Construcción De Vectores Construcción De Vectores Para Generación De Para Generación De Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos Monoclonales Modificados Por Ingeniería Modificados Por Ingeniería GenéticaGenética

T.M. Antonio SerranoAlumno Doctorado en BioquímicaFac. Cs Químicas y FarmacéuticasUniversidad de Chile

Los anticuerpos monoclonales

Revolución Parda.

Balas Mágicas

Tecnología generada en células fusionadas de mieloma de ratón

HAMA “human anti-mouse antibodies” Köhler y Milstein

Köhler y Milstein, 1975

Los monoclonales modificados

Características deletéreas de los llamados anticuerpos monoclonales de primera generación

Acm murinos fueron modificados, originando moléculas con mayor proporción de proteína humana en su estructura, permitiendo que estos puedan ser utilizados en inmunoterapias. Los llamados Anticuerpos Monoclonales Modificados (AMM) aparecieron en escena, en primer instancia como anticuerpos quiméricos, luego los anticuerpos monoclonales humanizados, y más recientemente los anticuerpos monoclonales completamente humanos.

Gavilondo y Larrick, 2000; Brekke y Sandlie, 2003)

PRODUCTO TIPO BLANCO INDICACIÓN APROBACIÓN

Abciximab (ReoPro) Quimérico Receptor de la coagulación GPIIb/IIIa en plaquetas

Anti-trombótico en pacientes sometidos a angioplastía

1994

Rituximab (Rituxan) Quimérico Molécula CD20 en linfocitos B

Linfoma de linfocitos B y no Hodgkin

1997

Daclizumab (Zenapax) Humanizado Cadena del receptor de IL-2 en linfocitos T activados

Rechazo agudo de transplante renal. Beneficios en transplante cardíaco

1997

Basiliximab (Simulect) Quimérico Cadena del receptor de IL-2 en linfocitos T activados

Rechazo agudo de transplante renal. Beneficios en transplante cardíaco

1998

Palivizumab (Synagis) Humanizado Proteína F del virus sincicial respiratorio (RSV)

Infección por RSV en niños 1998

Trastuzumab (Herceptin) Humanizado Receptor del factor crecimiento HER2/neu

Cáncer de mama avanzado

1998

Infliximab (Remicade) Quimérico Factor de necrosis tumoral Artritis reumatoide, enfermedad de Crohn

1998

Gentuzumab (Mylotarg) Humanizado Molécula CD33 en progenitores mieloides

Leucemia mieloide aguda refractaria y recidivante

2000

Alemtuzumab (Campath-1H) Humanizado Molécula CD52 en linfocitos y monocitos

Linfoma y leucemia crónica de linfocitos B

2001

Adalimumab (Humira) Completamente humano

Factor de necrosis tumoral Artritis reumatoide 2003

Aguillón, 2005

En los anticuerpos quiméricos, los dominios variables antígeno-específico, tanto de las cadenas livianas como de las cadenas pesadas de la molécula de inmunoglobulina (Ig), son codificados por genes de origen murino, mientras los dominios constantes corresponden al producto de genes de origen humano.

Estas tecnologías permitieron que a fines de la década pasada se realizasen numerosos ensayos clínicos investigando la eficacia de los diversos anticuerpos quiméricos, con usos clínicos definidos en el área de la oncología, reumatología y cardiología, por solo nombrar algunos. Cada día aumentan los posibles blancos moleculares de las patologías, augurando un promisorio campo de aplicaciones e innovación en el área de los AMM.

La artritis reumatoide (AR)

Es una enfermedad sistémica auto-inmune heterogénea con un amplio espectro de severidad clínica, que afecta a cerca del 1% de la población chilena, según el Ministerio de Salud, que la declaró como una de las enfermedades prioritarias del la política de Salud Pública. Se caracteriza por inflamación crónica, dolorosa y progresiva de la membrana sinovial de las articulaciones, conduciendo normalmente a una significativa incapacidad por destrucción del cartílago y hueso articular, afectando dramáticamente la calidad de vida. Es una enfermedad que va desde la artritis leve hasta una forma invalidante que se caracteriza por tener altos títulos de factor reumatoide y compromiso vital de otros órganos (Wicks et al, 1994). La etiología y la patogénesis de la enfermedad son complejas y no han sido completamente dilucidadas (Pincus et al., 1994; Breedveld 1998).Sin embargo se conoce que la sobre-expresión de TNF e IL-1 parecerían ser vitales, tanto en el proceso inflamatorio como en la ejecución del daño articular (Brennan et al., 1992; Smolen y Steiner, 2003).

