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Congreso MRAMA 2.qxp 4/6/09 18:04 Página 1

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VII WORKSHOP MÉTODOS RÁPIDOS Y AUTOMATIZACIÓN EN MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA


3

ÍNDICE

- RAPID METHODS AND AUTOMATION IN MICROBIOLOGY 25 YEARS OF DEVELOPMENTS AND PREDICTIONS 4

- DO METHODS USED IN FOOD MICROBIOLOGY SATISFY ACTUAL NEEDS FOR FOOD SAFETY IMPLEMENTATION? 7

- LA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 9

- TRANSGÉNICOS, NUTRIGENÉTICA Y NUTRIGENÓMICA EN ALIMENTACIÓN 11

- IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA TEMPO EN LA RUTINA DEL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD GRUPO

GALLINA BLANCA – STAR 13

- THE AOAC INTERNATIONAL RAPID METHODS VALIDATION PROCESS 15

- APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 17

- PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (ACM) Y SU APLICACIÓN EN EL ANÁLISIS DE ALERGENOS Y MICOTOXINAS 20

- VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS 24

- LA TECNOLOGÍA TRANSCRIPCIÓN REVERSA - PCR PERMITE UNA DETECCIÓN MÁS RÁPIDA DE LISTERIA 29

- EVALUATION OF THE USE OF THE RAPIDCHEK® SELECT™ SALMONELLA SYSTEM FOR IN NPIP ENVIRONMENTAL SAMPLES 30

- BBL™ CAMPY-CEFEX AGAR 31



4 � Alimentaria Congresos Nº 3

DDaanniieell YY.. CC.. FFuunngg

Department of Animal Sciences and Industry

Kansas State University

[email protected]

Rapid methods and automation in micro-biology is a dynamic area in appliedmicrobiology dealing with the study ofimproved methods in the isolation, earlydetection, characterization, and enume-ration of microorganisms and their pro-ducts in clinical, pharmaceutical, food,industrial, and environmental samples. Inthe past 25 years this field has emergedinto an important sub-division of thegeneral field of applied microbiology andis gaining momentum nationally andinternationally as an area of researchand application to monitor the numbers,kinds, and metabolites of microorga-nisms related to food spoilage, food pre-servation, food fermentation, food safety, and foodborne pathogens.Medical microbiologists started to beinvolved with rapid methods around mid-1960's and started to accelerate in the1970's and continue developments in the80's, 90's and up to the present day.Other disciplines such as Food,Pharmaceutical, Environmental, andFood Microbiology were lagging about10 years behind. Many symposia andconferences were held nationally andinternationally to discuss the develop-ments in this important applied microbio-logy topics. The current Rapid Methodsand Automation in Food MicrobiologyWorkshop in Barcelona, Spain is anexample of such an effort to provide up-dated information and constructive dis-cussions on this topic.

ADVANCES IN VIABLE CELL COUNTS AND

SAMPLE PREPARATION.– The number ofliving organisms in the product, on thesurface of manufacturing environmentand the air of processing plants is veryimportant for the food science andindustry. Colony forming units (CFU) isthe standard way to express the micro-bial loads. In the past 25 years severalingenious systems in “massaging” or“pulsifying” the solid or liquid sampleswere developed so that the samples arehomogeneously distributed in a disposa-ble bag after 1 to 2 minutes of operation.Typically one ml (after dilutions) is pla-

ced into melted agar to encouragemicroorganisms to grow into discretecolonies for counting (CFU/ml). Thesecolonies can be isolated and further iden-tified as pathogenic or non pathogenicorganisms. In the past 25 years, conve-nient systems such as nutrient housed infilms (Petrifilm), mechanical instrument tospread a sample over the surface of apreformed agar plate (Spiral plater), trap-ping microorganisms on a bacteriologicalmembrane and look for growth of targetmicroorganisms on selective and non-selective culture media (Isogrid), non-thermal Pectin-Ca gel system (Micrology,Inc.), etc. greatly help to reduce labortime in performing viable cell count. The 3or 5 tube Most Probable Number (MPN)system has been in use for more than 100years in water testing and food testing butthe procedure is very labor intensive andutilizes large amounts of test tubes andmedia. In 2007 a completely mechanized,automated, and hands-off 16 tube, threedilution MPN system named TEMPO bybioMerieux is being marketed for ease ofoperation of this tedious but yet powerfulMPN viable cell count procedure used inPublic Health, Pharmaceutical and Foodlaboratories around the world. Resultsindicated that TEMPO provided equiva-lent data compared with standard viablecell count methods. This author predictsthat TEMPO will be very successful infood and water microbiology in the nearand far future.As a guide the following FFUUNNGG ssccaallee oonnvviiaabbllee cceellll ccoouunnttss has been developed:

0 to 2 log CFU/ g, ml, or cm2

�Low count, no concern3 to 4 log CFU/ g, ml, or cm2

�Intermediate count, slight concern5 to 6 log CFU/ g, ml, or cm2

�High count, definite concern7 log CFU/ g, ml, or cm2

�Index of Spoilage, serious concern8 log CFU/ g, ml, or cm2

�Odor, unacceptable9 log CFU/ g, ml, or cm2

�Slime, highly unacceptable10 log CFU/ g, ml, or cm2

�Discard immediatelyThis scale is for general microbial popu-lation of food and water. No food patho-gens are allowed (e.g. Salmonella,

Listeria monocytogenes, Escherichiacoli O157:H7, Campylobacter jejuni, etc.)especially in cooked ready-to-eat foods.

