consejo nacional de ciencia y tecnologia...

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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN

INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES GENÉTICAS Y

METABÓLICAS –INVEGEM-

INFORME FINAL

“DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN T315I EN EL GEN QUIMÉRICO BCR-ABL

COMO INDICADOR DE RESISTENCIA AL TRATAMIENTO CON INHIBIDORES

TIROSIN KINASAS EN PACIENTES CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA”

PROYECTO FODECYT No. 46-2013

Dra. Claudia Lorena Carranza Meléndez

Investigadora Principal

Guatemala, mayo 2016

http://www.google.com.gt/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRw&url=http://congresocti.concyt.gob.gt/2014/bienvenida&ei=Hd9iVO6lJMqnNtmdg_AL&bvm=bv.79189006,d.eXY&psig=AFQjCNHuq19yT0VCna2zgu0YB5Kt2eC3Lw&ust=1415852118208663

ii

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional

de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología

–SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT- .

iii

OTROS AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible también gracias a:

• Apoyo financiero y académico del Instituto de Investigación en Enfermedades Genéticas y

Metabólicas –INVEGEM-.

• Apoyo financiero de la Fundación Rozas-Botrán.

• Cooperación de la Unidad de Oncología Pediátrica –UNOP-

• Cooperación del Dr. Mauricio Villegas, Dr. Julio Cáceres y Dra. Silvana Torselli.

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RESUMEN

El advenimiento de medicamentos a nivel molecular como los inhibidores tirosin kinasas

(Imatinib, Nilotinib y Dasatinib); marcan una nueva etapa en la era de tratamiento en cáncer. La

leucemia mieloide crónica es una enfermedad cancerosa, que posee una característica molecular

principal: el 90% de los pacientes tienen la t(9;22), que produce el gen quimérico BCR-ABL1. Los

tres inhibidores tirosin kinasas que actualmente se encuentran en el mercado son tratamientos

específicos para los pacientes BCR-ABL1 positivos. Sin embargo a nivel mundial, se ha visto que un

20-30% de pacientes tratados con este tipo de tratamiento, muestran resistencia al mismo. Y la

principal causa de resistencia que se ha encontrado es la presencia de mutaciones en el gen quimérico

BCR-ABL1.

En Guatemala se ha encontrado aproximadamente un 35% de pacientes que no están

respondiendo bien al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas y no se sabe la causa. La mutación

T315I en el gen BCR-ABL es la mutación más agresiva que se ha reportado en la resistencia a los

inhibidores tirosin kinasas; ya que es resistente a los tres inhibidores que se encuentran disponibles

actualmente en el mercado; dejando como única opción el trasplante de médula ósea. Por esta razón

en el presente estudio, se tuvo como objetivo principal detectar la presencia de la mutación T315I en

el gen BCR-ABL1 en pacientes que no han alcanzado una respuesta óptima; esto con el fin de

determinar la posible resistencia a Imatinib, Nilotinib y Dasatinib.

Se determinó la existencia de mutaciones de resistencia a inhibidores tirosin kinasa en el 11 %

del grupo de estudio. La mutación G250E fue la más frecuente (6.0 %); mientras que la mutación

T315I estuvo presente en 1.2 % de los pacientes analizados. Por tanto, los datos obtenidos son un

parámetro a evaluar por parte del médico para cambio en la estrategia de tratamiento en los pacientes

que presenten mutaciones de resistencia. Además este estudio permitió conocer las características

genéticas de población guatemalteca con Leucemia Mieloide Crónica, determinando la incidencia de

esta mutación en nuestra población.

Palabras clave: leucemia mieloide crónica, inhibidores tirosin kinasa, mutación T315I

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ABSTRACT

The advent of drugs at the molecular level as tyrosine kinase inhibitors (Imatinib, Nilotinib

and Dasatinib); mark a new stage in the era of cancer treatment. Chronic myeloid leukemia is a cancer

disease, which has a main molecular feature: 90% of patients have the t (9; 22), which produces the

BCR-ABL1 chimeric gene. The three tyrosine kinase inhibitors that are currently on the market are

specific treatments for BCR-ABL1 positive patients. However globally, it has been found that 20-

30% of patients treated with this kind of treatment show resistance to it. And the main cause of

resistance that has been found is the presence of point mutations in the BCR-ABL1 chimeric gene.

In Guatemala some researches has been found that approximately 35% of patients are not

responding well to treatment with inhibitors tyrosine kinases and the cause is not known. The T315I

mutation in the BCR-ABL gene generates the most aggressive resistance that has been reported to

tyrosine kinase inhibitors; include the three inhibitors that are currently available in Guatemala;

leaving as the only option a bone marrow transplantation for treatment. Therefore in this study, main

objective was to detect the presence of the T315I mutation in the BCR-ABL1 gene in patients who

have not achieved an optimal response; this in order to determine the possible resistance to Imatinib,

Nilotinib and Dasatinib.

We found the existence of mutations that generates resistance to tyrosine kinase inhibitors in

11% of the study group. The G250E mutation was the most common (6.0%); while the T315I mutation

was present in 1.2% of patients analyzed. Therefore, the data is a parameter to be evaluated by the

doctor to change the treatment strategy in patients who develop resistance mutations. Furthermore,

this study allowed us to know the genetic characteristics of Guatemalan population with chronic

myeloid leukemia, determining the incidence of this mutation in our population.

Key Words: Chronic Myeloid Leukemia, tyrosine kinase inhibitors, T315I mutation

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BREVE BIOGRAFÍA ACADÉMICA DE LOS AUTORES

1. Claudia Lorena Carranza, PhD. Biología Molecular:

En el año de 2004 se gradúo con honores de la licenciatura en Química Bilógica en la

Universidad de San Carlos de Guatemala.

En el período 2005-2007 cursó el programa de Doctorado en Biología Molecular y Celular,

especializado en Genética en el Centro de Investigación Médica Aplicada –CIMA–, de la

Universidad de Navarra, en Pamplona España.

En el año 2008, se incorpora en el Instituto de Investigación Científica y Educación acerca de

las Enfermedades Genéticas y Metabólicas - INVEGEM - , el primer centro de investigación

en Genética en Guatemala; donde labora actualmente como Directora Científica.

Durante el período 2011-2012 cursa el Master en Bioética de la Universidad del Itsmo de

Guatemala, graduándose en el año 2013.

2. Luisa Rosales, Br.:

Pensum cerrado de la carrera de Química Biológica, de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala, egresada en el 2012.

Desde el año 2013 hasta la fecha ha laborado en varios proyectos de investigación

relacionados con enfermedades hemato-oncológicas ejecutados por el Instituto de

Investigación Científica y Educación acerca de las Enfermedades Genéticas y Metabólicas -

INVEGEM – como investigadora científica.

3. Lda. Mariana Herrera, Q.B.:

En el año de 2012 se gradúo de Química Bióloga en la Universidad de San Carlos de

Guatemala. Posee pensum cerrado de la Maestría en Microbiología de las Enfermedades

Infecciosas de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos

de Guatemala.

Desde el año 2013 a la fecha labora como investigadora científica del Instituto de Investigación

Científica y Educación acerca de las Enfermedades Genéticas y Metabólicas - INVEGEM - ,

participando en diferentes proyectos de investigación en genética humana.

vii

ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... ix

LISTA DE TABLAS ........................................................................................................... xi

LISTADO DE FOTOGRAFÍAS ........................................................................................ xi

LISTADO DE GRAFICAS ................................................................................................ xi

GLOSARIO ........................................................................................................................ xii

RESUMEN ........................................................................................................................ xiii

SUMMARY (ABSTRACT) .............................................................................................. xiv

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1

I. 2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................. 3

I.2.1 Antecedentes en Guatemala ............................................................................... 3

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación .......................................................... 4

I. 3 OBJETIVOS ............................................................................................................. 5

I.3.1 General ............................................................................................................... 5

I.3.2 Específicos ......................................................................................................... 5

I.3.3 Hipótesis ........................................................................................................... 5

I. 4 METODOLOGÍA .................................................................................................... 6

1.4.1 Localización ...................................................................................................... 6

1.4.2 Variables ........................................................................................................... 6

1.4.3 Indicadores ....................................................................................................... 6

1.4.4 Estrategia Metodológica ................................................................................... 6

1.4.5 Método ............................................................................................................. 7

1.4.6 Técnica Estadística ......................................................................................... 11

1.4.7 Instrumentos a utilizar .................................................................................... 12

viii

PARTE II

II.1 MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 13

PARTE III

III. 1 RESULTADOS .................................................................................................. 29

III. 2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ...................................................................... 36

PARTE IV

IV. 1 CONCLUSIONES .............................................................................................. 41

IV. 2 RECOMENDACIONES ................................................................................... 42

IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 43

IV. 4 ANEXOS ........................................................................................................... 47

Anexo 1: Consentimiento informado ...................................................................... 47

Anexo 2: Ficha de recolección de datos .................................................................. 51

Anexo 3: Guía para la interpretación de resultados ................................................ 52

Anexo 4: Listado de pacientes y resultados obtenidos ........................................... 53

Anexo 5: Procedimiento de estandarización de muestras ........................................ 56

Anexo 6: PCR de amplificación BCR-ABL en pacientes con LMC ....................... 58

Anexo 7: Electroferograma de pacientes negativos para mutaciones ...................... 63

Anexo 8: Actividades de divulgación de los resultados del proyecto ...................... 89

PARTE V

V. 1 INFORME FINANCIERO ................................................................................ 93

ix

LISTADO DE FIGURAS

Figura No. 1: Frote de Sangre periférica con presencia de blastos ................................ 15

Figura No. 2: Análisis citogenético realizado a pacientes con sospecha de LMC .......... 15

Figura No. 3: Frote de médula ósea de un paciente con LMC ........................................ 16

Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR ........... 17

Figura No. 5: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR ............... 18

Figura No. 6: Ruta de señalamiento activada por BCR-ABL ........................................ 21

Figura No. 7: Estructura química de los principales inhibidores tirosin kinasas. ........... 23

Figura No. 8: Estructura química 3D de los principales inhibidores tirosin kinasas. ..... 24

Figura No. 9: Mecanismo de inhibición de la mutación T315I ..................................... 27

Figura No. 10: Electroferograma que muestra la mutación T315I ................................. 32

Figura No.11: Electroferograma que muestra las mutaciones G250E ........................... 32

Figura 12: Electroferograma que muestra las mutaciones G250E + E453K ................. 33

Figura 13: Electroferograma que muestra la mutación E279K ...................................... 34

Figura 14: Electroferograma que muestra la mutación F23V ........................................ 34

Figura 15: Valores de escala internacional de BCR-ABL. ............................................. 37

Figura 16: Agrupación de la mutación del gen BCR-ABL1, según dominio ................. 38

Figura 17: Sensibilidad de TKI según la mutación en BCR-ABL encontrada ............... 39

Figura 18: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 63








x




















Figura 45: Conmemoración día internacional de la LMC 2013 ...................................... 89

Figura 46: Conmemoración día internacional de la LMC 2015 ...................................... 90

Figura 47: Póster Científico FODECYT 46-2013 ........................................................... 91

Figura 48: Presentación de póster y conferencia. ............................................................ 92

xi

INDICE DE TABLAS

Tabla No. 1: Evaluación de la respuesta al tratamiento con Imatinib ................................ 25

Tabla No. 2: Mutaciones frecuentes en BCR-ABL ........................................................... 27

Tabla No.3: Respuesta al Imatinib en pacientes analizados FODECYT 24-2010 .............. 28

Tabla No. 4: Respuesta al Imatinib en el monitoreo molecular FODECYT 24-2010 ......... 28

Tabla No. 5: Características médicas de los pacientes con LMC evaluados ....................... 30

Tabla No. 6: Valores de % IS de los pacientes incluidos en este estudio ........................... 31

Tabla No.7: Características moleculares y clínicas de los pacientes con mutaciones en BCR-ABL .. 35

Tabla No. 8: Listado de pacientes y resultados obtenidos en el proyecto ............................ 53

LISTADO DE FOTOGRAFÍAS

Fotografía No. 1: Estandarización de PCR para dominio tirosin quinsa de BCR-ABL.. 56

Fotografía No. 2: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1 ........ 58





LISTADO DE GRAFICOS

Grafica No. 1: TKI utilizado como terapia según el centro de asistencia médica ........... 29

Grafica No. 2: Porcentaje de mutaciones de resistencia a TKI encontradas ................... 31

xii

GLOSARIO

BCR-ABL 1: Oncogen de fusión producido por la translocación del cromosoma 9 y 22

(cromosoma Philadelfia); presente en el 90 % de los pacientes con Leucemia Mieloide

Crónica.

Inibidor Tirosin Kinasa (TKI): Fármacos de nueva generación diseñados por computadora

para actuar sobre dianas moleculares específicas (proteínas tirosin quinasas). Son empleados

para el tratamiento de cáncer, ya que eliminan gradualmente las células con la proteína diana

(oncogénicas) sin afectar las células normales. En Guatemala existen tres inhibidores

disponibles: Imatinib, Dasatinib y Nilotinib.

Leucemia Mieloide Crónica: La leucemia mieloide crónica (LMC) es un síndrome

mieloproliferativo crónico de naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial

común a las tres series hematopoyéticas.