El TNF El TNF, liberado principalmente por los macrófagos activados,

promueve la síntesis de otras citoquinas pro-inflamatorias; estimula a las células endoteliales a expresar moléculas de adhesión que atraen a los leucocitos a las articulaciones afectadas; acelera la producción de metaloproteinasas por los macrófagos sinoviales, fibroblastos, osteoclastos y condrocitos, las cuales degradan la matriz extracelular. Además, TNF suprime la síntesis de proteoglicanos del cartílago (Choy y Panayi, 2001). Debido a las múltiples acciones mencionadas, es que a TNF se le atribuye un papel más preponderante en la patogénesis de la AR que el atribuido a otras citoquinas tales como IL-1. (Macnaul KL et al 1990)

En la actualidad existen AMM contra TNF- disponibles en el comercio internacional (Elliot MJ et al 1993). Entre estos destaca infliximab y adalimumab, (Glennie MJ et al 2000)

los cuales han arrojado excelentes resultados en la disminución de los síntomas y la progresión de la AR, presentando ventajas terapéuticas frente a drogas convencionales. Sin embargo, el costo actual de estos anticuerpos, hace casi imposible el uso de estas terapias en Chile. (Aguillón JC, et al 2003)

La estrategia

Hace algún tiempo en el Programa de Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile se desarrolló el hibridoma G9, el cual es capaz de producir un anticuerpo monoclonal murino contra Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-) humano. (Aguirre A et al 2003)

En base a este anticuerpo monoclonal, se propuso desarrollar un anticuerpo Químerico anti TNF- humano, en donde sólo las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina serian de origen murino, mientras que las porciones constantes de ambas cadenas son de origen humano.

La estrategia

Esquema de la estrategia a utilizar para el clonamiento de los segmentos de una inmunoglobulina quimérica. Las cadenas liviana y pesada de la inmunoglobulina son clonadas en vectores de expresión diferentes, los cuales poseen los segmentos constantes de origen humano (CH y CL) y solo la región variable de origen murino de ambas cadenas (VH y VL). Ambos vectores poseen genes de resistencia (R) a antibióticos diferentes, que permitan la co-transfeccion y selección de una línea celular productora de anticuerpos.

El método a utilizar se inicia con una amplificación de las secuencias de DNA correspondientes a los genes que codifican las cadenas polipeptídicas constantes CH y CL de Inmunoglobulinas humanas, mediante la técnica de PCR. Paralelamente también se obtienen las secuencias líder de las cadenas H y L, necesarias para su expresión en los sistemas eucariontes de producción de inmunoglobulinas. Esto genera sitios de restricción entre ambos insertos de DNA, lo cual permitirá el subclonamiento de las secuencias DNA codificantes de las regiones variables de las cadenas H (VH) y L (VL).

Para la elección de vectores de clonamiento de los genes constantes de cadena H y L de Igs, es importante tener en cuenta que deben tener diferentes genes de resistencia a antibióticos para células eucariontes, que permitan un co-transfección. En este sentido, existen diversos vectores que cumplen con este requisito, entre éstos pcDNA3.1 (Invitrogen, USA). Por otro lado, para clonar el gen que codifica la cadena L, se obtendrá del vector pSecTag (Invitrogen, USA) el cual tiene la secuencia líder de la cadena L tipo κ.

Objetivos OBJETIVOS En nuestro laboratorio se ha clonado el gen que codifica la porción constante de la

inmunoglobulina G a partir de DNA de leucocitos de sangre periférica humana, en un vector pcDNA3.1, el cual se nombró como pIgCH-16. De acuerdo a la estrategia, como resultado intermediario, se requiere insertar en el mismo plásmido la porción líder de la cadena kappa, para de esta forma permitir, en un sitio de clonamiento específico entre ambas regiones, la inserción de la porción variable de la inmunoglobulina anti TNF murina, u otras porciones de otros anticuerpos que se pudiesen quimerizar en el futuro

Además se pretende clonar en otro vector la cadena kappa solamente, de esta forma se pudiese insertar otras cadenas constantes de otros isotipos de inmunoglobulinas como IgA o IgE, de interés en variadas aplicaciones en medicina.

