control biològic del xancre del castanyer al parc natural...

Control biològic del xancre del

castanyer al Parc Natural del

Montseny i Montnegre-Corredor.

Fase 2006

Amb el finançament de:

Desembre 2006

Control Biològic del Xancre del Castanyer a Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006

1

Índex ÍNDEX...............................................................................................................................................................1

1. INTRODUCCIÓ .........................................................................................................................................3

1.1. ESTAT DEL PROBLEMA...........................................................................................................................3 1.2. ANTECEDENTS I JUSTIFICACIÓ ..............................................................................................................3

2. OBJETIUS ...................................................................................................................................................6

3. ACTIVITATS 2006.....................................................................................................................................7

3.1. SELECCIÓ DE PLANTACIONS DE CASTANYER ........................................................................................7 3.2. DETERMINACIÓ DELS GCV ...................................................................................................................8 3.3. DETECCIO D’AÏLLAMENTS HIPOVIRULENTS........................................................................................15 3.4. INCIDÈNCIA DE LA MALALTIA .............................................................................................................18

3.4.1. Can Tarrer...................................................................................................................................21 3.4.2. Polell............................................................................................................................................22 3.4.3. Trauna .........................................................................................................................................22 3.4.4. Can Preses...................................................................................................................................22 3.4.5. Fontmartina.................................................................................................................................22

3.5. PRODUCCIÓ DE INÒCUL .......................................................................................................................23 3.6. INOCULACIÓ A CAMP ...........................................................................................................................26

3.6.1. El Samon (Sant Pere de Vilamajor)...........................................................................................29 3.6.2. Can Tarrer (Sant Pere de Vilamajor) .......................................................................................34 3.6.3. Fontmartina (Fontmartina)........................................................................................................36

4. BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................................................40

ANNEX I. PARCEL·LES VISITADES .....................................................................................................44

CAN TARRER ...............................................................................................................................................44 Trauna....................................................................................................................................................49 Fontmartina ...........................................................................................................................................57 El Samon ................................................................................................................................................63 Can Preses .............................................................................................................................................70

ANNEX II. TAULES DE CREUAMENTS...............................................................................................73

CAN TARRER ...............................................................................................................................................73 FONTMARTINA ............................................................................................................................................74 EL SAMON ...................................................................................................................................................75 CAN PRESES ................................................................................................................................................76

Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006

2

ANNEX III. PROVA MORFOLOGICA DELS CULTIUS ...................................................................77

CAN TARRER ...............................................................................................................................................77 FONTMARTINA ............................................................................................................................................77 EL SAMON ...................................................................................................................................................78 CAN PRESES ................................................................................................................................................78

ANNEX IV. INVENTARIS D’ESTAT SANITARI.................................................................................79

PLANTILLA D’INVENTARI ...........................................................................................................................79 CAN TARRER ...............................................................................................................................................80 FONTMARTINA ............................................................................................................................................90 CAN PRESES ................................................................................................................................................95 POLELL ......................................................................................................................................................103 TRAUNA.....................................................................................................................................................108 RESUM INVENTARI ....................................................................................................................................111

ANNEX V. CULTIUS CONVERTITS ....................................................................................................112

EL SAMON .................................................................................................................................................112 FONTMARTINA ..........................................................................................................................................112 CAN TARRER .............................................................................................................................................112


3

1. Introducció

1.1. Estat del problema

El xancre del castanyer ha devastat les castanyedes de Catalunya durant els

últims 20 anys. A les comarques del nord-est, els propietaris frustrats per la

reducció dels beneficis de les seves perxades imposada pel xancre,

substitueixen els castanyers per Pinus radiata, assumint un elevat cost, i

potser sense donar suficient importància al risc que Sphaeropsis sapinea i

Fusarium circinatum, dos patògens molt virulents, comprometin la viabililtat

d’aquest pi en el futur. El mètode de control més eficient contra el xancre del

castanyer actualment és la lluita biològica mitjançant el virus CHV1. Aquest

mètode ha estat i és utilitzat amb èxit a diversos països d’Europa.

1.2. Antecedents i justificació

La malaltia del xancre del castanyer, causada pel fong ascomicet

Cryphonectria parasitica (Murril) Barr, originari d’Àsia, porta afectant les

castanyedes europees des de mitjans del segle XX (Milgroom et al., 1996;

Heiniger i Rigling, 1994; Griffin 1986).

La hipovirulència és una malaltia d’aquest fong que dóna lloc a l’atenuació de

la seva virulència, provocada per un virus de RNA de doble cadena (dsRNA)

(Milgroom et al., 1991; MacDonald i Fulbright, 1991; Choi i Nuss, 1992;

Heiniger, 1994). L’hipovrius disminueix la capacitat del fong de matar l’arbre,

doncs els xancres queden reduïts a la part externa de l’excorça i no

destrueixen el càmbium del castanyer (Griffin, 2000; Robin et al., 2000; Homs

et al., 2001). L’agent víric dsRNA es transmet horitzontalment via anastomosis

hifal (Kuhlman et al., 1984; Anagnostakis, 1987; MacDonald i Fulbright, 1991;


4

Heiniger, 1994; Griffin, 2000; Baidyaroy et al., 2000), o verticalment mitjançant

els conidis, tot i que no mitjançant les ascospores (Robin et al., 2000; Homs et

al., 2001). La incompatibilitat vegetativa limita l’anastomosis, pel que

restringeix la transmissió de l’hipovirus (Anagnostakis et al., 1986; Choi i Nuss,

1992; Bissegger et al., 1997; Cortesi et al., 2001). La disseminació de

l’hipovirus estaria directament relacionada amb la composició de grups de

compatibilitat vegetativa (GCV) de la població. Així, una de les causes de l’èxit

de la hipovirulència a Europa és la baixa diversitat de GCV (Bissegger et al.