AIR SAMPLES AND SURFACE SAMPLES–The Food industry also needs to ascer-tain the air quality as well as surfaces forproduct manufacturing, storage, andtransportation. An active air samplinginstrument can “suck” a known volumeof air and deposit it on an agar surface(impaction) or trapped it in liquid (impin-gement) to obtain CFU/ m3 or ml. Avariety of swabs, tapes, sponges, con-tact agar methods have been developedto obtain surface count of Food manu-facturing environment.

FUNG SCALE – for air and surface sam-ples:

0-100 CFU/m3

�Acceptable count100-300 CFU/m3

�Intermediate count >300 CFU/m3

�Too high, need corrective action needed

Note: In Singapore >500 CFU/m3 is notallowed in food plants.

Total Counts for Food Contact Surfacessuch as forks, knives, dishes, spoons,chopping blocks,table tops, glass for drinking water, etc.

0-10 CFU/cm2

�Acceptable count10-100 CFU/cm2

�Intermediate count>100 CFU/cm2

�Too high, corrective actions needed

AEROBIC, ANAEROBIC, AND “REAL TIME”VIABLE CELL COUNTS– By use of thecorrect gaseous environment or suitablereducing compounds one can obtainaerobic, anaerobic, facultative anaero-bic microbial counts of products.Typically microbial counts were obtainedin 24 to 48 hours. Several methods havebeen developed and tested in recentyears that can provide “real” time viablecell counts such as the use of “Vital”stains (Acridine Orange) to report livingcells under the microscope to count

RRAAPPIIDD MMEETTHHOODDSS AANNDD AAUUTTOOMMAATTIIOONN IINN MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGYY 2255 YYEEAARRSS OOFF DDEEVVEELLOOPPMMEENNTTSS AANNDD PPRREEDDIICCTTIIOONNSS



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fluorescing viable cells or measuringATP of micro-colonies trapped in a spe-cial membranes. These real time test cangive viable cell counts in about 1 to 4hours.A simple Fung Double Tube system usingappropriate agar and incubation condi-tions has been developed and tested inHawaii recreational waters in 2007 thatcan provide a Clostridium perfringenscount for water testing in 6 hours. The Fung/Fujioka scale for beach waterin Hawaii, USA based on single sampleconcentrations (CFU/ml) of Clostridiumperfringens using the Fung Double Tube(FDT) methods is as follows:

ADVANCES IN MINIATURIZATION AND

DIAGNOSTIC KITS– Identification of nor-mal flora, spoilage organisms, clinicaland foodborne pathogens, starter cultu-res, etc. in many specimens is an impor-tant part of food microbiology. In the past25 years many miniaturized diagnostickits have been developed and widelyused to conveniently introduce the purecultures into the system and obtain relia-ble identification in as short as 2 to 4 hrs.Some systems can handle several oreven hundreds of isolates at the sametime. These diagnostic kits no doubtsaved many lives by rapidly, accurately,and conveniently identifying pathogensso that treatments can be madecorrectly and rapidly. Fung is a pioneer inthe deveoopment of these type of systemstarting at around 1970's. There areabout 20 miniaturized systems on themarket to identify pathogens rangingfrom enterics (Salmonella, Shigella,Proteus, Enterobacter, etc.) to non-fer-mentors, anaerobes, gram positives, andeven yeasts and molds.

ADVANCES IN IMMUNOLOGICAL TESTINGS.– Antigen and antibody reaction hasbeen used for decades for detecting andcharacterizing microorganisms and theircomponents in medical and diagnosticmicrobiology. This is the bases forserotyping bacteria such as Salmonella,Escherichia coli O157:H7, Listeriamonocytogenes, etc. Both polyclonalantibodies and monoclonal antibodieshave been used extensively in appliedfood microbiology. The most popular for-mat is the “Sandwiched” ELISA test.Recently some companies have automa-ted the entire ELISA procedure and can