Translocación: Es el intercambio de un segmento o fracción entre dos cromosomas no

homólogos. Una translocación ocurre cuando una región cromosómica (brazo o segmento)

cambia de posición en el genoma, pero el número de copias de dicha región se mantiene.

xiii

RESUMEN

El advenimiento de medicamentos a nivel molecular como los inhibidores tirosin kinasas

(Imatinib, Nilotinib y Dasatinib); marcan una nueva etapa en la era de tratamiento en cáncer. La

leucemia mieloide crónica es una enfermedad cancerosa, que posee una característica molecular

principal: el 90% de los pacientes tienen la t(9;22), que produce el gen quimérico BCR-ABL1. Los

tres inhibidores tirosin kinasas que actualmente se encuentran en el mercado son tratamientos

específicos para los pacientes BCR-ABL1 positivos. Sin embargo a nivel mundial, se ha visto que un

20-30% de pacientes tratados con este tipo de tratamiento, muestran resistencia al mismo. Y la

principal causa de resistencia que se ha encontrado es la presencia de mutaciones en el gen quimérico

BCR-ABL1.

En Guatemala se ha encontrado aproximadamente un 35% de pacientes que no están

respondiendo bien al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas y no se sabe la causa. La mutación

T315I en el gen BCR-ABL es la mutación más agresiva que se ha reportado en la resistencia a los

inhibidores tirosin kinasas; ya que es resistente a los tres inhibidores que se encuentran disponibles

actualmente en el mercado; dejando como única opción el trasplante de médula ósea. Por esta razón

en el presente estudio, se tuvo como objetivo principal detectar la presencia de la mutación T315I en

el gen BCR-ABL1 en pacientes que no han alcanzado una respuesta óptima; esto con el fin de

determinar la posible resistencia a Imatinib, Nilotinib y Dasatinib.

Se determinó la existencia de mutaciones de resistencia a inhibidores tirosin kinasa en 11 % del

grupo de estudio. La mutación G250E fue la más frecuente (6.0 %); mientras que la mutación T315I

estuvo presente en 1.2 % de los pacientes analizados. Por tanto, los datos obtenidos son un parámetro

a evaluar por parte del médico para cambio en la estrategia de tratamiento en los pacientes que

presenten mutaciones de resistencia. Además este estudio permitió conocer las características

genéticas de población guatemalteca con Leucemia Mieloide Crónica, determinando la incidencia de

mutaciones en nuestra población.

Palabras clave: leucemia mieloide crónica, inhibidores tirosin kinasa, mutación T315I

xiv

ABSTRACT

The advent of drugs at the molecular level as tyrosine kinase inhibitors (Imatinib, Nilotinib

and Dasatinib); mark a new stage in the era of cancer treatment. Chronic myeloid leukemia is a cancer

disease, which has a main molecular feature: 90% of patients have the t (9; 22), which produces the

BCR-ABL1 chimeric gene. The three tyrosine kinase inhibitors that are currently on the market are

specific treatments for BCR-ABL1 positive patients. However globally, it has been found that 20-

30% of patients treated with this kind of treatment show resistance to it. And the main cause of

resistance that has been found is the presence of point mutations in the BCR-ABL1 chimeric gene.

In Guatemala some researches has been found that approximately 35% of patients are not

responding well to treatment with inhibitors tyrosine kinases and the cause is not known. The T315I

mutation in the BCR-ABL gene generates the most aggressive resistance that has been reported to

tyrosine kinase inhibitors; include the three inhibitors that are currently available in Guatemala;

leaving as the only option a bone marrow transplantation for treatment. Therefore in this study, main

objective was to detect the presence of the T315I mutation in the BCR-ABL1 gene in patients who

have not achieved an optimal response; this in order to determine the possible resistance to Imatinib,

Nilotinib and Dasatinib.

We found the existence of mutations that generates resistance to tyrosine kinase inhibitors in

11% of the study group. The G250E mutation was the most common (6.0%); while the T315I mutation

was present in 1.2% of patients analyzed. Therefore, the data is a parameter to be evaluated by the

doctor to change the treatment strategy in patients who develop resistance mutations. Furthermore,

this study allowed us to know the genetic characteristics of Guatemalan population with chronic

myeloid leukemia, determining the incidence of this mutation in our population.

Key Words: Chronic Myeloid Leukemia, tyrosine kinase inhibitors, T315I mutation

1

PARTE I

I. 1 INTRODUCCIÓN

La genética y la biología molecular son ciencias que han avanzado a pasos gigantes en la

última década, constituyéndose en una herramienta vital para el manejo integral de los distintos

procesos cancerosos.

Actualmente, en países desarrollados se realizan técnicas genéticas y moleculares para

mejorar un diagnóstico, para establecer el pronóstico, para seleccionar el tipo de terapia a prescribir

y para el monitoreo del tratamiento recibido por cada paciente.

En Guatemala, se ha iniciado con una serie de proyectos de investigación, que van

abarcando poco a poco las necesidades actuales de la medicina a nivel molecular y genético.

La leucemia mieloide crónica es una afección hematológica, que se caracteriza por un desbalance en

los procesos de división, diferenciación y apoptosis celular. Esto se produce por alteraciones en

genes que regulan estos procesos celulares. La principal alteración genética encontrada en esta

enfermedad es la presencia de la translocación t(9;22); la cual produce un gen quimérico llamado

BCR-ABL1. Este gen quimérico se convierte en un gen tirosin kinasa activo de manera constitutiva,

es decir no regulada; transmitiendo señales que alteran el desarrollo celular.

En la industria farmacéutica, se han desarrollado un tipo de medicamentos que son

específicos para el gen BCR-ABL1, llamados de manera global: inhibidores tirosin kinasa.

Actualmente, el Imatinib, Nilotinib y Dasatinib son los tres medicamentos de este tipo que se

encuentran en el mercado.

El Imatinib es el medicamento de primera línea para tratar la leucemia mieloide crónica;

cuando hay fallo de este tratamiento, se cambia a Nilotinib y Dasatinib, que son medicamentos de

segunda línea.

Se ha visto que la causa principal de la resistencia a este tipo de fármacos, es la presencia

de mutaciones en el gen BCR-ABL1, que impiden la unión del medicamento con su diana específica.

2

La mutación T315I, es la más agresiva que se ha reportado, y además los pacientes que la presentan

son resistentes a todos los inhibidores tirosin kinasas que se encuentran el mercado. Es decir que a

los pacientes que presenten este tipo de mutación, se les debiera suspender el tratamiento con

inhibidores tirosin kinasas, ya que son resistentes a los mismos; y debieran de ser tratados con

terapias alternativas.

En el presente proyecto de investigación, se tuvo como objetivo general la detección de la

presencia de la mutación T315I en pacientes con leucemia mieloide crónica que muestran resistencia

al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas; para poder apoyar el médico hematólogo en la

estrategia terapéutica ideal para cada paciente.

3

I. 2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.2.1 Antecedentes en Guatemala

Los inhibidores tirosin kinasas son los primeros medicamentos desarrollados en la era

molecular, cuya diana es un gen quimérico llamado BCR-ABL1, y que se encuentra en un 90%

en leucemia mieloide crónica (LMC). Un alto porcentaje de los pacientes con LMC, responden

muy bien a este tipo de medicamentos, y sin efectos secundarios severos como ocurre cuando esta

enfermedad se trata solo con quimioterapia. Una respuesta óptima a este tipo de inhibidores, se

define cuando el paciente alcanza una respuesta molecular mayor (< 0.1% IS BCR-ABL1/ABL)

en un período menor o igual a 18 meses. Si un paciente no logra alcanzar la respuesta molecular

mayor en este período; se dice que hay un fallo de terapia; y este fallo de terapia se debe

principalmente a presencia de mutaciones en el gen BCR-ABL1, que provocan una respuesta muy

pobre al tratamiento; siendo la mutación más agresiva la T315I. En Guatemala, no se han

estudiado las causas de la resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en los

pacientes con leucemia mieloide crónica BCR-ABL1 positivo.

La importancia de determinar la mutación T315I en estos pacientes, radica en que los

pacientes positivos para esta mutación, son resistentes a todos los inhibidores tirosin kinasas. Por

lo que el hematólogo, debe cambiar de estrategia terapéutica en los pacientes que sean positivos

para la mutación T315I.

En países desarrollados, se realiza la detección de mutaciones en el gen BCR-ABL1 como

una prueba de rutina para determinar la resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas.

En Guatemala no se han estudiado con anterioridad las causas de la resistencia al tratamiento con

inhibidores tirosin kinasas en pacientes con leucemia mieloide crónica BCR-ABL1 positivo. Y

por esta razón la sugerencia de cambio de terapia, se hace sólo basado en datos clínicos, aunque

la indicación sea determinar la presencia de mutaciones en el gen quimérico BCR-ABL1. La

detección de estas mutaciones confirmaría la resistencia al tratamiento, e indicarían el nuevo

tratamiento a elegir.

En un estudio co-financiado por SENACYT (proyecto FODECYT 24-2010) se realizó un

estudio piloto para el monitoreo molecular de las copias de BCR-ABL1 en pacientes con leucemia

4

mieloide crónica, y se determinó que aproximadamente un 35% del total de pacientes analizados

poseen fallo de respuesta a la terapia con inhibidores tirosin kinasas, este grupo es el candidato

para estudiar la presencia de la mutación T315I.

1.2.2 Justificación del trabajo de investigación

En Guatemala, aproximadamente el 35% de pacientes con leucemia mieloide crónica; no

alcanzan la respuesta molecular mayor en 18 meses; por lo que se clasifican como un fallo de

respuesta al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas. El costo de estos medicamentos oscila

entre Q. 30,000.00 a Q. 50,000.00, y actualmente todos los pacientes BCR-ABL1 positivos en

Guatemala, se encuentran recibiendo este tipo de tratamientos, sin importar si son resistentes o

sensibles al mismo.

Este 35% de pacientes que no responden adecuadamente al tratamiento, son candidatos

para evaluar la presencia de la mutación T315I; y de esta manera determinar a nivel de biología

molecular la resistencia a los medicamentos, y evitar la administración de los mismos a los

pacientes resistentes; esto conllevará a una reducción de costos económicos que actualmente están

siendo cubiertos por el seguro social y algunas fundaciones.

La determinación de la mutación T315I, sirve como un indicador para determinar esta

resistencia; y además de parámetro para descontinuar el uso de los inhibidores tirosin kinasas en

los pacientes resistentes.

Por otro lado, la detección de la frecuencia de la mutación T315I en la población

guatemalteca; por lo que los resultados obtenidos permiten continuar la caracterización genética

de los tumores hematológicos en nuestra población. Esto será un aporte a nivel nacional e

internacional, pues se conoce parte de la genética de la leucemia mieloide crónica en Guatemala;

y con ello es posible realizar comparaciones con lo publicado en el resto de países.

5

I. 3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

1.3.1 Objetivo General:

Detectar y evaluar la presencia de la mutación T315I en el gen quimérico BCR-ABL1,

como causa de resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en pacientes con

leucemia mieloide crónica.

1.3.2 Objetivos Específicos:

1.3.2.1. Detectar y evaluar la presencia de la mutación T315I en el gen quimérico BCR-

ABL1, como causa de resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en

pacientes con leucemia mieloide crónica.

1.3.2.2. Establecer la frecuencia de la mutación T315I en el gen quimérico BCR-ABL1 en

la población guatemalteca.

1.3.2.3. Determinar y evaluar la resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en

pacientes que presenten mutación T315I en el gen BCR-ABL1.

1.3.2.4. Orientar al médico a otro tipo de estrategia terapéutica, en los pacientes con

resistencia a los inhibidores tirosin kinasas.

1.3.2.5 Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su

competencia la información obtenida de la investigación.

1.3.3 Hipótesis

El presente proyecto de investigación es un estudio de carácter descriptivo, en el que

se determinará en Guatemala la frecuencia de la mutación T315I y se evaluará su presencia

en pacientes con fallo a terapia o respuesta subóptima a los inhibidores tirosin kinasas; por

lo tanto carece de hipótesis estadística.

6

I. 4 METODOLOGÍA

1.4.1 Localización:

La población objetivo de este estudio la integraron todos los pacientes con diagnóstico

clínico de leucemia mieloide crónica, y que reciben tratamiento con inhibidores tirosin

kinasas, y según análisis molecular han presentado fallo de terapia o respuesta sub-optima;

sin importar la edad.

La localización geográfica, será a nivel nacional; ya que todos los pacientes del país son

referidos a la ciudad capital; y se encuentran en el seguro social o son miembros de la

Asociación de Pacientes con Leucemia Mieloide Crónica –ASOPALEU-.

1.4.2 Variables:

1.4.2.1 Variables dependientes: no aplica a este estudio por ser descriptivo.

1.4.2.2 Variables independientes: no aplica a este estudio por ser descriptivo.

1.4.3 Indicadores:

El indicador este proyecto fue de tipo cualitativo y consistió en determinar la presencia o

ausencia de mutaciones en el gen quimérico BCR-ABL1. Para ello se evaluaron los

productos de PCR amplificados en las muestras de los pacientes con Leucemia Mieloide

Crónico que evidenciaron una falla terapéutica. Los productos fueron secuenciados por

medio de la técnica de secuenciación de Sanger. Posteriormente se analizó el

cromatograma para determinar la presencia de mutaciones.

1.4.4 Estrategia Metodológica:

1.4.4.1 Población:

La población objetivo de este estudio la integran todos los pacientes con diagnóstico

clínico y de laboratorio de leucemia mieloide crónica que además evidencia un fallo

terapeútico por medio de pruebas hematológicas o monitoreo molecular sin importar

la edad.