1997).

A Catalunya, s’han detectat 11 GCV, essent domintant un d’ells, EU-2, amb un

55,3% dels 380 aïllaments analitzats, estant present en totes les

subpoblacions mostrejades. La diversitat de GCV, en termes de relació entre

el nombre de GCV i el nombre d’aïllaments analitzats, és baixa (0,03),

comparada amb d’altres poblacions europees on el control biològic (CB) està

funcionant, com és el cas de França (0,20) i Itàlia (entre 0,04 i 0,18, segons la

subpoblació), on la hipovirulència es va expandir de manera natural

(Anagnostakis i Hillman, 1992; Cortesi i Milgroom, 1998; Anziani i Robin, 1999;

Robin et al., 2000; Trestic et al., 2001). L’índex de Shannon (1,37) és

comparable amb el valor donat per Cortesi et al. (1996) per Itàlia (1,23), i

inferior al d’altres regions europees com França (2,71), Bòsnia-Herzegovina

(2,26) (Trestic et al., 2001). Aquesta situació mostra unes bones condicions

per l’èxit del CB a Catalunya.

El CB es basa en l’exposició d’un xancre virulent a inòcul hipovirulent que deu

no només causar la conversió de la soca virulenta, sino també reduir la

quantitat d’inòcul virulent i inciar la producció d’inòcul hipovirulent (MacDonald

i Fulbright, 1991). D’aquesta manera, el fong infectat produeix conidis que són

portadors del virus, i són dispersats per insectes o esquitxades d’aigua que

porten aquests conidis fins un altre xancre. Quan aquests conidis infectats

germinen, transfereixen el virus a les soques sobre les que han caigut

dispersant el virus per la massa de castanyers. Un cop que el virus està


5

instal·lat dins d’una massa, els xancres virulents no arriben a donar-se, o

creixen uns centímetres fins a ser infectats pel virus i perden la seva

virulència.

Els factors més importants que influeixen en l’èxit del CB són la virulència, la

diversitat de GCV a la població, la capacitat de conversió, la transmissió del

fenotip hipovirulent als conidis, i la quantitat d’inòcul produït pels aïllaments

hipovirulent (Liu i Milgroom, 1996; Melzer et al., 1997; Robin et al., 2000).

L’aplicació del CB consisteix en la selecció d’un d’aïllament hipovirulent

corresponent al GCV predominant a la població a tractar. L’aïllament

s’introdueix als forats practicats als marges del xancre, de manera que el virus

pot transmetre’s amb èxit, afavorint la seva cicatrització (Anagnostakis, 1995;

Robin et al., 2000; Anziani i Robin, 1999).

A la selecció de soques a aplicar al CB, deu tenir-se en compte la prioritat

d’utilitzar aquells aïllaments amb una producció elevada de conidis

hipovirulents, de manera que s’afavoreix una expansió secundària del virus,

convertint en hipovirulents també els xancres no inoculats (Melzer et al.,

1997).


6

2. Objetius

Els objectius específics de l’any 2005-2006 han estat els següents:

• Caracteritzar l’estat sanitari de les finques de castanyer situades al Parc

Natural del Montseny i del Montnegre-Corredor, proposades per la

Diputació de Barcelona per a rebre el tractament i la seva adequació

per aquest tipus de tractament.

• Definir la composició en Grups de Compatibilitat Vegetativa (GCV) de

les finques a tractar.

• Avaluar a camp la presència d’hipovirulència natural a les finques a

tractar.

• Inocular les finques seleccionades amb una soca hipovirulenta del GCV

majoritari a la parcel·la, amb diferents intensitats de tractament.


7

3. Activitats 2006

3.1. Selecció de plantacions de castanyer

Aquesta fase ha consistit en la presa de contacte amb propietaris i gestors

interessats en la recuperació del cultiu del castanyer, preferentment distribuïts

de manera homogènia per la zona de distribució del castanyer, al Parc.

Aquest any, s’ha centrat la selecció de castanyedes en aquelles platacions

destinades a la producció de fusta. S’ha intentat identificar les perxades que

no arribessin al seu torn els propers deu anys, prioritzant aquelles en què

s’havia de fer la selecció de tanys a l’any següent per tal de seguir la

seqüència lògica d’aplicació del control biològic: inoculació i aclarida.

D’aquesta manera, les ferides produïdes durant l’aprofitament, seran punts

d’entrada pel fong hipovirulent introduït prèviament.

