herida tisular; si son productos liberados directamente por las células embrionarias
vivas; c productos de células desintegradas. "Se cree queson segregadas mediante herida directa del tejido comotam
bien de,células desintegradas."WLMGurwitsch se dedicó a estu
diar los problemas que presentan los factores que rigen ladivisión celular. "Esta división es debida a causas intrín
secas e inherentes a la célula mismac por el contrario afactores extrinsecos e independientes de ella". Sin negar
-22
la existencia de los primeros,precisa la "importancia cansiderable de los factores extracelulares en el determinismode
la dávisión celular. Y es ese el punto de partida en el descubrimiento de los rayos que él llama mitogeneticos."
Parece que existe una energia radiante de longitud de cn
da determinada, emitidas por las células en mitosis,que actuancomoexcitantes de las otras cercanas que no lo están: son los
rayos nombrados.
Se ha tratado de relacionarlcs también con el fenómeno
organizador.
Sorin y Kisljak- Statkewitch,utilizandc raiz de cebollacomodetector de rayos,examinaron huevos de gallina.
Resultados negativos dieron: albumiña, el polo vegetal
de la yemadurante toda la incubación, el líquido amniótico,tejido del cerebro con embriones desde cinco dias, etc.
Resultados positivos} con la substancia inmediatamentedebajo del punto germinal, con la sangre y digestiones tripsicas de la yema.
No emiten radiaciones los lugares adonde las divisdnnss
celulares son abundantes: glandulas genitales, foliculos linJfáticcs. Contrariamente el cultivo canceroso es muyactivo y
opina Gurwitsch que es debido a su fácil necrobicsis y a intensa glicolisis.
Los lugares necrosados las emiten y seria su origen laproteolisis.
"El capítulo que trata sobre las causas de 1a división
celular, escribe Doljanski, representa ahora un terreno des
conocido." Ni lateorïa de Hertwig; ni la teoria hormonal de
Haberland de la división celular, ni los de Oarrel y colaboradores "que se ocupan del problema de las causas dc la mul
tiplicación celular "en vitro",han podidoaclarar la etiología de la mitosis". Ultimamente apareció Gurwitsch con su hi
pótesis sobre una radiación mitogenética comofactor universal de la división celular."
-23.
“Actualmente (6) nada nos obliga suponer que las mito
sis,que se efectuan espontáneamenteen los tejidos normales,
deben tambien su producción a una radiación mitogenétioa, osea autoctóna. Pero, al considerar la radiación de G.,sólocomoun nuevo factor en la serie de otros factores ya cono
oidos de la división celular (comolo son: la partencgenesis
artificial según J. Loeb, estimulación en el sentido de M.
Popoff; estimulo del desarrollo por irritación mecánica (Brachet), acción estimuladora de división celular producidapor enegia de radiación emitida (Lazarus, Barlow, Haecker)
etc,) , hay que reconocer su importacia especial, debida aSu expansión universal y al hecho de que ya no se trata de
una irritación exógena,sino de una estimulación de divisióncelular endógena,fisiológica."
DOLJANSKI(6 ) estudió "el rol de las radiaciones de
G. en los procesos de la multiplicación celular",consideran
do que los cultivos son un material adecuado para la acciónde esas radiaciones,por encontrarse continuamente en acti
vidad mitótica, por'su sensibilidad a las irritaciones estimulantes etc.
El autor considera defectuosas las experiencias simi
lares de Guillery,"quien cree determinar la acción estimuladora de la radiación emitida por el tejido embrional de
pollo y de la radiación propia de los tejidos cultivados
sobre los cultivos vecinos", de Jaeger,sobre "la acción perniciosa de la radiación sanguínea sobre las colonias celulares" y de otros.
Comomaterial de experimentación usó troncos celulares
(que habian sido transplantados Varias veoesWpor permitir»
solo estos,por su crecimiento rcgular,una medición uniforme") de fibro y osteoblastos,cuyas leyes de desarrollo han
sido más estudiadas, pertenecientes a embriones de pollo de8 a 10 dias.
-2Hr
El medio de cultivo: plasma heparinizado casi sin e3
tracto embrmnnario,asi queda excluida 1a acción estimulado
ra de este,-pues " hay poca esperanza de obtener un efectomitogenético sobre los cultivos que se encuentran en un me
dio rico en extracto". Sin él,les cultivos reaccionan conun aumento inmediato de intensidad de crecimiento a una can
tidad mínima de substancia estimuladora,lo que es de gran valor para la experiencia. (En otra serie de trabajos los efectuó sin extracto - métodode crecimiento inhibido-).
Comofuente emisora de radiación,solo aquellas que la
emiten fuertemente: trituración de planta de cebolla, sangre
de pollo y humana,extracto embrional,cultivos de diferentestejidos pto.
Para observar la sensibilidad del cultivo a la radia
ción,se determinó "el aumento del número de células que se
encuentran en el proceso de división dentro de unos límites
definidos de la colonia celular" y "el aumentoc la disminución de la intensidad de crecimiento de todas las célulasde un cultivo".
Se variaron las condiciones de la experimentación como
Ser la distancia al inductor, a diversas temperaturas, tiempo de exposición,etc.
Los resultados han sido uniformes: no hay aumento de
multiplicación celular.El autor no quiere afirmar que los resultados negati
vos "permitan formular conclusiones generales sobre la im
portancia y alcance de la hipótesis de Gurwitsch". "Pero
para nosotros, dice, es importante haber establecido que,la explicación del aumentocelular y del estímulo de orecimiento de los cultivos tisulares "in vitro" por la hipótesis de la radiación mitogenética no puede comprobarse".
. -25*{B} Igfluencig sobre é; crecimiento celular Qe
substancias ¡gggioag
Bajo diversos nombres se conocen numerosas substancias
excito-formatrices: "auxetics", "blastines", "attraxines"; "archusia" (Burrows), "desmones" (Fischer); "trophones". (a!)
Bisoeglie y Juhasz-Sehüffer las dividen en dos grupos (mu
chas de ellas actuan en "in.vitro" e "in vivo" y algunas tienen
poder cancerigenqp intenso).
A)Substanoias duímioas comoacetona, ácido oleioo, cafeína,estrifinína morfina, cloral, nicotina, indol, ciertos derivadosdel alquitran etc. A estas substancias se les Puedeatribuiruna acción lipotrópica en el sentido de Overton y Hans Horst Me
yer. En este grupo estan las proteosas de Carrel y Baoker.
B) Substanoias fisiológicas: a) hormonasde glándulas endócrinas b) substancias producidas por autólisis e) vitaminas d)trefonas.
En esta parte, los resumenes que siguen corresponden a di
versos puntos de esta clasificación, (menoslas substancias no
existentes en el organismo) agregándose ademas otros de indudables relaciones con el crecimiento, comoson la naturaleza
del plasma, e1.sulfhidrilo, etc.I lQflEM929.2MBBIQEAElQiLREEQEAfi
El jugo embrionario y los leu
cocitos contienen trefonas; los tejidos adultos carecen de ellas.Bajo este nombrese designan principios hipotéticos que son
capaces de mantener indefinidamente el crecimiento celular. Sin
estas no hay verdadero crecimiento "in vitro", sino una sobrevida más o menos larga.
(3°)Estos nombres y otros que se citan mas adelante se con
servan en el idioma original, por no existir palabra similar encastellano.
-2g,"Las trefonas, según Carrel; tienen un doble carácter :
el de hormczonasdel crecimiento según el sentido de Gley y
el de alimento facilmente asimilables. Por el solo, los extractos de tejidos embrionarios contienen todos los elementos ne
cesarios para la sintesis del citoplasma de las células vivientes, que puedenmultiplicarse indefinidamente".
Para Carrel rigen la proliferación celular en las dos condiciones en que el organismohace valer sus capacidades plasti
cas: en la ontogánesis y en la cicatrización de las llagas. En
este último caso son aportadas por los leucocitos. Su aislamien
to tendría gran importancia para la curación de heridas, por lopronto para disminuir el tiempo de cicatrización. Ya esta acción acelerante ha sido probada mediante el empleo de trefonas
embrionarias sobre llagas cutáneas de cobayca.=
Las trcfonas;a) no actuan solamente comocatalizadores, si
no comoaltmcmt0.asimilable tambien, puesto que los gráficos decrecimiento muestran que hay un cierto paralelismo entre la con
centración y la proliferación.b) No muestran diferencias las homólogasy heterblogas. Es
igualmente intensa la acción del extracto embrionario de pollo en
un fibroblasto de este animal como el de uno de CQÉGIQOo cone
jo.
c) El calor las inactiva, los rayos X y el radio las destruyen, 1a luz ordinaria y la agitación les es nociva. Pasan a
través de un filtro de Berkerfeld, pero un Chamberlandlas retiene. Las membranasde colodio dejan pasar las trefonas y re
tienen las proteínas del jugo embrionario; aquellas (trefonas)parecen estar fijadas en cierta manerasobre las globulinas.
d) El potencial oxi-reductor es independiente de sus pro
piedadesBÉÉÉtO-formatrioes, pero con el envejecimiento espontáneo hay un paralelismo entre la disminución del potencial y
la actividad. Se supone que la inactivación es debida a una
-2?_
oxidación de algunos constituyentes del extracto.
e) Más que ¿1 804 (HH4) 2, la precipitación con 002 con
SGrvalas propiedades activantes de la fracción albúmina globulina.
f) El jugo embrionario es inactivado por la digestión tripsica., a
Por digestiones se ha observado lo que Sigue;
Más de 16 horas de digestión pepsica produce en el jugo
embrionario substancias tóxicas y desciende el coeficiente a2.2 . Pero 3 horas de esta última digestión hace el extractomás activo. Su coeficiente es dc 4.5 a 6.7 .
t nnn coeficiente o. N ta ¡}/N ¡mino
í De todo esto se concluye que la función trefona depende
de complejos moleculares ¿0 dimensiones moleculares compronp
aida. entre polipeptidos y albúminaa.Esta función no depende
de hidratos de carbono ni de lipoidoa.
g) El titulo en trefonas de un extracto leucocitario ytenor en hemolisinas naturales anticarnero son paralelas.La actividad dcl extracto respecto a la trefonas puede sertitulado por las hemolisinas.
(b) Un cultivo de leucocitos de 48 horas contienen en el
¡líquido! trefonas,lo que demuestran que lo seoretan;15 Carrel, Akamatsuy Heatan atribuyen a las ¿refonas
unaihipotétioa función hormonal, ademásde su nitrógeno ¿Sir
milable, aunque no hay hechos experimentales que demuestren
que lo son. Pero hay un cierto paralelismo entre ellas y las
hormonasextraídas del ovario, timo, tiroides, y supra-renales.
Estas aumentan la emigración celular, en menor grado y a fa
vor de oxidaciones más activas; las trefonas estimulan losprocesos sintéticos.
"Qarrel recuerda.a justo título,que existen substanciasestimulantes para el crecimiento, manifestandg una acción más
-28
o menos durable z esto último se opone netamente a la acción
de las trefonas¿ las únicas a mantener dg una Espera indgfi1giga la proliferación,"
El factor de crecimiento no es "más,probablcmente,que unaconjunción dc materiales nutritivos y una apropiada capacidad
para utilizarlos". (Carrel y Baker llegaron a la conclusión deque no había justificación para hablar de hormonade crecimiento).(20) Por los estudios de Carrel y colaboradores se sabe que
las peptonas,pépyidos,aminc-ácidos, etc. que contribuyen a la
nutrición celular, no llevan a una proliferación comola delextracto embrionario. Los cultivos degeneran cuando se intro
duce productos de hidrólisis proteica. Y lo mismopara otras
substancias, ácido nucleicc, deriVados hemoglobíniccs, glicecola, glutación etc. "Se admite que estas substancias ayudaneficazmente al crecimiento de las células sin bastar por si
mismas. Se tiene pues la impresión que no conocemos todavia
el o los factores de crecimiento verdaderamenteesenciales y
responsables del equilibrio perfecto y normal del metaboliSmocelular" (20)
Hueper y sus colaboradores (ll) han trabajado sobre estemismo asunto. r
A ellos se les debe la observación del diferente compor
tamiento entre cultivos frescos y ettahiliindós..El conjunto de la literatura sobre el efecto del calor en
el extracto embrionaric;.deja la impresión de que calentando
por 10' o 15’ a 709 C,esa substancia pierde sus cualidadesproliferativas.
Efectivamente calentando esa temperatura hay marcados camp
bios fisicos;y cultivos de fibroblastos frescos que no han en
trado en contacto con extracto norma1,no crecen bién,degenerany mueren despues de nueve pasajes.
J
Tero fibroblastos estabilizadusfiü se mantienen bien en el
—29
liquido que se calentó. La cepa fué llevado 29 veces.
Esto es comparable con una observación de Carrel y Fis
cher sobre protcosas,obtenidas por hidrólisis parcial de lapeptona Witto.
Ellos solo obtuvieron buen crecimiento alimentando elcultivo con la proteosa,cuando aquel había sido cultivado,
en un principio,en extracto normal."Mientras el extracto embrionario calentadc evidentemená
te puede mantener el crcctniento celular por un período lar
go,los teñidos expluntados necesitan el estimulo primario.da—do solo por el extracto normal,para continuar en condiciones
menos favorables“, Huepor.
Nohay evidencia que los extractos (los de diferentes
porciones del embrion) difieren en cuanto a cantidad de substancia estimuladora.
Tiene su origen esta suposición en lo siguientetEl doscubrimiento de la hormona cstimuladora del creci
mientp,en el lóbulo anterior de hipófisis,y lu afirmación deReiter y Gabor que los rayos aitogeneticus se producían ex
clusivamente en la cabeza ¿e renacuajosgllevó u examinar la
cantidad relariva de substancias estimuladoraa decorGCimrento
en diferentes partos del cmbrion. Se hizo extractos de cuer
pos, cabeza sin ojos, ojos.etc. de embriones de ocho dias yestos extractos fueron probados sobre cultiyos de fibroblas
tos efltnhilizados =, es decir sobre CuïtíVQSquc habían alcan
zado una proliferación uniforme después de dios pasajes,ycomparadosu crecimiento con testigos que contenían extracto
de embrión entero. Se llego a la conclusión ya dicha.
El jugo embrionario de pollo o de conejcien polvo o enextracto,fue probado en el crecimiento de renaouajos,por Car
not. No hay influencia en la metamórfosis,pero el crecimiento fué tres veces más grande quo en los testigos.
Poiblee supone,comoconeccuencia de sus trabajos,que el
—30—
factor de crecimiento puede encontrarse en huevos de equino
dormos y es probablemente una proteosa.
Las células del organismo estan reunidas por
comunicacionesinter-celulares. Se producen,según Fischer,
por medio de ell» ,intercambio de substancias llamadas desmonas que "rigen las funciones somáticas generales de las
células y miSmosus funciones mas eSpecializadas".
Lewis y Lewis, Levivno admiten anastomosis "in vitro"
y para ellos serían substancias difusibles. Estas para Burrows son de dos clases y les da el nombre de "ergusia" y
"archusia"3que provocan,uno la emigración y la otra 1a proliferación. La "ergusia" tendria la propiedad de disminuir1a tensión superficial y provocar comose ha dicho la emi-
gración y es derivada de la "archusia% que no sería mas que
un producto de oxidaciones celulares "El tiempo de latencia
de los cultivos Corresponde?justamcnte @J.periodo durante el
cual?1a "a‘chusiaïproducida incesantemente por las células ,llega a una cierta concentración que acaba por desencadenar
el crecimiento." Unexcesotrae la necrobiosis dalculmivoiu',lo que conviene evitar con trasplantes y junto con la ergucia pueden determinar "in vivo" las modificaciones de tensión
superficial conducientes al cáncer".El rol de la "archusia" es activar el crecimiento.
Para otros3esta substancias, importantes para la multiplicación celulargson secreciones endo-celulares no difusibles. Fischer supone que es el factor que impide los injer
tos y los trasplantes heterólogos. Y en efecto son eSpecífioas de las células de la mismaeSpecie: los fibroblastos no
utilizan más que las desmonas de un miSmogénero de fibro
blastos y las de estos no las podría utilizar,por ejemplo,una célula epitelial u otro tejido normal. Dos tejidos diferentes no pueden interpenetrarse y sus cultivos crecen juntos
-51sin destruirse.
Pero un tejido cancerosc las utiliza,pertenezcan o_noa'un tejido homólogo o hctcrólogo. No conoce esPecificidad y
un cultiïo dc sarcomainfiltra tan bién uno epitelial cero unode fibrohlaafica.
Las influencias recíprocas de las células no es un can
bio matcrial,piensan otros autores,síno una energia radianteque sigui las leyes.de la reflexión y es liburadn por reac
ciones qufzicns exotérxicas (Gurwitsch). "Que se trate c no
de un cañbio de desmonas a través de plasmodurzas, la estimulación mutua de células en vía de proliferación no esta ne
nos solidamcnte establecida; Pura proliferar indefinidamente
los cultiVOB tienengpucs,neccsidad de algo más que treíonasque son alimentos; les hace falta una acción trófioa y estimulante que se comunicadirectamente de célula a célula. La
cuestión es.saber si la acción.de tipo desmonaes debido a
un cambiode energía radiante; esto es tanto más justificadocuando que no se ha podido todavía aislar las deamcnas".
Cuandomás joven es el animal del cual provieneol plasma más alto es el indice de crecimiento. El factor de
crecimiento dube estar presente en dos partes, en la célulaprotoplasmática y en el plasma circulante.
A Carrcl y Ebeling se los debe estas observaciones,quioencontraron _
nesAque la vclccidad de crecimiento,de una cepa estabilizada defifroblastos,de dos años.cra afectada por la edad de la gallina de donde Se cxtraía el plasma.
Cuandomás viejo es el animal que da el suero, para el
medio de cultivo, las células de los embriones de igual edadcrecen más despacio.
La acción inhibidora,sobrc la multipliCaoión celular delsuero adulto,es debidagsegfir demostraron Carrel y Bakeroa cam
bios en lipoidea y proteínas debido a la edad y probablemente
relacionado con el aumentode antitripsina.o
Con plasma de animal senil el crecimiento ea solo el 10%
del obtenido con uno de animal joven.
El suero de pollo de un año contiene elementos estimu
lantes unidos a las globulinas, termolábiles a 569 y elemen
tos inhibidores fijados a las albúminas, termoestables a 652.
Por el mismométodo empleadopara lo anterior, es decir’la termoprecipitación, se ha podido ver: cv; esas substancias juveniles estimulantes disminuyen con la edad.
La precipitación fraccionada por 002 inactiva los sueros
jovenes. Si se estudia la acción estimulante de esos precipitados,se vé que el suero joven da un precipitado más activo.
"Estas ingeniosas investigaciones hacen ver que la ferti
lidad del suero, comomedio de cultivo,corresponde a una sanaalgebrica dondeparticipan dos cantidades variables en senti
do inverso. Esos dos tipos de substancias estan,pues,presentesen cualquier suero: solamente con 1a edad la substanciasezcito—
formatrices estan enmascaradas por sus antagonistas. Eso nosexplica,porqué el suero de un animal adulto ejerce ordinariamente una acción desfavorable".
Las substancias inhibidoras del suero parecen ser lipoídes,porque el crecimiento aumenta 28%al 70%con relación al
suero normal,cuando se les extrae.
Si a la solución salina de Tyrode se le agregan lipoídesdel suero, cerebro o hígado y allí se cultivan fibroblastos,hayun ÜO%de crecimiento menos que en Tyrode puro y 20% menos que
en suero sanguíneo normal. Esta diferencia se expiica,segúnCarre1,por la combinación de una cantidad de lipoídes con pro
teínas,quizás,euglobulinas.Para Schazillo la colesterina inhibe, la lecitina no.El plasma puede contener substancias estimulante81en cier
tos estados patológicos: de sifilíticos, animales tuberculosos,grávidos o portadores de tumores.
El suero sanguíneo no contiene practicamente proteinas ca
paces de mantener indefinidamente la proliferación celular.
Es interesante que antes de once días de edad,los tejidos
-33
embrionarios de pollo crecen activamente en un medio salino
puro (solución de Drew). A los de mayor tiempo hay'que agre
gar suero o plasma para evitar que se detenga 1a proliferación.
El jugo embrionario no contiene lisina ni histfdina. Enel plasma senil,que detiene el crecimiento celular "in vitrcw
existen.
' Las substancias estimulantes abundanen ciertos tejidos. El extracto de ovario
prgduce crecimiento abundante,perc no durable; las células mueren al séptimo pasaje. El extracto tiroideo provoca un creci
miento mayor que el muscular,pero por poco tiempo: 6 pasajes.
Estimula tambien la cicatrización de llagas. El de bazo es considerable su poder,pero no comoel extracto de tejido cancero
sc. El de higado inhibe los fibroblastcs,pero no las célulasepiteliales.
Dostejidos diferentes,a algunos milímetros de distancia;(método de culturas afrontadas) pueden proliferar los dos en
estos casos: 1) sobre el borde frontal, polaridad frontal; existe aquí un blastotrcpismo positivoi2) sobre el borde opuesto,polaridad distal; blastotropismo negativo que puede llegar aparar todo el crecimiento.
Puede crecer un fragmento de tejido A en el polo próximo
y el otro B en el polo distal. Hay entonces blastntrcpísmo po
sitivo de B para A y negativo de A para B.
Se trata de substancias difusibles, queexnrmfimo no la
proliferación y puedenprovenir de tejidos normales, patoló
gicos, procesos Íermentativos y de agentes pat686n05-°Las substancias estimulantes de tejidos adultos son aun
mentadaspor autólisis.
Un cultivo puede emplear ¡para la proliferación de nuevos elementos, los productos autolizados del tejido inicial.Puede vivir por autofagia un tiempo, independientemente de lo
r_
-34.
que le ofrece el medio.