7

1.4.4.2 Muestra:

Pacientes con diagnóstico de Leucemia mieloide crónica, con tratamiento con

inhibidores tirosin kinasas, referido por ASOPALEU (que atiende pacientes del Hospital

General San Juan de Dios y Roosevelt) y por Instituto de Seguridad Social –IGSS-.

Actualmente se tienen aproximadamente 150 pacientes en tratamiento, y se sabe que un

35% son resistentes, según lo reportado en la literatura; por esta razón se espera una

muestra aproximada de 50 pacientes.

1.4.5 El Método:

1.4.5.1 Materiales y suministros de laboratorio:

Guantes de nitrilo libres de polvo.

Puntas de pipeta desechables PCR clean de volúmenes variables.

Pipetas de Pasteur de plástico

Liga de hule.

Agujas Vacutainer 21 x 1 ½ G.

Camisa para Vacutainer.

Tubos Vacutainer de tapón morado (EDTAK2) con capacidad de 4 cc al vacío.

Jeringas con aguja 21 x 1 ½ G.

Papel mayordomo.

Algodón.

Fichas de recolección de datos.

Hojas de consentimiento informado.

Marcador indeleble negro.

Gradillas cooler.

Tubos PCR clean de 0.2, 0.6 y 1.6 mL

Guardianes para el descarte de material punzocortantes.

Papel parafilm

1.4.5.2 Reactivos:

A. Lisis diferencial de eritrocitos:

Bicarbonato de sodio

8

Cloruro de amonio

EDTA

Ácido clorhídrico

Hidróxido de sodio.

Etanol 70 %

Hipoclorito de sodio 5%

Solución salina fisiológica 9 %

B. Extracción de ARN con TRIZOL:

RNAsezap

Trizol

Isopropanol

Etanol 75 %

Agua DPC

Cloroformo

C. RT-PCR:

Kit de retrotranscripción de alta capacidad Applied Biosystems

H2O DEPC

D. PCR convencional:

Kit de amplificación (DNA polimerasa, buffer 10X, MgCl2)

Deoxinucleótidos, 10 mM

Primers específicos de detección (300 picomoles)

H2O DEPC

E. Electroforesis y tinción de geles:

Agarosa LE

Buffer TAE 1x (Tris Base, EDTA, ácido acético)

Gel Red 10,000X en H2O

9

1.4.5.3 Procedimientos de laboratorio:

A. Muestra biológica:

Se utilizaron muestras sangre periférica de pacientes con diagnóstico confirmado de

Leucemia Mieloide Crónica y tratamiento con algún inhibidor tirosin kinasa por más

de 18 meses. Las muestras fueron referidas de los de los distintos hospitales

nacionales, durante el período de dos años correspondientes a febrero 2014 hasta

diciembre 2015. La recolección de las muestras se realizó posteriormente a la firma

del consentimiento informado y aceptación de los pacientes y/o encargados (en caso

de menores) a participar en el estudio (Ver Anexo 1). Además se llenó una ficha

estándar para recolectar datos de interés del estudio (Ver Anexo 2)

Las muestras fueron recolectadas mediante flebotomía y se recolectaron entre 5 y 15

cm3 de sangre venosa periférica. Las muestras fueron recolectadas en tubos con

EDTA y almacenadas a 4 °C por un período máximo de 24 horas hasta su

procesamiento.

B. Obtención de glóbulos blancos por lisis diferencial de eritrocitos:

La forma bicóncava de los eritrocitos, hace su membrana particularmente sensible a

cambios de osmolaridad; y ésta característica permite hacer una lisis diferencial para

obtener células blancas mediante el uso de soluciones de alta osmolaridad con cloruro

de amonio.

C. Extracción de ARN con TRIZOL:

El RNA total se extrajo utilizando Trizol comercial (INVITROGEN, USA) a partir

de las suspensiones de leucocitos obtenidos en el proceso anterior. El procedimiento

fue realizado según las indicaciones de fabricante (Invitrogen Life Technologies,

Carlsbad, CA).

D. RT-qPCR para la evaluación de enfermedad mínima residual y monitoreo de terapia:

La evaluación de enfermedad mínima residual se realizó utilizando una cuantificación

relativa del gen BRC-ABL por medio de PCR tiempo real utilizando los kits

10

comerciales SuperScript® III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA

Polymerase y MolecularMD® One-Step qRT-PCR BCR-ABL Kit en el equipo 7500

Fast Real-Time PCR Systems de Applied Biosystems; según las instrucciones del

fabricante. Después de obtener los resultados del monitoreo de terapia se evaluaron

todos los pacientes con un valor de escala internacional (% IS) superior a 0.01 % y

más de 18 meses de tratamiento. Se incluyeron además pacientes con menor tiempo

de tratamiento pero una alta sospecha médica de resistencia a inhibidores tirosin

quinasa.

.

E. Retrotranscripción:

Para la síntesis de cDNA se utilizó 1µg de RNA extraído y se utilizó el Kit comercial

de Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, que utiliza

hexámeros al azar para la síntesis en 20µl de reacción en condiciones estándar.

F. Amplificación del dominio Tirosin kinasa del gen BCR-ABL1:

Se realizara un RT-PCR seminested para la amplificación. Los primers utilizados

fueron los descritos por Bradford y Hughes (2006) bajo las condiciones establecidas

por los mismos autores. En este proceso se obtuvo un fragmento de 863 pb

correspondiente al dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL1 [29].

G. Electroforesis en gel de agarosa:

Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa

al 2 %, después de la tinción por 25 minutos con GelRed 2 X. La presencia del

transcrito fue comprobada con la visualización de fragmentos de 1504 y 1579 pb

(primera reacción) y 863 pb (segunda reacción) correspondientes a la presencia del

dominio tirosin kinasa del transcrito BCR-ABL1.

H. Secuenciación de Sanger y análisis de resultados:

Los productos amplificados por medio de PCR fueron purificados por medio del kit

comercial Spin Prep PCR Clean Up (EMD Millipore, Billerica, MA) y fueron

enviados para secuenciación de Sanger a MACROGEN (Macrogen, Rockville, MD).

11

Los electroferogramas fueron analizados utilizando el software GENEIOUS R6

(Auckland, New Zeland).

Los resultados fueron enviados al médico tratante acompañado de la información

correspondiente (Anexo 3), para orientar al cambio de TKI o mantenimiento de la

terapia actual.

1.4.5.4 Consideraciones éticas:

Se solicitó mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de los

pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su ejecución,

en el caso de los menores de edad, el encargado responsable del paciente debió aceptar el

consentimiento (Anexo 1). Además el presente estudio fue sometido a un comité de

bioética asociado a la institución.

1.4.6 La Técnica Estadística:

1.4.6.1 Tipo de estudio:

El estudio realizado fue de tipo descriptivo longitudinal prospectivo, ya que se estableció

la frecuencia de la mutación T315I en Guatemala; fue longitudinal y prospectivo ya que

se ejecutó durante 21 meses en el período de enero del 2014 hasta diciembre 2015.

1.4.6.2 Diseño estadístico:

Las variables sociodemográficas y hematológicas fueron recolectadas mediante una

ficha de recolección de datos (Anexo 2).

Las variables obtenidas a través de la ficha de datos fueron tabuladas a de una base de

datos creada en el programa Excell, en el que se realizó el análisis.

Estadística descriptiva general de la muestra en el programa estadístico Excell.

Las variables cuantitativas se analizaron en base a la mediana de la muestra.

12

1.4.7 Instrumentos a utilizar:

Durante la parte experimental de este proyecto, se utilizó una gran diversidad de equipo de

laboratorio y análisis:

Refrigeradora.

Pipetas automáticas de volumen variable de 1.0 – 10.0 μL

Pipetas automáticas de volumen variable de 10 – 100 μL

Pipetas automáticas de volumen variable de 100 – 1000 μL

Centrífuga.

Autoclave.

Cabina de seguridad biológica tipo II.

Balanza analítica.

Termociclador

Vórtex

Congelador -20 °C

Potenciómetro.

13

PARTE II

II. 1 MARCO TEÓRICO

A. Aplicación de las técnicas citogenéticas y moleculares en el estudio del cáncer

El cáncer es una enfermedad en la que se produce un crecimiento desordenado de un

clon celular, debido a una alteración en el proceso de crecimiento celular, en la diferenciación

celular o en la apoptosis celular. Es una enfermedad considerada de origen genético

adquirido; esto quiere decir que su causa son las distintas alteraciones genéticas que se han

desarrollado y adquirido con el transcurso del tiempo.

Las principales técnicas que actualmente se utilizan para el diagnóstico, pronóstico y

monitoreo de las neoplasias son las técnicas citogenéticas y moleculares. Las técnicas de

análisis citogenético permiten estudiar de manera global los 46 cromosomas, y detectar

cualquier alteración presente. Estas técnicas se han desarrollado mejor en neoplasias

hematológicas debido a la facilidad de obtención de metafases en tejidos líquidos. En

neoplasias sólidas se tiene la dificultad de obtención de metafases adecuadas, por lo que la

utilidad de las técnicas citogenéticas es limitada.

Las técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa –

PCR- y sus distintas variedades, se han desarrollado también ampliamente para el estudio de

distintas neoplasias. Sin embargo estas técnicas no son pruebas de screening, por lo que se

necesita conocer específicamente la alteración genética que se desea estudiar. Entre las

ventajas de las técnicas moleculares sobre las citogenéticas es que poseen una mayor

sensibilidad y especificidad.

En el estudio de neoplasias hematológicas es posible la aplicación de métodos de

biología molecular por medio de la detección de transcritos (mRNA de una sección genética

especifica). Estas técnicas son de gran utilidad para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo

de la enfermedad mínima residual (EMR) y, por tanto, ayudan en las decisiones clínicas para

definir nuevas estrategias terapéuticas que favorezcan la disminución de la actividad

oncogénica [11].

14

En resumen, para un estudio genético completo de una neoplasia hematológica y

algunos tumores sólidos se recomienda utilizar tanto las técnicas citogenéticas como las

moleculares [11].

B. Neoplasias Hematológicas:

Las neoplasias hematológicas forman un grupo de enfermedades que provienen de la

expansión clonal de células hematopoyéticas. La leucemia constituye una colección

heterogénea de neoplasias originadas en el tejido formador de sangre, que se caracteriza por

la expansión clonal de células hematopoyéticas como resultado de una alteración en los

mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte celular, en cualquiera de las etapas de

maduración de las células sanguíneas, habitualmente acompañada de la invasión al torrente

sanguíneo y producción de metástasis, con mayor o menor grado de desorganización de los

tejidos invadidos [11,12].

Las leucemias se clasifican basándose en el tipo de células afectadas y en su estado

de maduración. Las agudas se caracterizan por la presencia de células muy inmaduras

(denominadas blastos) y por un curso rápidamente mortal. Las crónicas se caracterizan por

una población expandida de células que proliferan y que conservan su capacidad para

diferenciarse y madurar. Se distinguen dos variantes: linfocíticas y mielocíticas. Así pues de

forma rudimentaria las leucemias se pueden clasificar en cuatro tipos: leucemia linfocítica

aguda (linfoblástica) (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica aguda

(mieloblástica) (LMA) y leucemia mielocítica crónica (LMC) [11,12].

El diagnóstico se realiza, considerando, además de las manifestaciones clínicas,

estudios de laboratorio que incluyen hemograma, frotis de sangre periférica, inmunofenotipo,

biopsia y el frotis de médula ósea (Ver figura No. 1). En la actualidad la tinción con

inmunohistoquímica de células malignas en sangre periférica, es uno de los métodos más

específicos para clasificar las leucemias por lo cual se recomienda realizar este procedimiento

en todo paciente con esta enfermedad, al igual que el seguimiento de un protocolo que

combine la citomorfología y citoquímica con el inmunofenotipo, y siempre que sea posible

acompañado por métodos citogenéticos y moleculares permitiendo con ello no solo un

15

diagnóstico certero, sino que además proporcionar una amplia información sobre el

pronóstico del paciente y el tratamiento a seguir (Ver figura No. 2) [11,12].

Figura No. 1: Frote de Sangre Periférica con presencia de Blastos

Fuente: fuente:www.telmed.org

Figura No. 2: Análisis Citogenético, realizado en pacientes con sospecha de

Leucemia Mieloide Crónica

Fuente: www.telmed.org

http://www.telmed.org/

16

C. Leucemia Mieloide Crónica:

La leucemia mieloide crónica (LMC) es un síndrome mieloproliferativo crónico de

naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial común a las tres series

hematopoyéticas (Ver figura No. 3). Representa entre el 15% y el 20% del total de leucemias

y su incidencia en los países occidentales se ha estimado en 1,6 casos por cada 100.000

habitantes/año [12-18].

La LMC fue la primera enfermedad en la que se determinó una anormalidad genética

en el cariotipo, denominada cromosoma filadelfia, el cual se asoció en gran medida a la

patogenia de dicha leucemia. El cromosoma filadelfia, es el resultado de la translocación

entre los cromosomas 9 y 22, esta translocación genera la fusión de los genes BCR-ABL1;

esta reordenación se encuentra en el 90% de los pacientes con LMC. Sin embargo a pesar de

que el cromosoma filadelfia existe como única anormalidad cromosómica a través de la fase

crónica de la enfermedad y se mantiene también durante las fases avanzadas, entre el 50 y 80

% de los pacientes adquieren anormalidades cromosómicas adicionales, desarrollando

cariotipos complejos que incluyen trisomía 8, trisomía 19, isocromosoma 17 y copias

adicionales distintos cromosomas [18-19].