Objetivo general Construir vectores plasmidiales que codifiquen la secuencia líder de la cadena liviana Kappa. Objetivos específicos . Obtención de Cadena líder Kappa a partir del vector pSecTag. Ligación de secuencia líder en vector pcDNA y pcCH-16 Secuenciación

Mat y met MATERIALES Y MÉTODOS Miniprep de purificación de plásmidos: De cultivos de bacterias se tomaron 3 ml y se concentraron en un tubo Eppendorf, centrifugando a 5000 rpm por 1 minuto. Se

utilizó un Kit para purificación de plásmidos (Qiagen, Germany), según instrucciones del fabricante. Se obtuvieron 50 ul finales de vector purificado, que fueron almacenados a -20ºC para su posterior cuantificación.

Cuantificación de plásmido: Se realizó una digestión con la enzima de restricción EcoRI (BioLabs U.K) a partir de 0,5 μl de plásmido purificado, durante 37ºC por 2 horas, para luego calcular la concentración del DNA utilizando un marcador de bajo peso molecular (Invitrogen, USA), en una electroforesis gel de agarosa al 1%. La cantidad de plásmido cargado fue determinada en relación al marcador de tamaño de DNA Lambda/Hind III (Winkler, Chile)

Reacción en cadena de la Polimerasa para cadena líder Igk : Se ordenó la síntesis de una pareja de partidores. LidpSecF: AAAAGCGGCCGCCACCATGGAGACAGA y el partidor complementario: LidpSecR: TTTTCGCCGGCGGTGGTACCTCTGTCT. (Alpha Labs, USA) Se utilizaron 5 unidades de Taq polimerasa (Promega, USA), 10 pmoles de cada uno de los partidores. En un termociclador (ThermoCycler Gradient, Thermo USA) se realizó denaturación por 2 minutos a 72ºC y 30 ciclos de: 1 minuto de denaturacion a 94ºC, 30 segundos de alineamiento en gradiente de temperatura ,desde 45 a 55 ºC y 30 seg de elongación a 72ºC, para terminar con una elongación final de 10 minutos a 72ºC. El producto de la reacción fue evaluado en gel de agarosa al 3 %, se cuantificó con respecto al marcador de tamaño de DNA 25 pb (Winkler, Chile), utilizando densitometría de bandas mediante el software Scion Image.

Precipitación de productos de PCR: Se realizaron 10 reacciones de PCR, las cuales fueron mezcladas y concentradas en secadora Speed Vac (Perkin Elmer, USA) por 15 minutos a intensidad media hasta un volumen de 80 μl. Se agregó 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M y dos volúmenes de etanol absoluto frío, más 0,5 μl de glicógeno 5 ng/μl, precipitando por 30 min a –80ºC. Luego se centrifugó a 13.000 rpm a 4 ºC por media hora. Se retiró el sobrenadante con pipeta y el pellet se dejo secar a temperatura ambiente. Luego se agregaron 500 μl de etanol al 75% centrifugando por 2 minutos a 13.000. Se evaporó todo el etanol en baño a 37ºC, y se resuspendió en 20 μl de agua ultra pura. Se cuantificó el proceso de precipitación en un gel al 3% agarosa.

Digestión con Enzimas de Restricción Not I y EcoRI: El vector de clonamiento pcDNA3.1(-), el plásmido pIgCH-16, que contiene la región constante de la cadena liviana de la IgG1 humana y el fragmento que contiene la secuencia Líder de cadena Kappa, fueron cortados en reacciones independientes con las enzimas de restricción Not I ( Promega, USA )y EcoRI (BioLabs, UK) que en presencia de Buffer O (Promega, USA) en un volumen total de reacción de 25 μl por 2 horas a 37ºC. Luego para el fragmento Lider Igk se realizó electroforesis en gel de agarosa al 3 % por 1 hora a 80 v. Mediante un bisturí fueron cortados los segmentos del gel que contenían los fragmentos de interés visualizados por luz UV, para luego mediante congelación y descongelación de la agarosa puesta en un trozo de parafilm, tomar con pipeta el eluído líquido del gel al descongelarlo con la presión de los dedos. Los productos de digestión plasmidiales fueron cuantificados en gel de agarosa al 1%. En el caso de la purificación de fragmentos digeridos por electroforesis de los vectores, se realizó purificación del segmento mediante un kit para dichos fines. (Qiagen, Germany).

Reacción de Ligación: Después de la doble digestión con enzimas de restricción y su posterior cuantificación, el fragmento Líder Igk y los vectores de clonamiento, fueron incubados en una relación molar 1:3 vector: inserto. En una reacción se utilizó Enzima T4 ligasa según las indicaciones del fabricante (Biolabs, UK).