En un medio que contiene productos de digestión pepsioa
de hígado o hipófisis anterior de ternera,orecen normalmentelos fibroblastos de rata, proliferan bien durante tres mesos;los de pollo presentan rapidamente degeneración grasosa. Losproductos de proteolisis bacteriana dan excelente resultado
con cultivos de cartílago o carcinoma de ratón¡fibroblastosy tejido embrionario humano.
Conhigado de ternera o pituitaria digeridos, hasta cierto punto, por pepsina,se obtiene un medio conteniendo un máximo poder promotor de ore cimient'oi
Cerrel y Baker inVestigaron la actividad promotora de cre
cimiento de diversas substanciast digeridos de proteinas purasfibrina etc.
La yemadel huevo de gallina es inactiva para los culti
vos y suponiungflarrel y Bakergque los lipoides que contienen
inhibe el crecimiento. Pero dializados obtenidos por Wright se
muestran similares a los dializados de jugo embrionario: en una
experiencia, yemade huevos,de 7 a 8 diasnsometidas al anteriorprocedimiento y probadas en corazón de 10 a ll días.hioieron
pasar el número de mitosis a más de 115 mientras que en los
controles era 14.RofÍo insistio "sobre las relaciones existentes entre 108
'extractcs frescos de órganos que acentúan el crecimiento oe
lular y su tenor en colesterina“ "Los extractos de órganos c
tumores ejercen sobre 1a vida y desarrollo de los tejidos una
influencia que es función de su riqueza en lipoides: in vivoe in vitro los resultados son similares.
Un extracto de levadura,agotada por alcohol a 752,da unasubstancia termolabil que estimula el crecimiento de fibrcblusvtos. El alcohol a 952 arrastra substancias termoestables quetienen una acción favorable sobre los epitelios.
Los tumores y sus extractos contienen substanciaSIexcitoformatrices. El extracto de Rous es reversible: estimulzntee inhibidor del crecimiento. Drewa demostrado que el riñon
.35
normal produce productos estimulantes, si la autolisis se hacea 37° y nc la produce a 0°; contrariamente a los tumores que a
0° las producen. a
n Otros autores creen que el poder exito formador reside en
la ausencia de un factor inhibidor, presente en los explantadosde tejidos normales.
los elementosneOplásicos sufren influencias inter-tisula
res “in vitro" y producen a su vez substancias activas; pero losresultados obtenidos son divergentes,
Por medio de cultivos afrontados,se ha observado, que el
testículo y la tiroide favorecen, el bazo y riñón inhibe y el
higado es neutro con respecto al desarrollo del tumor, :
.Iarinov encuentra antagonismo entre timo y carcinoma derata; el lóbulo anterior de lajhipófisis estimula ed tumorderata e inhibe el de ratón,
BOFTOf Función éxcito-formadora del extracto de tumor enlas culturas de tejidos "in vitro" Bol, del Inst, de Med,Exper,
n° 28, Dic, 1931.5 ha encontrado en los extractos de sarcoma y
carcinoma substancias eficito-formadoras que responden a las con
diciones asignadas por'Carrel a las trefonas,
La expernmentación se ha efectuado comosigue: tejidos,
corazón de embrión de pollo y sarcoma fusocelular de rata, Cómo
medio,plasma solo o con el agregado de uno de los siguientes ex
tractos: embrionario, extracto de sarcoma o de carcinoma de ra
ta,al 5 %»ambos(extracto activo o autolisado de la porción pe
riférica o central del tumor), .Resultado: En medio de plasma solo el crecimiento es pobre;
en cualquier extracto, embrionario o de tumor, el crecimiento es
abundante y similar; cualquiera que sea de los dos tejidos culti
vados, lo que demuestra que los tumores contienen substancias
¿fito-formadores tan potentes comoel extracto embrionario,
Enotra.serie de experiencias, estos tejidos fueron cultivados
en plasma con extracto de esos tumores pero sometidos,estos últimos.a distintos procedimientos químicos y fisicos ( calentados a diver
sas temperaturas, filtrados, precipitados por 804 NH¿,602, etc.)
-35 bis
Ias variaciones del crecnniento en esos medios han indicado,
que las substancias activas son termolabiles, retenibles por filetramiento, precipitables por SO4NH4etc,, Es decir, que las prce'piedades fisicas y químicas de esas substancias activas del sar
comay carcinoma son semejantes a las prcpiedades fisicas y qui;
micas de las trefonas embrionarias,
BOFTOestudió también la acción de distintos productos aislados de los autolisados (dlbumosas,globulinas, polipeptidos,
peptonas, animo-ácidos, ácidos grasos, lipoides) sobre el creci
miento y agragados al medio en distintas concentraciones para en;
contrar el limite de dilución que permite el crecimiento,
"Observase que los grupos formados por desintegración pro
teica que se presentan más activos son los polipeptidos y los
amino-ácidos' " Debenígzcesariamente una acción más tóxica como
productasde última etapa en el proceso de autolisis" 'ÜontraríaI
mente a otros resultadosel poder inhibidor disminuido lo danlos lipoides que permiten el crecnmiento en los tejidos observados en diluciones muyconcentradas (44h)
Digestioneg de higado, Debe ser de gran importancia el des
cubrimiento de Baker y Carrel,(2) quienes observaron que, en una.digestión pepsica de higado, los fibroblastos malignos del sarcofma10 de rata (de la fundación Crocker) proliferan indefinidamen
te en ese medio,Se utilizó, comomedio de cultivo, el producto de diges-'
tión en total, sin aislar las diversas fracciones, ' para no remover las substancias de naturaleza desconocida que suplementa
los productos proteoliticos',Mcdificando la concentración de en?
zimas y del ion H, hidrolisando el higado con HDÉ,pepsina, tripsina y eripsina, se consiguieron productos en que la cantidadde proteosas variaba de 0 a 56 % y en N presente (comogrupos
libres aminos) de 13%La 81 %,
De estas experiencias se concluyó que, la multiplicación
indefinida de los fibroblastos malignos del sarcoma 10 pueden ser
mantenidos, no solamente por las proteosas, sinó también, por los
menores productos de fraccionamiento,
-36
En digestión tripsica de hígado y en los digeridos pepsi
cos, se multiplican rapidamente y por largo periodo¿ los fibroblastos sarcomatoscs de rata.
Hace decrecer el crecimiento de fibroblastcs normales mi
grandesdel corazón embrionario de pollo, la destrucción de proteosas por digestión tripsica.
Los productos hidrolíticos del higado se pueden clasificar
en cuatro grupos respecto a su acción sobre fibroblastos sar
comatosos: a)d1geationesconteniendo eo a 50%de proteosas y 19
a 55%de su N en la forma de grupos de aminos libres. Velocidad
de crecimiento lento,menor due en jugo embrionario o en digestioneeds higado anteriormente citados. Células en malas condicio
nes,aunque conservan sus caracteristicas y crecen lentamente por6 semanas b) conteniendo 39% o menos de proteosas y 35% o mas
de N en la fonmadicha. Las células proliferan indefinidamente
y en condiciones normales,ccmo las cultivadas en jugo embriona
rio c) Broteosas enteramente destruidas. 69%de N como amino
grupo libre y 13%de N en forma peptidaaque no fue posible hi
drolizarlo. Las células proliferan indefinidamente, comoen jugo embrionario o en digestivos pepsicos del grupo b. Se conclu
yó,que estas preparaciones daban todas las substancias necesarias para el crecimiento de fibroblastos sarcomatososadespues
que los tejidos fueron cultivados por 102 días. Pero entre lascélulas había diferencias en su aspecto de aquellas cultivadas
en jugo embrionario ó digestivos pepsicos: pequeñas, ovaladas,
menos transparentes, etc. d) Hígado completamente hidrolizadopor HCl hirviendo. No hay crecimiento aunque se le agregue triptofano.
Parece ser que es esencialapara la vida de las células
"in vitro",c1 13%de N pepsico que queda de la digestión tripsica.
De estas y de otras experiencias se han sacado hechos que
pueden resumirse en lo siguiente: no mantiene indefinidamenteel crecimiento de fibroblastos sarcomatosos 1a hidrolisis in
Icompleta del hígado obtenida por pepsina o autólisis, con 357o
—3aa.
a 69%del N bitado; cuando las peptonas con todas destruidas
.no hay crecimiento y no parece haber duda que son necesariaspara la vida de laS'oélulas,pero las protcosas aunqueno requeridas son utilizadas para el crecimiento y tambien son u
tilizadas las peptonas, peptidos y aminoacidos."Los productos activos son debidos a acciones enzimati
cas y ¿ón prefonmados en el higado“
La acción de los productos hidrolítioos del hígado so
bre fibroblastcs normales de rata son los siguientes;a) no
proliferan indefinidamente,sinó un corto tiempoien digeri
dos de hígado‘b) por 5 o 6 dias crecen tan rapidanente endigeridos tripsicos sin contener proteosas comoen digeridos pépsicos. El crecimiento decrece en el segundo pasaje.Lo mismoen fibrina hidrolizada en diferentes grados oedestina.
Se conoluye,que los menores productos de degradación
de las proteínas son tambienutilizados por las célulasnormales.
Cuandolas preparaciones son diluidas la acción toxicase reduce y los fibroblastos normales viven por largo tiem
po y sin mostrar degeneración.
En resumen, produce ilimitada multiplicación de fibroblustos sarcomatosos y proliferación temporaria de fibro
blastos normales,una mezcla dc peptonas, pepticos y amino—
acidos,contcnicndo pequeña cantidad de proteosas,si estassubstancias provienen del higado,que contiene productos des
conocidos,las cuales completanel efecto nutritivo de lassubstancias degradadas de las proteínas.
Estas diferencias nc pueden ser aun explicadas. Pero
las células ao sarcomaposeen gran actividad sluoolítica
en comparación con los fibroblasyós normales, por lo tanto el
medio es más ácido, aproximadamente PH 6.0; mientras el de losfibroblastos normales es PH 7.0. La actividad enzimatica varia
mucho entre esta concentración del ion H. Es probable que, mas
activamente que las normales, las células del sarcoma sinteti
zen de peptidos y peptonas, el protoplasma. Ya demostraron a1
gunos autores que la sintesis de proteifida,de productOd-proteolíticos de albúmina. por tripsinagse efectua rapidamente a una
concentración del ión H bue varía entre 6:5 y 6.5;
Tambien puede ser que las celulas del Barcomatengan enzi
mas que funcionan algo diferentes que aquellas de las célulasnormales.
"Estos hechos dan más luz en el mecanismo del crecimiento
de los tumores en el cuerpo. Todo proceso que trae digestión
proteica, comoacontece cuando tejidos muertos o heridos son
autolizados por las enzimas libertades o por maorófagos, pueden suplir a los fibroblastos sarcomatosos con material nutri—tivo".
Y gRomEINAs Y SUBSTANCIAS DERIVADAS (37)
.¿Lmingganigga,flurrows y Neymann
encontraron gue son tóxicosgaún a bajas concentraciones. Los
amino-acidos preparados del huevo también lo son_(perc las pep—
tonas de yema de huevo y las proteínas no son nocivas).
Para Carrel y Ebeling,a la concentración de 25-30 mgpcr% de
medio de cultivo,son inocuos. Los fibroblastos humanospueden
crecer,largo tiempo,en una concentración de 525 mg. por %de
medio (Vogelaar y Erlichmann). La adición de mezclas de amino
ácidos a jugo embrionario dializado apenas aumenta su actividad.
Los digeridos de fibrina dan buen crecimiento; menos favorable los de albumina cristalin. de huevo y de casaina. Es
to último se debe probablemente a que la caseína es pobre y la
albúmina de huevo no contiene glioina. Los productos de
desdoblamiento de la albúmina de huevo nc tienen gran poder,pero se acrecienta agregcndc glicina pura c ácido nucleicc
puro. Agregada a un medio pobre en ella (glicina),estimulael crecimiento.
La cistina, la cistcina, la arginina y la glutación sonestimulantes,8egún Hueper y RussellSy deducenqqucinfluyen
en la proliferación celular principalmente mediante suspropiedadesnutritivas capacificas.
Lcd fihrcblastos sarcomatcscs de rara,en digeat icneh de
huevo y oaseína, crecen muypoco,pero lo hacen mejor des
pués de adicionarles glicocola,ó digmfiflmg'degelatina,que
es una proteina rica en glicina. Es pués,pafla los autores ,la glicoccla,ya sea en esta forma o en la forma pcptida,
un componenteesencial del medio de cultiva. Prueba tam
bicngy esta observación es de gran importancia)que paraedificar su protoplasmalas células son capaces de utili
zar los amino-ácidcs (La glicina,ccnsiderada cano no in—o
dispensablc en el alimentc,puede ser sintetizada en elcuerpo animal).
Los resultados de los estudios sobre la influencia de
estas substancias sobre el desarrollo de los cultivoS'scn
contradictorios; pero nc hay duda que son utilizados parala síntesis de prot0plasma.
Piensa Bakcr¡que,1a incapacidad de los fibroblastcs paura crecer en una mezcla de aminovácidcs es debido a la ausen
cia de glutación y la carencia de poder sintetizador de las
células para ese compuesto.
Algunos autores encontraron que eran tóxicos,con lc que
están en contradicción con las observaciones de otros.
Muchos otros investigadores nc vieron aumento de masa
protoplasmática; pero con ello no se prueba que nc lo puedan utilizar. Probablementelas mezclas artificiales no
contenían todos los necesarios, tanto más cuanto que nc tc
-40
dos los amino-ácidos pueden ser sintetizados.Y los obtenidos a partir del huevo o del jugo embriona
rio también han fallado con respecto al crecimientd, pero
se puede suponer que el medio¡aún conteniendo todos los indispensables,era inadecuado.
Vlés y Coulon,experimentando con 15.000 animales, invcstigaron el significado de los amino-ácidos en relación
con el cancer animal. Se comportaron diferentemente varios
de ellos. Ejercieron una fuerte acción inhibidora en el de
sarrollo tumoral algunas mezclas,entre las cuales habianunas que contenían glicina. Lo mismoobservaron otros in
vestigadores."En vista del hecho que los amino-ácidos pueden algún
dia mostrarse útiles en el tratamiento del cáncer humano,esaltamente deseable investigar extensamente su influencia en
el crecimiento "in vitro" de tejido humano,tanto normal como patológico"
"El crecimiento de corazón embrionario de pollo "in vi
tro" (43) es acelerado por las siguientes substancias a una
conccntración de 1:5 000,glicina, triptofano, beta fenilalanina, ácido glutámico y prolina No es afectado por leucina,
scrina, cisteina, valina, alanina, arginina y glutatión; es
inhibido por cistinafi’fenilalanina, lisina'érhistidina.Debajo de la concentración l: 3H000los amino-ácidos
aceleradores son inactivos y sobre esa concentración inhibidores.
La 2.5 diquetopiperazinaacelera el crecimiento del CO
razón embrionario en una concentración corre3pondiente a l:
5 OOOde glicina; afecta menos a menores concentraciones y
es inhibidor a una dilución de1:600 .Bromas-v
Aunque ( 2) no son medios completamente nu
-11"
tritivos,causan proliferación de iibroblastos las proteosasde la peptona de Witte y los productos de desdoblamiento de
diferentes proteinas. Experiencias hechas con jugo embriona
rio demuestran,quela fracción proteica es la utilizada por
los fibroblastos y solamente proliferan poco tiempo con los
amino-ácidos,de ese jugo,u obtenidos por hidrólisis de profteinass
BAKERY CARREL,desdoblaran la peptona de Witte en he
teroproteosa,<x y p proteosa y las probaron en fibroblastosde corazórcileembriónde pollo y en una cepa pura de fibroblas
tos sarcomatosos de rata. La heteroproteosa se mostró inacti
va, la ny'p proteosa hicieron proliferar rapidamentelos dostejidos,pero la células permanecenen mejores condiciones con
laCY'proteosa._Lapurificación de esta por repetidas precipitaciones no hace decrecer su podereSÉiqqladofie crecimiento.
A igual concentración de N, ej. 17%de N en<qlproteosa,
17%en.p proteosa,17% en peptona control, los tres dan la misma cantidad de tejido, es decir,en los mismosdias los cultivos tienen igual area de crecimiento.
Las digestibnes de fibrina fueron separados en una
parte soluble y otra insoluble en HCl; las dos porciones contienen proteosas. Danbuen crecimiento tanto en fibroblastossarcomatosos comonormales.
La acción estimuladoïfia crecimiento, entonces, de las pro
teosas, no es propiedad-especifica de una sola fracción, sinoque has células utilizan varias fracciones con diferentes propiedades químicas.
Las proteosas no mantienen la vida de las células indefi
nidamente, pero producen crecimiento rápido por 8 6 lo dias.Para 1a nutrición completa de los fibroblastos se requiere
otras substancias de naturaleza desconocida.
ro e _uu
Desde los primeros tiempos de los cultivos se
«42
.saba que las proteínas son más ó menos inertes.
Es interesante anotar que las digeeiLOBSdeproteinas Ve
getales, cono edestina.y gluten,(contrariamente a los produc—.tos de desdoblamiento de la albúmina de huevo) tienen gran poder de crecimiento.
u GRUEC-¡3 .2 .
Varios autores han llamado la atención sobre la:
.impcrtancia del grupo SHpara la división celular. Rapkine,por
adición o supresión deiese grupo,suspende reversiblemente ladivisión del huevo de erizo de mar.
(35) Iá.glutat16n,o más bien,1os grupos sulfhidrilos son unosde los constituyentes importantes del jugo embrionario..Se
estima en 40 mgr por % de jugo,de SH expresado en glut'tiflfl.
Basandose (20) en las prepiedades del extracto embrionap
rio sobre los colorantes de oxi-redución,Sañks afirma que con
tiene una gran cantidad grupos sulfhidrilos (M/10.000 a M/100). Con ello se explica el enormepoder reductor del jugo,pero este poder no corresponde a la capacidad total de reduc
ción y por lo tanto afirma que,además del grupo SH, el extracto contiene otras substancias reductoras y en particular
sistemas diastásicos deshidrogenantes,que ha demostrado porreacciones "in vitro".
Los grupos SHpueden actuar 00m0factor para establecer
en el medio un potencial y este seria función de la concentración.
Parece que pueden intervenir químicamente de una manera
directa,en diferentes sistemas,por su poder reductor. Enciertos casos, según Sachs,quien lo ha verificado,el SHdelextracto embrionario puede intervenir en la formación de áci
do lactico a costa del pirúvico.Los —SHpueden actuar como co-diastasas y se ha podido
reemplazar (Lokmann)el co-fermento de la metilglioxasa por
el glutacion reducida—s
-4á+
Baker sugiere la idea que EL gluta‘ión actueqno solo re
gulando la respiración y 1a reacción oxidación-reducción dentro de las células, sinó tambiéngcreandoun potencial deseable de este mismo en el medio.
En cuanto a sus relaciones con el orecimientc.se ha ob
servado que él glutatdón,combinada a cenizas de higado y a la
hemoglobina,favorece el crecimiento de fibroblastos normales
y sarcomatosos (Baker); y que con jugo embrionario deficiente
por dilución, agregandole esa substancia o cisteina,se obtiene un crecimiento comparable o algo superior al obtenido con
jugo normal. (35)
Ephrussi, Verne Soubiran, Pires Soares tienen experiencias sobre este tema Siguen detalles de sus trabajos y desus opiniones.
EPHRUSSI(7) se pregunta si las substancias,que se agotan en el medio nutritivo durante el creoimiento,no son denaturaleza similar.
La reacción del nitroprusiato, llamada la reacción da.glutación,pone en evidencia el grupo SHdel glutatión y
aquellos fijados a la moléculaproteica (radicales SHfijados).
Efectuando esa reacción en diversos estados de creci
miento,se la obtiene positiva cuando hay desarr6110;y a me'dida que se va deteniendo la reacción es menos inffinsa,hü9’ta hacerse negativa cuandola división se detiene.
El lavaje de cultivos de crecimiento activo debilita la
reacción positiva(y hay que recordar que el glutaüión es soluble en agua)
Una prueba que la causa que detiene el crecimiento es el
agotamiento de substancias proteicas que suministran el r2 i
cal SH,1a da al siguiente ensayo: se desnaturalizan las proteinas por ebullición en medioácido; la reacción es reforza
da en aquello: cultivos de buen crecimiento y permanece negativa en los de desarrollo detenido.
-44
Otra prueba consiste en cultivar dos series de un mismo
cultivo por el método de crecimiento lento. Cuandoel desarro
llo se detienu,se efectua la reacción del nitroyrusiato en una
de ellas,que u-rá negativa. Agregandoa la segunda serie extracto embrionariv,¿ue comose sabe es rico en SH,ol orecinlerto
vuelve a comenzary la reacción se hace positiva. Los cultivosf}en presencia de extracto embrionariq Onótodoclásico) a las tie;
ó cuatro semanas, aunque muestran aun reacción positiva al ni
troprusiato, detienen su desarrollo. Hayque concluir, pues, quetiene otras causas esa detención del crecimiento, probablementela acumulación de substancias de desperdicio. n
“Si la detención del desarrollo de nuestros cultivos dice
Ephrussi, es debido al agotamiento de una categoria de proteí
nas,capaz de dar SHpor desnaturalfgíón,se puede preguntar oo
mo la regeneración de estos mismos cultivoa despues de un traumatismo,es posible. El med109enel oúal esta regeneración se
produce,(plasma coagulada) está desprovisto de SH; los cultivarno lo contienen. Hay que hacer llamado aqui a una hipótesis ac
cesoria que falta discutir".
VERNEY VERNESOUBIRAN(35) oultivaron "colonias estafiiliza
das de fibroblastos que habían perdido su energía residual yprovenientes de corazones de embriones de pollo de 9 a lo días
de incubación",en plasma más jugo embrionario (en unos normalen otros calentado o jugo viejo) con o sin glutatión. Los cul
tivos transplantados en mismomedio varias veces.