Figura No. 3: Frote de Médula Ósea de un paciente con LMC.

Fuente: www.telmed.org

17

D. Reordenamiento de BCR-ABL:

La fusión génica BCR-AB1L resulta de la formación del cromosoma Filadelfia, en la

que ocurre la translocación de la región q11 del cromosoma 22 (BCR) a la región q34 del

cromosoma 9 (ABL1) (Ver Figura No.4) [19].

Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR

Tomado de: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384

El gen ABL1 localizado en el cromosoma 9q, es el homólogo humano del oncogen v-

abl1 del virus de la leucemia murina y codifica para un receptor de tirosina cinasa. La

proteína normal ABL1 está involucrada en la regulación del ciclo celular, en la respuesta al

estrés genotóxico y en la transmisión de información acerca del ambiente celular a través de

la señalización mediada por las integrinas. Al parecer la proteína ABL1 tiene un complejo

papel como modulador celular que integra las señales del ambiente extracelular e intracelular

e influye en las decisiones para mantener el ciclo celular y la apoptosis [19-22].

El gen BCR, se localiza en la región q34 del cromosoma 22. La proteína BCR está

presente en varios tejidos y aunque existen datos que apoyan la hipótesis de que BCR

participa en la transducción de señales, su verdadero papel permanece sin ser determinado

[19-22].

A nivel molecular, la t(9;22) resulta en una fusión cabeza-cola de los genes BCR y

ABL1 cuando parte del gen ABL1 localizado en el cromosoma 9 es transferida e insertada

dentro del gen BCR del cromosoma 22, originando el transcrito de fusión del gen quimérico

33´ BCR

22q11

ABL9q34

5´BCR

3´BCR

5´BCR

ABL

9 22 der(9) der(22)

18

BCR-ABL1, mismo que codifica para una proteína que aumenta la actividad tirosina kinasa

con potencial neoplásico [19-22].

El oncogén quimérico BCR-ABL1 lleva a la síntesis de proteínas de diferente peso

molecular dependiendo de la localización del punto de rotura. Así es posible distinguir tres

nuevas proteínas de fusión (p190BCR-ABL, p210BCR-ABL y p230BCR-ABL). Los puntos de

rupturas más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones 1(e1), 12(b2), 13(b3) y 19(e19)

y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exón 2(a2) [19-23].

Cuando se da la unión de los exones b3a2 y/o b2a2 (Región M-bcr) se codifica para

una proteína de 210kD (p210BCR-ABL) la cual se presenta en el 20% a 40% de los pacientes

con Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) y es característica en más del 95% de pacientes

con leucemia mieloide crónica (LMC); si los exones e1 y e2 son removidos por el corte y

empalme (Región m-bcr) la unión de e1a2 se transcribe en una proteína de 190kD (p190BCR-

ABL) la cual se detecta en el 60% a 80% de los pacientes con LLA y en menos del 10% para

aquellos con LMC. Es posible observar una tercer proteína de fusión próxima a 3’ del

extremo distal del gen BCR denominada p230BCR-ABL, la cual resulta de la fusión de los

exones e19a2 (Región µ-bcr), cuya expresión se asocia a leucemias crónicas neutrofilas y

trombocitosis (Ver figura No. 5) [19-23].

Figura No.5: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR

Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.

19

Tanto la p210 como la p190 presentan una mayor actividad de tirosina Kinasa

comparada con la proteína ABL normal. La proteína BCR-1 fosforila residuos de tirosina de

muchas proteínas celulares y activa diferentes rutas de señalización, lo cual conlleva a la

transformación celular. En modelos experimentales, se ha observado que estas proteínas son

capaces de transformar precursores hematopoyéticos por la activación de señales mitógenas,

inhibición de apoptosis y alteraciones en la adhesión de las células al estroma [19-23].

E. Vías de señalización activadas por BCR-ABL1:

Una consecuencia del incremento de la actividad de la tirosina kinasa radica en que el

BCR-ABL1 puede fosforilar diferentes sustratos, activando múltiples señales de transducción

en las células. Las vías activadas son RAS, vía Fosfatidilinositol-3-cinasa, Jak-Stat, MAPK y

ROS.

1. Vía RAS:

La activación de Ras se poduce por transducción de señales mediadas por receptores

con actividad tirosin cinasas. Una vez realizada la unión al ligando y dimerización, los

receptores tirosin cinasas activados, se unen a moléculas adpatadoras que contiene los

dominios SH2 y SH3 como son Grb-2 y SHC formando complejos de señalización con

factores intercambiadores Ras en la membrana celular. Estos complejos desencadenan

una acumulación de la forma Ras e inducen un efecto antiapoptótico que, aunque sea

insuficiente, es necesario para la transformación derivada de BCR-ABL1. La activación

inapropiada del gen Ras por una mutación del gen, ha demostrado ser una importante

vía de la señal de transducción celular para la proliferación y transformación maligna

de los tumores.

2. Vía Fosfatidilinositol-3-cinasa:

Esta vía funciona en la regulación del metabolismo lipídico fosfoinositídico y en la

generación de segundos mensajeros lipídicos relacionados con la transducción de

señales. Se ha visto que una subunidad de esta proteína se fosforila en residuos tirosina

en células que expresan BCR-ABL y forma complejos con cbl y moléculas adaptadas

20

crk y crkl. PI3 está activado de forma constitutiva por la translocación BCR-ABL

jugando un papel importante en su transformación [19-23].

3. Vía Jak-Stat:

El crecimiento de las células hematopoyéticas normales se controla por citocinas. Los

receptores para estas citocinas traducen señales mediante activación de proteínas

denominadas genéricamente Jak (Janus tirosine kinases), que es una familia de cinasas

citoplasmáticas que fosforilan y activan los factores de transcripción STAT (Signal

Transducer and Activators of transcription), BCR-ABL1 activa constitutivamente las

vías de señalización de JAK y STAT en células hematopoyéticas, siendo STAT 1 y STAT

5 las tirosin-fosforiladas más importantes. La fosforilación constitutiva de factores de

transcripción STAT han sido reportados en líneas celulares positivas BCR-ABL y en

células primarias con LMC, la activación STAT 5 contribuye a la transformación

maligna a pesar de sus funciones pleiotropicas; su efecto en la transformación de

células BCR-ABL parece ser anti-apoptotico e implica la activación trasncripcional de

Bcl-xl. En contraste con la activación de la vía Jak-Stat por medio de estímulos

fisiológicos, BCR-ABL activa directamente STAT 1 y STAT 5 sin previa fosforilación

de proteínas Jak [18-23].

4. Vía MAPK:

Un primer acontecimiento de señalización que sigue a la activación de RAS es la

activación de la vía de señalización de proteínas activadoras de mitogénesis con

actividad cinasa (MAPK). Se conocen claramente tres cascadas de MAPK: la cinasa

regulada extracelularmente (ERK), la vía de las Jun cinasas o cinasas activadas por

estrés (SAPK) y la vía de la p28 cinasa. El punto final para cada una de estas vías es la

fosforilación y activación de transcripción. BCR-ABL y v-ABL activan la vía SAPK en

fibroblastos y células hematopoyéticas. Así mismo activan promotores dependientes

de Jun de manera dependiente de RAS, MEPK y SAPK. Mientras que los efectos de

BCR-ABL en la vía JNK parecen ser claros, estudios de la vía ERK muestran que la

BCR-ABL funciona de manera distinta a la mayoría de los receptores con actividad

tirosincinasa [19-23].

21

5. Vía ROS:

La transformación de las líneas celulares con BCR-ABL presenta un incremento de

ROS, comparado con las líneas celulares no BCR-ABL. Este incremento es suficiente

para la transformación fenotípica en sí misma. Se ha sugerido que ROS podría actuar

como segundo mensajero en la regulación de la actividad de las enzimas sensibles a la

acción de oxidorreducción (redox), como son las cinasas y fosfatasas. La inhibición de

la proteína tirosin fosfatasa (PTPasa) mediante la modulación redox explicaría el

amplio espectro de las actividades biológicas de ROS. Un incremento de ROS amplifica

las señales de BCR-ABL, posiblemente regulando las proteínas redox-sensibles, como

es la PTPasa celular, la cual también está incrementada. También es de particual interés

en la LMC humana, el hecho de que un incremento de ROS pueda tener consecuencias

a largo plazo en la estabilidad genética [19-23].

Figura No. 6: Ruta de señalamiento activada por BCR-ABL

Fuente: Weisberg, E., et al. (2007). Nat. Rev. Cancer, 7(5): 345-356.

22

Los niveles de ROS no sólo son modulados por enzimas, antioxidantes y grupos

sulfhidrilos, sino también reaccionados con las bases del ADN. Aunque las

modificaciones pueden ser corregidas eficientemente por los mecanismos de

reparación de ADN, un incremnto persistente de ROS podría inducir la acumulación

de mutaciones en las células de la LMC, que podría contribuir a la progresión de la

enfermedad (Ver Figura No. 6)

F. Inhibidores Tirosin kinasa (TKI´s):

Los inhibidores tirosin kinasa, son los primeros medicamentos de la era molecular, que

fueron diseñados por computadora; y que además tienen como blanco la proteína de un gen

quimérico (BCR-ABL1). Con estos medicamentos el pronóstico de los pacientes con

leucemia mieloide crónica ha aumentado considerablemente. Aunque todavía no se considera

curativo, ha incrementado la expectativa de vida de estos pacientes, con pocos efectos

secundarios. De hecho estos pacientes pueden hacer una vida normal. El primer medicamento

de esta línea es el Imatinib, y ahora más recientemente el Nilotinib, Dasatinib y Bosutinib

(Ver figura No. 7 y 8) [23-26].

1. Imatinib:

Imatinib fue el primer inhibidor tirosin kinasa desarrollado para el cromosoma

filadelfia en leucemia mieloide crónica. Se considera como medicamento de primera

línea a elegir en pacientes BCR-ABL positivos. Estudios demostraron que con una

dosis de Imatinib de 400 mg. un 88% de pacientes alcanzaron la respuesta

hematológica completa y un 49% la respuesta citogenética completa. El nombre

comercial de este medicamento es GLEEVEC [23,24].

2. Nilotinib:

Nilotinib es 30 veces más potente que el Imatinib, y tiene actividad ante varias

mutaciones que confieren resistencia a Imatinib. Fue aprobado en el año 2007.

3. Dasatinib:

Dasatinib es un inhibidor tirosin kinasa 325 veces más potente que el Imatinib.

Dasatinib cruza la barrera hemato encefálica, a diferencia del Imatinib que no la cruza,

23

y además se une tanto a la conformación activa como la inactiva de BCR-ABL. Este

medicamento fue aprobado en el año 2006 [23,24].

Figura No. 7: Estructura química de los principales inhibidores tirosin kinasas.

Tomado de: Weisberg E, et al. Nat. Rev. Cancer 2007 may;7(5): 345-356.

24

Figura No. 8: Estructura química 3D de los principales inhibidores tirosin kinasas.

Tomado de: Weisberg E, et al. Nat. Rev. Cancer 2007 may;7(5): 345-356.

G. Respuesta al tratamiento con TKI´s:

En el estudio IRIS, la resistencia primaria o fallo para alcanzar la respuesta

citogenética completa se observó en al menos 24% de pacientes después de 18 meses de

haber iniciado el tratamiento. Después de cinco años de tratamiento, la resistencia secundaria

o recaídas se observaron en un 17%.

Cuando hay un fallo a la terapia con Imatinib es imperativo el cambio a terapia de

segunda línea (Nilotinib, Dasatinib y bosutinib); y si hay fallo en estos, se recomienda

realizar un trasplante de médula ósea.

25

El nivel inicial de respuesta al tratamiento es la respuesta hematológica completa; que

se define como la normalización de los conteos celulares en sangre periférica. El siguiente

nivel a alcanzar es la respuesta citogenética completa (CCR). Y por último la respuesta

molecular mayor (MMR) medida por PCR en Tiempo Real.

Se considera fallo del tratamiento cuando la terapia con estos inhibidores ya no es

efectiva al paciente y por lo tanto se recomienda un cambio de tratamiento. Una respuesta

sub-optima indica que a pesar de que el paciente puede seguir obteniendo beneficios estos

medicamentos, a largo plazo va a ser necesario un cambio de tratamiento. El Fallo de

conseguir la MMR dentro de 18 meses del inicio del tratamiento o la pérdida de MMR a

cualquier tiempo indica una respuesta sub-optima [23,24].

En el estudio IRIS, el 68% de los pacientes después de un año de inicio del tratamiento

con Imatinib alcanzaron la CCR; y de estos se detectó MMR en 57%. También en el IRIS,

ningún paciente con CCR y MMR a los 12 meses progreso a una enfermedad avanzada en 5

años (Ver Tabla No. 1) [23,24].

Tabla No. 1: Evaluación de la respuesta al tratamiento con Imatinib

MESES OPTIMA SUBÓPTIMA FALLO DE TERAPIA

3 CHR No CHR (Ph>95%) Menos de CHR

6 PCR (Ph<35%) Menos de pCR (h<35%) No CgR (Ph> 95%)

12 CCR pCR (1% a 35%) Menos de pCR (Ph>35%)

18 MMR Menos de MMR Menos de CCR, no MMR

Cualquier tiempo

durante duración de

tratamiento

MMR estable Pérdida de MMR,

presencia de Mutaciones

Perdida de CHR, perdida

de CCR;

CHR: respuesta hematolótica completa; CCR: respuesta citogenética completa; pCR: respuesta citogenética parcial; MMR:

respuesta molecular mayor.