S’han realitzat diverses visites a camp, per tal d’evaluar les finques i de

seleccionar les parcel·les idònies pel tractament, d’aquelles que la Diputació

de Barcelona havia proposat com a candidates. A l’annex I es poden observar

les caracterísitiques de les parcel·les.

A continuació es fa una relació de les parcel·les propostes per la Diputació de

Barcelona (Taula 1).


8

Taula 1. Parcel·les proposades per la Diputació de Barcelona per a fer tractament.

Comarca Municipi Nom Coor X Coor Y

Vallès Oriental Sant Pere de Vilamajor Polell 449113 4621136

Vallès Oriental Sant Pere de Vilamajor Can Tarrer 449241 4619862

Vallès Oriental Fontmartina Fontmartina 449165 4619916

Vallès Oriental Sant Pere de Vilamajor El Samon 449678 4622466

Vallès Oriental Fogars de Montclús Trauna 451388 4624747

Vallès Oriental Sant Celoni Can Preses 466314 4612400

El resultat d’aquesta fase ha estat la priorització per a la inoculació, segons les

condicions de les parcel·les visitades a camp, de les parcel·les d’El Samon

(Sant Pere de Vilamajor), Can Tarrer (Sant Pere de Vilamajor) i Fontmartina

(Fontmartina).

3.2. Determinació dels GCV

Aquesta fase va consistir en la determinació dels GCV de les parcel·les a

tractar, per tal de triar el grup majoritari de la zona i l’aïllament que seria el

portador de l’inòcul.

Per tal de decidir a quines parcel·les s’havia de fer el mostreig de GCV, es van

cartografiar el punts amb GCV coneguts i les noves parcel·les on s’havia

d’inocular. Els punts amb GCV coneguts van ser aquells d’estudis previs

realitzats al Laboratori de Patologia Forestal de la Universitat de Lleida.

El mostreig a camp va consistir en agafar mostres d’escorça de 10 xancres de

10 arbres diferents: dos xancres dels dos castanyers afectats més propers al

punt central; i altres dos dels dos arbres malalts més propers a cadascun dels

quatre punts situats a 10 m dels punt central en direcció nord, sud, est i oest

(Homs et al., 2001). De cadascun d’aquests xancres, es van prendre dues

mostres d’escorça (Il·lustració 1, Il·lustració 2 i Il·lustració 3).


9

Il·lustració 1. Instrument per extraure les mostres.


10

Il·lustració 2. Gradeta on es guarden les mostres d’escorça.


11

Il·lustració 3. Xancre mostrejat a la finca d’El Samon, es pot apreciar

l’extracció de dos mostres d’escorça.

A més amb l’objectiu de detectar totes les possibles soques hipovirulentes de

la zona, es van prendre mostres addicionals de l’escorça d’arbres cicatritzats o


12

en procés de cicatrització, tan si estaven als punts de mostreig com si estaven

al voltant o al camí d’accés.

A la fase de laboratori, les mostres d’escorça es van aïllar segons la

metodologia desenvolupada per Anagnostakis et al. (1986). A la Il·lustració 4

pot veure el procés d’aïllament del fong en agar al 2%, segons la metodologia

abans esmentada. El procés va consistir en passar les mostres d’escorça per

aigua oxigenada 10 segons, aigua destil·lada autoclavada 10 segons més, i un

segons, per eliminar l’excés d’aigua, en paper dessecant.

Il·lustració 4. Procés d’aïllament del fong Cryphonectria parasitica, a partir de les mostres d’escorça.

La determinació de GCV es va portar a terme segons la metodologia descrita

per Anagnostakis (1988). Es van transferir a PDA (Potato Dextrose Agar)


13

petites porcions (menys de 3 mm per costat) de miceli del front d’avanç de

cultius que portaven en creixement menys de 7 dies (Anagnostakis et al.,

1986). Es van col·locar les peces de miceli a examinar separades a una

distància no superior a 5 mm i es van incubar a 25-27ºC a les fosques

(Anagnostakis et al., 1986) durant 7 dies, seguits d’una incubació a la llum del

dia al laboratori durant 7 dies més (Robin et al., 2000). Aquest procés es pot

veure a la Il·lustració 5. Es van realitzar vuit creuaments (parells de peces de

miceli) per cada placa de petri de 9 cm de diàmetre.

Il·lustració 5. Prova de compatibilitat vegetativa a la campana de flux laminar.

Es va evaluar la compatibilitat vegetativa segons la resposta de barreja-

barrera dels micelis (Anagnostakis, 1988) (Il·lustració 6 i Il·lustració 7). La

barreja de les dues soques indicava que aquestes eren compatibles (Bisseger

et al., 1997). En aquest cas, les hifes s’anastomosen (Anagnostakis, 1987). La

formació d’una línia de barrera entre les dues soques indicava la

inocompatibilitat vegetativa entre aquestes (Bisseger et al., 1997). A la zona

de barrera, es trobaven les cèl·lules mortes on l’anastomosis havia tingut lloc,

sense miceli aeri que la cobrís (Anagnostakis et al., 1986), i els picnidis aliniats

a ambdós costats de la barrera.


14

Il·lustració 6. Placa amb creuaments.

Il·lustració 7. Soques compatibles (esquerra) i incompatibles (dreta).