(Es de notar,para la interpretación de la experiencia, queel jugo embrionario se vuelve inactivo,con respecto al crecimi
ento,por calentamiento<que ¿estruye el glutatión)o por conscrvavción de varias Semanas).
La adición de glutatión a plasma y extracto normal no au
:Ïcnta el desarrollo, en razón,se supone, que ya contiene el ox”\
3raéfo grupos SHen cantidad.
-45
Agregándoseloal extracto calentadc,un el cúal disminu
ye la actividad de los oultivos,mejora el crecimiento,pero noiguala al obtenido en jugo normal. No hay duda que otras subs
tancias se han destruido por el calentamiento (trefonas).Se ve disminuir la actividad de crecimiento en los teji
dos cultiVaflos en jugo viejo y 1a adición de glutatián es ine
ficaz para mejorarlos,con lo que se demuestra que el jugo aún
contiene esa substancia y 1a disminución de su actividad debe
estar en relación cOnla desaparición de otros compuestos,
En resumen para la actividad del jugo embrionario, al glutation no es factor suficiente,pero si necesario.
PIRES SCABES(20)trabajó con una substancia rica en SH,
la cisteina. Comotejidos usó testículo de cabayo de un mes
y corazón embrionario de pollo; comomedio de cultivoaplasma 4
extracto embrionario, plasma-tcisteina, plasma-textracto embrionario-+cisteína.
Los cultivos con plasma extracto y cisteína son mejores
que con los otros medios. Se deduce de la experiencia que,es
causa de 1a fibrinolisis de los cultivos, 1a falta de SHjuncon otros factores,porque en los que contenían cisteina se retardaba este fenómeno.
Por comparación de experiencias, se concluye tambien que
el plasma, quitándole grupos SHal extracto embrionario,tie—ne un poder de oxidación muymarcado sobre él.
“Las experiencias que proseguimos, dice Pires Soares, nos
permitirán, quizás , considerar los grupos sulfhidrilos comolos factores esenciales de la proliferación y del crecimien
to de los tejidos. Los trabajos de Fischer, Fujino, Hammett,
Saunders, Waldsehmidt-Leitz, Mueller, Sturgis, Hueper, Russel,
Sachs y otros,que son particularmente sugestivos en esta materia,refuerzan esa opinión."
.45;XLI Homem
-Las hormonas y su papeloen el crecimien‘o en"brionario rzsido objeto de muchosestudios. Varios autores
encontraron que producen efectos en la velocidad de creci
niento,cono también en la morfología g con cultivos de cé
lulas enbriomarias se ha obtenido ¿ejor resultado aun.Katsura,con extracto de tino agregado al nedio,obtu
vo crecimiento más rápido de fibroblast s de embriones de
pollo. .BOFFO(25) ha encontrado que la insulina inhibe el
creci:iento,tanto normal comoneoplásieó . Solamente en can
tidades tu; diluidas,0.26 unidades por 1i1,se observa algundesarrollo.(a')
Quervain refiere que fué informado por Carrelgprmvada—
mente,de iguales resultados,con extractos conteniendo hormona tiroidea. Pero las publicaciones de Garrel y sus asocia
dos,solo hablan de que las proteosas de la tiroidea y de la
pituitaria dan buen resultado en crecimientc,pero sin ninguna evidencia de efecto esQecifico endocrinal.
Los estudios sobre la influencia de la hormonatiroi
dea son contradictorios. Por medios de cultivos afrontadas
Ebeling comprobóun efecto estimulante del epitelio tiroideosobre fibroblastos,en cuanto a crecimiento. Defluth en con
diciones análogas lo niega. Oarre1,con extracto de la glándula sobre fibroblastos,observa estimulación. Seaura y tam
bién Sato, con. tiroxina en el medio de cultivo,encuentranque a cierta concentración favorece, en otra mayor inhibe.Vogelaar y Ehrlichmann no ban encontrado acción de creci
ïiento sobre fibroblastos humanosy no creen que la tiroxina pueda actuar directamente.
VERNEY ODIEQTE(30) han utilizado en el uedic de cul-v
tüma solución de tiroxina a distintas concentraciones y cu
motejido,corazón de pollo de cultivos estabilizados es de
cir,que han mantenido durante 15 días a 3 semanas por medioÏa') En consecuencia de esta observación, Gomesda Costa, de
Portugal, aplicó un tratamiento a base de una pasta con insulina.
-47de trasplante). Tambiénutilizaron tejido nervioso. Noencontraron diferencia en el crecimiento entre los cultivos
con o sin tiroxina. En otra serie de exyeriencias,se sirvie
ron,cero medio para el tejide,de plasma,proveniente de un pollo al cual se inyectó previamente tiroxina; en este esse se0915:;r6 aumento del area de crecimiento,cn comparación con
los testigos, un número mayor de nitosis y una densidad tam
bién mayor de los elementos que invaden el medio,tantn en corazón comoen tejido nervioso.
Hasta fl dias despues de Ia'ultina inyección el plasma
es estimulante; pasado ese tiempo se vuelve indiferente y"este retorno al estado indiferente se mantiene aunque se
continuen regularmente las inyecciones”. Mástodavía,"en un pollo,que habia recibido durante tres semanas inyecciones dé
biles de tiroxina y después se habia puesto en reposo,se haobservado que el plasma presentaba una ligera reacción inhibidcra del creciniento“.
Se supone que la tiroxina en el organismo vivo sufre
transformaciones que hacen al plasma cstinulante,pero luegoaparecen anti-hormonas con efecto inhibidor.
Im V'lugng.Las vitaminas,aunque indispensables en la vida
entera, su necesidad es más pronunciada en la primer edad.
No esta esclarecido en todos sus aspectos la inrluencia de las vitaminas que rigen el desarrollo normal y el
crecimiento; pero es probable que en los cambios del tejidocelular tengan un rol importante y tanto mas tenga necesidadel organismo en ellas,euanto mas rapido se desarrollen los
procesos de vida; En oonecoueneia,pareoe probable, Que las
03'le maya:metabolismo,comoen el caso dé te; idas encrecimiento y cmbrionathmücl intercambio en vitsaunaa sea na
yor.Burrows, Biseglie, Erdnann le atribuyen para el creci
miento gran importancia.
-43
La vitamina A fuó estudiada por Burrows,en 1126,y porBisceglie,ta1bión on el mismoaño. El primero llegó a 1a con
clusión que es innibidora del crecimiento. Bisoeglie,con cul
tivos de bazo e higadofgota pendiente,encontró que estimulaba,
pero sin precisar hasta que punto el factor A habia sido purificado.
L. um“ puedereanimr Witivi. noribunc'LOs.En plasma heterólogo produce crecimiento débil y especialmen
te de tipo conjuntivo. En plasma homólogo predomina el tipo
epitelial. Iaíáfífisñgxnmzacciónbien definidafil)Bisceglic,cemo se ha dicho,investigó la acción de las vitami
yaacAlI B sobre el crecimiento de explantados hepáticos y deal medio de culbazos,de Qdmümfli recien nacidos agregando) )
tichsubstanoias nfifiuagamvi+Pqflggagos estimulan. La A en mayor grado y en los cultivos hopáticos con preferencia el tejido epitelial.
Burrors supone que “el tumor se produce por una aiüwui.
vitaúïhoáisyedeeflirïflO fine.sigPB i : una acumulación local de
vitamina B o bien una desapa ición de 1a vitamina a produce
un crecimiento ilihitado del tejido tumoral".A lo mismollegóErdmann. N
Juhász-Schaffor'aumprobó' 1a aceleración del crecimiento
de cultivos por lahB y no pudo observar la inhibición por lavitamina A.
BAKER(l) trató de dilucidar si la vitamina A es necesa
ria para la vida de los Íibroblastos. Utilizó a) carotenq queno influye en ol creoimionto;b) vitamina A relativamente pu
rificada extlaída de un aceitc;o) vitamina A de la mismaprocedencia pero muypurificada.
Las dos últimas fueron probadas en oultürus de fibroblastoa,cepa de 23 años y otro nuevo derivado de un corazón.
Ia.A es hasta cierta concentración muyestimulante del
crocimiento,pasado el cual es tóxica.La adición de la vitamina evita la acumulación de grasa
.49r
en las células; viven y proliferan los tejidos mas tiempo enlos mediosartificiales;
El diverso grado de purificación no influye en los reoultados.
Hosono‘mBISAWA(41) memwÓn 1a acción estimlanmde la vitamina D,para el crocimiento,en corazón de embriónde pollo.
La vitamina E fué estudiada por JUHASZ-SCHAFFER(12)
quien dice que,1a unidad de sensibilidad,con respecto a lafalta de esa vitamina,de los tejidos de embrióncs,de los re
cien nacidos ¿y testiculares,hnee pensar que tiene un papelimportante en el desarrollo vital mascaracterístico de esestejiddï la multiplicación celular.
Ese es el origen del problema de si la vitamina E estimula el crecimiento de las células.
JUHASZ-SOHAFFERempleó como tejidos bazo;hígado;corazón
y .Yimeri‘estieíde embriones de pollo de 5 a lO días.
Comomedio,plasma dc pollo de un año y solución Locke
1:1,sin extracto,"porqueíggfitiene toda una serie de factoresde propagación celular,prinoipa1monte vitaminasgyeharia imposible el analisis mas detallado de cada uno de los facto
res" y gotas-do ¿coit0500mo fuente de vitamina E,es decir,
extracto etereo de'aoeite de trigo,que lg contienefgmtoaen unoscultivos -Ehotros el'extractc inactivado por autoclave.Ytodavia,otras series sin aceite.
Se observaron los cultivos al estado viviente y también
fijados y coloreados. La medida de la velocidad de creci
miento se efectuó por medio de un metodo grafico,midiendo
las superficies cada 24 horas.(Este metodo consiste on el empleo de un aparato para
proyectar sobre papel los contormoscelulares crecidos ydibujar planimctricamente ol area.
Los resultados fueronsa)con respecto a la clase de có
lulasyflreeimiento de naturaleza mixta,especialmento de cé
-50
lulas ccnjuntivas,perc tambien de otras células. El efecto oe
timulador,pcr ciertas células) puede excluirse verosimilmente,porque, la mcrfolcgía,de lo que corresp0nde a la zona de inva
sión, no muestra desviación con respecto a los cultivos ccntro—les.
Pero el autor hace notar que no utilizó cultivos puros,condición necesaria para estudiar los efectos sobre un tipo celular determinado.
Conestos, cultivados sin interrupción, tal vez habría es
pecifidad para ciertos elementos y agrega,"tambien nuestros conccimientcs,scbre el rol de los distintos componentesdel teji
dc cancercso, podrían apoyar la opinión de que las células opiteliales,de origen de tejido conjuntivo,no reaccionan uniformemente ante el estimulo de las vitaminas".
b) Con respecto al crecimiento; 3:1agregado de aceite ÍM'N
aumenta el crecimiento y prolonga la vida del cultivo; con elaceite inactivadc no se modifica ni en favor o en contra ese
crecimiento. Por lo tanto,debe atribuirse a los contenidos v1tamíniccs el efecto propicio a la multiplicación celular. (Sihay otros factores que son destruidos por el calentamiento, noestá aI alcance de los conocimientos). No forman una zona uni
forme las areas de crecimiento; en algunas partes esas zonas
son más grandes, especialmente donde la fuente de vitamina esdeslindada visiblemente por el trozo.
El autor discute esta parte del trabajo comosigue.Tanto el aceite de trigo inactivadc comoel activado es asimi
lado uniformemente; pero solo aumenta.la fuerza de crecimientq
aquél, que en los experimentos de nutrición demostró que conte
nía el factor E. Podria decirse, pués, que la vitamina E y efectc estimiladcr de crecimiento son equivalentes, pero no es así,pues los brotes de trigo contienen otras vitaminas; que canti
dad contiene el aceite de trigo de esos otros factores no se oo1100€.
-51.
Lc que las observaciones pusieron en evidencia, es quegexcluvendo la vitamina Egla cantidad de factores vitaminioos no es
muy evidente y que,tratándose de la acción favorecedora de crew
cimiento de los aceites de trigo, la E debe ser puesta en primera linea. ¡
Pero para la solución del problema seria necesario aislafiIL
í:¿r SUBSTANCIAS EXTRAÑÁS AL ORGQKISMBQ CANCERIGENAS E INHIBIDORAS2
Comoun agregado se citan algunas
substancias no existentes en el organismo, peregpor su impor
tancia en la producción del cancer experimental, es interesante conocer su comportamientofrente a tejidos aislados y vivos.
La canccrización "in vitro" de células normales, por medio
de agentes bien definidos, es considerada un argumento de granvalor para la demostración de que el cancer es un mal celular.
Se ha obtenido por diversas vias: Fischer,agregando al tro
zo cultivado durante varios pasajes As 2 03; Carrel y Ebelingcon extractos de sarcomas provocados por substancias químicas (I):
Des Ligneros con 1!»2:5:—6: dibenzo-antracene; etc; cancerización los cultivost(5) .
Varios de estos investigadores han podido comprobar la can
cerizaciónfi injertando el trozo en experiencia a animales.en
los cuales han Conseguido, por esc medio,producir tumores¿HEARNECREECH(5) utilizó fibroblastos del tejido conec
tivo envolvente de las costillasfide embrión de rataComomedio, las substancias a próbarse disueltas en SOlu
ción de Pannett y Comptona‘Ph 7,4-7.5, plasma de pollo y extraflto.
Después de 24 o de 70 horas los crecimientos, fijados Y
¿filoreadcs o vivientes, dieran al microscopio los siguientes
resultados: 1:2:5:6 dibenzoantraoeno y ácido coleico ¡gumenta51 Crecimiento: no así el fenantrene fi ácido ooleico; y acenaf
tene y ácido coleice, compuestos, estos dos últimos nocanoerígenos.
-92—
MAUER(42) trabajó con ciertos hidroearburos cancerigenos
(benzopirene; benzantracene etc.) agregados a cultivos de fibro
blastos de embriones de 14 dias de perro, con objeto de ralacio
nar los fenómenosobservados (degeneración grasosa, coagulación,
etc.) con los de las células malignas.
Se ha estudiado muchola acción de substancias orgánicas
e inorgánicas,
Hay numerosos compuestos que, a ciertas concentraciones,
son inocuos para los tejidos nonmales y solamente a mayores dilu
ciones lo son para las neOplásicas_ BOETO(Ia biologia del ver
de de malaquita estudiada en los cultivos de tejidos normales yneoplásicos, Bol, del Inst, de Med, Exper, t, VI, n° 22, p.357
1929) lo observó con el verde de malaquita; BOEFOy-CAIBAGNO
(Estudio biológico de los vanadatos de Na, K, NH4, Li, Rb,Cs,
Mgy Ca sobre el desarrollo de los tejidos normales y neOplásicos
"in vitro" Bol, del Inst, de Med, Exper, n° 25, Dic, 1930) con
las Sales del vanadio, a
En este último trabajo, se ha observado además, que la
acción toxica del vanadio es reforzada, en muchoscasos por el
cation, Así el mayor poder de inhibición lo da el vanadato de NHÁ,con menor porcentaje de V en la molécula, que otros, los cuales
son menos tóxicos.
De la misma manera, mezclas de dos sales, de un mismo
cation, no actuan con acción conjunta. Se explica, porque susmexclas forman una tercer sal con acción diferente a las que la
engendran,
Mayorpoder inhibidor tienen los vanado-cromatos,(RDETO
y CAICJiWD;Ebtudio biológico de los vanado-cromatos alcalinos
á de magnesia, sobre el deSarrollo de los tejidos normales y neo
plásicos, Bol, del Inst. de led, ERper. N2 26, pág, 108, 1931.)
-52 bis
Son tóxicos para los dos tejidos ensayados: corazón y sarcoma. El
cromoes el que acrecienta este poder. Efectivamente con los mis;
nos cationes, los vanadocromatos son más nocivos que los vanadatos,
En general, la célula neoplásica es más sensible que las nor;males a los mismos agentes tóxicos.
Uña idea la da el siguiente experimento (BDFTO,Pérdida de 1a
vitalidad por la acción fotodinámicade los tejidos sensibilizados,Experiencias en las culturas "in vitro" Bol, del Inst, de Med, EXpeI‘
n° 27, pág, 339, 1931,), La eosina y la eritrosina permiten el crecimiento del tejido nornal y neOplásico (corazón embrionario de po
llo y sarcomafusocelular de rata).Irradiados los cultivos, en estosmedios, con rayos ultravioletas acontece: con una exposición de
hasta 30‘ a 40 cts, de distancia,el tejido normalprolifera inteny
sanente: solamente con exposiciones más próximas o de mayor tiempo
hay menor crecimiento, En cambio el sarcoma es inhibido en cual
quier caso de eXposición,
Es un proceso de foto-sensibilización de colorantes fluo
rescentes que, inativos de por si, son activos por influencia dela luz,
CAPITUIO III
EODIFICAOIONES DEI.CRECIHIENTO CELULAR POR EFECTO DE DIVERSOS
E”CTORES QUIMICOS, MODIFICACIONES QUIMICdS PRODUCIDAS POR EL
CRECIMIENIOCELULg
1.- AHÁEBQBIOSIS.(IV, vol, Za. sección 4, pág, 742)
Burrowshsestudiado la respiración "in vitro”.
Corazones embrionarios de pollo cm.diferentes presiones parcia
les de 02,se comportan diferentenonte según el grado de desarrollo del pollo. Fibroblastos de embriones,de 4 y 5 dias,
crecen y laten durante 46 horas en N2y hasta 50 on 7.5% de
02. De 10 a 15 dias no crecen en N2 puro y solo durante 12
horas en 1.5% de 02. Burrows omitiócsobre estos fenómenosrla
hipótesis,que las células Jovenes tienen una fuente de energia que falta en las más adultas y con 1a edad declina hasta
perderse la facultad de crecer en anaorobiosis.Wind confirmó este trabajo con un método on que obtenía
anaerobiosis ostricta. En esta condición celulas de corazóndo pollo,de 4 a 5 días,apenas se desarrollan. En 33.10"4 %de 02 la diferencia es más notable: las de lO días no ore
cen; las de 5 excelentemente. 0bservó,además,quo si so suboultivan muchas semanas y se ponia de nuevo en condiciones
de anaerobiosis la diferencia,entre células de diferenteedad desaparecian: no habia diferencia en el crecimiento.
Los resultados de otros investigadores son:
Wright
Explantaciones de mioblastos (embriones pollos lo días)
mm Hg 02.
a)en 0.22%de glucosa,mitosis cesa en 18.6emigración cesa en 12.4
b) en 0.06% do glucosa,mitosis cesa en 14.6emigración cesa en 9.0
Sarcomade Jersen rata,aitosis cesa on 6.0Carcimona de lancha " " " 3.0
Ephrussi, Chevillsrd,Meyer,Plantefol con oxplantaciones.de fibroblastos de corazón de pollos de 8 días:1a mitosisa
pero no el movimiento,cesa en 7.0 .
-54
"Estos hechos llevan a la consideración de la evidencia,
que se ha traido de tiempo en tiempo en favor de ia opinión;que durante los primeros estados embrionarios el crecimien
to anaerobio es posible o puede ocurrir normalmente".
n mapas; 129.11 '
Además de Warburg y sus colaboradores, Shearer
examinó "in vitro" la respiración de tejidos de embriones de
pollo y llegó a dos conclusiones: primero,quc la velocidadrespiratoria de los fragmentos de la cabeza es mayor Quelos
de laparte/Pfigyeïágg sobre el significado de este resultado.Segundo, que on los dos casos,al aumentar el grado de desarrollo la velocidad declina y esta es otra observación agro
gada a la idea,ya establecida,que en los embriones de polloel metabolismo disminuye con la edad.
E1 espesor del medioregulahasta cierto punto la difu
sión del oxigeno. Burrows,guiándoso por la aparición de mitosis y por la trasformación de la hemoglobina en oxihemoglobi
na,establoce que un espesor de 0.2 a 013 mmes el mejor parabazo Cds a 0.? para el tejido eonjuntivo. Sobre este espesorno hay verdadero crecimiento de fibroblastos.
Pero los efectos de la anaerobiosis se corrigen por adición de extracto embrionario y en profundidades mayores de0;? mmlos fibroblastos muestran mitosis normal.
En la rcacción,(glucosa.— acido
1actico. 602 y H20)01 proceso oxidativo puede -qu6mar el aci
\ do láctico, o ser menor 1a oxidación y acumularse.
%%%ÏíáánesdePasteur se sabe que las fermentaciones y las oxidaciones no son independientes. Si una celula, que en anaoro
biosis tormento el azucar; sepone en medio oxigenado; la res
piración que se estabf ee disminuye o hace desaparecer 1afermentación.