Fuente: Baccarani M, et al. (2009). Journal of Clinical Oncology, 27:6041-6051

26

H. Mutaciones del gen BCR-ABL:

Los mecanismos de resistencia a inhibidores tirosin kinasas son multifactoriales;

dentro de los cuales se puede mencionar un aumento en la producción de la proteína BCR-

ABL1 (debido a amplificación génica y sobreexpresión) y una disminución en los niveles

celulares del tratamiento [25,26].

Por otro lado la resistencia secundaria, se debe principalmente a la presencia de

mutaciones puntuales en BCR-ABL1, las cuales inhiben la unión del Imatinib. En estudios

recientes se ha determinado que la detección de mutaciones en BCR-ABL1 son altamente

predictivas de pérdida de la respuesta citogenética completa y progresión a crisis blástica

[25,26].

El análisis mutacional es recomendado en pacientes en los cuales la terapia ha fallado;

siempre antes del cambio de inhibidor tirosin kinasa u otro tratamiento, y en algunos casos

de respuesta subóptima [25,26].

A las fecha se han reportado más de 100 mutaciones en el gen BCR-ABL; sin

embargo en su mayoría, estas se traducen en sustituciones únicamente 15 aminoácidos (Ver

tabla No. 2) [25,26].

La mutación T315I es considerada la más agresiva, ya que no existe ningún inhibidor

tirosin kinasa que sea efectivo para esta mutación. En la tabla No. 2, se muestran las

principales mutaciones reportadas internacionalmente [25,26].

Las mutaciones dentro del dominio P-loop del dominio kinasa de BCR-ABL

incluyendo la Y253F/H y la E255K/V son altamente resistentes a Imatinib. El Nilotinib

exhibe actividad contra la mayoría de mutaciones que provocan resistencia a Imatinib,

incluyendo la Y253F/H, E255K/V. Dasatinib también presenta actividad contra la mayoría

de mutaciones que causan resistencia a Imatinib, excepto la T315I; el efecto de Dasatinib

para los pacientes con mutaciones es más fuerte que el Nilotinib e Imatinib [25,26].

27

Tabla No. 2: Mutaciones frecuentes en BCR-ABL

MUTACIÓN LOCALIZACIÓN

T315I Región de unión al ATP

Y253F P-loop

Y253H P-loop

E255K P-loop

E255V P-loop

M351T Dominio catalítico

G250E p-loop

F359V Dominio catalítico

H396P A-loop

H396R A-loop

Fuente: Ernst T, et al. 2011, Hematol Oncol Clin, 25, 997-1008.

I. Mutación T315I:

La mutación T315I es la única mutación reportada que es resistente a todos los

inhibidores tirosin kinasas que actualmente se encuentran en el mercado. Los pacientes que

presentan esta mutación no son sensibles a Imatinib, a Nilotinib y a Dasatinib; por lo que

carece de efectividad el brindar este medicamento a este tipo de pacientes. Estos pacientes

deben de ser sometidos a trasplante de médula ósea (Ver Figura No. 9) [25,27].

Figura No. 9: Mecanismo por el que la mutación T315I bloquea la unión al inhibidor

Fuente: Zachary, A. et al( 2010), Nature Reviews Cancer, 10, 130-147

28

J. Situación en Guatemala:

Del período 2010 al 2012 se realizó el primer proyecto de investigación

(FODECYT 24-2010); en el cual se monitoreo cada 3-4 meses, la cantidad de copias de BCR-

ABL1 que tenían 30 pacientes con diagnóstico de leucemia mieloide crónica. Todos los

pacientes se monitorearon por un período de 18 meses. Los pacientes se clasificaron, según

su respuesta al Imatinib como respuesta óptima, subóptima y fallo de terapia. Un 39% de los

pacientes analizados obtuvieron una respuesta óptima; es decir que alcanzaron una respuesta

citogenética completa a los 12 meses o una respuesta molecular mayor a los 18 meses. Y

luego se observa que un 25% de los pacientes incluidos en el presente estudio tuvieron una

respuesta subóptima, menos de respuesta molecular mayor a los 18 meses; y por último

presentaron fallo a la terapia un 36% de pacientes; los cuales no alcanzaron ni respuesta

citogenética completa a los 18 meses; de estos pacientes fallecieron 3. Los pacientes con

fallo a terapia y con respuesta subóptima son candidatos a análisis de mutaciones [28].

En Guatemala, no se han realizado estudios de mutaciones en el gen BCR-ABL1

previamente; por lo que no se conocen las mutaciones más frecuentes en el país. Y también

no se utilizan para evaluar el cambio de inhibidor de tirosin kinasa (Ver tabla No.3 y 4) [28].

Tabla No. 3: Respuesta al Imatinib en los pacientes analizados

RESPUESTA

ÓPTIMA

RESPUESTA

SUBÓPTIMA

FALLO DE

TERAPIA

FALSOS

POSITIVOS

39% 25% 36% 6%

Fuente: FODECYT 24-2010

Tabla No. 4: Respuesta al Imatinib alcanzada durante el monitoreo molecular

% CCgR % MMR %MR

21% 29% 14%


29

PARTE III

III.1 RESULTADOS

En este estudio participaron 83 pacientes con Leucemia Mieloide Crónica con presencia de

la t(9;22) que produce p210 BCR-ABL y tratamiento por más de 18 meses con algún inhibidor tirosin

kinasa de primera o segunda generación (Ver Anexo 4).

Para determinar la presencia de la mutación T315I en el dominio tirosin kinasa del oncogen

BCR-ABL, se estandarizó previamente la técnica de PCR semi anidada utilizando tres muestras de

pacientes con diagnóstico previo de la enfermedad y diferentes valores de escala internacional (%

IS) (Anexo 5). Posteriormente, las muestras fueron analizadas por secuenciación para evaluar que la

amplificación correspondiera al dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL1 (Anexos 6 y 7).

El 57 % de los pacientes analizados fueron varones (M/F: 1.30) y la mediana de la edad para

el grupo fue de 42 años (IQR 32 – 55 años). Los pacientes fueron referidos del Hospital General

San Juan de Dios – HGSJDD – (36.0 %), Hospital Roosevelt (24. 0 %), Instituto Guatemalteco de

Seguridad Social – IGSS – (36.0 % %), Unidad Nacional de Oncología Pediátrica – UNOP y

pacientes particulares (4.0 %).

Grafica 1. TKI utilizado como terapia según el centro de asistencia médica

Otros: UNOP y pacientes particulares

Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013

0

5

10

15

20

25

30

Imatinib Nilotinib Dasatinib

IGSS HGSJDD ROOSEVELT OTROS

30

En cuanto a las características clínicas encontradas en todos los pacientes incluidos, la

mediana para el recuento de leucocitos fue de 7.67 células/L (IQR 5.73- 14.42), 226 células/L (IQR

163 - 361.1) para plaquetas y 12.75 g/dL para hemoglobina (IQR 11 - 14.3) con algunos valores

extremos. La mediana del tiempo de vida con la enfermedad fue de 4 años (IQR 2-4) (Tabla No. 5).

Un total de 20 (24 %) pacientes no poseían respuesta hematológica después de más de 18 meses de

terapia.

Alrededor de dos terceras partes del total de pacientes se encontraban en tratamiento actual

con Imatinib, seguido de Nilotinib (23 %) y Dasatinib (11 %); variando su frecuencia según el centro

de referencia hospitalario en el que se recibe atención (Gráfica 1). La dosis recibida de cada inhibidor

fue variable según cada paciente, pero las dosis más frecuentes ingeridas fueron 400 mg/día para

Imatinib, 800 mg/día para Nilotinib y 100 mg/día para Dasatinib.

Tabla No. 5: Características médicas de los pacientes con LMC evaluados

Variable Mediana Mínimo Máximo

Años con la enfermedad 4 1 16

Recuentos celulares

Glóbulos blancos (células/L) 7.67 1.73 548

Plaquetas (células/L) 226 17.7 1590

Hemoglobina (g/dL) 12.75 6.1 28.6

Dosis de inhibidor (mg/día)

Imatinib 400 300 800

Nilotinib 800 100 800

Dasatinib 100 100 400


El 51 % de los pacientes presentó un valor de %IS arriba de 10 % y el 20 % presentó valores

por encima de 1%. En un 16 % no fue posible calcular los valores de %IS debido a que el número

de copias del oncogen BCR-ABL sobrepasó al número de copias de ABL en la cuantificación

relativa realizada por PCR tiempo real. El 13 % restante presentó valores de %IS entre 0.01 y 0.1

con valores que sugieren una alarma (Tabla 6).

31

Tabla No. 6: Valores de % IS de los pacientes incluidos en este estudio

IS % Frecuencia (%)

N=83 Mediana RIQ

>0.01α - 0.09 5 (6.0) 0.03 0.01 0.07

0.1β – 0.99 6 (7.2) 0.62 0.42 0.72

1.0γ -9.99 17 (20.5) 2.23 1.47 4.58

10 δ- 99.99 42 (50.6) 38.12 25.69 55.40

BCR-ABL >ABL* 13 (15.7) - - -

α0.01 corresponde a una respuesta molecular 4 (MR4); β 0.1 corresponde a una respuesta molecular mayor (MMR o MR3)

γ1.0 corresponde a una respuesta citogenética completa (CCyR); δ10 corresponde a una respuesta hematológica completa (CHR)

*BCR-ABL >ABL: no es posible calcular debido a que el número de copias de BCR-ABL es mayor al número de copias de ABL.


Se determinó la presencia de mutaciones de resistencia para TKI en el 11% de los pacientes

con tratamiento (Grafica 2). De éstos casos, la mutación T315 se presentó en el 1.2 % (Figura 10).

Así mismo se pudo detectar la presencia de otras mutaciones que confieren resistencia a los TKI

como la mutación E279K (Figura 11), G250 (Figura 12) y F359V (Figura 13). En un mismo

paciente se determinó además la presencia de dos mutaciones (G250E y E453K) en el gen BCR-

ABL (Figura 14).

Grafica 2. Porcentaje de mutaciones de resistencia a TKI encontradas


89,0%

6,1%

1,2%1,2%

1,2%

1,2%11,0%

WT G250E T315I E279K F359V E453K; G250E

32

Figura No. 10: Electroferograma en el que se observa la mutación T315I en BCR-ABL1. La muestra LMC-

160 mostró un cambio en la secuencia del gen BCR-ABL1 (c. 948 T>C) cuya traducción conlleva a la sustitución

de una Treonina por una Isoleucina en el codón 315 de la proteína; confiriendo una alta resistencia a inhibidores

tirosin quinasa de primera y segunda línea.


Figura No. 11: Electroferograma en el que se observa la mutación E279K en BCR-ABL1. La muestra LMC-

179 mostró un cambio en la secuencia del gen BCR-ABL1 (c. 838 G>A) cuya traducción conlleva a la sustitución

de ácido glutámico por lisina en el codón 279 de la proteína; confiriendo a resistencia a inhibidores tirosin quinasa.


33

Figura No. 12: Electroferograma en el que se observa la mutación G250E en BCR-ABL1. Las muestras LMC-18,

20, 230, 338 y 422 mostraron un cambio en la secuencia del gen BCR-ABL1 (c. 838 G>A) cuya traducción conlleva a

la sustitución de glicina por ácido glutámico en el codón 259 de la proteína; confiriendo a resistencia a inhibidores

tirosin quinasa.


34

Figura No. 13: Electroferograma en el que se

observa la mutación F359V en BCR-ABL1.

La muestra LMC-325 mostró un cambio en la

secuencia del gen BCR-ABL1 (c.1078 T˃G)

cuya traducción conlleva a la sustitución de

fenilalanina por valina en el codón 359 de la

proteína; confiriendo a resistencia a inhibidores

tirosin quinasa.


Figura 14: Electroferograma

en el que se observa las

mutación E453K y G250E

en BCR-ABL1. La muestra

LMC-49 mostró un cambio en

la secuencia del gen BCR-

ABL1 (c.1078 T˃G y ) cuya

traducción conlleva a la

sustitución de por y por en

los codones 453 y 250

respectivamente de la

proteína; confiriendo a

resistencia a inhibidores

tirosin quinasa


35

Todos los pacientes que presentaron mutaciones de resistencia para TKI presentaron valores

por encima del rango normal para los parámetros del hemograma y una %IS mayor a 1 % (Tabla

7). El 55 % de los pacientes se encontraron en tratamiento con un inhibidor de segunda línea

(Dasatinib o Nilotinib). Respecto a los pacientes con terapia de Imatinib, solamente un paciente

ingería la dosis recomendada para segunda línea (800 mg/día).