15

Es van creuar tots els aïllaments d’una mateixa parcel·la de mostreig entre

ells, en totes les combinacions possibles, i es va guardar un aïllament de cada

GCV per a creuar amb cadascun dels GCV trobats a Catalunya fins a la data

(EU-1, EU-2, EU-5, EU-12, EU-65, EU-66, EU-67, EU-72, CAT-B, CAT-H,

CAT-X). Si els aïllaments d’una parcel·la eren incompatibles amb aquests

aïllaments-tipus, es van creuar amb la resta dels 74 aïllaments-tipus europeus.

El mostreig de GCV es va dur a terme a les següents parcel·les: Can Tarrer

(Sant Pere de Vilamajor), Fontmartina (Fontmartina), El Samon (Sant Pere de

Vilamajor) i Can Preses (Sant Celoni).

A les taules de l’annex II, es poden veure les proves de creuaments entre els

aïllaments de les parcel·les i els tipus. Les proves de compatibilitat vegetativa

de la parcel·la Can Preses s’han inclòs només els resultats dels GCV

existents, però no estan determinats encara a quin grup es corresponen

(nodet). A les taules, es poden veure GCV que no han estat compatibles amb

cap dels onze GCV trobats a Catalunya fins a la data (noCat) i, actualment

s’estan creuant amb la resta de testers presenta a Europa, esperant resultats.

3.3. Detecció d’aïllaments hipovirulents

Per detectar els possibles aïllaments hipovirulents ja presents a les parcel·les

visitades, es va fer la prova morfològica descrita per Bisseger et al. (1997).

Aquest mètode es va aplicar a tots els aïllaments recollits als mostreigs. La

prova morfològica va consistir en la classificació de l’aparença dels cultius de

C. parasitica, que està correlacionada amb la infecció del fong per l’hipovirus

europeu (Choi et al. 1992; Day et al., 1977; Rigling et al., 1989).

L’aparença típica blanca en PDA s’ha utilitzat àmpliament per a distingir les

soques hipovirulentes de les virulentes, tot i que s’ha observat una expressió


16

variable dels fenotips associats a les soques que contenen dsRNA (Heiniger et

al., 1994; Uscuplic et al., 1999).

La morfologia del cultiu no deu ser l’únic criteri per a determinar la

hipovirulència d’aïllaments desconeguts (MacDonald i Fulbright, 1991), per

això, es va fer aquesta prova com a primera aproximació i, dels possibles

aïllaments hipovirulents, se’n va fer l’extracció de dsRNA. L’extracció es va dur

a terme segons la metodologia descrita per Allemann et al. (1999).

En cultiu, els aïllaments hipovirulents (Il·lustració 8) mostren una velocitat de

creixement menor que els virulents (Il·lustració 9), un miceli de color blanc o

lleugerament ataronjat (MacDonald i Fulbright, 1991; Anagnostakis, 1987;

Anagnostakis, 1995), i una escassa producció de picnidis (Kuhlman et al.,

1984; Heiniger, 1994; Heiniger i Rigling, 1994; Anziani i Robin, 1999; Uscuplic

et al., 1999; Dawe i Nuss, 2001). Al contrari, els aïllaments virulents

normalment presenten un ràpid creixement, un miceli dens i taronja, i una

producció abundant de picnidis (Kuhlman et al., 1984; MacDonald i Fulbright,

1991; Heiniger, 1994; Uscuplic et al., 1999).


17

Il·lustració 8. Aparença del miceli hipovirulent de Cryphonectria parasitica.

Il·lustració 9. Aïllament virulent de Cryphonectria parasitica.

D’aquesta manera es va utilitzar la següent classificació per a determinar la

infecció per l’hipovirus dels aïllaments analitzats: B, quan el cultiu era

totalment blanc i presentava una producció de picnidis poc freqüent; Po, quan

l’aïllament presentava una morfologia anormal, era ataronjat clar sense ser

totalment blanc; R, quan el creixement era escà o irregular; i Pi, quan

l’aïllament presentava una abundant i freqüent producció de picnidis i una

aparença taronja brillant.

Per evaluar les característiques morfològiques del cultiu, es van cultivar tots

els aïllaments de C. parasitica en plaques de petri amb PDA incubant-los a

25ºC a les fosques durant 7 dies, seguits d’una incubació a la llum del dia al

laboratori durant 5 dies (Bissegger et al., 1997). Sota aquestes condicions, els


18

aïllaments virulents i hipovirulents van desenvolupar una morfologia en cultiu

clarament diferent.

A l’annex III es pot veure la morfologia dels cultius analitzats.

L’extracció de dsRNA es va realitzar d’aquells aïllaments que van donar a la

prova d’hipovirulència B, Po, o R, d’aquelles parcel·les que s’havien d’inocular,

per saber si els aïllaments s’havien de convertir, en cas de no tenir el virus,

amb l’aïllament hipovirulent catalá, LL0559. La extracció de dsRNA podia

donar positiva (+), confirmant-se la presència de l’hipovirus, o negativa (-),

aïllament sense hipovirus.