Según Meyerhof existe en el músculo este ciclo.' l r
Hidrato de carbonu'SZZEg acido láctico
55
El fenomenol, es decir, el pasaje hidrato de carbono ácido
láctico,es anaerobio y espontáneo, El 2, la resíntesis, es aerobioy necesita energia,
Unarespiración, de cierta intensidad, no puede hacer desapare
cer ácido láctico en cantidades grandes cualesquieras. Hayuna rela»
ción. fijada por la energia necesaria para que se efectúe la reaccid1
2. Esta fórmula se puede medir por el valor del cuociente'ct c des
reSpira01on
Cuandolas células, que tienen la propiedad de fermentar al
azúcar, pasan a medio acrobio, si la velocidad de fermentación es
grande y la respiración pequeña, aquella subsistirá, Este es el caso
de la levadura de cerveza, que forma tanta azucar en aero ccmo en
anacrobiosis,
Pero si la reSpiración es suficiente o grande la fermentación
desaparece en el oxigeno, como es el caso del Mucor Mucedode Pas
teur,
Tejidos normales Nargelein ( III t,2, cap, XV,pág, 109) efec
tuó sus trabajos en la forma siguiente:
Estudió la glucdlisis en distintas edades del embrión (rata), Co
moel Ringer altera los tejidos embrionarios, utilizó suero de caba
llo inativado y en algunas experiencias liquido amniótico, provenien
te de grandes embriones, El Ringer, conteniendo 02%de glucosa y
2,5 10"2 moléculas de bicarbonato por litro, era isótonico con suero
de rata.
la medida de la glucolisis y de la respiración se efectuó mono
métricamente y la glucolisis aerobia determinada por la disminución
del tenor en bicarbonato, que un corte de tejido producía en una
solución de suero y Binger. la duración de la experiencia 30',
_La_'. _an_'_ae.'_ro_“_bi_'_a,_deembriones de rata, en suero, á
38°,dió el siguiente resultado:L
Peso embrión
(más pesado I lo, láctico por hora en %de pesomayor edad) L seco de embrión,
10.6 7,5 3,0
4,89 10,8 4,3
2,48 15,1 6,1
1,87 14,5 5,80,47 32,0 13,0
0.30 26,3 10,6
N2 í '
siendo I acido lacticg fgrïadfi en N en mm?L mg, e31 o ora.
¿La_%lucolisis-Perobisï_embriones de rata, de algunos miligramosglucolisan en aerobiosis cuando están en solución Ringen a pesar de
su respiración, pero no en suero, En consecuencia, el Ringer los altara,
Los pequeños embriones, de l mm, o menos, glucolisan en aero
biosis, en cualquiera de esos medios, Pero, midiendo el metabolismo
de los embriones conservados dentro del amnios, (para aproximarse
a las condiciones fisiológicas) la glucolisis es muychica o nula,basta para los embriones pequeños,
Si el saco embrionario es destruido, aparece glucolisis aerobia,tanto mayor cuanto más pequeños son los embriones,
De estas experiencias lo que se deduce es, que "in vivo“ no
debe haber glucolisis aerobia, cualquiera que sea el grado de evolu
ción del embrión de rata, Lo que parece acontecer, es que, en los
primeros estados de evolución aquellos son muyfrágiles y se altepran cuando se trabajan en suero o en líquido amneótico.
Los resultados de otros autores (IV vol, II, Sección 4, pág,
768) sobre lo anterior son los siguientesá
warburg y Kudowitztrabajaron con fibroblastos, células epi
teliales y células del corazón, A medida que crece en edad y por latanto en peso, el NCBcae; para 0,1 mgr, 50 y para 0,8 mgr, 14,
(NGR= glucolisis anaerobiótica)
(Khmanomidoempleó como medio suero y en otros casos Ringer
y embriones de pollo, El NGRsiempre fué mayor en 50% en el último
medio (Ringer); no cree que esta anomalía sea debido a alteraciones
del embrión, sinó a un efecto inhibidor del suero que no permite
la intensidad máximade producció%deláctico.)En general el NGRdecae con la edad y ha sido comprobada
con las siguientes experiencias higado de rata (Rosenthal y
Lasnitzki); riñón de rata (por los mismos); embrión de rata entere
y coreon de rata (Nagelein); placenta humana(Ioeser); higado depollo (Tamiya); corazón de pollo " in vitro" (Warburg y Kubowitz)_
embriones de pollo entero (Kumanomido);cristalino de rata y placenta (Fujita); placenta de rata (Adler).
Solamente se ha observado en un caso que el NGRaumente con
la edad: retina de pollo (trabajo de lamiya).
La proporción de la glucolisis aerobia puede aumentar o caercon la edad.
sube: higado de rata (Rosenthal y Lasnitzki)
cae: placenta humana(loeser)
embrión de pollo entero (Khmanomido)
Tejidos neoplósicos¡)(III, vol, I, cap, II, pág. 212) Warburg en colaboración con Posener y Nagelein trabajaron con enbriop
nes de tres a cinco dias incubación, La velocidad de crecimiento
es considerable y coincide con la velocidad de los carcinomas
nuevos (Blexner, de rata), lo que interesa a los autores, porque
estas experiencias sehicieron en comparacióncon tumores diversos,
La glucolisis en medio anaerobio
IN2 = mg 3 de GQ? ggggñdg en N3002 mgr, e e31 o, oras
fué por término medio 23,
El embrión forma 9%de StlpeSO, por hora, de ácido láctico
Pero la mismaexperiencia, en aerobiosis, da comoresultado_
que el embriónno forma el écidor'el oxi¿eno lo hace desaparecer,
En los tumores: si se llevan del B2,donde fermenta el azú
car, al 02,1a glucolisis subsiste en gran parte.Si la actividad glucolitica es una propiedad de las célula?
en crecimiento, tanto el tejido adulto comoel embrionario debe
glucolisar, El reposo del primero es solo aparente y con métodossuficientemente finos_ se encuentra que los tejidos adultos glu
\‘\\colisan.El tejido conjuntivo adulto tiene metabolismo muydébil‘ E;
el epitelial hay glucolisis anaerobia, lo que prueba que la pro
piodad de tejido embrionario no desaparece, pero en el epitelio
58
en reposo es diez veces menor que en los epitelios de los tumores,
La glucolisis anaerobia es apenas mensurable,
Ademásde los tumores y del tejido embrionario hay un tercer
estado: el estacionario.
Resumiendodflos tejidos en estado embrionario presentan in
tensa glucolisis, en anaerobiosis, Respiración del niságégál estadoestacionario presenta pequeñaglucolisis anaerobia phel de los tu
mores con fuerte glucolisis anaerobia, Respiración pequeña en proporción,
(V capitulo VI-V, pág, 225 y 253) PriVando durante varias ho
ras de GBa las células cancerosas, (24 carcinoma de Flexner, 72
sarcoma de Jersen) pueden ser trasplantadaS¡ Viven pués de la fer
mentación, (Okamoto).
Puade vivir respirando sin fermentar: cortes cancerosos, en
Ringer dializado hasta desaparición de la glucosa, pero aereados,
presentan respiración y fermentación normal,
Del punto de vista del aprovisionamiento de la energia es
superior la célula cancerosa a la normal, pués mientras ésta tienesolamente la respiración, la otra tiene dos funciones: reapiracióny fermentación,
“Pudicnáola célula cancerosa vivir, "in vitro”,después de
muchashoras de privación de 02,¿.uede crecer,también,an esas con
diciones y cual es la causa de la energia que asegura tal crecimiento?Wind trató de resolver el próblema por el método de los cul
tivos, Eliminando lo más completamente el 02, creció durante 48
horas y por lo tanto a expensas de la fermentación, el sarccma de
Rous, el cual "no es más sensible a la falta de 02 que la levadura",
El mismo sarcoma, en cualquier tenor en GBdel medio, ( 95 á
04%)pero en medio pobre de glucosa, crece todavia con 0.007% de
glucosa, pero se detiene con cantidades menores de la misma,
Parece, en resúmen, que en medio privado de 02 las células
normales mueren, las de sarcoma y carcinoma viven durante días,
siempre que el medio tenga glucosa.Con ©2 viven las células cance
59
rosas, pero sin fermentar,b) La glucolisis intensa de la retina ha dado lugar a dis
cusiones, El crecimiento ilimitado del tejido maligno no puede ex"
plicarse por su glucolisis intensa, pués la retina de rata lo efectúa con igual intensidad, (AunqueWarburg cree que "in vivo" este
tejido no debe producir láctico. La retina de rana, por ejempio,
menos sensible, no produce el ácido en presencia de UB,pero poseepoder glucolitico anaerobio considerable, Pentimalli replica, a suvez, que la glucolisis aerobia de la retina de rata es tan elevada
que no es suficiente la explicación anterior).IV vol, II, Sección 4, pág, 767) Los resultados de las expe—'
riancias sobre la retina son los siguientes:
Krebs encontró que la retina embrionaria tenia una glucolisisaerobia igual a 33 y es adulta 130
Tamiyatrabajó en glucolisis anaerobia (aves)
cmmtotal 002 engflg_ ; NGRmgmtejido por hora
FERde la retina en relación con la edad: 8 dias, 35; l5_dias, 45; nacimiento, 85; mayor/gn¿ida pcst-natal; adulto,130;
en la vejez parece bajar, 4 años, 90,Estos resultados demuestran, que en el momentode salir del
huevo, la retina embrionaria produce en anaerobiosis 2C)%de su
peso, por hora, de laciioo y al año en las mismascondiciones el
75 %.
1a rating posee, pués, intensidad glucolitica mayorque
cualquier otro tejido.c) BORFOy CORREA(27) Han efectuado experimentaciones en
tres tejidos: sarcoma fusocelular y adenocarcinomade ra
.d-ÏGO
ta y corazón de embrión de pollo; enth eultÍYQQdispuestos
en varios medios gaseosos; aire nitrógeno e hidrógeno y 01
002 formado reducido a 09 y 760 mmy referido a 100 gr. detejido,dosando la cantidad total de C02 producida en 48 decultivo.
Los resultados han sido lfigin acrobiosis los datos con
cuerdan con los de Warburg. E1 corazón y el sarcoma acudan
cifras similares; el carcinoma menor cantidad de 002,10 queoe atribuye a diferente inten.idad de crecimiento del ultino. 29:Bn.anaerobiosis el corazón produce nayor cantidad de
002 que los otros dos tejidos. En este ambiente no hay creci
miento y se atribuye el resultado a la fermentación tisular,que provoca la escisión de la.glucosa en acido láctico.
En aerobiosis (28) el 002 proviene de las dos reaccio
nes energóticas fundamentales; 19 respiración; producto decombustión celular y 29,fermentación,que da 002 comoproducto final.
El 002 desprondido no informa,puós,sobre los anterioresprocesos independientemente.
En anaerobisis,el 002 proviene en su totalidad de lafermentación y si el corazón desprende en esas condiciones
una mayor cantidad,se atribuye a una mas grande actividad
fermentativa que los neoplasicos,en las condiciones de 1aexperimentación.
Grandes cantidades dosprondidas de 002 se relacionan
siempre con gran desarrollo del cultivo.
En anaerobiosis el desarrollo es pobre o nulq lo queindica cue "in vitro" la fermentación sola es insuficientepara quorhaya reproducción celular.m
’ l, ROFFOY CORREA(29) determinaron
también el cuociente respiratorio de corazón embrionario de
pollo sarcoma y carcinoma de rata,siendo ese cuociente mayorque la unidad en los neoplasicos,1.51 a 2.02,y menor en el
.afil»
corazón,0.79 y Ó;‘i. "La actividad fermentativa láctica eleva
da, caracter pzcdominonto on el metabolismo de los tejidos
neOplasicos,cxwlica con toda claridad tal anomalía.fl 0 L
En cl embrión de 90110,03 el 11 avo
dia'de inoubación,ol punto en ontogonia que comienza ia ser
notable el almacenaje del glucógeno.
Potvin y Araon examinaron dia por día el higado,histo
quimicanentc’sin encontrar vestigios de 61 hasta el día indioado,o uno mas. El aumento es muy rapido después de 14 dias.
Hay otro canbio brusco en el dia 11. ¿En vitro? antes
de ese tiempo,1as celulas del hígado crecen comocpiteliales1
despues comofibroblastos. Y también después dc este día;pero no antes; el crecimiento os inhibidogxgktraoto de levadura,1o que acontece siempre con fibroblastos.
Este canbio,quo aparece regularnentc en ese tiempo,coincido con la inflexión y subida rapida de 1a curva del gluco
I1m. . .H ./bvno H /j/
o 8 0.4 17/,W? fiS o ha 0.58 8 oo m o 0.2 /2; 2° s:m g I ‘ "d “—
H o- . o O vo o 15 179 ll IBTiempo de incubación
Es considerado significativo que,en injertos cerco-alantoiaeos,el higado despues de este nisno dia 11 no crece.
Por medio de observaciones histoquimicas de ese órgano,explantado, Nordnann pudo ver que el glucógeno es sintetizado desde el día 9 en adelante y esa sintesis es independien
te de la constitución del medio.
Krontowski y Bronstein con tejidos cn creciaionto han
hecho trabajos. Sobre gragncntos de 0.0s a 0.13 mg; por el
mótodo de Hagedorn_Jerson,han dosado azucar en bazo y riñon, ¿ , seco
y comprobado que por dia consumen 4 Jo su peso/para sus no
.62.
cocidades energéticas,psra una proliferación muyactivaá}lfisreservas en azúcar son consunidaá en cuatro o cinco dins por
las células normales y on menor tiempo por las canccrouss;
Estos autores confirman la ley de warburg.segun la cua1,hohay crecimiento sin glucolisis y la glucosa es la substancia que da la energía de crecimiento.
Lc substancia blanca del encófalc consume 15%de azú
omr en 24 horas, la gris 58 %; ol riñon 40%; el bazo 25 acet; los tejidos cancerosos 45 a 50%.Los fibroblastos de
lu cepa de Carrel queman 0.04 a 0.05 mgr. en dos diasjlos
ribroblnstos recientemente aislados de 0.06 a 0.07 mgr.
Durante los tres o cuatro primeros pasajes,el metabolismodecrece como intensidad,y,cuando agotan las reservas del
trozo inicial,se vuelve estable. .Alcentrariq "in vivo" laintensidad del metabolismo decrece durante toda la embriogénesis.
EOFFO(26) mide la glucolisis por diferencia de 1a glu
cosa existente ¿n el plasma,entes de poner e1.tejido y des
pues de 24, 48 y 72 horas de desarrollq,por el método de Fo
lin y los siguientes son algunos de sus resultad05¡Corazón Crecimiento +++48 horas Disminución % Glucosa
existente 35.14 i
Suprarrenal (¡mbrión 15 días) Crec-.1++48\horas Disminución 7°Glucosa 36.79
Suprarrenal (embrión 15 días) Cree“ +++72 Diáminu
ción % glucosa274.72
Bazo (embrión 10 días) Crec a+++48 "uk Disminu
ción %glucosa 70.50 ‘(Riñon (embrión 18 días) Crer +++48 \Disminu
ción % glucosa 42.26 a
Riñcn (embrión 18 días) ‘Crec.«+++72 Disminué
ción % glucosa 80.64
Hígado (embrión 18' días) Cree +++48 Disminu
ción % glucosa 35a. 1-Sarqoma fusooelular de rata Crec -+24 ilminue
ción % glucosa 50
Sarcoma fusocelular de rata Crec +++ ¿ü horas Lisminu
O ps;. J glucosa 60
En un mismoórgano los resultados -ue-e‘ variïr hectant
así,en tres determinaciones diferentes,soï?c corazones con '«
gual crecimiento y a las 48 horas,se 'an ObtuÜidx 23%, 3%y
71%de disminuciózf, pero igualmente se observa q-:e hay órganos
que tienen rna glucolisis más pronu.siadalque otros. El quepresenta mayor poder gluóolítico es el bazo y le sigues en or
u decreciente timo, oapsula suprarrcncl, riñon, híge o, tumor (surcoma fusocelular), corazón.
¡a glucolisis producida esta en relación con determina
o órgana?. Para la interpretaoi/ de los resultados anteriop;
rcs,huv que hacer inte"venir el 'a tor crecimiento y a la intensidad Lc él deben a‘ribuirsc tr; diferencias de la glucclim
sis,mas que a la especi icidad le tejido. Unaprueba lo da lascii*as altas del bazo o? relaciín son las del hígado 'Ïn vi
tro" este da escaso deSnrrollog el bazo,contrariamente, da exu
ber.Lte,tres voces mayorgsi se r.fi‘re al volumen¿cl tejido dcsarzollado.
La reprodución CCÏM1ÏÏ, según ptrece, es la que regula la
combustión de la gluc sm.
mmmLos experimento: de Loeb mostraicr la gran Sl nifioaoión
“de los iones H y OH¿era los procesos vitales y en particularpara la división celular.
El primer experimento,en que SL estudiaron las :elacien\sentre el crecimiento celular y la r.acción ¿el me ¿Cgfué flecha
por HOTSen 1913. Cultivó sarcoma de gallina y xíbrcblastüs dc
corayín y venaInn un medio compuesto de plasma y solución dc
tornmsol. Observó que en donde se ven puntos rcjcs aparece pron
oo el crecimiento celular. Cuandomás rápido el csecimionto ma
yor es la formación de ácido y su acumulación pled” SLI resis
tiia por la célula durante un tiempo,porque el .esarr ""0 puede
.642?
ser visto,a pesar de él. E1 autor opina que la .ormación de
ácido es característico del crecimiento de tejidos.
FISCHER(8) se propuso conocer, con respectg al creci
miento de una cepa de fibroblastos cultivaCos "in vitro" lar
go tiempo, el rol de la concentración del ion H del media.
Los fibroblastos usados derivaban de cwrazón de pollo,
fresco; de cepa de tejido conectivo de uno a dos ¿eses y de
otra cepa de nueve años de cultivo. Usó buffer de SÜrensen (y
demostró primeramente que este no tiene influencia sobre la ve
lociuaa de crecimiento). Comoel fin de los experimentos era el
estudio, para diversas generaciones, de la mismaconcentración
de H, el cultivo se dividia en dos partes en cada pasaje: unocomocontrol y otro en el medio experimental calculándose elcrecimiento.
Los resultados fueron: la velocidad de crecimiento tiene
su máximoen‘fH 7.4-7.8. Esta velocidad decrece rapidamentecuando se aumenta la concentración de H o de OH. Estos re
sultados fueron los mismoscon diferentes ácidog ¡Los anionesparecen no tener influencia.
"Si la serie de experimentos era repetida llevando los fi
br“blastos a un nuevo medio,conteniendo la mismaconcentración
de H que la usada en el culttya preliminar,se observa que elabsoluto aumento del nuevo crecimiento es cada vez menon en el
medio más ácido o más alcalino".
En un medio conteniendo 1a misma concentración de H, si
guiendo generación tras generación el crecimiento de fibroblas
tos,se observa que la proliferación se detiene en el sexto pa
saje a la mayor acidez'PH5.5. A mayor aloalinidad los fibroblastos muestran mas resistencia,pero en la mas altaIPH 8.5,crecie
ron alrededor de 8 a 10 pasajes. j
Las diferencias morfológicas de las célulag debidas a lavariación del medio,no son importantes; muestran solamente másvacuolos en el medio ácido que en el medio alcalino.
LEWISy FELTON(15) Utilizando como medio solución Locke
Lewis, metodos colorimétricos, cultivos de tejidos conectivos
provenientes de embriones de 5 a 14 días de incubación,ebtiene estos resultados:
en‘?H 4.0 a 5.2 no hay mayor crecimiento’pero en general’cuando más joven es el tejido embrionario hay.uayor purcenttje de
crecimiento en medio de (en,bajo.
A'PH 6.0 crece al 71%de los cultmbs.; a ïh 7.0 el 88%;
a’en 8.0 el 89%; y a’PB 9.o el 81%. l
Tejido embrionario de 11 o más días,no crecen en'PH 6.0.El desarrollo de‘PH9.0 es pobre.
ObServaron además que el cultivo modifica el medio, a pe
sar del buffer (mezclas de HCl y NaOHen solución Locke-Lewis).
De tres a cuatro horas despues de sembrado pasa el‘PH de 8.2 a
6.8 y 7.2. De9H.9.0 a‘?H 7.6 - 8.0 y aunque no se hicieron
suficientes ensayos para ccnfirmarlos,parece ser’que cualquiera qee fuera l: concentración de H inicial,el cultivo con buen
crecimiento tiende a ser neutro, los que no crecen ligeramenteácieou y Los que después de un crecimiento abundante degeneran
¿un ligeramente alcalinos.
Ha] contradicción entre este trabajo y el de Rous,pero losexplica por la diferencia del medio empleado: plasma, Reus;
Lodke- Lewis,los autores.La concentración del ion H optimo, para tejido conecti
vo de embriones de pollo de 9 días,es 6.8 - 7.0.
Los autores se preguntan,porque no es este optimo del valor del de la sangre adulta del mismo animal. Suponen que (aun
que no se probaron suficientes cultbnnc a un‘HUdado para deci
'ïfr el asunto) 89m2". prob able. quea’Im 7.4 (ple esezclïela sangre)
lo mismoque an?) 6.8 7.0,haya crecimiento, si se tiene ercuenta el large margen en que los cultivos crecen. Sin embargo
hay que recordar que se trata de tejido embrionario, probablemente más capáz que las celulas adultas de adaptarse a ambien»
tes experimentales. Esto se explicaría por la amplitud de limites de le concentración del ton H en que pueden crecer las cé
lulas. Ye.se dijo,que- en medio mas ácido, el porcentaje decrecimiento es mayor cuando mas joven el tejido embrionario.
Ln ln yema hay gradual neutralización a medida que so desa
rrolla el embrión, pasando desde el día l al 23 de 4hït1.c e
‘PI 6.4. Suponiendo esto cierto, un embrión de 9 dias se desarrolla en un medio mas ácido que uno de mayor edad y en un ne
dio menos ácido que otro mas joven.
MENDELEEFF(18) emplea pieldgobGYD de embriones de mitad
o dos tercios a término. Inyectando a un cobayo 2 cc de :rotei
nas heterogenecsel ‘PHdel suero baja. y pasa por una Suriu ora-
cilaoiones do 9H;persisgentes durante semanas. Basado en este
fenómeno,preparó sueros de reacciones diferentes; obtuvo el mejor crecimiento en Ph 5.2 a 6.6
Suero fresco de cobayu nuevo PH 7.6 crecimiento ++
" 24 horas despues de inyectar 2 cc leche;PH 7.4 crecimiento ++
S ero 4 dias despues de inyección ’PH7.2 crecimiento +++n 7 n n u n n 6.6 n ++++
” 24 horas despues 22 " 5.2 " ++++
Concluye de sus experiencias que "el crecimiento celular
está en relación directa con el valor del TH del medio y que
una.‘g&ída.de este valor favorece la proliferación celular".
