RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y MANIPULACIÓN DE MUESTRASINTEGRANTES:

- Álvarez Lida- Burneo Katherine- Bustos Claudia- Cajas Silvia- Calva Diana- Campoverde Carlos

- Cango Andrea

Dra. MARIA DEL CISNE LUZURIAGA04 de abril de 2011

Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida. Una toma mal realizada, pobremente recogida o mal transportada determinará un posible fallo en la recuperación de los agentes patógenos, que puede inducir a errores diagnósticos, e incluso a un tratamiento inadecuado del enfermo. 3

1. Generalidades para las muestras clínicas:Para la efectividad en el análisis de muestras clínicas, lo más importante es la apropiada selección, recolección y el transporte de las mismas. Las normas de bioseguridad para la recolección y el transporte de las muestras son las siguientes:• La recolección de muestras clínicas deben realizarse utilizando guantes, gabacha y, cuando sea necesario,

bozal o mascarilla.• Se debe evitar la contaminación de la parte externa de los recipientes. Todos los recipientes para las muestras

deben ser a prueba de derrames (con tapa de rosca).• No se deben transportar jeringas con agujas al laboratorio. En su lugar, se debe transferir el contenido a un

tubo estéril o remover la aguja, recubrir la jeringa y transportarla en una bolsa plástica.• Los recipientes con muestras clínicas derramadas no deben ser transportadas al laboratorio ni las muestras

clínicas derramadas deben ser procesadas.

1.2. Selección y recolección de muestras clínicas.

• En lo posible, la muestra debe ser recolectada antes de iniciar la terapia con agentes antimicrobianos.• Evitar contaminar con flora normal para asegurar que la muestra sea representativa del proceso infeccioso. Seleccionar el sitio anatómico correcto del cual obtener la muestra y utilizar las técnicas y los materiales

apropiados para la recolección de las muestras.• Utilizar materiales, instrumentos y equipos estériles para la recolección de las muestras.• Tener especial cuidado en la recolección de muestras para cultivos por bacterias anaerobias. Muestras de

escogencia son biopsias y aspirados, mientras que el material infeccioso recolectado por torunda es indeseable. Las muestras para cultivo por bacterias anaerobias deben ser mantenidas a temperatura ambiente y no deben ser refrigeradas.

• Es esencial recolectar un volumen de muestra adecuado.• Utilizar recipientes estériles para la recolección de las muestras, preferentemente de boca ancha, con tapa de

rosca para muestras de orina, otros fluidos corporales, esputo y tejidos. Los contenedores o recipientes deben ser de un material adecuado, diseñado para promover la sobrevivencia de los agentes bacterianos y para eliminar riesgos de derrame y de bioseguridad.

• Todos los recipientes con muestras clínicas deben ser transportados en bolsas plásticas sellables, con dos compartimientos separados, uno para el recipiente y otro para la documentación.

• La mayoría de las muestras clínicas recolectadas con torundas y que se han secado durante el transporte son inaceptables para su procesamiento.

• En el caso que sea necesario utilizar torundas, se debe hacer una selección adecuada del tipo de material• Si la muestra es recolectada a través de piel intacta (hemocultivos), se debe lavar la piel con agua y jabón,

luego desinfectar en forma centrífuga con etanol al 70% y finalmente de la misma manera con una solución yodada (tintura de yodo al 1-2%).

• La muestra clínica debe estar acompañada de una solicitud de análisis.

1.3. Transporte y almacenamiento de muestras clínicas.Luego de recolectadas las muestras, estas deben ser transportadas al laboratorio lo más pronto posible, con el objeto de:Asegurar la sobrevivencia y el aislamiento de microorganismos fastidiosos y para evitar el sobre-crecimiento de microorganismos menos fastidiosos, disminuir el tiempo de contacto de los microorganismos con agentes anestésicos locales que pudieron haber sido utilizados durante la recolección y proporcionar un diagnóstico más preciso del proceso infeccioso.Recomendaciones para el transporte y almacenamiento de muestras para cultivo de agentes bacterianos. Todas las muestras deben ser transportadas rápidamente, antes de 2 horas luego de la recolección. Si la muestra no puede ser procesada inmediatamente debe ser entonces almacenada bajo condiciones

específicas. Las muestras con probables agentes bacterianos no deben ser almacenadas por más de 24 horas, mientras que

muestras con agentes virales pueden ser almacenadas por 263 días a 4°C. Las muestras con un volumen pequeño deben ser enviadas al laboratorio en 15-30 minutos luego de

recolectadas. Las biopsias de tejido pueden ser almacenadas hasta por 24 horas a 25°C en un sistema de transporte

anaeróbico. Muestras clínicas conteniendo agentes bacterianos altamente sensibles a condiciones adversas deben ser

procesadas lo más pronto posible, incluyendo Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae (sensible a bajas temperaturas) y Shigella spp.