Tabla No. 7: Características moleculares y clínicas de los pacientes con mutaciones en BCR-ABL

Código cDNA Proteína Sexo Años de

diagnóstico TKI

Dosis

(mg/día) GB PLT HB %IS

LMC-18 c.752 G>A G250E M 5 Imatinib 400 15.48 614 12.1 38.374

LMC-20 c.752 G>A G250E M 3 Dastinib 100 53.8 614 8.5 68.37

LMC-49 c.752 G>A ;

c.1360 G>A

G250E;

E453K M 9 Nilotinib 800 24.1 242 11.3 NC

LMC-160 c. 948 T>C T315I M 2 Nilotinib 400 21.32 403 11.41 3.84

LMC-179 c. 838 G>A E279K F 16 Nilotinib 800 NR NR NR 57.85

LMC-230 c.752 G>A G250E F 2 Imatinib 400 17.44 1590 12.3 NC

LMC-325 c.1078 T˃G F359V M 1 Dasatinib 100 6.58 64.1 11.01 33.1

LMC-338 c.752 G>A G250E F 13 Imatinib 800 208.9 580.2 7.58 1.43

LMC-422 c.752 G>A G250E M NRβ Imatinib 400 548.32 466 6.3 95.03

TKI: Inhibidores Tirosin Kinasa, GR: Glóbulos Rojos, GB: Glóbulos Blancos, PLT: Plaquetas, HB: Hemoglobina, %IS: Escala Internacional, βNR: No refiere, NC: es posible calcular debido a que el número de copias de BCR-ABL es mayor al número de copias de ABL.


Durante el desarrollo del proyecto se realizaron diferentes actividades de divulgación de los

resultados de la misma en sectores de interés como la Asociación de Pacientes con Leucemia

Mieloide Crónica (ASOPALEU), residentes de Medicina Interna de los Hospitales Nacionales,

estudiantes de la carrera de Química Biológica de la USAC y se tuvo participación en el I Congreso

de Actualización en Biología Molecular y Genética realizado en el país (Anexo 8).

36

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La muestra utilizada en el presente estudio fue de 83 pacientes, que se seleccionaron por tener

más de 18 meses con tratamiento con un inhibidor tirosin kinasa y un porcentaje en escala

internacional mayor de 0.1 % indicando un fallo de terapia o respuesta sub óptima.

En el presente estudio se observa que la mayor parte de pacientes que presentaron resistencia

son de sexo masculino, dato que coincide con lo reportado en otros países, aunque la razón de esto

se desconoce. Y además la mediana de edad es de 42 años; esta mediana de edad es bastante baja

comparado con estudios realizados en la mayoría de países, en los cuales la mediana está por arriba

de los 55 años de edad. Este es un dato interesante, ya que es conveniente determinar factores

genéticos y ambientales en Guatemala, que predispongan a un desarrollo temprano de leucemia

mieloide crónica [30].

Se analizaron muestras procedentes de hospitales nacionales y del IGSS; y se puede observar

en la gráfica No. 1 una clara diferencia, entre el tipo de inhibidor tirosin kinasa utilizado en los

hospitales nacionales y los utilizados en el IGSS. Esto se debe a que el IGSS posee disponibilidad

del uso de tres inhibidores tirosin kinasas: Imatinib, Nilotinib y Dasatinib; mientras los hospitales

nacionales únicamente tienen acceso a Imatinib. El medicamento de primera línea a nivel mundial

sigue siendo el Imatinib; el Nilotinib y Dasatinib son de segunda línea; estos dos últimos son

medicamentos más agresivos, que producen respuestas de los pacientes mucho más rápido; por esta

razón muchas entidades prefieren prescribir primero los de segunda línea. Existe otro medicamento

de segunda línea aprobado mundialmente, que se denomina bosutinib; el cual no se encuentra

disponible en Guatemala. Y uno de tercera línea, ponatinib, que se recomienda en pacientes con

resistencia a inhibidores tirosin kinasa de primera y segunda línea, y/o que posean la mutación

resistente T315I [31, 32].

Si bien la mediana del recuento de glóbulos blancos, plaquetas y hemoglobina (Tabla No. 5)

fue normal; un 24% del total de pacientes no posee respuesta hematológica completa, lo cual es un

criterio mayor para evaluar la presencia de mutaciones o la falta de adherencia de pacientes.

37

El análisis de la presencia de resistencia a inhibidores tirosin kinasa; se realiza cuando el

paciente no ha alcanzado respuesta citogenética completa (1% IS). Antes, de esto se debe corroborar

que el paciente tiene adherencia al tratamiento; una vez revisado esto; se deber realizar el estudio de

la presencia de mutaciones en el gen BCR-ABL1 [31, 32].

En nuestro estudio, el 87 % de pacientes no poseía respuesta citogenética completa a los 18

meses, es decir que presentaron fallo de terapia; y el 13% restante poseen respuesta citogenética

completa, pero no han alcanzado respuesta molecular mayor (0.01%), es decir que presentaron

respuesta sub óptima (Tabla No. 6); esta clasificación se realizó según la Figura 15 [33]. Todos

estos pacientes seleccionados cumplen con los criterios descritos en la leukemianet [31, 32]; para la

evaluación de la presencia de mutaciones en el gen BCR-ABL1, como parámetro e indicador de

resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas. La mutación T315I es resistente a los tres

medicamentos disponibles en Guatemala, y por esta razón se planteó su identificación en el presente

estudio.

Figura 15. Valores de escala internacional de BCR-ABL

Fuente: Baccarani, M., Soverini, S. and De Benedittis, C. (2014). Molecular

Monitoring and Mutations in Chronic Myeloid Leukemia: How to Get the Most

out of Your Tyrosine Kinase Inhibitor. ASCO EDUCATIONAL BOOK. 167 –

175. asco.org/edbook

38

Internacionalmente se ha reportado que entre un 20-30 % de los pacientes que reciben terapia

con inhibidores tirosin kinasas, presentan mutaciones en el gen BCR-ABL1. En nuestro estudio la

frecuencia fue de 11 %; un poco más bajo de lo reportado en otros países. Sin embargo es importante

destacar que algunos pacientes presentaron poca adherencia al tratamiento, situación que puede

afectar la frecuencia encontrada.

La mutación T315I se encontró en un 1.2%, mientras que en otros países se ha reportado de

un 3 a un 7%; y muchas veces se ha reportado como la más frecuente [34]. En la población

guatemalteca esta no es la mutación más frecuente. La mutación más común es la G250E, la cual se

encontró en un 6.1% (Gráfica No. 2). En el caso de la mutación T315I, que es resistente a todos los

inhibidores tirosin kinasas disponibles en Guatemala, la única opción útil es recomendar un

trasplante de médula ósea.

En cuanto a las mutaciones E279K, F359V y E453K; es bien conocido que las mutaciones del

dominio kinasa del gen BCR-ABL más agresivas son las que corresponden al dominio P-LOOP; por

lo que, únicamente la mutación G250E, se ha encontrado. Sin embargo cabe resaltar que es la más

frecuente para la población guatemalteca. En la Figura No. 15, se pueden observar las mutaciones

más frecuentes agrupadas según los dominios de la proteína [35].

Figura No. 16: Agrupación de la mutación del gen BCR-ABL1, según dominio

Fuente: Kimura, Sh., Ando, T., and Kojima, K. (2014). BCR-ABL point mutations and TKI

treatment in CML patients. J Hematol Transfus, 2(3):1-11

39

En la Figura No. 16 se muestra una tabla en donde se pueden observar los cambios en

sensibilidad a los distintos inhibidores tirosin kinasa, según la mutación encontrada en el dominio

ABL, del gen BCR-ABL1 [36]. En esta gráfica se puede observar que la mutación T315I, es

considerada la más agresiva de las encontradas ya que se encuentra de color rojo, indicando que es

resistente.

Figura No. 17. Sensibilidad de inhibidores tirosin kinasas según la mutación

en BCR-ABL encontrada

Fuente: Zabriskie, M. et al. (2014). BCR-ABL1Compound Mutations Combining Key

Kinase Domain Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-

Positive Leukemia. Cancer Cell, 26: 428–442.

40

En el caso de la mutación G250E, es altamente resistente solo al Imatinib, moderadamente

resistente al Nilotinib y sensible al Dasatinib. Por esta razón, en el caso de las personas que poseen

esta mutación, la opción de tratamiento sería el Dasatinib.

Respecto a la mutación F359V, también genera una resistencia alta al Imatinib, y

moderamente al Nilotinib, sin embargo es sensible al Dasatinib; por lo que esta sería la opción de

tratamiento recomendada para estos pacientes. La mutación E279K y E453K son mutaciones menos

agresivas.

41

PARTE IV

IV. 1 CONCLUSIONES

IV.1.1. La mutación puntual T315I del gen quimérico BCR-ABL1 fue detectada el grupo de

pacientes analizados; así mismo se determinó la presencia de las mutaciones G250E,

E279K, F359V y E453K.

IV.1.2. La frecuencia de la mutación T315I del gen quimérico BCR-ABL1 en el grupo de

pacientes guatemaltecos con LMC analizados fue de 1.2 %. Las mutaciones E279K,

F359V y E453K presentaron la misma frecuencia; mientras que la mutación G250E

fue la de mayor presencia con 6.0 %.

IV.1.3. La mutación T315I del gen quimérico BCR-ABL1 genera una elevada resistencia a los

tres inhibidores tirosin quinasa usados en el país, dejando el transplante de médula ósea

como única medida terapéutica para los pacientes portadores de la misma.

IV.1.4. La detección de las mutaciones en el dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL1 brindó

información importante a los médicos tratantes sobre el pronóstico de la enfermedad y

orientó al cambio de inhibidor tirosin kinasa utilizado para el tratamiento de los pacientes

con LMC según los protocolos establecidos.

IV.1.5. La divulgación de los resultados obtenidos en el presente estudio se realizó a través de

medios escritos que brindaron información a los médicos, pacientes y familiares con

LMC para una intervención médica adecuada.

42

IV. 2 RECOMENDACIONES

IV.2.1. Implementar y fortalecer el programa de monitoreo y seguimiento de enfermedad mínima

residual de pacientes con LMC en tratamiento con inhibidores tirosin kinasa del país

para la detección temprana de pacientes con fallo terapéutico o alarma; y con ello realizar

una intervención terapéutica adecuada

IV.2.2. Promover la educación a pacientes con LMC sobre la importancia de la adherencia al

tratamiento con TKI para prevenir recaídas y evitar el surgimiento de mutaciones de

resistencia que limitan sus opciones terapéuticas.

IV.2.3. Evaluar la presencia de otros factores genéticos asociados a falla terapéutica de los TKI

como las mutaciones en el trasnportador Oct-1, co exsistencia de mutaciones en JAK2 y

polimorfismos en el gen BIM.

IV.2.4. Los resultados obtenidos evidencian la necesidad de utilizar TKI de segunda línea o

tercera línea en pacientes con mutaciones de resistencia al Imatinib que son tratados en

Hospitales de la Red Nacional en los que no se cuentan.

IV.2.5. Fomentar sistemas de inter comunicación con los Hospitales Nacionales que refieren las

muestras de trabajo para estudios de caracterización de LMC con la finalidad de reducir

o eliminar las desviaciones debidas a los sesgos de información.

43

IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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leukemia patients after Imatinib resistance. Hematology, 18(3), 158-162.

35. Kimura, Sh., Ando, T., and Kojima, K. (2014). BCR-ABL point mutations and TKI treatment

in CML patients. J Hematol Transfus, 2(3):1-11.

46

36. Zabriskie, M. et al. (2014). BCR-ABL1Compound Mutations Combining Key Kinase Domain

Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-Positive Leukemia.

Cancer Cell, 26: 428–442.

47

IV. 5 ANEXOS

Anexo 1: Consentimiento Informado

Consentimiento Informado para Pruebas Genéticas

1. Título de los proyectos

“GENÉTICA DE LA LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC) EN

GUATEMALA”

(Este estudio se basará en el análisis de ácidos nucleicos para evaluar la presencia de genes alterados en su enfermedad)

2. Investigador Principal

Dra. Claudia Carranza

3. Institución

INVEGEM

El presente documento es un consentimiento informado que le brindará a usted y su familia información

importante sobre los estudios. Puede que el documento contenga palabras que usted no entienda. Por favor

pregunte al investigador encargado o a cualquier personal del estudio para que le explique cualquier palabra

o información que usted no comprenda claramente. Usted puede llevarse a su casa una copia de este

consentimiento informado para pensar sobre este estudio o para discutir con su familia o amigos antes de

tomar la decisión de participar en él.

INTRODUCCIÓN

Usted ha sido invitado a participar en esta investigación. Antes de que usted decida participar en el estudio

por favor lea este documento cuidadosamente. Haga todas las preguntas que usted tenga, para asegurarse de

que entienda los procedimientos del estudio, incluyendo los riesgos y los beneficios.

PROPOSITO DEL ESTUDIO

El propósito del presente estudio una caracterización genética de la leucemia mieloide aguda, es decir

detectar la presencia de genes que se encuentran alterados en leucemia, lo que permitirá un mejor manejo

de su enfermedad ya que le servirán a su médico para conocer el pronóstico de su enfermedad; y por lo tanto

elegir con mayor exactitud el tratamiento más adecuado para usted.

Además se estudiarán otros genes que ayuden a conocer mejor la genética de la leucemia mieloide aguda;

por lo que se obtendrá información que permita conocer mejor los mecanismos de producción del cáncer y

así facilitar la cura del mismo.

Fuente: INVEGEM/Rozas Botrán ONG


48

PARTICIPANTES

Las personas que podrán participar en este estudio deben de tener un diagnóstico confirmado de leucemia mieloide

aguda, y además seguir según los siguientes criterios:

Criterios de Inclusión

Pacientes de 0-99 años

Diagnóstico confirmado de leucemia mieloide crónica

Tratamiento con algún inhibidor tirosin kinasa mayor a 18 meses

Porcentaje de escala internacional (% IS) mayor a 0.1

Pacientes con recaídas.