3.4. Incidència de la malaltia

Es va dissenyar una plantilla per fer l’inventari de la incidència de la malaltia

(annex IV). L’inventari va consistir en l’establiment d’una parcel·la de 6 m de

radi, de tal manera que entressin 15 arbres o més. Si amb un radi de 6 m no

entraven 15 arbres com a mínim, es va augmentar el radi, fins a arribar a

aquest mínim d’arbres. El radi es va fer amb l’ajut d’un distanciòmetre, que es

pot veure a la Il·lustració 10.


19

Il·lustració 10. Centre d’una de les parcel·les inventariades, amb el distanciòmetre com a referència del punt central.


20

Es va contabilitzar cada soca i els arbres de cada soca. Si les soques només

tenien un tanys per soca, no es van contabilitzar les soques, sino els tanys

com a arbres individuals. En el cas de parcel·les de castanyers de fruit, es van

contabilitzar els arbres i el nombre de rebrots o branques (N rebrots) per arbre.

A cada arbre (tany, rebrot o branca) es van numerar els xancres presents,

classificant-los en xancres hipovirulents, virulents o intermitjos segons les

següents característiques:

- Xancres hipovirulents: xancres atípics que havien estat frenats per les

defenses de l’arbre. Havien cicatritzat. No presentaven coloració

vermellenca, ni una abundant producció de conidis.

- Xancres intermitjos: xancres que tenien una aparença entre virulenta i

hipovirulenta. Tenien característiques de xancres virulents i

hipovirulents. Podien estar parcialment cicatritzats o presentar un

creixement retingut o escàs, però tenir una producció de conidis

considerable.

- Xancres virulents: xancres en fase de creixement actiu, coloració

vermellenca i abundant producció de conidis.

La classificació de l’aparença dels xancres a camp no determina

definitivament la virulència del fong. En el cas dels xancres d’aparença

hipovirulenta, s’hauria de demostrar per tècniques moleculars la presència de

l’agent víric causant de la hipovirulència, per tal de determinar la seva condició

hipovirulenta.

Es va mesurar també la severitat de la malaltia per a cada arbre en termes de

percentatge de capçada morta. Es va estimar a partir de la quantitat de

branques mortes o sense rebrots i aquelles que encara produien. Les classes

establertes per a definir la severitat van ser aquestes:


21

- 0: 0% de capçada morta, arbre sa.

- 1: 1-25% de capçada morta.




- 5: 100% de capçada morta, arbre mort.

Es van contabilitzar tots els xancres que podien veure, marcant-se amb esprai.

Aquells que eren inaccessibles i no es podien marcar, es van registrar a la

plantilla amb un asterisc. De la mateixa manera, es van marcar el nombre de

mostres agafades dels xancres, en cas de ser atípics; i el nombre de fotos

fetes als xancres, en el cas que se n’haguessin fet.

A l’annex IV, es poden observar els inventaris fets a les següents finques

(entre parèntesis, el nombre de parcel·les d’inventari realitzades a cadascuna

de les finques): de Sant Pere de Vilamajor, Can Tarrer (6), Polell (3); de

Fogars de Montclús, Trauna (3); de Sant Celoni, Can Preses (4); de

Fontmartina, Fontmartina (5).

3.4.1. Can Tarrer

Can Tarrer va constituir el paratge amb un percentatge més gran de xancres

d’aparença hipovirulenta (3%), trobats a tres de les sis parcel·les mostrejades,

essent el percentatge en una d’elles força elevat (13%). Aquestes xifres van

quedar reflectides en la severitat mitjana de la parcel·la, de grau 1.


22

3.4.2. Polell

El paratge Polell tenia un elevat percentatge de xancres virulents, 88% del

total de xancres, i només un 9% i un 2% de xancres intermitjos i hipovirulents,

respectivament. Els xancres hipovirulents trobats estaven concentrats en una

de les tres parcel·les mostrejades, en una proporció del 4%. La severitat

mitjana de la parcel·la va ser de grau 2.

3.4.3. Trauna

En aquest paratge van ser mostrejades tres parcel·les. D’aquestes, dos van

presentar el 100% dels xancres amb aparença virulenta. A l’altra parcel·la, hi

va haver un 11% de xancres intermitjos, i un 89% de xancres virulents. Calia

destacar la inexistència de xancres d’aparença hipovirulenta, i una severitat

mitjana de grau 2.

3.4.4. Can Preses

Aquest paratge va destacar per no presentar cap xancre d’aparença

hipovirulenta, en cap de les quatre parcel·les mostrejades. Tot i així, el

percentatge mitjà de xancres virulents va ser el més baix de tots els paratges,

amb un 75%. El 25% restant dels xancres tenien característiques intermitges

entre xancres virulents i hipovirulents.

La severitat mitjana de les quatre parcel·les va ser de grau 2.

3.4.5. Fontmartina

De les cinc parcel·les mostrejades a Fontmartina, es van trobar només dos

xancres hipovirulents en una d’elles (FMT2), la qual cosa representava un 4%


23

del total de xancres d’aquesta parcel·la, i 1% del total de xancres d’aquest

paratge.

La severitat va ser de grau 2.

3.5. Producció de inòcul

Després de la decisió de les parcel·les a inocular, es va procedir a la

preparació de l’inòcul.