complete an assay from 45 minutes to 2hours after overnight incubation of thesample with suspect target organisms.Lateral Flow Technology (similar to preg-nancy test with three detection areas ona small unit) offers a simple and rapidtest for target pathogens (e.g. E. coliO157) after overnight incubation of foodor allergens (e.g. wheat gluten) The enti-re procedure takes only about 10 minu-tes with very little training necessary. Atruly innovative development in appliedmicrobiology is the immuno-magneticseparation (IMS) system. Very homoge-nize paramagnetic beads have beendeveloped which can be coated with avariety of molecules such as antibodies,antigens, DNA, etc. to capture targetcells such as E. coli O157, Listeria ,Cryptosporidium, Giardia, etc. Thesebeads can then be immobilized, capturedand concentrated by a magnet stationedoutside a test tube. After clean-up, thebeads with the captured target molecu-les or organisms can be plated on agarfor cultivation or used in ELISA,Polymerase Chain Reaction (PCR),microarray technologies, biochips, etc.for detection of target organisms.Currently many diagnostic systems(ELISA test, PCR, etc.) are combining anIMS step to reduce incubation time andincrease sensitivity of the entire proto-col. Using the Pathatrix system of captu-ring circulating enriched meat samplesby IMS Fung=s laboratory can detect E.coli O157:H7 in 5.25 hours from the timeof enriching the meat sample to the timeof ELISA results of the presence orabsence of the pathogen.

ADVANCES IN INSTRUMENTATION AND

BIOMASS MEASUREMENTS– Instrumentscan be used to automatically monitorchanges (such as ATP levels, specificenzymes, pH, electrical impedance, con-ductance, capacitance, turbidity, color,heat, radioactive carbon dioxide, etc.) ofa population (pathogens or non-patho-gens) growth kinetic and dynamics in aliquid and semi-solid sample. It is impor-tant to note that for the information to beuseful, these parameters must be rela-ted to viable cell count of the same sam-ple series. In general, the larger thenumber of viable cells in the sample, theshorter the detection time of thesesystems. A scatter gram is then plottedand used for further comparison of unk-

nown samples. The assumption is that asthe number of microorganisms increasesin the sample, these physical, biophysi-cal, and biochemical events will alsoincrease accordingly. When a samplehas 5 log or 6 log organisms/ml, detec-tion time can be achieved in about 4 hrs.Some instruments can handle hundredsof samples at the same time.

ADVANCES IN GENETIC TESTINGS–Phenotypic expression of cells are sub-ject to growth conditions such as tempe-rature, pH , nutrient availability, oxida-tion-reduction potentials, etc. Genotypiccharacteristics of a cell is far more sta-ble. Hybridization of DNA and RNA byknown probes has been used for morethan 30 years. More recently PolymeraseChain Reaction (PCR) is now an accep-ted method to detect viruses, bacteriaand even yeast and molds by amplifica-tion of the target DNA and detecting thetarget PCR products. By use of reversetranscriptase, target RNA can also beamplified and detected. After a DNA(double stranded) molecule is denaturedby heat (e.g. 95C), proper primers willanneal to target sequences of the singlestranded DNA of the target organism, forexample Salmonella at a lower tempera-ture (e.g. 37C). A polymerase (TAQ) willextend the primer at a higher temperatu-re (e.g. 70C) and complete the addition ofcomplement bases to the single strandeddenatured DNA. After one thermal cycleone piece of DNA will become two pie-ces. After 21 and 31 cycles one piece willbecome 1 million and 1 billion copies,respectively. At the beginning PCR pro-ducts are detected by gel electrophore-sis . Now ingenious ways to detect eitherthe occurrence of the PCR procedure byfluorescent probes or special dyes, or byactually reporting the presence of thePCR products by molecular beacon.Since these methods generate fluores-cence, the PCR reaction can be monito-red over time and provide “real-time”PCR results. Some systems can monitor4 different targets in the same sample(multiplexing). These methods are nowstandardized and easy to use and inter-pret.To further characterize closely relatedorganisms, detail analysis of the DNAmolecule can be made by obtaining thepatterns of DNA of specific organisms bypulse field gel electrophoresis (DNA fin-





ger-printing) or by “Riboprinting” of theribosomal genes in the specific DNAfragment. Since different bacteria exhibitdifferent patterns (e. g. Salmonella ver-sus E. coli) and even the same speciescan exhibit different patterns (e. g.Listeria monocytogenes has 49 distinctpatterns), these information can be usedto compare closely related organisms foraccurate identification of target patho-gens (such as comparing different pat-terns of E. coli O157:H7 isolated from dif-ferent sources in an outbreak) for epide-miological investigations.