Transformación de bacterias competentes: A la reacción resultante de la ligación fue agregada una alícuota de bacterias Escherichia coli DH5α previamente descongeladas, se incubó por 30 min en hielo. Luego se indujo transformación a 42ºC por 1,5 min y se enfrió e hielo por 2 min. Luego se agrega 1 ml de SOC, se mezcla y se incuba a 37 por 1 hora. Luego en placas Petri preparadas con agar LB con 200 ug/ml de ampicilina sólido fueron sembrados 100 μl de la transformación. Se crecen colonias por 24 horas, se seleccionaron algunas y se subcultivó expandiéndolas en nueva placa. Se realiza una PCR con los partidores LidpSecF y LidpSecR para verificar inserto en colonias. Una detección positiva determinó la amplificación del vector en crecimiento en medio LB líquido. Se realizó purificación y cuantificación de los vectores.

Secuenciación: Se enviaron 500 ng de plásmidos seleccionados al servicio de secuenciación automática del departamento de Ecología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Católica, para corroborar que los productos amplificados correspondan a un marco de lectura abierto que dé origen a la secuencia esperado. Las secuencias obtenidas fueron analizadas y alineadas en el programa Vector NTI8.

Resultados 881 LidpSecF ......AAAA GCGGCC..GC CACCATGGAG

ACAGA..... .......... LidpSecRC .......... ..................... .......... .......... pSecTag GGAGACCCAA GCTGGCTAGC CACCATGGAG

ACAGACACAC TCCTGCTATG

931 LidpSecF .......... ..................... .......... .......... LidpSecRC .......... .......... ..GGTTCCAC TGGTGACGAA

TTCCCCC... pSecTag GGTACTGCTG CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC

TGGTGACGCG GCCCAGCCGG

Alineamiento de los partidores LidpSec F (amarillo) y R (celeste) para la región líder Igk del vector pSsec Tag 2B. Los partidores diseñados portan en su secuencia zonas de corte (negrita) para las enzimas de restricción Not I y EcoRI para F y R respectivamente, lo que amplificó fragmentos de 77-80 pb en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Determinación Temperatura Óptima de Alineamiento para Reacción en Cadena de la Polimerasa. ( PCR) El cálculo teórico de la temperatura de alineamiento por parte del programa Vector NTI8 sugirió una temperatura de alineamiento teórica de 50º C para los partidores.

Se determinó en termociclador de gradiente de temperatura de alineamiento donde se obtenía mayor eficiencia de amplificación de producto de PCR., Si bien en rangos de temperatura de +/- 5ºC con respecto a la temperatura optima obtenida no se producen grandes diferencias de cantidad de producto, se consideró la mayor densidad de señal, mediante densitometría de bandas.

La temperatura de alineamiento que otorga mayor producto de PCR de los partidores Lidpsec es a 50ºC. Fotografía de gel de acrilamida a al 8% cargado con los productos de una gradiente de temperatura de alineamiento de los partidores Lidpsec F y R para cadena Líder de Igk de la inmunoglobulinas humanas utilizando como templado el plasmido pSsec Tag 2B. Se utilizó como estándar un marcador de peso de 25 pb.

Cuantificación fragmento pre ligación: La secuencia líder de Igk obtenida de la PCR de el plásmido pSecTag, fue precipitada, resuspendida y digerida con las enzimas de restricción EcoRI y Not I, para luego realizar electroforesis que permita la eliminación de los segmentos cortados. Se purificó el fragmento a partir del trozo de gel de agarosa al 3%, para luego cuantificar nuevamente previo a la reacción de ligación.

Por otro lado los vectores de expresión pcDNA3.1(-) y pIgCH-16 fueron digeridos, purificados y cuantificados en un gel del agarosa al 1%.

Cuantificacion de fragmento líder Igk y vectores pcDNA y pIgCH-16 pre ligación. En un gel de agarosa al 3% el fragmento líder Igk se cuantificó según el marcador de peso molecular de 100 pb (A). Utlizando el marcador Lambda Hind III como estándar molecular, pcDNA y pIgCH-16 fueron cuantificados previos a la ligación. pIgCH-16 posee una masa mayor pues es un pcDNA que porta la porción constante de las cadena liviana de la IgG.(B)

Screening de Colonias Transformadas post Ligación por PCR: Producto de la ligación de los vectores y el fragmento Igk, se realizó transformación de bacterias E. coli DH5α competentes. Se efectuó el plaqueo de colonias en medio de selección sólido con ampicilina. Posteriores se aisló colonias con las que se realizó un PCR de colonias. Para ello se tomó una pequeña de bacterias y se agrego directamente a la reacción de PCR en base a los partidores LidpSecF y LidpSecR. De esta forma se seleccionó y verificó que clones presentaban el plasmidio que contenían el fragmento líder Igk.