Las muestras conteniendo Shigella spp. deben ser procesadas inmediatamente para asegurar su recuperación en cultivo.

Para el transporte de muestras dentro de un mismo edificio, el personal encargado debe evitar las áreas más transitadas por pacientes o visitantes.

Las muestras clínicas pueden ser almacenadas a 4°C mientras son transportadas al laboratorio, con las siguientes excepciones: Si la muestra de sangre ha sido recolectada directamente en un medio de cultivo, se debe colocar

inmediatamente (≤15 min) a 35-37°C para su incubación. Si la muestra clínica puede contener bacterias sensibles a las bajas temperaturas, es mejor mantener la

muestra a temperatura ambiente. Muestras de líquido cefalorraquídeo deben ser mantenidas a temperatura ambiente o a 35-37°C, excepto

que la muestra haya sido sometida a análisis por agentes virales. En este caso, la muestra debe mantenerse a 4°C.

Muestras de heces que han sido mezcladas con medios de transporte se mantienen a temperatura ambiente.

2. Procesamiento de coprocultivos.IntroducciónEstudio bacteriológico de las heces cuyo objeto es evidenciar la existencia de un germen no habitual por microscopia directa o bien por cultivo especifico.

2.1. Material Envase estéril de plástico irrompible, capacidad 50 cc, estéril, de boca ancha y tapón de rosca, hermético. Depresor de madera estéril. Escobillón estéril con medio de transporte.

Normas generales Envase correctamente identificado según protocolo acompañado de petición rellenada por el facultativo. De ser posible tomar las muestras antes de administrar cualquier tratamiento antibiótico o antiséptico

intestinal. Caso contrario se hará constar en la petición tipo de antibiótico, dosis  y hora de la última toma. Tomar una pequeña porción de heces recién emitidas eligiendo, si las hay, las zonas mucosas, hemorrágicas

o purulentas. No cultivar muestras de heces duras o compactas. Introducir la muestra con un depresor estéril evitando tocar el interior del frasco o la tapa. Evitar la

contaminación con orina y otras substancias.

Una vez obtenida la muestra enviar inmediatamente al laboratorio de bacteriología en las 1-2 horas siguientes. Si no es posible, conservar en nevera. Si se conserva mas de 4-5 horas en nevera pueden obtenerse falsos negativos como en la shigellosis y algunas salmonellas.

Es frecuente que en algunas muestras no se aísle el germen patógeno responsable por lo que deben enviarse al laboratorio tres muestras correspondientes a días distintos o al menos de tres deposiciones diferentes.

2.2. Selección, recolección y transporte de muestras.

2.2.1. Muestras aceptables.Los principales criterios de aceptación de muestras para cultivo incluyen: Hisopos rectales de niños o adultos con diarrea aguda Muestras no contaminadas con orina Seleccionar las porciones que contengan pus, sangre o moco. Heces formadas en estudios epidemiológicos. Recibir 2 o 3 muestras de días separados incrementa la probabilidad de aislar el patógeno Muestras frescas de 1-2 horas, o preservadas de acuerdo con el punto 4.2.4.

2.2.2. Muestras inaceptables.Las muestras que no deben aceptarse, se rigen por los siguientes criterios: De más de 2 horas no preservadas Hisopos rectales secos Varias muestras en un mismo día Muestras sin datos del paciente, hora y procedencia.

2.2.3. Recolección de la muestra.Para la recolección de las muestras se deben de seguir las siguientes recomendaciones: Frascos plásticos con tapa de rosca de cierre hermético. Hisopos en tubos con tapa.

2.2.4. Preservación y transporte.Las muestras fecales que no se pueden inocular directamente en los medios de cultivo se pueden preservar a 4 - 6ºC en: Buffer salino de glicerol (partes iguales de buffer salino de fosfatos 0.033 M pH 7.0 y glicerol) recomendado

para Salmonella sp. y Shigella sp., pero no para Campylobacter sp. y Vibrio sp., a menos que sea enriquecido con CaC12 (100 mg/l).

Medio de transporte Cary-Blair, apropiado para Vibrio spp. y Campylobacter spp, pero no es tan efectivo para recuperar Shigella sp. y es inapropiado para Clostridium difficile. Algunos autores recomiendan reducir el contenido de agar de 0.5% a 0.16% para el mantenimiento de Campylobacter spp.