ADVANCES IN BIOSENSOR, MICROCHIPS,AND NANOTECHNOLOGY. – Biosensor is anexciting field in applied microbiology.The basic idea is simple but the actualoperation is quite complex and involvesmuch instrumentation. Basically, a bio-sensor is a molecule or a group of mole-cules of biological origin attached to asignal recognition material. When ananalyte comes in contact with the bio-sensor the interaction will initiate arecognition signal which can be reportedin an instrument. Many types of biosen-sors have been developed. Sometimewhole cells can be used as biosensors.Analytes detected include toxins, speci-fic pathogens, carbohydrates, insectici-des and herbicides, ATP, antibiotics, etc.The recognition signals used includeelectrochemical (e.g. potentiometry, vol-tage changes, conductance and impe-dance, light addressable, etc.), optical(such as UV, bioluminescence, chemilu-minescence, fluorescence, laser scatte-ring, reflection and refraction of light ,surface phasmon resonance, polarizedlight, etc.) and miscellaneous transdu-cers (such as piezoelectric crystals,thermistor, acoustic waves, quartzcrystal, etc. Recently, much attention has beendirected to “biochips” and “microchips”developments to detect a great variety ofmolecules including foodborne patho-gens. Due to the advancement in minia-turization technology as many as 50,000individual spots (e. g. DNA microarrays)with each spot containing millions ofcopies of a specific DNA probe can beimmobilized on a specialized microscopeslide. Fluorescent labeled targets can behybridized to these spots and be detec-ted.. Biochips can also be designed todetect all kinds of foodborne pathogens

by imprinting a variety of antibodies orDNA molecules against specific patho-gens on the chip for the simultaneousdetection of pathogens such asSalmonella, Listeria, Escherichia coli,Staphylococcus aureus, etc. The marketvalue is estimated to be as high as $5billion at this moment. This technology isespecially important in the rapidly deve-loping field of proteomics and genomicswhich require massive amount of data togenerate valuable information.Nanotechnology is starting to makemajor advances in pure and appliedsciences, including Food Science andApplied Microbiology.

TESTING TRENDS AND PREDICTIONS–There is no question that many microbio-logical tests are being conducted natio-nally and internationally in agriculturaland food products, environmental sam-ples, medical specimens, and watersamples. The most popular tests aretotal viable cell count, coliform/E. colicount and yeast and mold counts. Alarge number of tests are also performedon pathogens such as Salmonella,Listeria and Listeria monocytogenes, E.coli O157:H7, Staphylococcus aureus,Campylobacter and other organisms.According to reliable sources in 1998,the worldwide microbiological tests wasestimated to be 755 million tests with amarket value of US$1 billion. The projec-tion is that in 2008 the number of testswill be about 1.5 billion tests with a mar-ket value of US$5 billion. In 2007 aboutone third of the tests are being perfor-med in North America (USA andCanada), another third in Europe, andthe last third in the Rest of the World.This author predicts in twenty year theRest of the World will perform 50 % of thetests with North America and Europeperforming 25% each. This is due to rapideconomic developments and food andhealth safety concerns of the world inthe years to ahead.

PREDICTION OF THE FUTURE– The followingare the ten predictions made by theauthor in 1995. Many predictions havebeen correct in 2007. (+) is a good pre-diction. (?) is an uncertain prediction.

1. Viable cell counts will still be used inthe next 25 years. (+)

2. Real-time monitoring of hygiene willbe in place. (+).

3. PCR, Ribotyping, and genetic tests willbecome reality in food laboratories.(+)

4. ELISA and immunological tests willbe completely automated and widelyused. (+)

5. Dipstick technology will provide rapidanswers. (+)

6. Biosensors will be in place for HazardAnalysis Critical Control Point pro-grams. (?)

7. Biochips, microchips, and nanotech-nology will greatly advance in thefield. (+)

8. Effective separation, concentration oftarget cells will assist rapid identifi-cation. (+)

9. A microbiological alert system will bein food and other packages. (?)

10. Consumers will have rapid alert kitsfor pathogens at home. (?)

In conclusion, it is safe to say that the fieldof rapid method and automation in micro-biology will continue to grow in numbersand kinds of tests to be done in the futuredue to the increase concern on foodsafety and public health. The future looksvery bright for the field of rapid methodsand automation in microbiology. Thepotential is great and many exciting deve-lopments will certainly unfold in the nearand far future in Food Microbiology andother applied microbiology areas.

REFERENCES–• Fung, D. Y. C. 2002. Rapid Methods and

Automation in Microbiology.Comprehensive Reviews in Food

Contamination

Pollution FDT Extrapolated FDT Scale of beach pollutioncategory (CFU/10 ml) (CFU/100 ml)

I 0 <10 CFU Uncontaminated

II 1-10 CFU 10-100 CFU Non-point contamination

III 11-50 CFU 110-500 CFU Sewage contamination

IV >50 CFU >500 CFU Elevated Sewage


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Science and Food Safety. InauguralIssue, Vol 1(1), 3-22 (www.ift.org).

• Fung, D. Y. C., R. Fujioka, K. Vijayavel, D.Sato, and D. Bishop. 2007. Evaluation ofFung Double Tube for Clostridium per-fringens and Easyphage Test for F-Specific RNA Coliphages as RapidScreening Tests for FecalContamination in Recreational Watersin Hawaii. Journal of Rapid Methodsand Automation in Microbiology, Vol15(3), 217-229.