Por otra partdïbejar el‘Ph.por medio de ácidos fuertes
muydiluidos no da crecimiento análogo‘ al obtenido por los mótodos de Mendéléeff5(plasna y suero,de THbajo,obtenido de unanimal al que se le provoca el choc anafiláctico) que es superior.
(El‘?h normal de la sangre venosa esnlgo alcalinaflos liquidos intersticiales son neutros o alcalinos, es interesantehacerlo notar).
Ebeling supone que la acción del extracto embrionario se
debo, en parte, a que disminuye el'?H.
En cuanto a la cmbriología, para Mendéléeff, la embriege
.67»Louis evoluciona por la acidificación ¿e los humoros. La pruli»
furación celular,tantc "in vitro" como"in vivofi soria ¿chidoa noidificaoiones. Y todo esta ¿o acuerdo con las observacio
nes ¿cágguzctti,qui n comprobóla evolución del amarillo Col
huy o, ¡cado el punto dc vista de su'Ph.
MIHAIÏK(19),1o 3131: que Sankarar,ufinaror la: investi
gaciznos de Lewis y Felton,buscando, no c; creci.itho pysibloeL u: amplia escala dc-fH,sino ol optinc de cada tejido. Mihalik 5‘ asegura primero que el buffer rc es tóxicoi los de
Clark no lc s::,scgún Lewis)y para el c¿sc particular del tejido nerviOSO;lc demuestra Sombrandouna serie en solución Lc
ckc-Lewis sin dextrosa o pcptcza ni buffergquO'Ph es 6.8 y 0tra serio de la mismasolución pero con 10%de buffer'rh 6.8.Ho encuentra diferencia en el crecimiento de los cultivos de
las ios series.
n número de cultivos e: eso ncdic5con‘?h graduado desde
5.4 a 8.4,nostrarcn su xojor desarrollo 3‘?H6.6-6.8.
A‘Ph 5.6 y 8.2 no se observa desarrollol
Asi comolo notaron Luwis y Feltoq el cultivo tiende a llevar el medio a su-fih óptimo:
‘ïa ¿el medio 6.2,a las 24 horas 6.4,a las 49 horas 6.6,7.6 n n n 7.2 n n n 6.8
Confirzó tazbien el trabajo de Lewis y Fclton,cs1 tejidoconectivo,encontrandc comoóptimo ?H.6.G-1.0 y limite 5.6 y8.8
SANKARAN(35) Busca el óptimo de‘?H.para creciziento ¿o
filroblastos ¿e _allo. Lleva la :echu de plasza y extracto al
Ph ¿eseadc con buffer Sorensen;(fosfato ácido Cc potasio y N;CH)ox3:ina poricdicancnte el desarrollo y con ayuda de un di
oroscopio y una cámara lúcida mide sobre papel el aumento
'Ph area Ln diferentes periodo0 horas 12 horas 56 horas 60 horas 80 hwrns
6.6 588 1.413 2.088 2.088 "
6.8 706 1.475 2.695 4.134
/\
nicas y
aaa»0 fluTQS 12 horas 36 horas 60 horas 80 horas
7.2 613 1.958 3.000 5.713
7.¿ -625 1.207 3.765 6.175 11.555
8.0 577 700 1.900 4.700
31‘?“ óptimo es,puos,7.4Conoel desarrollo del tejiflo hace variar el medio,an c
tra serie dc experiencias,miñc el ïh simultaneancnte con el crocitzi 02:1:o.
Su técnica consigue en cubrir el coágulo con buffer p ex
tracto H lospues dc "60 horas de inoubación,1os líquidos sc 31.an C’ï gigcias cstírilus,para :eñir su TH; nuevo líquido se
agrcgw v Su efectua una medida 12 horas después“. Trabaja concluctrofios ¿e vidrio.
rn con teH ¿el buffer H del medio H del ECCiO19 jiúo 72 hsin tejido con tejido,60 horas6.776.5 7.0 6.53
30'?» ¡8.1.Hay¿91"ficaoi6n progresiva ¿el :cüio
creciaionto Promediofudel midio con“Ph mediosin ïojido
o 4: 60 72 hórás
6.6 7.0 800 849 2.195 2.195 6.88
6.8 7.25 450 4.803 7.100 7.500 7.16
7.4 7.82 450 4.890 3.800 12.000 7.61
8.00 8.00 230 1.485 1.710 1.710 7.91
Alrh 6.6 el crecimiento cesó a las 60 }: as; a‘Pn 6.8 ¿cb
pués de 72 horas; axPH 7.4 mucho después Ce 72 horas; a‘PH ¿.Cnuevazentc es inhibido a las 60 horas.
"El creciïiento Cel fibroblnstos es inhitiïo,después de 60
horas,a variaciones de‘?h a aíbos lados ¿e 7.4 - 7.6,tnnto enel alcalino comoen el áciúo".
Entro las experioncias de Mihálik y las ¿e Saakaran hay un:
contardicoión: para cl primero al tejido modifica el vaio,yasua hacia lo ácido o aloalino,tcnliendo alóptimo; para Sankara1se acidifica siempre. Sc podrían explicar por GÏÍJÏGRGÉTJde tác
uodios de cultivos. Sankaran al sacar >i liquido que
¡69...
sdbrenada,no toma,ya,en cuenta,el 002 emitido por el tejidqque satura el ambiente de la capsula y en parte debe estar di
Suelto en el plasma,debido a su presión. Por otra parte,Lcwisy Felton hacen notar que en el plasma no difunden bien los iones.
KRONTOVSKIy RADZIMOVSKA(14), LEWIS y MICHAELIS (16), RAD
ZIMOVSKA(21), tienen grabajos sobre influencia de Ph y la nap
turaleza del buffer en la vida de los tejidos. Radzimovskaha
hecho notar y da su teoria al respecto,que los ácidos orgánicosson más tóxicos que los inorgánicos.
CARREL(4) y RUBINSTEIH(52),con metodos eléctricos, obser
varon la modificación del pu del medio,produoidapor la actividad sola del tejido, sin agregado de buffer o substancia alguna.
Con tejidos neoplasicos tienen trabajos ROFFOy DEGIORGI
(30 y 31) y CHAMBERSy LUDFORD (59)
ROFFOy DEGIORGI(30 y 31) Utilizando el método colorimé
trico, con cultivos de corazón de embrión de pollo y sarcoma
fusocelular de rata, en un medio compuesto de plasma y rojo cre
scl al l por 5.000 en partes iguales, comocontroles este mis
memedio sin tejidos; observando los cultivos,de tiempo en tie:
po,12 horas,24 horas,3tc.,n0tan que‘?n del medio ileïïialnÓOEQQF
cia mayor :cidez,a medida que se acentúa el crecimiento,mientraslos controles permanecenconstantes.
CHAMBERSy LUDFORDcon células de tumores de rata,(saroo
ma, carcinoma mamarioetc.)-mediante inyección intracelular de
colorantes,(rojo fenol y purpura de bromocresol) observ6;a%« 1)
ellfh del citoplasma queda entre 6.4 y 7.0 y el del núcleo arriba de 7.2;b) herida en el núcleo nc produce ácido dentro de el,
pero el citoplasma herido produce acidez,que hace bajar su'?H a5.8 o menos.
En todo esto no hay diferencia entre células normales o tumorales
Los cultivos de tejidos de animales adultos son mons resis
¿Ryu
tcntes que los embrionarios y no sorportan un cambio de mediotan bien.
En solución Locke,con 1%de dextrosa,los tejidos de embriones viven solo unos diaa pero los adultos no pueden desaprrollar.
La influencia de la concentración de H del medio sobre te
jidos adultos ha sido estudiada por Bálint y Weiss,usando bazode conejo.
Debajo deng 7.3 no hay migración celular. Más alcalino
que Ph 9.5 no hay formación de fibroblastos. El óptimo es8.1.
Comparándoloscon tejidos enbrionarios,se obServa,que resisten menosun desplazamiento hacia el lado ácido. FisCher en
contró crecimiento aIfiI 5.5. Bálint,con los adultos,no 10 encontró debajo de pH 7.3. Pero en lado alcalino es la inversa.
Límite de embrionariospE 9.2" " amfljos " 9.5
"Sumariandolos experimentos,se encuentra,que un despla
zamiento de la reacción del medio nor:al,en una dirección ácida,detiene la proliferación y diferenciación de las células de
cultivos de bazo,de animales adultos; desplazamiento en el lado
alcalino aumentaesa proliferación y diferenciación,hasta unpuntc,sobre el cual,ojerce una influencia retardante".
Del oonjunto-de-estas-e;periencias ¿á deduoe’que cuando
más joven es el embrión: sus tejidos se desarrollan mejor enmedios tanto más ácidos.
Y que cada tejido debe tener un pH óptimo particular paracada uno de ellos.
Un trabajo sobre potenciales
de oxi-reducción es debido a HAVARDy KENDAL(10). Hacen notars
primero,que hay un númerode datos contraditorios en los tra
bajos efectuados sobre anaerobiosis: sarcoma de pollo de Reus
crece, corazón de embrión de pello de 10 días no crece en anue
-71
robisosis. (Wind)
Células malignas le dividen a menor presión de oxígeno
que las embrionarias normales (Wright).
Y en oposición a esto: células malignas sobreviven menos
u bajas presiones que las normales (Fischer)
“Se nos ha ocurrido,dicen Havard y Zendal,la posibilidad,
que crecimiento y división de tejidosyen esos experimentos,pu—dieran estar gobernados más directamente por el potencial oxi
reductor del medio_de cultivo,que por le concentración de 02en 1a faz gaseosa";
Se proponencorrelacionar crecimiento y di'isión,de corazón de embrión de pollo,con el Eh del :cdic. Posteriormente,pien—san hacer lo mismocon células de tumores.
Sus resultados fueron: crecimiento y división,se estudiócuando el Eh era mantenido a diferentes niveles. Cuando¿ás ba
jo el Eh más pobre el crecimiento del cultivo;
le :itosis cesa entre Eh+ 20 mv y - 30 mv; la migración cesaen Eh — 30 mv.
El líquido amniotico,con reapecto al embrión,es en un princ'pio Hipertónico,luego isotónioo y por último hipotónico. "El embrión parece ser independiente del ambi
ente". Las celulas embrionarias de pollo,"in vitro? soportan,por un tiempo5medioshiper e hipotónicos. Para largo crecimien
to les es necesqrio medio isotónico. La presión osnótica afecta
solamente la migración celular; para Hoguey Willuer;pero no lamultiplicación,según Lambert y Ebeling.
La dilución del plasma con agua destilada da un crecimien
Tc acelerado (Ebeling, Ruth etc.). Los medios ligeramente hipo
tónicos son favorables,como el ClNa al 0.5%¡;en un hipertónico,ejemplo ClNa al 1.8% no hay actividad celular (Hogue). Estos
hechos han sido confirmados para los uonocitos y leucocitos" y
de ello resulta que,desde el punto de vista de su presión osmotica el tlasma san uineo no es el me'or medio de cultivo"., _ 8 J
._72_
BRUESy MASTER(3) utilizaron, corazón de pollo y rata
e:brionaria,sarcoma de hauoha 180 y tumor de Walker 256.
En medios de distintas presiones osmóticas,no hay diferencia entre fibroblastos normales y malignos,en cuanto a e?lasticidad o tensión superficial."La ocasional fragilidad de
los macrófagos esféricos,en xeúios hipotónicos,no han sidoobservadas en ningún fibroblasto."
El crecimiento y nigraoión,de1 sarcoma 180,es más afectado que los tejidos ezbrionarios de pollo por cambio de to-icidafl del medio,en ambasdirecciones.
Segúnciertos investigadores’una disminución de la tensión superficial,en o alrededor de las células Vivientes,puede acelerar su crecimiento.
MANGERy HOCHE(17) utilizaron jabones para producir esa
disuinución de la tensión y a‘?H diferentes,por la influenciade esto último sobre el crecimiento y sobre la constitución de
las soluciones de jabon.
Emplearon,co:o tejido,corazoncs de embriones de pollo de7 a 8 días.
Comomedio, plasma homólogo (sin extracto, para evitar su
accion aceleradora de crecimiento) + buffer, o plasma homólogo-+buffer-+oleato de Na.
Algunos Ce sus resultados:
Th=5 . 7
ldía 2 dias 5 días
cultivo sin jabon 5,25 3,25 3.8
con " 5.2 4,25 433
.25.
siendo 2icrecimiento regular; 4,bueno; 6,sobresaliente."La influencia de Ph en de sumaimportancia para el cre
cimiento. Se observa sobre todo en los cultivos tratados sinjabon".
Se acelera esa proliferación al agregársele. (En diver
soi ngiEngglgÁ94 el oleato es inhibidor.‘ __.__.a____;'v ' ROFFO(22) ha referido resultados "que tes
timonian la importábia que tiene la colesterina cn el terre
no canceroso". Hansido elementos suficientes, diceï(para quedesde los primeros trabajos diera a ese factor la mayor impor
tancia, tanto en la génesis de los tumores comoen la preparación del terreno canceroso)1as observaciones de orden cli
nico y etnico relacionado con la constancia del siguiente fenómeno:hipercolesterinea muyacentuada en los tejidos neoplap
cicos en relación con los normales e hipercolesterinemia que
lo acompaña, que ya Se manifiesta en forma neta en estados precancerosos.
"Las investigaciones modernas sobre el proceso celular dan
1a mayor importábia,en su desarzllo,al metabolismo de lOs li
poides". Entre estos, la que parece desempeñarun papel pri
mordial en el intercambio celulan regulando la permeabilidad
de las membranasy aún el crecimiento de los tejidos,es la colesterina.
Utilizando comotejido neoplasico,e1 sarcoma fusocelular
de rata y comonormales,corazónï y pulmón de embrión de pollq
sc ha dosadgfgarte del plasma y luego en otra cantidad en quese cultivó durante un tiempo el tejido en estudio la coleste
rina,por el método de Gringaut.
La cclesterina disminuye en el medio cultivado,aparecicndo la máxima disminución con el sarcoma y la menor disminución
con cl.corazón.
"Esta experiencias son un exponente de la estrecha relaciónentre el crecimiento celular y la adsorción de la colesterina".
Nose puede precisar,aún,si “se trata de una función relacionada
-74,.
con la nutrición protoplasmática o de una función puramente
de la membranacelular". Pero se sabe bien,que de la semiperp.méabilidad de la membranadepende el metabolisma de la célu
la. Y a la colesterina se le atribuye importancia grande en
sus relaciones con la permeabilidad celular."Estas consideracines dan particular interés a la fun
ción de la membranaen su relación con el contenido de coles
torina, especialmente en su función de permeabilidad y se com
prende facilmente que una,variación en la concentración colesterínica puede traer involucrada una modificación en el quimismocelular.
Los resultados,que muestran una relación entre crecimien
to y colesterina,se interpretancomo un fenómenode nutriciónen dependencia con una aflsorción de la membranacelular.
De,ahí,que a mayor crecimiento de celulas mayor adsorciónde colesterinn del-medio en que estas se desarrollan".
GR¿fi¿5
Szantroch "llamó laatención sobre la necesidad de
un estudio,detenido,de la cuestión,de la distribución morfológica de las materias grasosas en los cultivos tisulares enrelación con la edad y tambien con las propiedades morfoló
gicas y funcionales( por ej. células musculares epiteliales,hepáticas etc.) de los elementos cultivados".
Comprobóque en tejidos diferentes,pero de embriones de
una mismaedad, 5 a 7 días, "la grasa,contenida en las célu
las nuevas recien crecidas,presenta un tenor específico parael tipo de células correspondiente, un tenor ya dado y determinadopara el tipo celular de tejido".
Rix,en difierente clase de células,ha observado,parcia1mente,diferencia de distribución ej. los endotelios hepáticosy las células epiteliales se comportandiferentemente.
Levi,basándose en la observación de Szantroch,(con relación al tipo de células existe especificidad en el tenor y
¿1'53
distribución de grasas) dice,que "ese hechofacilita la iden
tificación de las diversas células en la zona de movimiento".Skowrony Keller:"existe una notable y constante especi
ficidad en cierto tipo celular,en cuanto al tamañoy distribución de grasas."
Pero Zweibaunestá en contradicción,sosteniendo que la
cantidad y tamaño de las gotas dependen de muchas causas,como
ser,el estado del tejido y el estado físico-químico del citoplasma sujeto a la influencia de las condiciones externas.
SZANTROCHy ZAKRZEWSKI(34) trataron de comprobar si las
células sarcomatosas,con respecto a la distribución y tenorde las grasas morfolmgicamentevisiblegtienen síntomas característioos.
Utilizaron tronco de sarcoma de rata de Jersen,cultivadopuro durante tres años y comprobadasu malignidad por repeti
das implantaciones en animales.
Las disparidad de las primeras observaciones (en unas, pre
sencia y en otras,ausencia de grasa en las células."in vitro")los llevó a comprobar,que la aparición precoz de gotas de grasa en las células sarcomatosas se observa en los cultivos‘cuan
do el plasma empleado comomedio pertenece a un animal viejo o
es recientemente extraído; cuando se le guarda más de 6 lías;
si pertenece a animales cuya sangre (por razones desconocidas)
no sirve para cultivos; cuando se cometenerrores técnicos(aplastamiento de explantados eto.) al cultivarlos o se mantienenesos cultivos a más de 38°.
La absoluta ausencia de granulos grasos morfologicamente
visibles es característico para las células del sarcomade Jersen. Cultivadas en ideales condiciones no la contienen. Su in
dice de grasa (débil, fuerte) es un buen indice para juzgar lacomposición justa del medio y el estado de las células sarcomatosas.
Sontrariamente,los tejidos normales embrionarios son menos
resistentes, se llenan de grasa muchoantes. En cultivos cardía
¿fi&=l.
cos de 6 días su adiposis es total: las células están comple
tamente 1lenas de gotas de grasa, no están delineados clara
mente los contornos celulares y sus nucleos.Los cultivos de sarcoma de la misma edad no la contienen.
Teniendo en cuenta que 19 "las células normales presentan
siempre un contenido específico, aunque de cantidad variada’degrasa visible"; 29 los sarcomas cultivadas en medios adecuadosno contienen y 39 que estas mismas,en ciertas condiciones,(com
posición no adecuada del medio) si, la presentan, se llega a 1aconclusión que el engrasamiento de células no es consecuencia
de lesiones de naturaleza general; sino,mas bien,está relacionado con una falta o un exceso de ciertas substancias de impor
tancia capital para el metabolismode grasas.
Parece depender, el experimento con cultivos sarcomatosos,de que estas substancias influyen sobre las células desde el medio.
Por otra parte, las células normales de tejidos diferentesy las del mismotipo de tejido,pero de diferente edad y función,tienen grandes desemejanzasglo que hace pensar que las células
poseen,además de estas substancias supuestas, que comofactores'
exógenos influyen en el metabolismo de grasas, tambien fac
tores endógenos,queen 1a distribución caracteristica de grasastienen rol primordial.
-77.D I F E R E N O IÁA 0 I 0 N 0 E L U L A B
Diferenciaeión. La mayor parte de los conocimientos quese tienen sobre organizadores son originados en experienciascon transplantes. Se sabe que el organizador a) no actua sola.
mente sobre su mismaespecie. Injertos de el pueden provenir
hasta de géneros; familias o sub clases diferentes. b) Su in;
fluencia no es peculiar del labio del blastdpore; otros teji;dos pueden ser injertados en el y usarse comoorganizadores
después de ser “infectadot. e) Requiere tiempo para extender
su influencia. Gerc¿d%l,el eetoderma puede estar determinadopara transformarse en cuerda dorsal y mas lejos permanecer indiferenciado aún. d) Su influencia exige continuidad. Etc.
Los cultivos “in vitro“ han aclarado algunos puntos so
bre diferenciación.(ya se citaron varias obserVaeioneezpag.
12).Ademas¡por este mótodb se ha puesto en evidencia el si
guiente hecho,qu: parece indicar que la diferenciación es independiente de toda influencia nerviosa y vascular: el bos
queJo que produce el revestimiento epitelial del laberinto,(estudiado por Fell en su desenvolvimiento) de embrión de 3
dias;produce,despuós de lo ó 12 dias de cultivo,todos losconstituyentes de origen opitelial del laberinto auditivototalmente diferenciado. Presentan caracteres histológicos
normales, el organo de Corti,las areas sonoras ete. asi desarrollados.
De su naturaleza Ííeieo-químiea se conoce muy poco. En
trozos nmaceradba la región del organizador encontró Spef
mannel poder induetor " No significa este que la lateralidad del organizador es estereoquimica mas que\citológiea?"
Needham.La sequedad no anula su propiedad,pero si,el frio."La Naturaleza del organizador permaneceinoierta,poro
si esgeomeaparece muyprobable,algo de la especie de una
hormona,un extremadamente significativo puente va ha serpuesto entre los procesos Íísiccaquímicos m sus manifesta
o 7B .
ciones morfológicas. Aqui,ol hallazgo de Mark,que las regiones del organizador narcotizadas inducen perfectamente bien,es de muchasignificación. Hace añcs hubiera sido dificil,
sino imposiblo,concebir una vitamina cristalizada;pero deobtensiín.del ergostenol irradiado hamdeeyirtuadc—talCreencia,
aunqueqelflcambioocurrido por irradiación sea aún Obscur0¡pero
sq es aventunade suponer que,en unffumuro más o menos remate,
se logra obtener el organizafiorhenim amada cristalino... ' n
.. Los bioquímicos sienten que Las rolaciones,entre losprocesos fisico-quimicos y diferenciación y creeimiento.sontan cercanos comopara indicar que las conex;iones causales
entre ellos va ha ser revelado en el futuro ". Needhmm.Crecimiento; diferenciación z respiración. Puede exis
tir crecimiento sin diferenciación. manteniendohuevos fér
tiles a la temperatura ambiente,antes de incubarlos,hay sc1amente crecimiento. Incubandolos entraflorxy 272 hay división celular pero no organización.