Es van triar quatre aïllaments del GCV majoritari de la parcel·la i es van

convertir amb l’aïllament LL0559, segons el següent procediment: es va posar

una porció de miceli de l’aïllament a convertir i una altra porció de miceli de

l’aïllament LL0559 separats 5 mm, en un extrem de la placa de petri amb PDA.

Es van fer tres plaques de conversió per aïllament. Un cop es va veure que

l’aïllament LL0559 havia convertit al virulent, es va transferir l’aïllament

convertit a una altra placa de petri amb PDA. La conversió es feia palesa pel

canvi en el patró de creixement de l’aïllament virulent i pel canvi de coloració,

de manera que l’aïllament virulent passa de tenir una presència abundant de

conidis i una coloració taronja, a tenir un miceli blanc (Il·lustració 11 i

Il·lustració 12). Després d’aïllar el cultiu convertit, es va repicar en vàries

plaques de petri, per tal de fer la prova morfològica d’hipovirulència.


24

Il·lustració 11. Placa on es pot observar la conversió de l’aïllament virulent, degut a la compatibilitat vegetativa entre ambdues soques.


25

Il·lustració 12. Placa on es veu que la conversió de l’aïllament virulent no s’ha produït, degut a la incompatibilitat vegetativa entre ambdues

soques.

Paralel·lament, es va fer l’extracció de dsRNA dels aïllaments convertits.

L’aïllament que va donar blanc a la prova morfològica i positiu a l’extracció de

dsRNA, es va utilitzar com a inòcul.

Un cop triat l’aïllament, es va repicar en grans quantitats en plaques de petri

amb poc PDA i es va fer crèixer durant 7 dies a la llum. Quan el miceli havia

cobert tota la placa, es va triturar el miceli de totes les plaques fent una pasta

uniforme que es va introduir en tubs de plàstic, per la seva posterior aplicació

en camp (Il·lustració 13).


26

Il·lustració 13. Procés d’elaboració de l’inòcul a la campana de flux laminar.

A l’annex V, es poden veure els aïllaments convertits per a cada parcel·la

inoculada i els resultats de la prova d’hipovirulència. A les taules es poden

veure els aïllaments convertits, data de la prova d’hipovirulència, el resultat de

la prova (morfologia), i el resultat de les extraccions (-, negatiu; +, positiu,

infectat pel virus; buit, si no s’ha fet l’extracció).

3.6. Inoculació a camp

Aquesta fase va consisitir en la inoculació a camp dels xancres trobats sobre

els arbres seleccionats. Es va utilitzar la tècnica d’inoculació amb miceli,

preparat segons l’apartat anterior.


27

Els arbres seleccionats pel tractament van ser prioritàriament aquells més

vigorosos amb xancres hipovirulents. Els arbres morts o amb un alt

percentatge de capçada morta, no van ser prioritzats, tot i que de vegades van

ser inoculats, degut a la manca d’altres castanyers en millor estat.

La inoculació amb miceli va consistir en practicar forats al voltant dels xancres

seleccionats, separats un centímetre del front d’avanç del fong (Il·lustració 14).

Es va introduir l’inòcul dins dels forats (Il·lustració 15), tapant-los posteriorment

amb cinta adhesiva, per evitar la dessecació del miceli (Il·lustració 16).

Il·lustració 14. Forats realitzats la perifèria del xancre.


28

Il·lustració 15. Introducció del miceli als forats practicats al voltant del xancre.


29

Il·lustració 16. Xancre inoculat amb la cinta adhesiva per evitar la dessecació.

Es va fer inoculacions a les parcel·les d’El Samon, Can Tarrer i Fontmartina.

3.6.1. El Samon (Sant Pere de Vilamajor)

La inoculació es va realitzar el dia 6/9/06.


30

L’objectiu d’aquesta inoculació va ser doble: d’una banda, aconseguir la

disseminació de l’hipovirus a la finca El Samon; i de l’altra, avaluar la dispersió

de l’hipovirus a la zona tractada i al seu perímetre.

Per assolir aquest doble objectiu, es van establir tres àrees dins de la finca de

0,06 ha (20×20 m). A una d’elles, es van tractar el 50% dels xancres

accessibles trobats (un sí, un no); a una altra, es van tractar el 100% dels

xancres accessibles (tres de cada quatre); i a l’altra no es va tractar cap

xancre, constituint la parcel·la control.

Cada parcel·la es va inocular seguint transectes segons corbes de nivell, fins a

cobrir la totalitat de l’àrea seleccionada a tractar. Els xancres que es van

inocular van ser preferentment aquells que es trobaven en arbres joves i

vigorosos, essent marcats per a evitar que fossin tallats a les aclarides, i

utilitzar-los així com a punt de dispersió de la hipovirulència. Els xancres en un

estat molt avançat, que estaven a punt de matar l’arbre, en principi, no es van

inocular (Il·lustració 17).


31

Il·lustració 17. Arbre no inoculat, per l’estat avançat del xancre virulent.

A l’àrea tractada cadascun dels xancres inoculats es van marcar amb esprai

vermell i un número al costat del xancre; es van marcar els arbres amb una

cinta, per a poder localitzar-los en futurs seguiments. Els xancres d’aparença

hipovirulenta que s’anaven trobant es van marcar i numerar amb esprai groc.