BIOGRAPHIC DETAILS– Daniel Y. C. Fung,M.S.P.H., Ph.D., is a Professor of FoodScience at Kansas State University(KSU). He is the Founder and Director ofthe world renowned InternationalWorkshop of Rapid Methods andAutomation in Microbiology since 1981at KSU. He has published more than 800papers and is a Fellow of AmericanAcademy of Microbiology, Institute ofFood Technologists and InternationalAcademy of Food Science and

Technology. In 2006 he was honored asUniversitiy Distinguished Professor atUniversitat Autonoma de Barcelona,Spain. In 2007 he completed 33 Ph.D.and 67 M.S. degree students as theMajor Professor. In 2007 he won theInaugural Outstanding Educator in FoodSafety Award given by Food SafetyMagazine and ConAgra Foods and pre-sented at the 2007 InternationalAssociation for Food Protection Annualmeeting in Florida.

CCéécciillee LLaahheelllleeccAgencia Francesa para la

Seguridad Alimentaria (AFSSA)

cé[email protected]

VII WORKSHOP MRAMA . BARCELONA.25 NOVEMBER 2008During the past decades, something like atornado could be observed in the sky ofFood Safety . Happily, while that topic beca-me more and more important for the consu-mers as well as for public authorities andindustrials , a lot of efforts to find newmicrobiological methods adapted to thenew needs were developed.However , due to the important demands inFood Safety ,one is allowed to ask itself thefollowing question: do methods used inFood microbiology satisfy actual needs forFood Safety implementation ? In order to answer that question, at leastpartly, I would like to share with you a fewdata concerning at first the analysismethods used in Food microbiology for pro-ducts analysis and their evolution duringthe past decades ; then , we shall examinebriefly the needs for Food safety implemen-tation . Finally , we’ll try to answer the ques-tion Do methods used in Food microbiologysatisfy actual needs for Food safety imple-mentation? and draw a few conclusions

METHODS USED IN FOOD MICROBIOLOGY – I-11-- GGEENNEERRAALL AASSPPEECCTTSSClassically, methods used in Food microbio-logy are divided into two groups :- Qualitative methods, based on the isola-

tion, identification and characterizationof presumed pathogenic microorganisms

- Quantitative methods based on theenumeration of microorganisms onagar or in liquid medium, using themost probable number technique .

During a long period , methods used inFood microbiology were based exclusi-vely on the use of culture media .However, from a few decades, followingtheir development in medical microbio-logy, alternative methods have beeninitiated in the field of Food microbiologyand, as you probably know, the “father”of those new, rapid methods is Dr Fungwho, as you know, is the keynote spea-ker and Major lecturer of this workshop.At the moment , one is able to find a lotof microbiological kits on the market toidentify, characterize or enumeratemicroorganisms and it is somewhathard to choose and decide the bestmethod for a given purpose or accordingto the type of laboratory .As you probably know, during a longtime, some legal requirements limitedthe use of alternative methods .However, we shall see that the situationhas somewhat changed by now and wecan classify methods used in Foodmicrobiology into the following ones :• Reference methods, which are com-

plete expertise methods; they are usedespecially in the case of discordancein the results obtained by two labora-tories; their main advantage is theirinternational recognition (ISO, CEN);till recently they were based exclusi-vely on classical principles .

• Routine methods (in France at least),which are reference simplified methods;in a first step, those methods are experi-mental and published for two years; thecomments of users during that periodare used for their revision and homolo-gation .

• Alternative validated methods you willstudy during the present workshop: theyallow to analyse and estimate for onecategory of product the same value asthat given by the reference method;moreover, they have to answer one ormore of the following criteria: rapidity,facility to perform, analytical characte-ristics .

• Internal methods which are used insome laboratories; that is the reasonwhy a standard concerning specificallyintralaboratory validation of internalmethods has been developed.

• Sectorial methods, whose opportunity isexamined in different groups of ISO, forexample concerning canned products.

II--22-- TTHHEE MMEETTHHOODDSS UUSSEEDD MMAAYY BBEE DDIIFFFFEE--RREENNTT AACCCCOORRDDIINNGG TTOO TTHHEE MMIISSSSIIOONNSS OOFFLLAABBOORRAATTOORRIIEESS..

PPuubblliicc aanndd (( iinn ssoommee ccaasseess )) pprriivvaattee llaabboo--rraattoorriieessIn France and in most countries , micro-biological food controls have to answer todifferent purposes :- Official controls which are realized

using standard reference methods - Auto-controls : they are performed

using reference or alternative methods

DDOO MMEETTHHOODDSS UUSSEEDD IINN FFOOOODD MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGYY SSAATTIISSFFYY AACCTTUUAALL NNEEEEDDSS FFOORR FFOOOODD SSAAFFEETTYY IIMMPPLLEEMMEENNTTAATTIIOONN??