Otro tipo de muestras se puede preservar y transportar de la siguiente manera: Muestras para estudio por C. difficile se deben congelar a -200C hasta su procesamiento. Hisopados rectales pueden transportarse alternativamente en un caldo Gram negativo(GN). Contenidos de duodeno, colostomías o ileostomías se transportan en viales. Biopsias rectales se transportan en contenedores estériles con agua destilada, no sumergir en formalina.

2.3. Procedimientos.Exámen directo.

Un examen al fresco de una muestra de heces sin teñir es útil para detectar parásitos y, con experiencia, las formas curvas y con movilidad en dardo de Campylobacter y Vibrio cholerae a partir de heces frescas. Estos últimos se pueden observar mejor en microscopios de campo oscuro o contraste de fases.

Examen a fresco con azul de metileno: Seleccionar una porción de material fecal de un área con sangre y moco y mezclar con una gota del colorante de azul de metileno de Loeffler (azul de metileno al 0.3% en etanol al 30%) por 2-3 minutos observar en alto poder seco. El predominio de polimorfonucleares indica la presencia de un posible patógeno invasivo, mientras que el predominio de monocitos se asocia con infecciones por Salmonella typhi.Tinción de Gram: Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar una tinción de Gram. Observar predominio de polimorfonucleares, levaduras, cocos Gram -positivos o bacilos Gram-negativos, lo cual

puede sugerir una infección por Candida, S. aureus o Pseudomonas, respectivamente. El predominio de bacilos Gram-positivos largos, rectos y con paredes paralelas puede sugerir sobrecrecimiento de Clostridium difficile, aun cuando no es una prueba totalmente confiable de la infección. La tinción de Gram modificada con fucsina básica al 0.1% permite la observación de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de coma, ese (S) o en alas de gaviota, sugestivos de infección por Campylobacter spp. Además, puede usarse una tinción de Giemsa para buscar protozoarios relacionados con cuadros diarreicos.

3. ESTUDIO COPROLÓGICOIntroducciónEl análisis de las heces abarca el estudio macroscópico y microscópico de sustancias anormales, el coprocultivo para determinar presencia de microorganismos patógenos, el estudio parasitológico de las heces, sangre oculta y substancias anormales en heces de 24 horas.2

El examen macroscópico consiste en la observación directa de las características de la muestra. Se examina la cantidad, color, olor, forma y consistencia así como fragmentos de fécula, grasas no digeridas, moco, pus, sangre, etc. que pueden variar según la dieta, medicación o proceso patológico del paciente. El examen microscópico de las heces determina la presencia de sustancias como proteínas de la carne y carbohidratos como el almidón por un defecto en la digestión o tránsito acelerado a través del colon.   Si aparecen leucocitos es muy útil en el diagnostico diferencial de la diarrea de origen infeccioso. También detecta pigmentos biliares anormales como la bilirrubina, enzimas como la tripsina, coproporfirinas y podemos determinar el pH.

3.1. Material Envase estéril o limpio capacidad 50 cc, boca ancha, de plástico irrompible, hermético con tapón de rosca,

con o sin medio de transporte. A veces es preciso que sea opaco para proteger de la luz o lo cubrimos con papel de aluminio.

Depresor de madera.

3.2. Normas generales Envase correctamente identificado. Son suficientes cantidades pequeñas de heces, en general 2.5cc de heces formadas o 15-30 cc de heces

liquidas. La muestra se traslada al frasco con depresor o tira de cartón. Evitar la contaminación con orina, sangre,

agua o papel higiénico. En niños pequeños aislar los genitales con bolsa colectora de orina. No llenar el envase demasiado. Liberar el gas aflojando la tapa.

Evitar contaminar el exterior del envase con la muestra y vigilar perdidas, derrames o roturas durante el transporte.

Las muestras deben ser remitidas lo antes posible al laboratorio para su procesamiento en las 1-2 horas siguientes a la recogida y si esto no es posible guardar en nevera.

En función del tipo de análisis el paciente a veces deberá seguir una dieta determinada y   evitar o restringir algunos alimentos o fármacos previa consulta médica los días previos a la toma de la muestra.

Tras la obtención de la muestra reanudar la dieta habitual y el tratamiento. Evitar la ingestión de anti-diarreicos o catárticos así como aceites minerales para lubricar las heces porque su

composición altera los resultados. Hay pruebas en las que se precisa proteger la muestra de la luz como en la determinación de coproporfirinas

y cubriremos el frasco con papel de aluminio.