Criterios de exclusión:

Paciente que presente otras formas de leucemia

Pacientes que ya se encuentren en tratamiento

Pacientes con recaídas

Con el fin de identificar la existencia de estos cuatro marcadores genéticos, el presente estudio requiere su

participación, ya que reúne los criterios de inclusión para colaborar con el estudio. Su participación es

completamente voluntaria y puede abandonar el estudio en cualquier momento sin ser penalizado.

PROCEDIMIENTOS

El cumplimiento de uno o más de los criterios de inclusión indican que su médico sospecha que usted tiene leucemia

mieloide aguda, y por lo tanto se procede a la extracción de sangre periférica o médula ósea. La extracción de sangre

periférica se llevará a cabo por venopunción (extracción de sangre de una vena) y la de médula ósea por punción al

interior del hueso; la muestra extraída será enviada en dos tubos, uno con tapa morada (EDTA) y otro con tapa

verde (heparina) al laboratorio de biología molecular y citogenética de INVEGEM, para su respectivo análisis.

RIESGOS

Los riesgos de la venopunción son mínimos y generalmente se relacionan a hematomas (moretes que se quitan con

el tiempo) en el lugar de punción, los cuales no representan un riesgo para su salud y desaparecen en pocos días,

sin necesidad de tratamiento. Además puede causar dolor, mareos y en raras ocasiones infecciones. Los riesgos de

la extracción de médula ósea también son mínimos, pueden encontrarse en algunas ocasiones sangrado o

infecciones, hematomas y dolor.

COSTOS

La presente prueba tiene un costo elevado, sin embargo por ser parte de este estudio se le realizará de forma gratuita.



49

PRIVACIDAD Y CONFIDENCIALIDAD

Si usted elige participar en este estudio, el investigador del estudio conseguirá información personal sobre usted. Esto

puede que incluya la información que puede identificarle. También puede conseguir información sobre su salud

incluyendo, expedientes médicos actuales y del pasado que pueden incluir resultados de laboratorios, placas o exámenes

físicos

Los resultados de esta investigación pueden ser publicados en revistas científicas o ser presentados en las reuniones

médicas, pero su identidad no será divulgada. La información de su salud será mantenida confidencialmente

bajo la ley. Esta autorización servirá hasta el final del estudio, a menos que usted la cancele antes. Usted puede cancelar

esta autorización en cualquier momento enviando un aviso escrito al Investigador Principal: Dra. Claudia Carranza

Coordinadora de Laboratorios INVEGEM Tel. 40507444 Correo electrónico: [email protected]

Si usted cancela esta autorización, el Investigador Principal no usará ni divulgará su información personal ni de su

salud. La autorización para el uso y el acceso de la información protegida de la salud para los propósitos de la

investigación es totalmente voluntaria.

UTILIZACIÓN DE MUESTRAS Y RESULTADOS

La muestra de médula ósea o sangre obtenida de usted será utilizada para el presente estudio; y el análisis se realizará

en INVEGEM. Se podrá almacenar su muestra para futuros estudios dentro de las instalaciones de INVEGEM, y se

podrá utilizar para otros estudios que ayuden al conocimiento de la genética de leucemia mieloide aguda.

PREGUNTAS

Si tiene alguna pregunta sobre este estudio o sobre su participación usted puede contactar a:

Dra. Claudia Carranza, Coordinadora de Laboratorios INVEGEM

Tel. 40507444 Correo electrónico: [email protected] .

OTROS ASPECTOS DE INTERÉS:

Si existiera información de relevancia en el presente estudio, se le dará conocimiento del mismo.

No se dará ningún tipo de compensación para la participación, su participación es totalmente voluntaria.

Siempre se respetará la opinión de cada participante

No existe ningún conflicto de interés con respecto al patrocinio del proyecto ni en el equipo investigador.

No firme este consentimiento a menos que usted haya tenido la oportunidad de hacer preguntas y recibir contestaciones

satisfactorias.

Si usted firma, aceptando su participación en este estudio, recibirá una copia del consentimiento con su firma, el sello

de aprobación de INVEGEM y la fecha.


mailto:[email protected]

mailto:[email protected]


50

DECLARACIÓN DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

Señores

Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas – INVEGEM –

Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología – SENACYT –

Yo, ______________________________ (nombre y apellidos) de ____ años edad y con cédula de vecindad o DPI

___________________ he sido infirmado/a sobre la participación de mi o de mi hijo _______________________en

el proyecto “GENÉTICA DE LA LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC) EN GUATEMALA”; en el que se

tomará una muestra de sangre periférica para la realización de las pruebas necesarias. El resultado de la prueba de

brindará información a mi médico sobre el pronóstico de mi enfermedad o la de mi hijo.

El procedimiento de extracción de sangre periférica o médula ósea constituye un procedimiento seguro para mi salud

y sin complicaciones importantes o que afecten mi integridad física.

Autorizo el uso de la muestra de sangre periférica o médula ósea para la presente investigación y otras investigaciones

que contribuyan a conocer más sobre el comportamiento y tratamiento de la enfermedad. Y otorgo mi consentimiento

para la extracción de sangre periférica o médula ósea y uso del resultado de mi prueba para la presente investigación.

Comprendo que mis datos pueden ser publicados en revistas científicas o ser presentados en reuniones médicas, pero

mi identidad no será divulgada.

Fecha: ___________________________________

Firma del Paciente o huella digital: _________________________

Firma del médico/persona que realizó la extracción: __________________________


Sello de la institución


51

Anexo 2: Ficha de Recolección de datos

DATOS GENERALES DEL PACIENTE INFORMACION HEMATOLÓGICA

NOMBRE: ________________________________________________________

EDAD: ________ FECHA DE NACIMIENTO: ______/______/______

LUGAR DE ORIGEN: ____________________________________________

TELÉFONO: _____________________________________________________

DIRECCIÓN: ____________________________________________________

___________________________________________________________________

FECHA: ______/______/_________

RECUENTO ERITROCITARIO: ____________________________

RECUENTO LEUCOCITARIO: _____________________________

RECUENTO PLAQUETARIO: ______________________________

HEMOGLOBINA: ___________ HEMATOCRITO: ___________

% BLASTOS: ______________________________________________

INFORMACIÓN CLÍNICA DEL PACIENTE OTRAS PRUEBAS

HOSPITAL DE REFERENCIA:

⃞ ROOSEVELT ⃞ IGSS ⃞ UNOP

⃞ GENERAL SAN JUAN DE DIOS

⃞ OTRO (especifique): ____________________________________

MEDICO QUE REFIERE: ________________________________________

TELÉFONO: _____________________________________________________

EXAMEN SOLICITADO:

⃞ Monitoreo ⃞ Mutaciones

EVENTOS TROMBÓTICOS PREVIOS:

⃞ NO ⃞ SI No. DE EVENTOS: ________________

ESPLENOMEGALIA: ⃞ NO ⃞ SI GRADO: _________

OTROS HALLAZGOS RELACIONADOS A LA

ENFERMEDAD:

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

FECHA: ______/______/_________

CARIOTIPO/FISH: __________________________________________

________________________________________________________________

FECHA: ______/______/_________

INMUNOFENOTIPO*: _______________________________________

________________________________________________________________

FECHA: ______/______/_________

OTRA DE INTERÉS: _________________________________________

________________________________________________________________

PACIENTES EN TRATAMIENTO

FECHA DE DIAGNÓSTICO: ________/________/_____________

FECHA DE INICIO TRATAMIENTO: ______/______/________

TRATAMIENTO Y DOSIS: _________________________________

RECAIDA: ⃞ NO ⃞ SI 1Leucemia Mieloide Crónica.

INFORMACIÓN DE LA MUESTRA

FECHA DE RECOLECCIÓN: ________/_________/_____________

TIPO DE MUESTRA: ⃞ SANGRE PERIFÉRICA TUBOS RECOLECTADOS: __________________________

PRUEBA TUBO DE RECOLECCIÓN TIPO DE MUESTRA

ANALISIS CUANTITATIVO DEL TRANSCRITO BCR-ABL Y ANÁLISIS DE MUTACIONES EN BCR-ABL EN PACIENTES CON LMC.

3-4 TUBOS CON EDTA* (MORADO) SANGRE PERIFÉRICA

* Tomar tubos adicionales si el paciente presenta un recuento menor de 4,000 glóbulos blancos por mm3



52

Anexo 3: Guía para la interpretación de resultados de mutaciones

GUÍA PARA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS PARA LA DETECCIÓN DE

MUTACIONES EN BCR/ABL1 COMO INDICADORES DE RESISTENCIA A INHIBIDORES DE TIROSIN

QUINASA 1. La resistencia a los inhibidores tirosin quinasa es un

fenómeno complejo que puede ser causado por

diferentes factores; uno de ellos es la aparición de

mutaciones puntuales en el dominio tirosin quinasa

de BCR-ABL1.

2. El objetivo de detectar mutaciones en oncogen

BCR-ABL1 es determinar si existe resistencia y fallo

terapéutico con Imatinib y otros inhibidores de

segunda línea (Dasatinib y Nilotinib); así como

también predecir la progresión de la enfermedad en

los pacientes que las presenten.

3. La detección de mutaciones en BCR-ABL1 es una

prueba recomendable:

a) En la fase blástica o acelerada para determinar

mutaciones basales presentes en un bajo

porcentaje (resistencia primaria).

b) Durante la fase crónica con tratamiento, en

todos los casos de fallo de terapia y en los

casos de alerta (resistencia secundaria).

c) Por lo menos cada 3 meses en el caso de los

pacientes con tratamiento de segunda línea o

tercera línea que hayan sido detectados con

alguna mutación previa (resistencia

secundaria).

4. Existen diferentes tipos de mutaciones que pueden

brindar resistencia a diferentes inhibidores de la

tirosin quinasa pero pueden ser sensibles a otros

(ver tabla adjunta).

5. La sensibilidad del método de secuenciación para la

detección de mutaciones en BCR-ABL1 es del 10 -

20 % (10 o 20 copias mutadas por cada 100 copias

de BCR-ABL1)

Mutación Imatinib Nilotinib Dasatinib

M244V

G250E

Q252H

Y253H

E255V

V299L

F311I

T315I

T315M

F317L

M351T

F359V

H396R

L248R

E279K

L248V

Y253F

E255K

D276G

E292L

G250E V299L

Y253H E255V

Y253H F317L

E255V V299L

V299L F317L

V299L M351T

V299L F359V

F317L F359V

Sensible

Moderadamente resistente

Resistente

Altamente Resistente

REFERENCIAS Redaelli, S., Mologni, L., Rostagno, R., Piazza, R., Magistroni, V., Ceccon, M., Flynn, D. y Gambacorti, C. (2012). Three novel patient derived BCR-ABL mutants show different sensitivity to second and third generation tyrosine kinase inhibitors. Am J Hematol. 87(11):E125-8

Zabriskie, M. S., Eide, C. A., Tantravahi, S. K., Vellore, N. A., Estrada, J., Nicolini, F. E., … O’Hare, T. (2014). BCR-ABL1 Compound Mutations Combining Key Kinase Domain Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-Positive Leukemia. Cancer Cell, 26(8), 428–442. http://doi.org/10.1016/j.ccr.2014.07.006

53

Anexo 4: Listado de pacientes incluidos en el estudio

Tabla No. 8: Listado de pacientes y resultados obtenidos en el proyecto

No. Código Sexo Edad

(años)

Hospital de

Referencia TKI GR GB PLT HB %IS

Mutaciones en BCR-

ABL1

1 LMC-04 M 33 ROOSEVELT IMATINIB 5.4 9.34 442 16.2 BCR-

ABL>ABL No presenta mutaciones

2 LMC-16 M 49 HGSJDD IMATINIB 3.34 4.5 108 11.8 26.95 No presenta mutaciones

3 LMC-18 M 48 ROOSEVELT IMATINIB 4.35 15.48 614 12.1 38.374 Homocigoto G250E


5 LMC-20 M 34 HGSJDD DASTINIB 3.1 53.8 614 8.5 68.37 Homocigoto G250E

6 LMC-37 F 15 UNOP IMATINIB 4.86 7.33 245.2 13.19 1.5178 No presenta mutaciones

7 LMC-38 F 57 HGSJDD IMATINIB 2.79 5.31 17.7 8.44 53.49 No presenta mutaciones

8 LMC-39 M 31 HGSJDD IMATINIB 2.9 194 19.3 9.18 BCR-


9 LMC-42 M 43 HGSJDD IMATINIB NR 8.35 NR 14 56.91 No presenta mutaciones

10 LMC-49 M 67 HGSJDD NILOTINIB 3.77 24.1 242 11.3 BCR-

ABL>ABL Homocigoto G250E

Homocigoto E453K

11 LMC-50 M 42 HGSJDD IMATINIB 3.32 10940 201 10 23.42 No presenta mutaciones

12 LMC-60 M 22 ROOSEVELT IMATINIB 5.62 8.6 269 15 2.23 No presenta mutaciones



14 LMC-67 F 27 HGSJDD IMATINIB 2.1 4800 184 11 2.096 No presenta mutaciones

15 LMC-68 F 50 HGSJDD NRβ 3.9 8.1 60 10 33.81 No presenta mutaciones

16 LMC-70 M 44 IGSS DASTINIB 5.81 5.73 222.1 11.64 0.01 No presenta mutaciones

17 LMC-71 M 73 HGSJDD IMATINIB NR NR NR NR 0.45 No presenta mutaciones

18 LMC-75 F 44 HGSJDD IMATINIB 4.41 6.2 234 12.6 3.58 No presenta mutaciones

19 LMC-81 F 55 IGSS NILOTINIB 4.76 6.4 241 14.2 10.38 No presenta mutaciones

20 LMC-85 M 39 IGSS IMATINIB NR NR NR NR 0.59 No presenta mutaciones

21 LMC-92 M 24 IGSS NILOTINIB 4.8 9.4 235 13.3 28.9 No presenta mutaciones

22 LMC-105 F 65 ROOSEVELT IMATINIB 2.57 3.45 114 28.6 44.14 No presenta mutaciones

23 LMC-113 M 49 IGSS NILOTINIB 4.63 4.74 206.7 14.74 31.78 No presenta mutaciones

24 LMC-114 M 37 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 2.56 No presenta mutaciones

25 LMC-115 F 71 IGSS NILOTINIB 4.09 8.9 683 11.6 29 No presenta mutaciones

26 LMC-117 F 66 IGSS NILOTINIB 2.51 3.12 146.2 0.1 No presenta mutaciones

27 LMC-118 M 43 ROOSEVELT IMATINIB 5.12 8.56 373 14.9 12.31 No presenta mutaciones

28 LMC-120 M 55 IGSS NILOTINIB 4.51 26.1 250 14 72 No presenta mutaciones

29 LMC-122 F 35 IGSS NILOTINIB 4.81 6.8 344 13.11 BCR-



31 LMC-124 F 28 IGSS NILOTINIB 4.42 4.7 776 12.7 57.38 No presenta mutaciones


TKI: Inhibidores Tirosin Kinasa, GR: Glóbulos Rojos, GB: Glóbulos Blancos, PLT: Plaquetas, HB: Hemoglobina, %IS: Escala Internacional, βNR: No refiere