Según los resultados, se seleccionó los clones pcDNA2, pcDNA4, pIgCH16-3 y pIgCH16-4, los cuales portan la secuencia líder Igk para su posterior crecimiento en medio de cultivo líquido y posterior cuantificación.

PCR de selección de colonias transformadas con vectores que porten el inserto Igk. Fotografía de una electroforesis de productos de PCR de 5 colonias transformadas con el vector pcDNA y 5 colonias de bacterias transformadas con el vector pIgCH-16.

Cuantificación vectores clonados previo secuenciación: Una vez crecidos las colonias seleccionadas mediante PCR, se procedió a una purificación de plásmido para su posterior cuantificación previa al envío al servicio de secuenciación automática.

Según las estimaciones de cantidad de DNA obtenido del plásmido pcDNA2 no cumplía la cantidad mínima requerida para la secuenciación automática por lo que se descartó.

Cuantificacion de vectores clonados previos a secuenciación Fotografía de una electroforesis de plásmidos que portan la secuencia lider Igk, con respecto a marcador de peso molecular y al vector original pcDNA.

Secuenciación: Se enviaron 500 ng de plásmido al servicio de secuenciación, el cual permitió realizar un alineamiento revelando que los 3 vectores presentan el inserto de cadena líder de Igk, demostrado por la secuencia Kozak y el triplete de iniciación ATG (Kozak, 2002).

Alineamiento de de cadena Líder Igk, y vectores pcDNA4, pIgCH3 y pIgch4. La secuenciación reveló que la cadena kappa proveniente del vector pSecTag 2B se encuentra presente en los 3 vectores analizados

90 Kappa GCTGGCTAGC CACCATGGAG ACAGACACAC TCCTGCTATG GGTACTGCTG PCDNA-4 GCGGCC..GC CACCATGGAG ACAGACACAC TCCTGCTATG GGTACTGCTG PIGCH3 GCGGCC..GC CACCATGGAG ACAGACACAC TCCTGCTATG GGTACTGCTG PIGCH4 GCGGCC..GC CACCATGGAG ACAGACACAC TCCTGCTATG GGTACTGCTG 140 Kappa CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC TGGTGACGCG GCCCAGCCGG CCAGGCGCGC PCDNA-4 CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC TGGTGAC... .CGAATTCCA CCA....... PIGCH3 CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC TGGTGAC... ..GAATTCAA GGGC.CCATC PIGCH4 CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC TGGTGAC... ..GAATTCAA GGGC.CCATC

DISCUSIÓN Mediante esta Unidad de

Investigación se pudo construir tres vectores de expresión que portan en su estructura el gen que codifica para la cadena líder de iniciación de la trascripción de la cadena liviana kappa de las inmunoglobulinas humanas: pIgCh-3 y 4 que además poseen la cadena constante (CL) dejando entre ambos sitios de inserción para la ingeniería de fragmentos de la cadena variable de la inmunoglobulina anti TNF murina. Este vector permite además dejar la puerta abierta para que se inserten otras cadenas variables de interés en el futuro para otras aplicaciones en bio medicina. También se genero un vector pcDNA-4, que sólo porta la cadena líder kappa, lo que permite insertar cadenas pesadas de otras clases de inmunoglobulinas como E o A para otras aplicaciones, por ejemplo en inmunología de mucosas.

Ya logrado este objetivo intermedio, continúa el paso de amplificar el segmento variable de la inmunoglobulina anti-TNF murina. Se amplifica la secuencia de codifica para este fragmento mediante PCR, y luego se procede a realizar la ingeniería para la inserción en los vectores pIgCH-3 o 4, para luego corroborar y secuenciar la inserción.