Tambiénse puede ver crecimiento sin diferenciación en
células embrionarias explantadas.
La respiración puede ser separada del crecimiento,segunexperiencias de warburg y calculos de Brody. Una cierta do
sis de rayos X,sin cambiar 1a respiración ni la fermentación,
puede parar el desarrollo de un embrión de pollo (Hubert).
Dosis mayores,dejando la fermentación inalteradageliminancrecimiento y respiración.
Diferenciaeión z guimiea. 0diettc estudió la influenciade los anincgácidos en la formación de fibras elásticas "in
vitrog utilizando glutatión y diez diferentes amino-acidosen varios tejidos embrionarics de pollo. Eneontró gue sepueden dividir en tres grupos. E1 primero estimula la forma
ción de fibras elasticas y el crecimiento de los cultivos;el segundo no influye en ninguno. El tercero decrece el cre
cimiento y 1a formación de estas fibras.En el primero esta la glicocola.
-159 H
Son.estas observaciones de 0diette,1aa primeras que muestran que pueden comportarse diferentemonte varios amino-áci
doo y en la diferenciación de tejidos "in vitro" pueden serdecisivos.
Con excepción del ácido glutámiec,todos los ¿mino-ácidos faborablea al crecimiento reducen ciertos compuestosdelHg. Estos hechos indican la significación posible que los
aqino-ácidoc;influyendo ol potencial cai-reductor del medio,pueden tener para el crecimiento y la diferenciación.
Las vitaminaa,según algunos investigadores,pueden estimular ciertos tejidos con preferencia a otros.(Bisceélie),
'Yaeanotaron.tambión; ciertas opiniones de Juhaaz-Scha
-80
CÁPITUID V,
PARTE EÏPE‘RIMENTAL
MODIFICACIONESde la
RESERVA ALCALINL
del medio dc cultivo, provocadas por elC R E C I M I E N T 0
de
T'E J I D 0 S BIO R M A.I.E S Y NZE0 P I.A.S I C 0 S
“ I N V I T R 0"‘
El objeto de la osperimentación ha sido,observar lasmodificaciones que, en la reserva alcalina, produce el cre
cimiento celular "in vitro", (método de Harrison - BurrowsCarrel,modificada por Roffo.) dejando actuar libremente el
cultivo, sin intervención alguna sobre su metabolismo y desarrollo celular o agregado de substancias modificadora deestas.
Se ha utilizado los siguientes órganos: corazón, hígado y bazo de embrión de pollo y sarcoma fusocelular de rata.
El medio de cultivo: plasma de pollo diluido y extractoembrionario.
T E C N L C A
La técnica ha sido de tallada por Roffo A.H quien dice;;
"se esteriliza una caja en el autoclawe con todo el material
de vidrio que se emplea en las manipulaciones.
Está cubierto por una tapa de vidrio". "En las paredes
hay dos aberturas con mangas donde el operador introduce sus
manos,con guantes esterilizados, de manera,que una vez .cerra
das,se trabaja en una caja completamenteesteril"."Como reci
piente para los cultivos,he empleado siempre ventajosamente
saleros cuadradosde cristal". San estos unos recipientes de
paredes gruesa,con excavación esferica de unos 3 centímetrosde diametro. Se colocan sobre la tapa pequeños trozos de teji
do. eye se cubren con la mezcla de plasma y extracto, que se
introduce con una pipeta a través de un orificio". "Se espera
la coagulación y enseguida se da vuelta la tapa colocándola so
bre el salero en el cual se ha puesto una gota del líquido deRinger para mantener la humedad.Cuandolos saleros están lis
tos,se les retira al exterior a través de una puerta lateraly se cierra con parafina " ROFFO. LA CULTURIDE TISSUS NEOPLA
SIQUES IN VITRO.NEOPLASMES-SEPTEMBRE-OCTUBBE et.NOVEMBRE—DE—
CEMBRE, 1935.
Comoes necesario,por razones después explicadas, agregar a cada tapa de salero contidades exactamente medidas de
plasma, lo que es dificultoso hacerlo desde el exterior en laforma antedicha, se encontró más conveniente introducir en la
caja: la cantidad necesaria,manteniéndolo líquido por mediode hielo, es decir colocando el frasco con plasma dentro deun termo pequeño con hielo y cuya envoltura metálica exteriorha sido esterilizada.
Se introduce todo lo necesario: el extracto, el Ringer y
los embriones,saoados del huevo por medio de pinzas esteriles,con la mayor asepsia o los tumores extirpados con la mismaprecaución.
El extracto se obtiene macerando el embrión, agregando Bin
ger y utilizando 1a parte liquida después de oentrifugada.
El plasma de pollo, homólogopara los tejidos.normales y
heterólogo para el sarcoma, presenta diversas ventajas, entre
ellas, su resistencia a la fibrinolisis de los tumorescancerosos y que ha hecho tan dificil su cultivo. Se emplea diluído,
con Ringer (los plasmas puros son inadecuados) y proveniente de
sangre de animal joven, pués a medida que aumenta la edad es mas
desfavorable el crecimiento celular. No se ha agregado ningún
anticoagulante o substancia cualquiera, (para evitar accionessobre el cultivo o el plasma), y utilizándolo conforme se ha
-32
comprobado su esterilidad, o a lo sumomuypocos dias después,
(es decir entre 2 y 4 dias después de la extracción del animal)5lo mismoel extracto anbrionario,que se empleó recientemente /
preparado al efectuarse el sembrado de los trozosyó con 24 horas más o menos. Tanto este como el plasma están asi en mejores
condiciones2 que con larga conservación.
La sangre extraída esterilmente, diluida al medio, o un po
oo más diluida con solución de Ringerq (CO3HNa0.3. grs., 011139.
grs., 01K0.42 grs y 01203 0.24 grs. por litro) se oentrifuga.El plasma así obtenido {se mezclan bienCsi pertenece a varios
animales,ya que 1a reserva alcalina tiene que diferir algo entre
los Éïggg% pollos¿ _Igualmente se mezcla aunque provenga de un
mismoanimal,porque las diferencias de las diluciones con que
uno puede haberlo extraido, si no lo hace de una sola vez, puede introducir tambien variaciones) y se utiliza.g;_gigmg_plagmg
1 gg mismgextracto para todas las series de testigo y tejidosque se van a comparar. (Se utiliza el mismoextracto porque la
concentración de este_ influye sobre el crecimiento).A cada tapa se le agrega una misma cantidad de extracto
medido con jeringa graduada al vigésimo y luego plasmaotambien
medido en igual forma. Y los mismos para el Ringer del interior
de los saleros. Los que serán testigos sin tejido, los otroscon un mismo número de trozos.
Las proporciones generalmente utilizadas han sido 0.300
plasma, 0.15co de extracto y 0.15co de Ringcrgpor salero y 6trozos de tejido.
Las razones que se han tenido para tomar estas medidas
efiprciales se explicará más adelante. (ver; Variaciones de losvalores,-de la reserva alcalina por modificación de las pro
porciones de los componentesdel cultivo a,b,o,d,akbficfi)Preparando de esta manera una serie de saleros testigos
\j tantas otras series de igual número comotejidos se vayan
-83
a comparanjpuestos en estufa 370,56 saca día a dia el número necesario separando los que presente infección o mal cre
Cimiento y efectuada la observación micr6s00pioa,se quitan conpinza los trozos de tejido y se reune el contenido total devarios saleros (coágulo y liquido interior) Hasta obtener una
cantidad algo superior(0.500 aproximadamente de mas) a lo quese va a introducir en el VanSlyke,batiendose hasta licuarlo
y que pueda pasar por los orificios de las pipetas graduadas.Se trasvasa a ampolla de decantación,saturandose cdh aire contenido 5.5% de CO2.
La saturación con mezcla de aire 002,por desplazamiento
del aire de la ampolla mediante aire alveolar del operador,dió
poco resultado por las diferencias de tensión.j Aunquela saturación con aire alveolar no da grandes e
rrores,"1a composición no es naturalmente tan constante 00m0la obtenida cuando se usa una mezcla analizada de gas..."
(van Slyke y G.E.Cullen The Journal of Biolégal Chemistry vol30-1917) Se saturo por medio de la mezcla obtenida en un apa
rato mezcladondespués descripto. Para saturar el plasma se ha
agitado la ampolla 10 minutos, mayor tiempo que el indicado porel método Van Slyke.
Por último,lavado el aparato, quitado el aire de este yde la mezcla agua alcohol octiliccose introdujo 2cc de plas
ma, 0.500 de agua. alcohol y 05cc de SO4H2al 579cantidad. esta
última,que se ha comprobadosuficiente para descomponer todos
los carbonatOSgpuesto que el plasma toma reacción ácida al
tornasol. \\ \Es necesario medir el CO2liberado-variasxyeces,previap
mente bien agitado,porque por razones desconocidas no se 11--M
bera el máximorápidamente. Ejemplo; primer medida 0.49 se
gunda medida 0.49¡teroera medida 047,0uarta medida 0.52,quin—
ta medida 0.51 y esto a pesar de haber sido cada una de ellasobtenida después de numerosa agitaciones y de igual número de
veces. En otros Casos ha habido mayor uniformidad.EJempo; CC2
las
.áá.igual a 0.46 0.46 0.46. Se ha tomado comoregla efectuar nume
rosa lecturas hasta que permanece constante o por los menoefiheta
últimas lecturas scan de menorvalor que las anteriores, como
el primer ejemplo, con lo que se asegura uno que ya se ha ob
tenida el máximode desprendimiento y que no hay entrada de ai
re. La lectura es naturalmente el númeromáximo,corregida a 0oy 760?mperono se consideró necesario la corrección de-solubilidad.
Se ha encontrado nuohoe inconvenientes al utilizar recipi
entes grandes,conteniendo todo el material necesario para efectuar un dosaje. una infección de uno de ellos inutiliza toda
una experiencia y hace perder gran cantidad de tejido y plas
ma. Para ponerse a resguardo de estas inyecciones parciales ypoder llevar la experiencia durante los dias necesarios, habria que preparar varios recipientes nás,de reserva,oon el con
siguiente gasto de trabajo y material. Además,llevando cada
uno muchos trozos, que desde luego no presentarán el mismo
orecimiento,no es posible selecionarlos, conolos ealeroquuesiendo muynumerosos y conteniendo cada uno poco tejido se pue
den apartar los inadecuados.Además,distribuyendo en estos_pe
queños saleros, cano se ha explicado, tomand: un número para
cada medida, la pérdida de algunos por infección u otra causa,no afecta mayormentetoda esa medioión.No es necesario,tampoco,
una gran cantidad de saleros; bastan 6 mas o menos para cada
determinación; es decir.(con algunos maspara reserva) se llega comodamenteal tercer dia con unos 25 de testigo y otros tan
tos para cada tejido.
Los recipientes, mas comodospara efectuar las medidas que
con los saleros, pero no mas exactos, estan formados por dos viw
drios de reloj de lO cts. de diámetro, uno de los cuales llevael Ringer el otro,adosado,para formar un recipiente cerrado yentre medio un vidrio plano circular de menor diametro, que llem
vara el coagulo en su parte inferior, es decir frente ai Linger»
.35;Las proporciones han sido las mismas que para los sulercs;
200 de plasma,lcc de extracto,lcc de Ringer para cada recipienvte, es decir,2alql y en los cultivados además40 trozos (experiencias 7 y siguientes).
Las anotaciones de los crecimientos se han hecho comosi
gue y que es la forma acostumbrada. Comoes una medición relap
tiva, con el solo fin de ver si hay aumentode un dia a otro,
se ha considerado dividido el campodel microscopio en 4 par
tes (siempre con el mismoaumentopara todas las experiencias).Al total del campocubierto por las nuetas células corresponde
++++ ; mitad del campo++ ; cuando las células recien aparecen,crecimiento incipiente etc.
Cuandoes crecimiento en superficie se puso crecimiento fi
no; cuando hay diversas capas de células, crecimiento espeso.Ademásse anotó cualquier fenómeno comolicuación del plas
ma,etc.VARIACIONES DE LOS VALORES DE LA RESERVA ALCALINAFoñ'm'o'ñIFïc-¿ETQNppp; " _"_" "'" ' COMPONENTE D
’l z i de e t v r a " e
Siendo en resúmen toda la experiencia una comparación, losdetalles han tendido a ese fin por los siguientes medios; la pcner en la mas absoluta igualdad de condiciones testigo y cultivos?entre si y con los que se le comparana diversas horas?etc;
2g dependiendo los valores de la reserva alcalina de muchosfacu
tores, fijar todos estos y dejar solamente depender esas varia»
ciones numéricas del crecimiento celular, que esÏprcpósito deltrabajo. Estas dos condiciones se han alcanzado poniendo/T%ualcantidad en cada salerc o recipiente a compararseáel plasma,
Finger, extracto y númerode trozos. Las razones son las siguiente;
a) Se puede reunir el contenido de cualquier número de sa
leros sin que varian las proporciones de sus componen»
tes,pudi¿ndose desechargasialos que presentan infección
-86—
b) Se ha observado que,ha medida que se efectúa el creci
miento del tejido el coagulo pierde líquidc,e1 cual seagrega al que existe en el interior (Experiencia l BA,
ZO, a las 28 horas, 1.400; 52 horas 1.100; 75 horas 0.5
cc) Estas diferencias no siempre son tan marcadas depen
diendo de la clase de tejido y del estado del cultivo.
Lo que no sucede con el testigo, por lo menos apreciablemente
(experiencia 2 testigo,a las 22 horas 1.600; 46 horas 1.400; 72horas 1.7cc) y si en algunos casos son estas diferencias algo
mas marcadas(experiencia l testigo,a las 28 horas 1.800; 52 horas 1.3cc; 75 horas 1.5cc) nunca lo es tanto comolos cultivos
ni tampoco son progresivas con el tiempo y dependen de errorestécnicos solamente.
A los cultivos se le suma, a estas variaciones poco gran
des, unas mayores que tienden a disminuir cada dia mas la can
tidad del coagulo.
La composición del coagulo testigo y del sembrado ya no sm:
similares. Conteniendo el testigo un plasma mas diluido ya no es
posible efectuar una comparación; por esc se hace necesario 19
mar en conjunto cgggulg y liguidg del interigr y en consecuencia
se hace necesario medir el Finger que humedaceel ambiente delsalero.
c) Variando los valores du la IGSGTVHalcalina según la dilución
del plasma, es necesario agregarscle el extracto en una proporción constante en todas las series a compararse. En esta forma
la proporción plasma diluido, extracto y Ringer de cada salerces absolutamente igual.
La relación plasma extracto igual a 2:1 se ha tomado sola
mente por comodidad. Pudiendc extraerse el plasma o prepararse
el extracto mas o menosdiluido, dentro de cirtos limites, esobvio que esta proporción puede modificarse. ¿l'pcner en abso
luta igualdad de condiciones cada uno de los saleros cualquie
ra que sea el número del contenido de ellos que se reunan para
efectuar una determinación, permanecen siempre esos componentes
en la mismaproporción. En esta ceso particular plasma, extracto,
-33Ringer,igual 2:1:1, en casi todas las experiencias.
d) Suponiendo que la diferente cantidad de trozos y su di
ferente tamañopuedan influir en los valores de la reser
va alcalina,se dispuso en cada salero un mismonúmero yde igual tamaño practicamente.
Otras modificaciones nan tenido diferente objeto.
A voluntad del experimentador, la curva de las variaciones de la
RApueden tener sus valores mas o menos distantes,en magnitudes
numericas,de los de 1a curva del testigo y a modificaciones delcrecimiento se podran observar modificaciones correlativas,tam
bien mas o menos grandes,de esa RA.
Pero si se guarda la condición de que sea el crecimiento
celular el único que la modifica,resultarán curvas que se puedenobtener con diferente aumento,pero absolutamente semejantes. La
forma y no las magnitudes es lo que interesa. (La experiencia 6,
corazón, ha dado los siguientes valores con respecto al testigo;
27 horas 0.04,51 horas 0.04, 76 horas 0.00 Modificando 1a concentración del Ringer pudieran haberse obtenido valores dobles
o triples Ej; bajadas de 0.08,0.08 y 0.00 respectivamente. En
este segundo caso la curva sería mas clara, con valores numeri
cos mayores,pero seria semejante a la otra, puesto que han depen
dido de un mismofactor, el crecimiento.
Es indudable gue hay interés en obtener curvas ggn valoresrand ara ue e tos no ucdan c nfundir e v r acio
bidas a errores.ConGirarobjetose Wisin-3m:
a)Considerando que las modificaciones de la RAdel cultivo
con respecto a 1a del testigo deben ser proporcionales e
la cantidad de tejido que actúa, se puso el máximode tro
zos que pudieran ponerse, sin que sus crecimientos se es
torben, 14 por superficie formada por lco de coagulo; es
decir, 6 trozos por salero o bien 40 en los recipientesgrandes.
-88
Para tener esa certidumbre debian haberse hecho experien
cias,en que,en igualdad de todas las condiciones, especialmen
tel; crecimiento.solo variara la cantidad delxposos, observando entonces las modificaciones de la R4.No se ha hecho esto, penro es presumible la suposición anterior.
Pero debe hacerse notar,que se ha observado que los trozos
que no crecen tampoco actúan sobre 1a RA,solamente lo hacen por
intermedio de su crecimiento. Por lo tanto lo anteriormente di
oho debe modificarse diciendo,que se ha supuesto que la modifi
cación es proporcional al número de trozos, pero teniendo orecimiento.
b) Introduciendo mayor cantidad de plasma en el Van Slyke,
200, que en realidad,por las diluciones explicadas,contiene a—proximadamente 0.5cc de plasma puro. Efectivamente en esta for
ma han dado valores, en el testigo, alrededor de 0.46 y en elcultivo 0.34. Con lcc de plasma los valores hubieran sido 0.28
y 0.17 respectivamente.
No se consideró nCCesario introducir una mayor cantidad,loque lo permitía la graduación del aparato¡porque las diferen«cias eran ya bien visibles.
c) Por último cuando mayor sea la cantidad de Ringer delinterior del salero menorSerán las diferencias entre el tes
tigo y cultivo.
Efectivamente en dos experiencias de oorazón,del mismo
tiempo de cultivo, igual crecimiento y cantidad de tejido, pero uno de ellos-con 0.5cc de plasma 0.15xhe extracto y 0.15ode
Ringer y el otro con las mismas cantidades menos el Ringer que
estaba en la proporción de 0.253y sus correspondientes testigos,
respectivamente con esas dos formas de preporciones, las dife
rencias entrc testigo y cultivo fueron 0.100 al primer día y
0.1cc a los dos días en el primer caso, y en el segundo paraI
los mismos tiempos 0.04 y 0.04 (Experiencias N9 2 y 6). Lo que
es fácil preverlo; en la primer experiencia,para obtener los200 necesariosgse utilizaron ó saleros,habiendo actuado,por lo
49tanto,30 trozos. En el otro bastaron 4,con un total de 24 trozos.
Usando porta y cubrebobjetos comorecipientes,en vez de sa.
leros,la pequeños de la excavación, no permite que seque en elambiente y hace innecesario el Ringer. Pero estos no presenta
mayorventaja sobre los saleros.¿zaragg
El aparato mezclador se ha armado de esta forma. Consta
de 3 recipientes (¿,B,C,) con boca en la parte inferior. Dos
de capacidad para varios litros (¿,0) y uno de ellos marcado
cada lOOcc (C);el terceroade menores dimensiones (B),con dosbocas en la parte superior o un tapon perforado en dos partes.
Por uno de ellos se le adapta una ampolla de decantaoión ci
lindriea (D),que tambien se gradúa, por el otro un tubo accdado (a) al que se le agrega una llave (b). Tubos gruesos en
igual forma, es decir acodados, llevan las bocas inferioresde los tres recipientes.
Los recipientes (AyB), unidos por medios de cilindros de
goma, pueden poner en comunicación sus contenidos o interrum
pirselos poniendo en posición horizontal (posición c'y d) o
vertical (posición o; y dÜlos tubos caodados.Se llena con agua la ampolla (D) y es indispensable que
la parte tubular (p) contenga una columna de agua, lo que se
hace por succión; no hay salida de liquido mientras permanezca cerrada la tapa superior (e). Adaptada la ampolla (D) al
recipiente (B), interrumpiendo las comunicaciones que entren a
(A y B), se agrega un poco de agua a (A) y se llena completa
mente (B). El resto del aire,que permanece en el tubo acodado,
(a) es expulsado abriendo (e),lo que deja caer agua de (D).
Cerrado (e y b) se tiene el recipiente completamentelleno,sin entrada posible de aire.
En comunicación la llave (b) con un recipiente de carboni
cc y tambien de comunicación (a y B),el 002 entra por su pre
sión y por arrastrc,ya que cl nivel de (B) es superior al (A).
5-0!
-90
Conviene que los tapones de (B) ajusteimuy fuertemente,para evitar entrada de aire cuando pasa el 002 con poca fuerza y por
arrastre,o inversamente,que salten cuandoentra a presión.Cuando el nivel de (B) es inferior a1 de (A) se termina
la operación,cerrando (b) e interrumpiendo las comunicaciones
entre (A y B). En esta forma el recipiente contiene 002 absolutamente exento de aire.
Para llevar el gas a presión atmosferica, nuevamenteen
conexión los dos recipientes,(B en nivel inferior a a para evitar entrada de aire) se deja escapa 002 por (b )hasta que
se igualan los niveles.