54

Continuación tabla No. 8


(años)

Hospital de


Mutaciones en BCR-

ABL1

33 LMC-130 M 44 IGSS IMATINIB 5.53 3.7 167 16.7 0.65 No presenta mutaciones

34 LMC-146 M 51 IGSS DASATINIB NR NR NR NR 0.03 No presenta mutaciones

35 LMC-149 M 60 IGSS DASATINIB 4.62 8.34 130.3 13.96 26.45 No presenta mutaciones

36 LMC-159 F 32 HGSJDD IMATINIB NR 14.7 NR 13 BCR-


37 LMC-160 M 36 IGSS NILOTINIB 4.16 21.32 403 11.41 3.84 Homocigoto T315I

38 LMC-166 M 39 IGSS DASATINIB 4.42 6.5 245 12.8 12.8 No presenta mutaciones

39 LMC-173 M 19 ROOSEVELT IMATINIB 6.54 9 416 10.9 BCR-


40 LMC-178 F 22 HGSJDD IMATINIB 4.31 21 317 12.1 57.1 No presenta mutaciones

41 LMC-179 F 37 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 57.85 Homocigoto E279K



44 LMC-184 M 45 HGSJDD IMATINIB 3.9 7.67 347 13 1.99 No presenta mutaciones


46 LMC-196 F 60 IGSS IMATINIB NR 250 350 8 23.29 No presenta mutaciones

47 LMC-207 F 33 IGSS IMATINIB 3.33 6.09 190.8 11.92 1.15 No presenta mutaciones


49 LMC-218 M 35 HGSJDD IMATINIB 2.5 1.73 110 10 1.55 No presenta mutaciones


51 LMC-230 F 24 ROOSEVELT IMATINIB 3.77 17.44 1590 12.3 BCR-

ABL>ABL Homocigoto G250E



54 LMC-252 M 75 IGSS DASATINIB 4.49 5.32 139.8 15.72 8.77 No presenta mutaciones

55 LMC-255 F 46 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 37.88 No presenta mutaciones



58 LMC-266 F 66 PRIVADO IMATINIB NR 8.2 178 12 48.04 No presenta mutaciones


60 LMC-282 F 34 IGSS NILOTINIB 3.57 5.61 207.3 11.5 0.34 No presenta mutaciones

61 LMC-285 F 29 IGSS DASATINIB NR NR NR NR 55.67 No presenta mutaciones


63 LMC-300 F 47 IGSS DASATINIB 4.86 10.96 224.4 14.79 34.74 No presenta mutaciones

64 LMC-304 F 34 HGSJDD IMATINIB NR NR NR NR 21.1 No presenta mutaciones

65 LMC-316 F 39 IGSS NILOTINIB 4.38 9.46 372.2 12.86 19.67 No presenta mutaciones

66 LMC-319 M 59 HGSJDD IMATINIB 4.1 21.45 NR 13.3 19.73 No presenta mutaciones

67 LMC-325 M 27 IGSS DASATINIB 3.3 6.58 64.1 11.01 33.10 Homocigoto F359V



55

Continuación tabla No. 8


(años)

Hospital de


Mutaciones en BCR-

ABL1

69 LMC-329 M 76 HGSJDD IMATINIB 5.76 9.2 212 16 BCR-


70 LMC-338 F 55 HGSJDD IMATINIB 2.52 208.9 580.2 7.58 1.43 Homocigoto G250E

71 LMC-340 M 41 HGSJDD IMATINIB NR 7.5 143 13.4 1.35 No presenta mutaciones

72 LMC-343 F 7 UNOP IMATINIB NR NR NR NR 0.034 No presenta mutaciones

73 LMC-364 F 32 HGSJDD IMATINIB 4.36 206 225 12.2 BCR-


74 LMC-381 F 42 HGSJDD IMATINIB 3.79 119.8 375 12.1 BCR-


75 LMC-402 F 48 ROOSEVELT IMATINIB 3.53 12.62 226 10.5 BCR-




78 LMC-411 M 38 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 31.82 No presenta mutaciones


80 LMC-422 M 29 ROOSEVELT IMATINIB 1.79 548.32 466 6.3 95.03 Homocigoto G250E

81 LMC-428 M 44 ROOSEVELT IMATINIB 5.17 11.5 310 16 19.21 No presenta mutaciones



83 LMC-443 F 55 HGSJDD IMATINIB 3.89 6.9 327 13 5.33 No presenta mutaciones


Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013

56

Anexo 5: Procedimiento de Estandarización de la prueba

A

B

Fotografía No.1: Estandarización de PCR para amplificación del dominio tirosin quinsa del gen quimérico

BCR-ABL. Los páneles A y B muestran los productos amplificados de 863 pb en un gel de agarosa al 2 %. En la

parte superior pueden observarse los resultados utilizando una PCR nested y diluciones comparando con el uso de

cDNA (RT) directo para la amplificación. En la parte inferior se observa la amplificación de tres muestras con un

valor de IS% diferenciado (LMC-166:12.8; LMC-115: 12.0 y LMC-81:10.38).


57

A

B

Figura No. 18: Análisis informático de electroferogramas. El panel A muestra el análisis de la secuencia de

ADN correspondiente al dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL. En esta se muestra una correspodencia del

100 % con la secuencia consenso de referencia. El panel B muestra la secuencia proteica de BCR-ABL sin ningún

cambio en su estructura primaria. Ambos resultados confirman la estandarización exitosa de la técnica para la

detección de mutaciones en BCR-ABL.


58

Anexo 6: PCR de amplificación del dominio Tirosin Kinasa de BCR-ABL en pacientes con


Fotografía No. 2: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1. Se muestra una serie de fotografías

de geles de agarosa 2% teñidos con Gel Red 2 X en las que se observa el fragmento de 863 pb correspondiente al dominio

tirosin kinasa del gen BCR-ABL obtenido a partir de cDNA. Todas la muestras son amplificadas por triplicado para su

secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-16, 49, 120, 122, 20, 70, 92, 130, 191 y196.


59




secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC- 128, 159, 113, 173,. 184, 215, 207, 38, 39, 60, 75, 178, 123, 71, 182,

255, 296, 85, 160, 261, 319 y 304.


60




secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-329, 340, 118, 146, 114, 179, 364, 252,266, 285, 338, 343, 37 y 4.


61




secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-244, 246, 402, 404, 264, 273, 300, 443, 42, 67, 68, 419, 181, 407 y

422.


62




secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-218, 328, 411, 428, 435, 19, 50, 282, 316, 105, 325, 18, 65, 221 y

230.


63

Anexo 7: Electroferograma de las muestras de pacientes negativos para mutaciones en

BRC-ABL1

Figura 19: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis

realizado que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin

kinasa del oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de

concordancia entre secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a

inhibidores tirosin quinasa.


64

Figura 20: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis realizado

que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin kinasa del

oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de concordancia entre

secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a inhibidores tirosin quinasa.


65

Figura 21: Análisis

informático de

electroferogramas del gen

BCR-ABL1. La figura

muestra el análisis realizado

que permite la comparación

entre la secuencia de ADN

amplificada, que corresponde

al dominio tirosin kinasa del

oncogen BCR-ABL; y la

secuencia consenso referencia.

En ambas figuras se observa

un 100% de concordancia

entre secuencias, por lo que los

pacientes carecen de

mutaciones que produzcan

resistencia a inhibidores tirosin

quinasa.


66






67


informático de


BCR-ABL1. La figura

muestra el análisis

realizado que permite la

comparación entre la

secuencia de ADN

amplificada, que

corresponde al dominio

tirosin kinasa del oncogen

BCR-ABL; y la secuencia

consenso referencia. En

ambas figuras se observa


entre secuencias, por lo que

los pacientes carecen de



tirosin quinasa.


68


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


69


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


70


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


71


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


72


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


73


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


74


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


75

Figura 31: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis

realizado que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin

kinasa del oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de

concordancia entre secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a

inhibidores tirosin quinasa.


76


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


77


informático de


BCR-ABL1. La figura




secuencia de ADN

amplificada, que











tirosin quinasa.


78






79


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que





ambas figuras se observa un

100% de concordancia entre

secuencias, por lo que los




tirosin quinasa.


80


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


81


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


82


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


83


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


84


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


85


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


86


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


87


informático de


BCR-ABL1. La figura




amplificada, que











tirosin quinasa.


88






89

Anexo 8: Actividades de Divulgación de los resultados obtenidos en el proyecto

Figura 45: Conmemoración

del día internacional de la


2013. Durante la actividad

tuvieron participación las

asistentes de laboratorio del

proyecto Mariana Herrera y

Luisa Rosales.

En la actividad se promovió la

adherencia al tratamiento, para

evitar la aparición de

mutaciones de resistencia a

TKI’s. Y se informó de la

ejecución del proyecto para la

participación de los

interesados.


90

Figura 46: Conmemoración del

día internacional de la Leucemia

Mieloide Crónica 2015. Durante

la actividad tuvieron participación

la asistente de laboratorio del

proyecto Luisa Rosales y el Dr.

Mauricio Villegas, miembro de

INVEGEM.

En la actividad se informó de la

ejecución del proyecto para la

participación de los interesados y

se mostraron algunos de los

resultaos obtenidos en el proyecto.


91

Figura 47: Póster Científico FODECYT 46-2013. Durante el “I Congreso de actualización en Biología Molecular

y Genética” realizado en el mes de abril de 2016 se tuvo participación con la elaboración y presentación de un

póster científico con los resultados obtenidos en el proyecto.


92

Figura 48: Presentación de

póster y conferencia. Durante el

“I Congreso de actualización en

Biología Molecular y Genética”

realizado en el mes de abril de

2016 se tuvo participación con la

elaboración y presentación de un

póster científico con los

resultados obtenidos en el

proyecto.

Además la Dra. Claudia

Carranza, investigadora principal

del proyecto impartió una

conferencia sobre el mismo tema.


93

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO

Monto Autorizado: Q217,000.00 Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago): 01/02/2014

Plazo en meses 24 meses

Fecha de Inicio y Finalización: 01/02/2014 al 31/01/2016

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignación

Presupuestaria

TRANSFERENCIA

Ejecutado Pendiente de

Ejecutar

Menos (-) Mas (+)

1 SERVICIOS NO PERSONALES

122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 2,000.00 Q 2,000.00

181 Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad Q 108,000.00

Q 97,125.00 Q 10,875.00

181 Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad: evaluación externa de impacto Q 8,000.00

Q 8,000.00

185 Servicios de capacitación Q 2,500.00 Q 2,500.00

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

261 Elementos y compuestos químicos Q 75,000.00 Q 73,157.04 Q 1,842.96

272 Productos de vidrio Q 1,500.00 Q 923.55 Q 576.45

295 Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio Q 20,000.00

Q 19,657.35 Q 342.65

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

GASTOS DE ADMÓN. (10%)

Q 217,000.00

Q190,862.94 Q 26,137.06

MONTO AUTORIZADO Q 217,000.00

Disponibilidad Q 26,137.06

(-) EJECUTADO Q 190,862.94 -

SUBTOTAL Q 26,137.06

(-) ANTICIPO PARA GASTOS MENORES Q -

TOTAL POR EJECUTAR Q 26,137.06

82

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Actividades Duración en meses

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Cotización y compra de reactivos X X X X X X X

Estandarización de técnicas X X X

Vínculos con hospitales X X

Determinación de la mutación

T315I en pacientes con Leucemia Mieloide Crónica

X X X X X X X X X X X X X X X

Informar sobre pronóstico X X X X X X X X X X X X X X X

Orientar a tratamiento X X X X X X X X X X X X X X X

Divulgar resultados X X X

Elaboración de informe final X

consejo nacional de ciencia y tecnologia...

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