4. EXAMEN PARASITOLÓGICOConocido como examen coproparasitario, es un conjunto de técnicas diagnósticas que constituyen la indicación metodológica para la identificación de la mayoría de las entero-parasitosis causadas por protozoarios o helmintos.Para obtener resultados satisfactorios de un examen coproparasitario, debe cumplir con los siguientes requisitos:o Solicitud de Examen coproparasitario, en donde debe constar los datos filiatorios del paciente, los datos

clínicos, antecedentes personales, familiares y ambientales a destacar. Antecedentes personales de inmunodepresión, de viaje al extranjero; antecedentes ambientales como vivienda sin agua potable, saneamiento, etc.; antecedentes familiares de parasitosis, no deben obviarse en la solicitud, ya que tienen implicancias en el procesamiento de la muestra. Es importante saber si el paciente ha recibido antidiarreicos,

antiparasitarios y/o antibióticos y en tal caso cuales; se indicará el examen coproparasitario antes de iniciar tratamiento con cualquiera de los fármacos mencionados, si es posible.Todos estos datos pueden adaptar o orientar la secuencia de técnicas diagnósticas que ejecutará el especialista en el laboratorio y son condición imprescindible para obtener resultados fidedignos.

o Preparación del paciente. Debe indicársele al paciente la realización de un régimen alimentario 48-72 hs. antes de realizarse el estudio, libre de frutas, verduras y grasas, dado que preparaciones con abundantes residuos o grasas, obstaculizan la visualización microscópica, pudiendo ser causa de falsos negativos.

o Muestra correctamente obtenida.Una muestra correcta de materia fecal para realizar un examen coproparasitario debe ser suficiente (mayor de 50 grs.), debe ser emitida recientemente pudiéndose conservar en heladera hasta unas 8-12 horas, debe ser enviada al laboratorio correctamente rotulada con nombre completo del paciente y fecha de emisión, en frasco de vidrio o plástico transparente, limpio, seco y de boca ancha , con tapa de rosca. La muestra debe recolectarse sin mezcla de orina, para evitar el deterioro de parásitos.

o Muestra seriada (3 muestras mínimas de materia fecal). La muestra debe ser seriada, considerándose que muestras únicas solo permiten diagnósticos positivos en 60% de las materias fecales con parásitos; que tanto protozoarios como helmintos tienen ciclos de eliminación de quistes y huevos, con períodos negativos.Existen diferentes esquemas sobre la secuencia de recolección de materias fecales para realizar un examen coproparasitario; algunos de los más usados indican: 3 muestras en días alternos o 3 muestras separadas 1 semana entre sí, teniendo siempre presentes las premisas antes mencionadas para la colecta de la muestra.

4.1. MATERIAL NECESARIO: Frasco de vidrio o de plástico, limpio y seco, transparente, de boca ancha y con tapa de rosca. No se deben utilizar recipientes con medios de transporte.

4.2. TÉCNICA: Si son formadas o pastosas se toma una porción del recipiente donde hayan sido emitidas, y se transfieren al frasco que se enviará al laboratorio. En caso de que sean líquidas puede emplearse jeringa para pasar la muestra al frasco de envío. Se descartarán muestras contaminadas con orina.

4.3. VOLUMEN MÍNIMO: heces formadas o pastosas: tamaño de una nuez. Heces líquidas: 10-15 ml.

4.4. TRANSPORTE: Deben enviarse lo antes posible al laboratorio, de no ser así mantener refrigeradas a 4 ºC hasta 8-12 hs, antes de ser procesadas. Nunca se guardarán en estufa o a temperatura ambiente hasta el envío.

BIBLIOGRAFÍA: Fernando García, Norman Rojas. MANUAL DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS PARA

DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO. Págs, 1-4, 17-18, 53-75. Facultad De Microbiología-Universidad De Costa Rica.

Alejandro Ojeda Maroto, Miguel Sanz Martínez. CAPITULO 38: NORMAS GENERALES PARA TRATAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS.

Dr. Leonardo Anzalone Cantoni, Dra. Cristina Arenas Giménez, Dra. Raquel Ballesté Alaníz, Dra. Cristina Bazet Ugalde, Dr. Julio Blanco Toloza, Dra. Marcela Legnani Cardoso, Dra. Grisel Rodríguez Cuns, Dr. Roberto Salvatella Agrelo, Dra. Verónica Seija Scarone. MANUAL DE TOMA DE MUESTRAS PARA ESTUDIO BACTERIOLÓGICO, PARASITOLÓGICO Y MICOLÓGICO SELECCIÓN, RECOLECCIÓN, CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE. Departamento De Laboratorio Clínico-Repartición Microbiología/Hospital De Clínicas - Facultad De Medicina. Montevideo - Uruguay 2004.