32

A la parcel·la control es van marcar els xancres virulents i hipovirulents

existents, amb el mateix codi de colors (vermell, pels xancres virulents, i groc,

pels hipovirulents).

Es van establir transectes de seguiments de la disseminació de l’hipovirus de

la següent manera: tres transectes paral·lels, seguint la direcció de les corbes

de nivell, separats a una distància de 20, 40 i 60 m dels costats inferior i

superior de la parcel·la (Figura 1). Els transectes van tenir una longitud de 30

m i una amplada de 5 m. A la es pot observar la disposició dels transectes per

a les àrees tractades. Dins dels transectes es van marcar i numerar els

xancres virulents i hipovirulents existents amb esprai vermell i groc,

respectivament.

Figura 1. Esquema de l’àrea d’inoculació i dels tres transectes de seguiment a 20, 40 i 60 m de l’àrea tractada.

A la primera parcel·la on la intensitat del tractament va ser del 100%, es van

inocular 31 xancres. i a la segona parcel·la, amb una intensitat del 50%, es

van inocular 20 xancres. Alguns d’aquests xancres es poden observar a la

Il·lustració 18 i Il·lustració 19.


33

Il·lustració 18. Xancre inoculat a la parcel·la d’El Samon. Es poden

observar els forats practicats a l’escorça i la pasta introduïda.


34

Il·lustració 19. Xancre basal inoculat a la parcel·la d’El Samon.

3.6.2. Can Tarrer (Sant Pere de Vilamajor)

La inoculació es va fer el dia 10/10/06.

La metodologia que es va seguir per a la inoculació va ser la mateixa que la

utilitzada per a la finca d’El Samon. A la primera parcel·la es van inocular tots


35

els xancres accessibles i presents en arbres que no estaven morts, és a dir,

amb una intensitat de tractament del 100%. El total dels xancres inoculats en

aquesta parcel·la, va ser de 30 xancres.

A la segona parcel·la es van inocular 15 xancres, el 50% dels xancres

virulents accessibles. Es poden observar els treballs d’inoculació a la

Il·lustració 20 i Il·lustració 21.

Il·lustració 20. Treballs d’inoculació a la finca de Can Tarrer.


36

Il·lustració 21. Marcatge dels límits de la parcel·la a inocular.

La tercera parcel·la, es va deixar com a control, marcant els xancres trobats.

3.6.3. Fontmartina (Fontmartina)

La inoculació es va fer el dia 11/10/06.

La inoculació d’aquesta parcel·la es va fer al voltant de l’àrea tallada arreu

d’aquesta finca (Il·lustració 22). Es va marcar un perímetre de 10 m d’amplada

i es va inocular cadascun dels xancres. Es poden observar els treballs

d’inoculació a la Il·lustració 23.


37

Il·lustració 22. Estat del rebrot de les soques que havien estat tallades, el dia de la inoculació.

Il·lustració 23. Treballs d’inoculació a la finca Fontmartina.


38

A una part del perímetre, el castanyer es trobava barrejat amb alzina

(Il·lustració 24). En total, es van inocular 45 xancres. Es van trobar dificultats

durant la inoculació, degut a l’elevada edat dels castanyers (Il·lustració 25).

Això dificultava la distinció dels xancres, doncs les esquedes naturals de

l’escorça confonien els xancres. D’altra banda, els rebrots, generalment, no

tenien el diàmetre suficient per a ésser inoculats.

Il·lustració 24. Castanyeda mixta amb alzinar.


39

Il·lustració 25. Castanyers adults a la finca de Fontmartina.


40

4. Bibliografia

Allemann, C.; Hoegger, P.; Heiniger, U.; Rigling, D.; (1999). Genetic variation

of Cryphonectria hypoviruses (CHV1) in Europe, assessed using

RFLP markers. Molecular Ecology 8: 843-854.

Anagnostakis, S.L. (1988). Cryphonectria parasitica, cause of chestnut blight.

Adv. Plant Pathol. 6: 123-136.

Anagnostakis, S.L.; (1987). Chestnut blight: the classical problem of an

introduced pathogen. Mycologia, 79: 23-37.

Anagnostakis, S.L.; (1995). The pathogens and pests of chestnuts. Advances

in Botanical Research, 21: 125-145.

Anagnostakis, S.L.; Hau, B.; Kranz, J.; (1986). Diversity of vegetative

compatibility groups of Cryphonectria parasitica in Connecticut and

Europe. Plant Disease, 70(6): 536-538.

Anagnostakis, S.L.; Hillman, B.; (1992). Evolution of the chestnut tree and its

blight. Arnoldia 52,2:3-10.

Anziani, C.; Robin, C.; (1999). Le chancre du châtaignier en France. Phytoma,

La Défense des Végétaux, 517: 44-47.

Baidyaroy, D.; Huber, D.H.; Fulbright, D.W.; Bertrand, H.; (2000). Transmisible

mitochondrial hypovirulence in a natural population of Cryphonectria

parasitica. Molecular plant-microbe interactions: MPMI. 13(1): 88-95.