- Expertises in case of disagreement bet-ween laboratories which are performedusing reference methods

- Analyses performed in case of foodbor-ne outbreaks : in that case, internalmethods are used systematically but,simultaneously, reference or validatedmethods are undertaken in order tiobtain a confirmation .

PPrriivvaattee llaabboorraattoorriieess ooff FFoooodd iinndduussttrriieessIn those laboratories, the analysesdepend mostly of the applications forwhich they are requested .: quality con-trol, production lines, end-products, envi-ronment, cleaning, HACCP or quality assu-rance . In that context, different types ofmethods may be used ; the choice mayvary according to the objective .For a long time, only the results obtainedwhen using standard methods were offi-cially recognized but it is obvious thatstandard methods do not always answerindustrial needs , but we have also tomention that the diversity of alternativemethods is such that it is very difficult todecide which method must be used andthat is true, even for industrials involvedin standardization works .Happily, validation of alternative methodshas been considered quite early in diffe-rent countries but the situation can beconsidered as clear only from the publi-cation of the EC regulation 2073/ 15December 2005 concerning microbiologi-cal criteria “Test results are dependent onthe analytical method used and, therefore,a given reference method should be asso-ciated with each microbiological criterion.However, Food business operators shouldhave the possibility to use analyticalmethods other than the referencemethods in particular more rapid methodsas long as the use of these alternativemethods provide equivalent results. “Moreover, the use of new principles cannow be introduced in standard methods,as it was decided 4 years ago during a joi-ned meeting of ISO /TC34/ SC9 andCEN/TC275/WG6:1- Each time a standard method is being

revised, the possibility of using newtechnologies, including PCR, must beexamined by comparing results withthose obtained when using the officialconventional method.

2- For a given microorganism, in order tocomplete the existing method, , thedevelopment of standardized methods

based on new technologies can beproposed when the purpose to beobtained (for example pathogenicitylevel) makes it necessary .

3- When new technologies , includingPCR, are used as alternative methods,they must be validated against the refe-rence method. “ So, after a long period , we have now torecognize that innovation has found itsplace in Food microbiology.

However,one additional and importantpoint must not be forgotten: we have toinclude in the word “method” a lot ofparameters including sampling , transportand preparation of the sample, preenrich-ment, enrichment and measurementuncertainty ..which I did not develop inthis first part.

IIII-- TTHHEE MMEETTHHOODDSS UUSSEEDD IINN FFOOOODD MMIICCRROO--BBIIOOLLOOGGYY MMUUSSTT AANNSSWWEERR TTOO NNEEWWNNEEEEDDSS . Of course , as we have seen , official andindustrial controls have been existing for along time and the HACCP method hasbeen introduced in different industries,from many decades now, with the wish ofindustrials to get a production as safe aspossible .However, there were very important diffe-rences in the way the controls were orga-nized and the relationship between Foodand the consumer’health was not consi-dered as obvious, except in a few cases offoodborne outbreaks . For a long time, this relationship has beenunderestimated; then, the problem of BSE,the recognition of Food as responsible oflisteriosis outbreaks… has lead to an ove-restimation which conducted the authori-ties to undertake a lot of efforts to protectthe consumers (what I above mentionedas a tornado). When we look at the new world of Foodsafety,this evolution appears as a conse-quence of a long period during which a lotof work has been realized in differentfields: setting up regulations in differentcountries, introduction and implementa-tion of the HACCP concept in differentindustries and, what is also wonderful, allefforts done in the purpose of setting upnew techniques, more rapid, cheaper andeasy to handle… It looks somewhat as ifsomebody had to prepare a piece of workand, if that purpose, a lot of people, belon-ging to different groups, knew they had toparticipate to that purpose, each group

working without knowing the work beingdone in different parts of the world .So, very important changes have appea-red at the beginning of the new millen-nium. From 1998, different national agen-cies for Food safety were created and, inDecember 1998, a meeting of all thoseagencies was held in Paris in order toexchange ideas, concepts and projects inthe field of Risk analysis . On January 12, 2000, David Byrne , actingas EC Commissioner for Health andConsumer protection, presented the“White paper” which gave new orienta-tions and directives to eennssuurree FFoooodd ssaaffeettyypprrootteeccttiioonn iinn aallll ccoouunnttrriieess ooff EEUU . He pro-posed to prepare a coherent set of rules inorder to modernize the legislation and toreinforce controls from farm to table .Moreover , he recommended the creationof an independent Authority to give inde-pendent scientific advices and provide aclear communication on risks .Following the presentation of the WhitePaper, on 28 January 2002, the EuropeanParliament and Council adopted the regu-lation EC 178/2002laying down generalprinciples and requirements of the FoodLaw. The objectives were as follows: - achieve effective control systems;- prepare international relations with

third countries;- work in relation with the European Food

Safety Authority in order to insure ascience based risk management.