Paralelamente a este trabajo en nuestro laboratorio se trabaja para la construcción del segundo vector que codifica para la porción pesada de la inmunoglobulina. Una vez seleccionados ambos vectores, se transfectarán, por electroporación o lipofección a células Cos-7 o CHO (Sanna, 2002; Andersen y Krummen, 2002). Las células transfectadas o transfectomas se seleccionarán por su resistencia a antibiótico y la secreción de la proteína al medio. Se verificará la incorporación del DNA por PCR y la expresión del RNA mensajero por RT-PCR. La secreción de la proteína se realizará por ELISA sándwich, utilizando anticuerpos anti-cadena H o L de Igs humanas para capturar la proteína, mientras otro anticuerpo anti-cadena H ó L, conjugado a peroxidasa, servirá para la detección.

Con la finalidad de verificar que la secuencia de los insertos de DNA clonados correspondan a las regiones variables de Igs de ratón, éstos serán secuenciados, solicitando el servicio a un laboratorio externo. Las secuencias nucleotídicas obtenidas serán analizadas, haciendo uso de programas computacionales que permitan determinar su homología con otras secuencia de Igs reportadas en la literatura (Ej. GeneBank). Se utilizará las secuencias nucleotídicas con el fin deducir la secuencias aminoacídicas y clasificar las regiones variables, según los subgrupos existentes, utilizando bases de datos alternativas (Johnson y Wu, 2001).

De esta forma se avanza en la implementación de la tecnología de modificación y producción de AMM, aplicable al desarrollo de otras moléculas de importancia económica y social, Como sub-productos biotecnológicos, se han generado productos intermedios patentables vectores de DNA con genes constantes de las cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulinas humanas, con sitios de clonamiento para genes variables murinos, que permitirán quimerizar o humanizar otros Acm. De esta forma nos acercamos a que un tratamiento de última generación esté disponible a un porcentaje de nuestra población que sufre artritis reumatoide, contribuyendo así a mejorar su calidad de vida.

BIBLIOGRAFÍA Aguillón JC, Contreras J, Dotte A, Cruzat A, Catalán D, Salazar L, Guerrero J, López M, Soto L, Salazar-Onfray F, Cuchacovich M. New immunological

weapons for the medicine of XXI century: Biological therapy based on the use of monoclonal antibodies from the ultimate generation. Revista Médica de Chile. 2003; 131(12): 1445-1453.

Aguirre A, Escobar A, Ferreira V, Molina MC, Ferreira A, Aguillon JC. An anti-human recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) monoclonal antibody recognizes an epitope in feline TNF alpha. Vet Res. 2003; 34(2): 177-184.

Andersen DC, Krummen L. Recombinant protein expression for therapeutic applications. Curr Opin Biotechnol. 2002; 13(2): 117-123. Breedveld FC. New insights in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 1998; 25: 3-7. Brennan FM, Maini RN, Feldman M. TNFa: a pivotal role in rheumatoid arthritis. Br J Rheumatol. 1992; 31: 293-298. Brekke OH, Sandlie I. Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 2003; 2(1):52-62. Choy EH, Panayi GS. Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 2001; 344(12): 907-916. Elliot MJ, Mainim RN, Feldmann M, Long-Fox A, Charles P, Katsikis P, Brennan FM, Walker J, Bilj H, Ghrayeb J, Woody JN. Treatment of rheumatoid

arthritis with chimeric monoclonal antibodies to tumor necrosis factor alpha. Arhtritis Rheum 1993; 36: 1681-1690. Gavilondo JV, Larrick JW. Antibody engineering at the millennium. Biotechniques. 2000; 29:128-36. Glennie MJ, Johnson PW. Clinical trials of antibody therapy. Immunol Today 2000;21(8):403-410. Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res. 2001; 29(1): 205-206. Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-497. Kozak M. Emerging links between initiation of translation and human diseases. Mamm Genome. 2002; 13(8): 401-410. Macnaul KL, Hutchinson NI, Parson JN, Bayne EK, Tocci MJ. Analysis of IL-1 and TNF alpha gene expression in human rheumatoid synoviocytes by

in situ hybridization. J Immunol. 1990; 145: 4154-4166. Pincus T, Brooks RH, Callahan RF. Prediction of longterm mortality in patients with rheumatoid arthritis according to simple questionnaire and joint

count measures. Ann Intern Med. 1994; 120: 26-34. Sanna PP. Expression of antibody Fab fragments and whole immunoglobulin in mammalian cells. Methods Mol Biol. 2002;178: 389-395. Smolen JS, Steiner G. Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis. Nat Rev Drug Discov. 2003; 2: 473-488. Wicks I, McColl G, Harrison L. New propestics on Rheumatoid Artritis. Immunol Today. 1994; 15: 553-556.