Quitada la llave (b),se adapta al tubo (a) uno de gomacon un tubo acodado a su extremo (g) y se imterrumpen las co
municaciones (A y B).
Abriendo la tapa (e),la caida de agua desplaza el CO2queexpulsa a su vez el aire de este tubo y vidrio acodadc (g), lo
que es fácil vor,cuando así se ha efectuado, haciendo burbujear en agua de barita o hidroxido de Ca y especialmente obser
vando si hay buena salida de 002. Los diametros de los tubos
(a y g) deben ser mayores que el que forma el agua al caer por
(p),para que pueda ser desplazado comodamenteel mismo volumen
de gas que el volumcn33guaentrante. Si no se observa esta precaución, puede fluir melestaddoasu salida y por lo tanto a diversas presiones.
El tercer recipiente (C) con un tapan con dos perforaciones_
uno,con tubo (K),para entrada ¿e aire, el otro comunicandocon
(B) introduciendojfg). ¿l tubo inferior se lo adapta otro recto (j) y se le mantiene cerrado por medio de una pinza (t) que
ajusta la gomaque los une y se llena completamente de agua el
recipiente.Para efectuar la mezcla carbonica aire se saca (t) dejan
do caer el agua y se abre simultaneamente (e). Por (k) entra
aire y la entrada de agua desde (D) empuja el 002 a traves de
.‘
-9fn(g) (Las comunicaciones A Y B interrumpidas, naturalmente).
Previamente por diversos ensayos y una vez para siempre,
conectado (B y C) cano se acaba de explicar, se graduada la
abertura de la llave (n) de la ampolla (D) con respecto a la
abertura (j), de manera que para cada litro que por (j) sale,
la llave (n) permite pasar 5500 de agua.pantidad que se leenen las graduaciones que llevan (D y C).
Una precaución que hay que tomar y que sin ella puede fal
searse toda la mezcla, es procurar que quede una columna de a
gua en el tubo inferior a la llave (n) y sin burbujas de aire
en esta llave seniabierta; lo que se consigue dejando escurrirlíquido al abrir y cerrar alternativamente (e) e inclinando elrecipiente (B) para que estas burbujas pasen a la parte supe
rior de (D). Si permanecen en la llave o no se forma columna
la salida del agua y por lo tanto la de carbonico es discontinua o insuficiente.
Conviene eliminar llaves entre (a y g); lo mismose utilizaron t bos en vez de llaves para la parte inferior de (C).
Se han hecho todas las uniones por medio de tubos de goma y
vidrio. En esta forma La entrada del 002 a (C) y salida de a»
gua de este mismorecipiente se efectúa por abertura fijas, lolo que no se consigue siempre con estas llaves de construccióndefectuosa.
Para saturar la anpolla con plasma, se pinza entre (a y g),se desconecta (B) y se conectan los recipientes (A y C) por la
parte inferior,siendo naturalmente superior el nivel de (A).Dejando pasar un poco de la mezcla aire oarbonico para elimi
nar el aire de (k),se adapta a (k) la ampolla y se hace pasar
un volumen un poco mayor que el que abarca la ampolla.
El pasaje de carbonico es provocado por los desniveles de
(A y C).
Para tener la seguridad que pasa la mezcla por la ampolla,
si así sucede, tapándola a esta, se oeserva que el agua que en
(C) deja de subir,a pesar del ezpuje que le comunica el desni
—9L
vel. Si continuara la subida sería indicio de una perdida porpor otro lugar.
No se ha preparado una gran cantidad de mezcla, sino una
cantidad suficiente para la experiencia de un solo dia, porqueestas mezclas guardadas por algún tiempo no quedan perfectamen
te homogeneas. Van Slyke,dice "el análisis tiene que ser repetido cada pocos dias, porque el contenido de 002 del gas algu
nas veces cambia inexplicablemente" VaN SLYKE¿ND CULLEN.THE
JOURNALOF BIOLOGICALCHEMISTRY. VOL. 30-1917". Pero Se ha to
madola precaución de que el testigo y los cultivos, que Se le
comparaban fuesen saturados de una sola vez. Es decir,que seprepara el recipiente (C) con la suficiente cantidad de mezcla
para las ampollas que se van a utilizar ese día, la que es per
fectamente homogenea, lo que pudo comprobar saturando dos par
tes de un mismo plasma con dos porciones de la minha.momclo
(experiencia 4,75 horas).Y no se saturan algunas y luego de efectuar otra mezcla
las restantes que Se le van a comparar. Esta precaución se ha
tomado, a pesar que la llave (n) ha quedado fija y graduadacon respecto a 1a salida de agua por (j)1que por otra parte
es invariable, en la presunción que un accidente,no obServado,hiciera diferir las dos mezclas; con lo quo no se podria ya has
cer comparaciones entre los plasmas.
-94...
B R V ’ .
a) A pesar que se agregan a cada salero las substancias
medidas con toda precaución o se utilizan recipientes grandes
con cantidades mayores, y en los que es imposible tener erro
res de medida, no se consigue recoger las mismas cantidades que
se ponen. En la experiencia L (es uno de los tantos ej;) en quecada salero llevaba 0.3cc de plasma90.l5cc de extracto y 0.150c
de Ringer o sea Scc en total por cada 5 saleros,se consiguió
juntar las cantidades alli indicadas¡2.4 c,c1.6«c,c2.3°%tc.
En experiencia 95en que cada recipiente llevaba 20o de plas
ma,1cc de extracto y lcc de Ringeraes decir,4cc en total por re
cipientegse obtuVo335°? Bdlcf, 3.10€ 3.00cc '351CC, 2,2cc,étc.)
Estas diferencias se deben a pequeñas cantidades, imposii
bles de tomar, que van quedando en los recipientes; trozos muychicos de coagulos adheridos a los tejidos cuando se sacan...
Y al utilizarse saleros,a lo anterior se agregaron otrosvPara no extremar medidas, que causaría errores mayores, ee han
formado coagulos con cantidades no muy pequeñas; por el tamaño
de estos coagulos pueden haber pérdidas por los bordes,si no Setiene gran cuidado.
Aún con esta última desventaja,las cantidades tomadas dulos saleros no varían,entre si,mucho mas que la de los recipien
tes grandes, comose ve por los números anteriores y presentan
los primeros, sobre estos, siempre ventajas, ya citadas.Es indud'ble que se toman los contenidos con todo genero
de precauciones; procurando quitar la menor cantidad de coagu
lo junto con el trozo, absorbiendo con pipetas los liquidos delos recipientes....
Estas diferencias,entre las cantidades conseguiias,no suacentúan preferentemente en el plasma cultivado, o en el tbbti
go (experiencia 1 2€ día: testigo menor cantidad 1.60c; culti
vo mayor cantidad 2.5cc - Experiencia 9 29 día ¡testigo mayor
cantidad 31.00; sarcoma menor cantidad 2.200) ni dependen
del tiempo de cultivo (experiencia ó corazónsler dia ¿.5cc,
-95
29 día 2.3cc, 3er dia 2.50c), con lo que no hay peligro de e
rrores sistemáticos.Para tener la evidencia que estas diferencias no dan erro
testigo 75 h)res,se ha tomado (experiencia d¡ al azar un mismonúmero de sa»leros, 5, y comopertenecían a 1a miamaexperiencia y al misno tiempo de cstufa,estaban en toda otra igualdad de candicio
nes. Sus totales recogidos eran, 20o y 2.400. Se saturaron condos porciones de una mismamezcla de carbcnico aire (para
tener la certidumbre tambien de que esa mezcla es homogenea).
Sta RLcorregidos a presión y temperatura normal difirieroren 0.0100.
Estas mediciones,entre cantidades dc igual númerode sa
lercs,sc hanefectuado en todas las experienciasgpara tener
Siempre una idea del error,(a 0.4cc correspondió en la RA0.010C
no háaiendo obstaculo, una vez medido, se agrega el contenidode otros hasta tener 1a cantidad cómodapara trabajar en el van
Slyke.
(Estando todos los saleros de toda 1a experiencia en igual
dad de medidas, no es necesario que 1a cantidad que se introdu
ce en el aparato provenga, testigo y cultivo, cada uno de estos de igual númerode saleros).
Las diferencias entre las cantidades puestas y las encontradas han oscilado alrededor de lcc dedisminución. Comoesta
disminución aparece tanto en el cultivo comoen el testigo no
introduce errores en la comparación. Es decir,que no se toma
en cuenta las diferencias entre cantidades puestas y recogidas,sino las variaciones entre estas últimas.
Aunque se debian haber tomado mayor número de pruebas,pa
ra tener la seguridad, 1a rigurocidad de las medidas y las precauciones tomadas para juntar los contenidos de los recipien
tes, no hacen presumir mayores errores debidos a estas variaciones.
b) Cuandose utilizaron recipientes grandes se ha posadoel total del tejido empleado, calculando 1a cantidad que co
-96responde a cada uno por división.
Pesar independientemente el contenido de cada recipiente
no es práctico (y desde luego imposible cuando se trata de sa
leros que llevan pocos trozos)¿l extremar el número de pesadas
se introducen errores debidos a diversas manipulaciones; lo quegana en exactitud de peso se pierde con creces en otra forma;
no se tiene nunca el peso real; pesar el tejido no tiene uti
lidad pues. Ademas,hayque recordar que se ponen los trozos en
igual número, de muy pequeño tamaño y practicamente del mismo
grandor; este es indudablemente la mejor manera de proceder.
Se tiene igualdad dc peso (lo que es de gran importancia) pormedio de estas últimas condiciones.
Para el conocimiento del número del peso no es necesario;porque no es el fin de este trabajo hacer comparaciones entre
los tejidos,deade el punto de vista de la relación RAy unidadde peso; el conocizientogen este caso,de la cantidad de tejidoshubiera sido esencial.
Lo que se necesita es igualdad,pero no magnitud de peso
y esto se obtiene en la forma anteriormente dicha.
c)En algunas experiencias,como la 5, la RAdel testigo ha
permanecidoigual,practicamente,durante los dias en consideración, dentro de pocos centésimos ¿e diferencia,(28horas 03295,
51 horas 0.315, 76 horas 0.318) Los mismos en la 4,1a 7,1a 10,
la 12. En las otras ha variado. Pero es de notar,que de los tres
tiempos observados, dos han permanecido constantes y el tercero
no coincide en las experiencias entre ellas, ni en el sentidode 1a variación, ni en el dia(experiencia 9B;0.34 0.34 y a las70 horas 0.30. Experiencia 8 ;49 horas 0.33; 72 horas 0.324;
97 horas 0.37. Experiencia 1; primero y tercer dia 0.3439egun
do dia 0.41. Experiencia 2 gsegundo y tercer dia 0.56 y 0.37;
dia 1. 0.44. Experiencia 6; Segundoy tercer día 0.32,dia 1.0.28 etc).
Debe suponorse,entonces,que esta variación no corre pende
a una modificación del plasna, sinó una diferencia en el percan
-9;teje de 002 con respecto al de las mezclas dc los otros dias.
Comola comparación del testigo con aus correspondientes
cultivos se hacen con una sola mezcla, sin volver a cargar el
aparato y que se ha comprobadohomogenea, esa variación,tanto
en sentido comoen magnitud,es igual para'todos aquellos y Porlo tanto no introduce error en la modificación debido al tejido.
Por otra parte,si fuera una variación real del plasmayloque no es presumible, comose ha empleado el mismopara testi
go y cultivo, tendría que WEBIÜCUÏtac ien en el de estos últi
mos y en todo Sentido dando igual modificación. Por lo tanto la
debida al tejido soria independiente de la anterior.
b) Bs necesario disponer un número suficiente de salerospara efectuar los trabajos continuadamente durante los dias que
se quieran llevar las observaciones. Construir las curvas de las
modificaciones biológicas en función de creciniento, efectuan
do dosajes parciales, unos a ¿eterninadas horas y luego en o
tre serie de ensayos independientes, anotar las producidas enotro tiempo mayor, no es conveniente. En dos experiencias efec
tuadas al tercer día¿en una, el cultivo hizo bajar la RLcon
respecto al testige,en le otra fue superior.(experiencia l y 5)Estas diferencias son dificilnento explicables,efeotuadas
por medio de ensayos parciales; no se tiene en esta iorua antecedentes de las nodificaiones que hubieran producido anterior
mente y de la form; particular que hubiera tomado esa curva,
porque,aún en las mas rigurosas condiciones experimentales ¿e
igualdad,los gráficos de las modificaciones puedendiferir enun mismotejido, dependienüo del estado del cultivo en esa experiencia particular.
-98P R o T o c o L ora
v'PEnIENeiA 1
28 horno
Temperatura y presión del día 18° 758 mm
Testigo
Coagulos de 5 ealeroe total 1.8 oc.
Contenido total de ealero(coagulo y
Ringer de 5 ealeroe) total 2.4 cc.
002 leído en el Van Slyke en Zoo. 1 . lectura 0.38,
Lectura máxima a 0° y 76o mm 0.348...
Bazo
Crecimiento [ífá (plnema licuado alrededor deuno de loa trozom.
Coagulosde 5 aaleroa total 1.4 oo.
Contenido total de saleroa(coegulo yFinger de 5 seleros) total 2.5 cc.
002 leido en el vnn Slyde en 200. 19 lectura 0.28ze o.2e,5e 0.28.
Lectura a ogyeomm 0.256..Sabores
Temperatura y presión del día 16° 765mm
Testigo
CoaguJoSGe5 oaleroS total 1.3 cc.
Contenido total de auleroe(congulo yRinger de 5 eeleros) total 1.6 cc.
002 leído en el Ver Slyke en 200. lE_lectura 0.44;2Q 9.43, 390.44.
Lectura a 09 y 760mm 0.41...
Bazo
Crecimiento f//} eopeeo(el plasma licuado alrededor de 4 trozos).
Coagulofide5 salercs total 1.100.Contenido total de-5 saleros(ooagulo y
Binger) total 2.3 cc.002 leído en el Van Slyke en Zoo. 1a lectura 0.88
2a o.37,53 0.37€.Lectura a 09 y 760mm. 0.554
75 horas
Temperatura.ï presión del día 169 762mm
Testigo
Bazo
Nota
Goegulosde 5 eeleroe total 1.5
Contenido total de 5 celeron (ooagulo y Finger) Ïotal. .800
002 leído en el Van Slyke lavleotura. 0.37,.29-0.57,' 39' 0.37
Lectura a 09 y 760 mm 0.344....
Crecimiento plasma licuado alrededor del tejido;
las células del crecimiento ya no se ven;degeneradouna colonia de infección muypequeña.
Ooagulosde 5 aaleroe (uno de los 5 saleroe con 88 horas
de eatufa) total 0.500Contenido total de 5 saleroe (ooegulo y Binger)total
1.800
002 leido en el Van Slyke en 200 primera lectura 0.27;2a 0.29; 5 0.30; 4a 0.295
Lectura a 09 y 760 mm 0.2799..
Bazo de cnbriones de 14 y 16 dias
Cada ealero contenía 0.500 de plasma diluido, 0.1500a
de extracto, 0.1500 de Finger.4 trozos de bazo por calera.
:NOGAALasdemás experiencias,lleVan la misma forma deanotación.
"EXPERIENCIA 2
22'horas
Testigo
Coáguloa de 5 salerosContenido total de 5 saleroe
002
.A 02 y 760
Corazón
Crecimiento
179 y 761 mm
1.600
2.200
0.46 0.46 0.48 0.47
0t443..
unos no crecieron,otroe crecimiento incipiente, el resto J
Coáguloe de 5 ealeroaContenido total de 5 ealeroe
002
A 00 y 760
HígadoCrecimiento O
Coáguloe de 5 Boleros
Contenido total de 5 ealeroe
002
A 09 y 760
46 horas
Testigo
Coágulos de 5 ealerosContenido total de 5 saleroe
002
A 09 y 760
Corazón
Crecimiento ¿fiar
Coágulos de 5 saleroeContenido total de 5 Boleros
002
A 09 y 760
Hígado
200
2.500
0.37 0.34 0.57 *\_
0.342 OOO
Bco
2.8000a58 0.37 0.37
0.351..
199 y 757 mm
1.400
Zoo
0.37 0.40 0.390.364...
1.800
2.700
0.88 p.27 0.29 0.29A 0.264.“L
Crecimiento; incipiente,otroe #,algunoe 0 y todos crecimiento pooo espeso (pocos trozos conplasma licuado a su alrededor)
-lOl
coágulos de 5 ealeroa 1.1 coContenido total de 5 saleroa 2.200
002 0.32 0.31 0.82
A oe y 760 0.291,.72 horas
209 y 752 mm
Testigocoágulos de 5 ealeroa “11.700
Contenido total de 5 saleroe Bco
002 0.595 0.42 0.41 0.39
A 09 y 760 0.578...Corazón
Crecimiento; igual al de 46 horasOoáguloa de 5 saleros 1.100
Contenido total de 5 aaleros 200002 0.30 0.31 0.32 0.30
A 02 y 760 0.288...
NOTA: Cada galera contenía 0.300 de plasma diluido,0.lóccde extracto y 0.15 de FingerCada aalero con cultivos de corazón contenían 5 trozos
W I h fl fl H ll 6 nD- n - Q- . o q-—d
-102
EXPEDIENOLg 3
27 horas209 y ‘760 mm
Testigo
Ooágulos de 4 saleroe ‘s 0.900
Contenido total de 4 saleroe 2.800
CO2. 0.28 0.28 0.30 0.29
l 09 y 760 0.273...Baza
Crecimiento; # fino (plasma licuado alrededor dealgunos trozos)
Coáguloa de 4 saleroe 0.7oo
Contenido total de 4 ealeroa 8.600
ooz 0.24 0.24. 0.24 0.26 0.25
A on y 766 0.236.“
Testigo “ulbom i99 y 760mmCoágulos de 4 saleroa 0.800
Contenido/Égtïlsaleroa 200002 0.2.7 0.27 0.30 0.80 0.29
.A OR y 760 0.29d...
Bazo
Crecimiento; plasmaliqmqkp alrededor de los trozos.Coáguloe de 4 Boleros 0.600contenido Total de 4 saleros 8.500
002 0.55 0.35 0.54 0.36 0.36
A oo y 760 0.32976 horas
188 y 763 mm
Testigo
Coáguloa de 4 ealeroe(2 sale 8896 horas de estufa)total 0.700Contenido total de'4.saleros 2.100002 0.25 0.25 0.26 0.26
A og y 760 0.240....
Enzo Crecimiento; gig}. (En general no eepeaogplaemalicuado alrededor de algunostrozos)
01,03
Ooáguloa de 4 saleros o;7bototal
Contenido/do 4 aaleroa 200002 0.49 0.49 0.47 0.52 0.51
A oc y 760 0.480...
Cada aalero contenía 0.300 de plasma diluido,0ü500'deextracto y 0.2500 de agua en el interior de los saloros.Cada ealero con oultivo;oontenía 4 trozoaBazo de embriones de 16 días.
-104
EXPERIENCIA 4
27 horas16° y 765mm
Testigo
Ooágulos de 5 saloroa (Los totales no fueron anotados)Contenido total de 5 saleros ' " " "
002 0.39 0.405 0.40
A 0° y 760 0.378...
Hígado.0reoimiento o en?%gcostrozos incipienteCoáguloa de 5 aaleros (Los totales no fueron anotados)Contenido total de 5 aaloros " "
002 0.38 0.38
A 0° y 760 0.354...
Baza
Crecimiento: ##fiá finoOoáguloa de 5 ealeros “¡1.900
Contenidoígga% aaleroa 2.700002 0.53 0.35
A 0° y 760 0.308...52 horas""“”' 16° y 761mm
Testigo
Ooágulos de 5 saleroa 1.500
ContenidO/dgtglsnloros 2.200002 0.42 0.425 6.425
A 0° y 799 0.594...
Hígado
Crecimiento; o plasma licuado alrededor de los trozosCoágulos de 5 saleros tot’l 1,700
00ntenidoÉÉgag saleros 2.700002 0.39 0.45
A 0° y 760 0.417.0n
Bazo
crecimiento;++++_.finoOoágulos do 5 snloroa 0.900
Contenido/dgtñlsaloros 2.00
-105
002 0.30 0.52 0.52 0.51
A 0° y 760 0.29775 horas
Testigo 16° y 757mm
Goágulon de 5 snleroa 2 oo
Gontenido t otai de 5.sa1eros 2.4 oc
.02 0.45 0.45
A 0° y 760 0.415..4
Testigo_ l
'¿áágulos de 5 saloron 1.2 co
aontonido latal'db 5.3aleros 2.09002 0.46 0.46 0.46
A 0° y 760 0.424..
Bazo
Crecimiento; ttttíünz.oáguloa de 5 saleros 9.8 oo
lfióntcnido total de ¿osaleros 1:6 co002 0.34 ¿.34
A o° y 760 0.514“
NOTA:_0adaealcro aontenía 0.5 oo de plasma diluido,0.15 óode extracto y 0.15 de Binger.—
Bazo de embrión dé 16 días.
-106
EXPERIENCIA 5
28 horas
TestigoCoágulosde 5 salerosContenido total de 5 saleros
002
A09 y 760 mm
crecimiento f! finoCoágulosde 5 salerosContenido total de áïfialeros
002
.A 09 y 760 mm
51 horas
TestigoCoágulosde 5 aaloroo
Contenido ÉOÜAILÓQ5 aaleros
002
A 02 y 760 mm
Bazo
Crecimiento
Coágulosde 5 saloros
Contenido total de 5 saleros002
A 02 y 760 mm
76 horas
TestigoOOÉguloSde 5 saloros
Contenido total de 5 aaleros
002
A 09 y 760 mm
229 y 755 mm
1.200
200
0.525
0.295...
1.500
2.800
0.26 0.250.252...
0.26
219 y 753 mm
1.800
2.300
0.35 0.34
0.514...