41

Bissegger, M.; Rigling, D.; Heiniger, U.; (1997). Population structure and

disease development of Cryphonectria parasitica in European

Chestnut forests in the presence of natural hypovirulence.

Phytopathology, 87: 50-59.

Choi, G.H.; Nuss, D.L.; (1992). Hypovirulence of chestnut blight fungus

conferred by an infectious viral cDNA. Science, 257(5071): 800-803.

Cortesi, P.; McCulloch, C.E.; Song, H.; Lin, H.; Milgroom, M. G.; (2001).

Genetic control of horizontal virus transmission in the chestnut blight

fungus, Cryphonectria parasitica. Genetics 159: 107-118.

Cortesi, P.; Milgroom, M. G.; (1998). Genetics of vegetative incompatibility in

Cryphonectria parasitica. Applied and Environmental Microbiology,

64(8): 2988-2994.

Dawe, A. L.; Nuss, D. L.; (2001). Hypoviruses and chestnut blight: exploiting

viruses to understand and modulate fungal pathogenesis. Annual

Review of Genetics, 2001. 35: 1-29.

Day, P. R.; Dodds, J. A.; Elliston, J. E.; Jaynes, R. A.; Anagnostakis, S. L.

(1977). Double-stranded RNA in Endothia parasitica. Phytopathology

67: 1393-1396.

Griffin, G. J.; (1986). Chestnut blight and its control. Horticultural reviews, 8:

291-335. Griffin, G.J.; (2000). Blight control and restoration of the

American chestnut. Journal of forestry. 98(2): 22-27.

Griffin, G. J.; (2000). Blight control and restoration of the American chestnut.

Journal of Forestry 98(2), 22-27.


42

Heiniger, U.; Rigling, D.; (1994). Biological control of chestnut blight in Europe.

Annu. Rev. Phytopathol., 32: 581-599.

Heiniger, U.; (1994). Le chancre de l'écorce du châtaignier (Cryphonectria

parasitica). Symptômes et biologie. Nierhaus-Wunderwald, Dagmar,

22: 1-7.

Homs, G.; Rodríguez, J.; Rigling, D.; Colinas, C.; (2001). Caracterización de la

población de Cryphonectria parasitica y detección de cepas

hipovirulentas en 3 subpoblaciones de Cataluña. Montes para la

sociedad del nuevo milenio. III Congreso Forestal Español. Ed.

Junta de Andalucía. Granada.

Kuhlman, E.G.; Bhattacharyya, H.; Nash, B.L.; Double, M.L.; MacDonald, W.L.;

(1984). Identifying hypovirulent isolates of Crypthonectria parasitica

with broad conversion capacity. Phytopathology, 74(6): 676-682.

Liu, Y.C.; Milgroom, M. G.; (1996). Correlation between hypovirus transmission

and the number of vegetative incompatibility (vic) genes different

among isolates from a natural population of Cryphonectria parasitica.

Phytopathology, 86 (1): 79-86.

Macdonald, W.L.; Fulbright, D.W.; (1991). Biological-Control of Chestnut Blight

- Use and Limitations of Transmissible Hypovirulence. Plant

Disease, 75: 656-661. (Del tercer párrafo de la página 657).

Melzer, M.S.; Dunn, M.; Zhou, T. y Boland, G. J.; (1997). Assessment Of

Hypovirulent Isolates Of Cryphonectria Parasitica For Potential In

Biological Control Of Chestnut Blight Canadian Journal Of Plant

Pathology_Revue Canadienne De Phytopathologie, 19(1): 69-77.


43

Milgroom, M.G.; Macdonald, W.L.; Double, M.L.; (1991). Spatial Pattern-

Analysis of Vegetative Compatibility Groups in the Chestnut Blight

Fungus, Cryphonectria Parasitica. Canadian Journal of Botany, 69:

1407-1413.

Milgroom, M.G.; Wang, K.; Zhou, Y.; Lipari, S.E.; Kaneko, S.; (1996).

Intercontinental population structure of the chestnut blight fungus,

Cryphonectria parasitica. Mycologia, 88(2): 179-190.

Rigling, D.; Heiniger, U.; Hohl, H. R.; (1989). Reduction of Laccase activity in

dsRNA-containing hypovirulent strains of Cryphonectria (Endothia)

parasitica. Phytopathology 79, 219-223.

Robin, C.; Anziani, C.; Cortesi, P.; (2000). Relationship between biological

control, incidence of hypovirulence, and diversity of vegetative

compatibility types of Cryphonectria parasitica in France.

Phytopathology, 90: 730-737.

Trestic, T.; Uscuplic, M.; Colinas, C.; Rolland, G.; Giraud, A.; Robin, C.; (2001).

Vegetative compatibility type diversity of Cryphonectria parasitica

populations in Bosnia-Herzegovina, Spain and France. For. Snow

Lands. Res., 76(3): 391-396.

Uscuplic, M.; Trestic, M.; (1999). Chestnut blight in Bosnia-Herzegovina and its

control. Proceedings of the Second International Symposium on

Chestnut, Bordeaux, Frances, 19-23 October, 1998. Acta Horticulturae

1999, 494, 489-494.

control biològic del xancre del castanyer al parc natural...

Documents