¡f y ¡ff Íino,plaama licuado alrededor detrozos.‘1.loo
l I1.800
0.31 0.31 0.131
0.278...
239 y 749 mm
0.700
1.900
0.355
0.318,.a0.35 0.35 0.36
Baza - 2.07
Crecimiento, igual al do 51 horas.Ooágulosdc 5 maloros 0.800
Contenido/ágtglaaleros 2.400002
A09y760m0.30 0.305 0.29 0.29
0.269...
dada sqloro contenía 0.300 de plasma diluido,0.l5ec doeXtráctó y 0:15cc.de Ringer.Bazo de embrión de 16 díaa.¿
-108—
EXPERIENCIA 6
27 horas20° y 757 mm
Testigo
.GoáguIOSdo 4 saleros .0.6 oo. totalContenidO/ dev4 saleros 2.2 oo002 0.51 0.31 0.31 0.31
Corazón
Crecimiento (2 trozos no crecieron)Goáguloa de 4 saleros 1.2 co
_ totalGenten1d0/de 4 aaleros 2.5 oo
S} I
602 0.27 0.27 0.27 0.a?A 09 y 760 mm . 0.244...
2u44523yï 219 y 755 mm ._«Testigo
'ÓoáguIOSde4 saleros 0,566tataí 1 ContenidO/ a. fifihergg ¿.4oo
002 0.56 0¿55 0435 0¡54
A 0° y 760mm 0.523 ...
Corazón
Crecimiento ¿ff
GoágulOSde4 saleros 1.200tContenidO/ Séaí silence 2.300002 0.51 0.315 0.515
A 0° y 760 mm 0.233...
76 horas23° y 750mm
TestigoOoágulosde 4 saleros 1.00
. fiotíl 2 5Contenidg,ee oalerca . co002 0.36 0.565 0.55
A oo y 760mm 0.323...
Corazón
CrecimientO' f}; (Un trozo no creció)
Ooágulesde 4 saleros 1.500ot, _
Contenido/tae ¿341sala-(.3 2.oeo
NOEA:
-109
A o° y 760 mm 0.318."..
Oada salero contenía 0.300 de plasma d11u1d0,0.15de extracto y 0.2500 de Finger.Oorazón de embriones de 14 a 16 días}Los saleros cultivados,contenian 5 trozos.
-llO
EXPERIENC IA '7
Todas las exporioncias,en adelantc,oetan en oapsulaagrandes quo contienen zoo de plasma diluido, leo de extrao
to y loc de Ringer.
Testigo
Ooraáfin
Baraona
Testigo
Corazón
24 horas
Temperatura y presión del dia 25°y 756 mm
Finger 0.5 oo
Total (l ooágulo y Ringer) 2.9 co
002 de 2 oo leído en el Van Sly150_34 y 28‘91345
Lectura.máxima a 0° y 760 mm l 0,30'7....J Y
Crecimiento ¿"í
1 colonia de infección pequeña; se observan glóbulos.Binger 0.5 co
Total (l coágulo y Binger) 3 co
002 de 2 co 15 0.25, 23.0.25
Lectura máxima a 0° y 760 mm 0.223...
Crecimiento incipienteFinger 0.4 oc
Total (l ooágulo y Ringor) 3.2 co
002 do 2 oc la 0.27, 23HO.28, 3° 0.26
Lectura máxima a 0° y 760 mm 0.249
47 horas
Temperatura y presión del dia 26° y 756 mm
finger 0.3 ccTotal (1 ooágulo y Finger) 5 co
002 de 2 co 1? 9.34; 29 0.34lectura máxima a 0° y 766umm 0.298...
Crecimiento H“muy fino
(se observan glóbulos)
Binger lco
Sarcoma
Testigo
Sarcona
-lll
Total (1 coágulo g Ringer) 5 cc
002 (le 2 cc 1Fl 0.245; 2°" 0.23
Lectura maxima a OPy 760 mm 0.215...
Crecimiento Á! y 8 trozos de é
(plasma lleno de cólulac;aapecto menoolimpio ue elde 24 h.3
Binger 0.6 cc
Total (l coagulo y Finger) 2.9 cc
002 dc 2 cc 1a 0.25; 2“ 0.25
Lectura a 0° y 760 mm 0.219...96 horas
Temperatura y presión del día 27° y 754 mn
Binger 0.5 cc
Total (1 coágulo y Binger) 3 cc
002 de 2 cc 1“ 0.34, 2“ 0.36; 39‘ 0.33
lectura máxima a OP y 760 mm 0.513-oo
Crecimiento ¡fé espeso
(plasma lleno de células pero aspecto limpio)Finger 1.3 cc
Total (coágulo y Bingof) 3.00
002 de 2 cc 13 0.54; 23 0.33
Lectura máxima a 0° y 760 nn 0.29
Oada cápsula cultivada con corazón contenía 40 trozossarcoma
excepto la utilizada a las 96 horas que contenía 55Peso de cultivo utilizado para el total de cápsulao
(oarcoma)
0.2692 gr. Termino sodio de cada cápsula 0.2692j/. 4:0.0675
Pcao de cultivo utilizado para el total de capsulasCorazón)
0.4862 gr. Termino medio de cada cápsula 0.4862j/. 4:0.1215
-112
4 cápsulas para corazón, 4 para sarcoma y 4 païa toa' tigo.Cada cápsula contenía 2 co do plasaa diluido, 1 oodo extracto y 1 oo do Bingor.A laa 72 horas ol orocizionto del sarooaa ora de
esposo y 01 corazón esposo do í/ y algunoa ¡KK
NQT¿;Lasexperiencias siguientes,11evan la mismaforma de anotación que las anteriores.
-113
EXPERIENCIA 8
49 horas19° y 761 mm
Testigo
Finger 0.300Total Soc
002 0.36 0.36
A 0° y 760 0.329 ...
Sarcoaa
Crecimiento i f'
Bingor 0.700Total 5.100
002 0.25 0.25
A 0° y 760 0.228...
Corazón
Crecimiento f f
Finger 0.600Total zoo
002 0.25 0.25
A oP y 760 O¿228...
8 horas—__"‘ 2105 y 7563:)
Testigo
Finger 0.200Total 5.200
002 0.36 0.36
A 0° y 760 0.324
Sarcoaa
Crecimiento -# J espeso
Finger 0.900Total 3.106
002 0.31 0.51
A 0° y 760 0,27%,...
Corazón
Crecimiento f f
BingorTotal
002 ‘
A 0° y 760
Testigo
BingorTotal
002
.A 0° y 760
Saroona
NOTA
Orocinionto
FingerTotal
002
A 0° y 760
H
-ll4—
.97 horas
0.400
3.200
0.27 0.26 0.270.243...
210 y 757
0.41 0.41
004.35
El corazón,llovaba 26 trozos por cápsula" sarcoma
0.200
2.800
0.369...
1.400
5.400
0.44
0.596...
alrededor de 30 trozos por cápsulaPeso total del tejido empleadopara 4 oápaulaa-Oorazón
4 II0.2504 gr.-Sa.rco:n0.1852 gr.
Término medio por cápsula del poso del tejido-Corazón" fl
0'. 0626 gr.-Saroonao. gr.
Oorazón de embriones do 14 Gian.
“d‘ó - . _ —nun-L
Testigo
Hígado
FingerTotal
002
A 0° y 760
Crecimiento
BingerTotal
002
A 0° y 760
Corazón
Crecimiento
FingerTotal
002
A 0° y 760
Sar002a
Oreciniento
FingerTotal002
A 0° y 760
Testigo
Hígado
BingerTotai002 \
A OP y 760
Crecimiento
Finger
-115
EXPERIENCIA 9
25 horas21° y 758 un
0.500
5.500
0.56 0.58 0.370.343...
O
0.900
3.100
0.28
0.253...0.27 0.28
incipiente0.400
8¡1cc
0¿23 0.24 0.24
oo oJ
0 y en nlgunoe‘trozos incipienteO¿Gcc
Soc
0¿27 0827 0.28 0.28
0.253...
¿9_Q922224° y 757 nn
1.503
3.190
0.38 0.39
0.546...0.59
f fino
-116
"K Total 300
002 0.29 0.29
A 0° y" 760 0.257...
Saroona
Crecimiento 'fnf' (de 10 a 15 trozon;sin creeiziento)
Finger 0.800
Total 2.200002 0.25 0.26 0.26
A 0° y 760 0.231...
79 horas26° y 755 nu
TestigoBinger 0.600Total 2.800
002 0.345 0.545
A 0° y 760 0.302...
Hígado
Oreoiuicnto degenerado
Ringor 2.500Total 5.100
002 0.36 0.37 0.36
A 0° y 760 0.524...Corazón
Crecimiento í fi. :Iuy fino
Finger 1.300Total 3.100
002 0.38 0.37
A 0° y 760 0.55Baraona
Crecimiento 7‘.71 algunou 0
Finger leñeeTotal 2.409
002 0.54 0.3.5 0.34
A0° y 760 o._
-117E1 ocluzdn llevaba 80 trozos por cápsula" hígado " 27 n n w' sarcoma " 28 ” " "
Poao total dol tejido ozmloadopara 4 cápsulas-CorazónO.4296 gr.
u I a n N " 4 " -Híga.do' 0.5618 gr.
” " " " 4 -Saroomao. gr.Embrionea de 14 dinn.
-118
JKZEEWIENCIA 10L
Zé horac22° y 756 nn
Testigo
Bingo: 0.500
Total 8.200
002 0.41 0.41
A 0° y 760 0.367...Sarcoma
Crecimiento % f
Ringcr 01500
Total 3.20c
002 0.25 0.26
A 0° y 760 0.233...
¿Lima21° y 755 mm
Testigo
Hingcr 0.300
Total 3.100
002 0.38 0.38
A 0° y 760 0.341%.
Sarcoma
Crecimiento f fino aspecto degenerado
Bingo: lcc
Total 2.700002 0.26 0.26
A 0° y 760 0,253...Corazón
Crecimiento 14 esposo y 10 trozos w' espeso thlplasma se observan globuloe rojos
Ringor 0.700
Total 2.800‘
002 0.50 0.30
A oo y 760 0.269...72 horno
210 y 755 mm
-119
Testigo
Finger- 0.100Total 300
002 0.38 0.39 0.39
A 0° y 760- 0.350...Corazón
Crecimiento 9 trozos (lo 24.94%:ol resto de 73111108 ospeaoa otros no.
Binger 1.700
Total 3.100
002 0.23 0.28
A 0° y 760 0.260...
ngggz Peso total del tejido empleado para 4 oápsulas-Sarooma0.2572 gr.
" 4 ' -00razón0.4806 gr.
Corazón do embriones do 20 días.:
-120
KPERIENCIA 11
24 horas25° y 751mm
Testigo
Finger 0.300Total 2.900
002 0.46 0.46
A 0° y 760 0.403...Sarooma
Crecimiento á fiFinger 0.300Total 2.900
002 0.32 0.51
A 0° y 760 0.280...
48 horas26° y 750 mm
Teotigo
Binger 0.500Total 2.800
002 0.45 0.46
A 0° y 760 0.400...Sarcoma
Crecimiento 1/3 del número de trozos ¿é el reatorÉ
Bingor 100
Total 500
002 0.33 0.34 0.35 0.53
A 0° y 760 0,364...72 horao’“‘“‘ 25° y 755mm
TestigoFinger 0.300
Total 5.100002 0.58 0.59
A 0° y 760 0.347...
Sarcomn
Crecimiento 0
Finger 0.500
Testigo
Ringerïotal002
A 0° y veo
Corazón
Greci2iento
RingerÉotul
002
A 0° y 760
Eeetigo
Binger
Total002
A 0° y P60
Corazón
4.22-r
BSPERIENCIA 12
JD horas28° y 754m2
0.6 oo
5 00
0.56 0.37 0.35
ooo
inoipiente(ue observan globulos r Joa en el plasma.
0.7 co
5.2 oc
0.25 0.24 0.230.207
43 horaa fl29° y 753mm
XQ.5 oo
g;loc0.54 0345 8\55
0.2g9...\
\\
Crecimiento ¡.; Iino.-(So observan glóbulos ro;
FingerTotal
002
A 0o y 760
Testigo
FingerTotal
Corazón
Jos;_)1.100
2.900
0.26 0.245
0.223...72 horas
31° y 753mm
0.300
300
0.38 0.36 0.37'0.323...
-123
Crecimiento ¡HA- eE-Lom (Se observan glóbulos rojos)
Singer 1.500
Total: 2.3uo002 0.44 0.47 0.44
A o°y 760 0.399...96 horae
Corazón
NOTA:
Crecimiento Á/ÉÁ¿espeso DegeneradoCada cápsula llevaba 27 trozos
1)Él crecimiento celular hace disminuir 1a reserva alcalina
del plasma que contiene tejido con respecto a1 plasma testigo.
El Valor numérico de esta disminución puede hacerse variar
a voluntad,modificando las condiciones experimentales.Fijada la magnitud de estas modificaciones para toda una
determinada experiencia,quedan las particularidades del crecimienw
to comoúnica causa de variación¿Se observa,entonces,lo siguiente;
2)Algunos tejidos,como el bazo y el corazón,inician su creci
miento visible muyrapidamente¿(menos de 24 horas).
El sarcoma es más variable;puede iniciarlos antes de las24 horas comotambién alrededor de las 48 horas.
E1 higado tarda siempre más de 24 horas,como puede obser
Varse con las experiencias 2 y 9.
Las determinaciones efectuadas en el higado y en algunos
casos de sarcoma/revelan,que la disminución de 1a reserva alcalinaes previa al crecimiento del tejido (Exp.2 y 9-higado-).
3)A partir del primer dia la RApermanece«cunetantapdurante
2 6 3 días.
4)Luego aumenta la RA,progresivamente hasta‘áfiífifiínangualar6 sobrepasar los valores del plasma testigo.
5)En un pequeño porcentaje de experiencias no se observa eso
ta estabilización,habiendo aumento de 1a RAen el segundo dia con
respecto al primero (experiencias 3 y 12).
Dependedel estado del cultivo,como lo prueba el hecho que
fué observado también en el bazo,que es el que precisamente mantiee
ne más tiempo su equilibrio.(Ho se hicieron suficientes experiencias para comprobarlo en todos los otros tejidos,pero es evidente
que asi puede suceder.6)En algunas experiencias estas estabilizaciones dan cifras
muyconstantes)variando apenas entre cantidades comprendidas desde
-125
de 0.0100 o de 0.0200 ej. (experiencia 2, corazón, dis
minución con respecto al testigor22 horas 0.100; 46 horas 0.100;72 horas 0.09cc.)
En otras,oscilandentro de centésimosxgjm( exp. l, bazo,disminución con respecto al testigo;0.09, 0.056, 0.065)y sinmggïrgral microscopio ninguna particularidad que las interprete. Seoonsideranequilibrios porque estas oscilacionescaben dentro de errores aceptables; su disminuciones o aumen
tos son muypequenos en comparación con la generalidad de las
experiencias (exp. 9 sarcoma, 2do dia disminución de 0.115; 70
horas iguala al testigo); no tiene una orientación determinadacomoen la experiencia 8 (sarcoma) que varia dentro de valores
no muygrandes,pero siempre en aumentohacia el del testigo.5) E1 bazo es el que mantiene mas largo tiempo este equi
librio; sobre q experiencias,en 3 no se notaba.á% tercer diaindicios de subida en la RAaEn el corazón sucedió esto 3 veces
(experiencias 2,8 y lo). Sarcoma, una Vez. Del higado se hicie
ron pooasexperiencjas pega hacer porcentajes.O) La fi 31 se mantiene en equilibrio mientras hay cre
cimiento visible ej. (experiencia 6, 76 horas, RAalta; crecimiento detenido desde las 51 horas. Experiencia 9, sarcoma,
70 horas,RA ya muy alta; crecimiento detenido después de 46
horas. Experiencia 9, higado, 70 horas,RA muyalta;crecimiento
en decadencia después de 46 horas) o dura mas después de cesar1a proliferación ej.'(experiencia_4, bazo, Ser dia RAen equilibrio; crecimiento detenido después del primer dia. Experien
cia ll, sarcoma, 72 horas RAen equilibrio; crecimiento en decadencia después de las 48 horas) pero ngngg_gggggta_gign1;as;ngx
_prgliggrggién, 'Hubouna sola excepción inexplicable-experiencia 12 sobre el total; pero es de observar,que al 4to dia pre
sentaba degeneración grasa
NOTA.Algunas experiencias aisladas efectuadas en diversos cul
tivos demuestran que en ingualúad de peso el bazo produce una
mayor disminución ¿e le RA, El escaso número de experiencias re
alizadas impiden, por ahora, generalizar esta afirmación
-126
DL‘2‘CUSJ'QHmv. ¿gs ¿LISUL'Z“Jos
Sobre reserva alcalina en cultivos,norbdflfigggfgágfifigggggbadocitado en la bibliografia mundial.
Recordando las relaciones existentes entre RAy concentra
ción del ion H,esinteresante comentar los resultados obtenidos en
las experiencias efectuadas sobre pH "in vitro".
El conjunto de estas últimas pueden clasificarse en varios
grupos: a) pHintrecelular,b)modificación es del pHdel tejido c)relaciones entre pHy naturaleza quimica del buffer con relación
a la vida de los tejidos, d) influencia del pH del medio sobre el
crecimiento,e) modificaciones del pHdel medio por efecto del crecimiento.
En los dos grupos últimos,existen algunas experiencias que
pueden relacionarse con el presente trabajo y a los cuales se analizará.MIEALIK(19)prepara medios de cultivo a diversos pH,desde 4.8 a
más de 7.8 y alli siembra,observando las modificaciones por el méu
todo colorimétrico.
Los tejidos cultivados en medios con pH 6.6-6.8 presentan
el mejor desarrollo;luego,eseng es su óptimo.
Cualquiera que sea el pH inicial,cae o sube,a pesar del
buffer,para alcanzar en más o menos tiempo ese óptimo.
Si el pu inicial no es muyalejado del óptimo,empieza un
equilibrio desde el segundo dia.Si coincide con el valor óptimose mantiene estable desde un principio.
RUBINSTEIN(32) dice"después de 24 horas se puede comprobar una
caida marcada que varia con los cultivos;parece que depende de la
velocidad del crecimiento y puede ser también de la naturaleza del
tejido cultivado.Después la caida del pH se moderapara llegar a
una especie de qquilibrio o mostar pequeñas oscilaciones."
" En los cultivos envejecidos,parece que el pHpuede algu
nas veces subir un poco."
-127
CONCLUSIONES
I)Bn el plasma conteniendo tejido,se obtiene una disminu
ción de la reserva alcalina dentro de las primeras 24 horas.
Esta disminución no se observa en el plasma testigo,e3
decir,sin tejido.2)A partir del primer dia y mientras dura el crecimiento del
tejido,1a RAqueda estabilizada.3)La RAaumenta al detenerse la proliferación celular o po
co tiempo despuéa.En algunos casos,el aumento iguala y hasta puc
de sobrepasar el valor original44)Los gráficos,construidos mediante los datos obtenidos con
diferentes tejidos muestran curvas similares. 2 t!
E4/
W”
-123.
BEEQMEN DE LOS PBQIOCOLOS
Plasma diluido,extracto y Ringer = 23121
T B T C H
Trozos(a) 4 5 6
l día 0.348 0.256 0.443 0.341 0.351
2 " 0.410 0.354 0.364 0.264 0.291
3 " 0.344 0.280 0.378 0.288 e.fi¿¿
Experiencia l Experiencia 2
T H B T B
Trozos1 dia 0.378 0.354 o.áb8 0.295 0.2322 " 0.394 0.418 0.297 0.314 0.278
3 “ 0.425 ----- 0.314 0.318 0.292
Experiencia 4 Experiencia 5
T C S T S . C
Trozos(89 40 40 30 261 día 0.307 0.223 0.249 . . . . . . . . . . . . . -2 " 0.298 0.215 0.219 0.329 0.229 0.229
3 u ---.- . . . . . . . . -- 0.324 0.279 0.2434 " 0.313 ----- 0.295 0.369 0.396 ----
Experiencia 7 Experiencia 8
T H c-' s
Trozos 27 30 gg_1 dia 0.343 0.253 0.216 0.253
2 " 0.346 0.258 -:--- 0.231
3 " 0.302 0.324 0.333 0.307
Experiencia 9
NOTA:(a) número de trozos por salero.
(a!) ll ll il cápsula .
T S T S T C
Trozos 34 27
1 dia 0.367 0.233 0.403 0.280 0.320 0.2072 " 0.341 0.233 0.269 0.400 0.304 0.296 0.223
3 " 0.350 ----- 0.347 0,214 32 9
Experiencia 10 Experiencia ll Experiencia 12
Plasma diluido 0.acc,extracto 0.15cc y Ringer 0.25cc
T B T g
Trozos ________á___ _Ú____._____1 dia 0.223 0.236 0.281 0.2442u3 " g¿g4o 0,480 Q¿323 Q¡318
Experiencia 3 Experiencia 6
NOTA.los gráficos se han construido de la siguiente forma: Tomando
comovalor la Ra del plasma del primer dia de experiencia, se ha
trazado una recta, Es decir, sin tener en cuenta las pequeñas os
cilaciones experfimentalesde ese plasma (testigo),
Se ha construido la curva del plasma cultivado,tomando los
valores que dan la resta de las dos reservas alcalinas (plasma tes
tigo y plasma cultivo)que se están comparando,
Enlos gráficos la linea discontinua es el testigo,
Si." III¡#difl ___aii-555255132535
Ei“Si?!
5225;!
gi:
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rE. II:
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55.“.
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v ‘ , l ;,.7'::.-_:A‘ l “x.A ..,.-‘-¿‘q' fa“. (¿gm-ag
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