So, the White paper outlined a radicalrevision of the EU’s food hygiene rules .The hygiene package aims to harmoniseand simplify very detailed hygiene requi-rements scattered over 17 directives.Finally , it includes five regulations whichcan be considered as the basis of the con-trols which have to be realized from farmto fork in order to establish the traceabilityof products and ensure Food safety for theconsumers. Of course, the Food law is only the basis ofthe regulation; later, subsequent regula-tions providing additional details havebeen set up, including microbiological cri-teria for foodstuffs (CommissionRegulation EC N° 2073/2005 updated byCommission Regulation 1441/2007) andalso Implementation measures includingprovision methods for food and chaininformation . OOnnee kkeeyy aassppeecctt ooff tthhee nneeww lleeggiissllaattiioonn iisstthhaatt aallll ffoooodd aanndd ffeeeedd bbuussiinneessss ooppeerraattoorrsswwiillll hhaavvee pprriinncciippaall rreessppoonnssiibbiilliittyy ffoorr iinnssuu--


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rriinngg tthhaatt ffoooodd ppllaacceedd oonn tthhee EEUU mmaarrkkeettmmeeeettss tthhee rreeqquuiirreedd ffoooodd ssttaannddaarrddss.. That may appear as a quite impossiblechallenge . However, we have to take pro-gress into account and look at what isreally done “ in the field”. I think the first perception we may havewhen looking at the new regulations is towonder how to implement the require-ments in terms of sampling , analyzing ,interpreting the results in order to ensureFood safety. Another question is: how tobe sure that the controls set up and reali-zed by laboratories are in conformity withthe official requirements.One part of the answer is surely given inthe necessity for each group of producersto propose a Guide of good hygiene prac-tices . Those guides whose main purposeis to avoid any problem of Food safetydescribe the way in which the HACCPconcept is implemented and must be sub-mitted by the administration for agree-ment . In those guides , the critical points aredefined as well as number of samples tobe examined, the nature of the samples,the microbiological methods used …inthat context, the sentence included in theregulation concerning the microbiological

method above mentioned is very impor-tant as it gives the possibility of usingalternative methods instead of referencestandard methods, when they have beenvalidated by an accepted protocol .Thatrepresents really a very important impro-vement compared to the situation a fewyears ago .

FINALLY, IIIII-- CCAANN WWEE AANNSSWWEERR TTHHEE QQUUEESSTTIIOONN““DDOO MMEETTHHOODDSS UUSSEEDD IINN FFOOOODD MMIICCRROO--BBIIOOLLOOGGYY SSAATTIISSFFYY AACCTTUUAALL NNEEEEDDSS FFOORRFFOOOODD SSAAFFEETTYY IIMMPPLLEEMMEENNTTAATTIIOONN““?? When trying to summarize and draw afew conclusions , we observe a lot ofimprovements which help to satisfy theneeds but, at the same time, we must con-fess that the situation is not perfect andthat difficulties remain.Among the improvements, we can men-tion that rapid and alternative methodsallow to analyse a far higher number in agiven period of time than classical ones.Presently, the alternative methods can beused currently subject to their validation . - Molecular methods allow to help a lot in

the traceability approach .- At the same time (I did not develop this

aspect today), we have to recognize

that efforts have been done in the fieldof interpretation of the results , inclu-ding measurement uncertainty ,through the work of standardizationgroups (one meeting should be held inValencia next year)

We have by now, the advantage ofInternet communication….Concerning the difficulties, we can saythat, even if rapid, alternative methodsallow to examine a higher number of sam-ples than the standard ones within thesame period of time , we must considerthe analysis of a sufficient number ofsamples will always be insufficient, atleast for financial reasons .- The choice of a method , even for a

given objective, will always remain adifficult one. Among the difficulties , wemust not forget the eventuality of fin-ding higher positive results than whenusing a standard method .

But, finally , even if it is realistic to wait fornew improvements , my opinion is that,objectively, we can answer that methodsused in Food microbiology are presentlyon the right way to satisfy actual needs inFood safety implementation . The “torna-do” had surely profitable consequen-ces…

LLAA PPOOLLYYMMEERRAASSEE CCHHAAIINN RREEAACCTTIIOONN ((PPCCRR))

AArrmmaanndd SSáánncchheezz BBoonnaassttrreeDepartamento de Ciencia Animal

y de los Alimentos

Universitat Autònoma de Barcelona

[email protected]

La reacción en cadena de la polimerasa(conocida como PCR por sus siglas eninglés, Polymerase Chain Reaction) esun método de análisis de ácidos nuclei-cos, desarrollado por Kary Mullis amediados de los años 80, para producirgrandes cantidades de un fragmentoespecífico de ADN de secuencia y longi-tud definida a partir de una pequeñacantidad de material inicial.La técnica permite amplificar selectiva-mente una molécula de ADN o ARNvarios millones de veces en pocas horas.Mediante la PCR podemos realizar ladetección y análisis de secuenciasespecíficas de un gen sin necesidad deaislarlo previamente por técnicas de clo-nación de ADN. Los análisis pueden rea-

lizarse a partir de unas pocas células ode una mínima cantidad de muestra bio-lógica sin la necesidad de aislar previa-mente grandes cantidades de ácidosnucleicos.La PCR ha revolucionado el campo deldiagnóstico molecular y se ha convertidoen una técnica de rutina en el ámbito dela genética, la microbiología y la biotec-nología.

PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA PCR– La PCRse fundamenta en la amplificación enzi-mática de un fragmento de ADN flan-queado por dos secuencias de oligonu-cleótidos que hibridan en la cadenacomplementaria de la molécula moldeque se va a amplificar (cebadores o “pri-mers”) y que son utilizados por una ADNpolimerasa termoresistente (general-mente se emplea la de la bacteria termó-fila Thermus aquaticus, capaz de crecera elevadas temperaturas) para copiar lasecuencia de la misma.

La reacción es un proceso que consta de3 etapas (repetidas unas 30-35 veces):desnaturalización, hibridación de loscebadores y extensión de los mismos.DDeessnnaattuurraalliizzaacciióónn: Para que pueda ini-ciarse la reacción es preciso que lasmoléculas de ADN molde se encuentrenen forma de cadena simple. Esto se consi-gue calentando a temperaturas de 90 a95ºC para que produzca la rotura de losenlaces puente de hidrógeno intercatena-rios y la separación de ambas cadenas.Para asegurar la completa separación dela doble cadena del ADN esta temperatu-ra debe mantenerse unos minutos. Si elADN solo se desnaturaliza parcialmenteéste tenderá a renaturalizarse muy rápi-damente dificultándose una eficientehibridación de los primers y la posteriorextensión de los mismos.HHiibbrriiddaacciióónn: Una vez que el ADN está des-naturalizado se disminuye la temperaturade la reacción hasta un rango comprendi-do entre los 40 y los 60ºC para que se




pueda producir la hibridación específica delos cebadores a las secuencias flanquean-tes del fragmento que se desea amplificar.Esta etapa se denomina también fase de“annealing” y la temperatura a la que serealiza debe establecerse para cada reac-ción en función de la longitud de los ceba-dores y su secuencia (temperaturas inferio-res a la óptima nos producirán hibridacio-nes inespecíficas de los cebadores y tem-peraturas superiores nos dificultarán la efi-ciencia de la misma). EExxtteennssiióónn: Durante esta etapa la ADN poli-merasa termoresistente incorpora nucleóti-dos en el extremo 3' del cebador utilizandocomo molde la cadena de ADN previamen-te desnaturalizada. La temperatura a la quese realiza esta etapa de la reacción sueleser de 72ºC ya que es la temperatura a laque la Taq polimerasa alcanza su máximaactividad. Normalmente una extensión de20 segundos es suficiente para fragmentosmenores de 500 pares de bases, y 40segundos para fragmentos por encima de1.2Kb.Al finalizar cada uno de los ciclos el núme-ro de copias obtenidas se duplica y des-pués de 20 ciclos ya tenemos aproximada-mente 1 millón de copias de cada una delas moléculas molde iniciales de ADN.La técnica puede usarse para la amplifica-ción de moléculas de ARN si previamentese realiza una copia de las mismas median-te la enzima transcriptasa reversa. De estemodo podemos realizar estudios sobremoléculas de ARNm o bien la podemosaplicar para la detección de virus ARN.La elección de los cebadores y el tamañodel fragmento amplificado es de granimportancia para el resultado final. En prue-bas de diagnóstico el tamaño del fragmen-to amplificado no debe superar los 100-150pares de bases de ADN si partimos demuestras que puedan haber sufrido unadegradación de los ácidos nucleicos y laelección de los cebadores debe realizarsepara fragmentos específicos de la dianaque queramos amplificar para evitar falsospositivos.Una vez realizada la amplificación, se pro-cede a la identificación de la secuenciaobtenida mediante electroforesis, hibrida-ción con sondas complementarias o técni-cas de análisis de polimorfismos.El análisis por PCR puede ser de dos tipos:cualitativo (detección de la presencia oausencia de un fragmento de ADN determi-nado) o cuantitativo (detección de la canti-dad de un fragmento de ADN determinado).

ANÁLISIS CUALITATIVO DE ADN MEDIANTE

PCR– Este tipo de análisis se suele realizarcuando tan sólo es necesario conocer lapresencia o ausencia de alguna secuenciaespecífica de ADN o ARN, como por ejem-plo la detección de la presencia de un pató-geno en una muestra. El análisis del pro-ducto amplificado suele realizarse median-te electroforesis en gel o capilar y su visua-lización por tinción en bromuro de etidio opor detección fluorescente si previamentehemos utilizado uno de los cebadores mar-cado con algún tipo de fluorescencia.En algunos análisis resulta necesario iden-tificar la secuencia del producto amplifica-do y el producto de la PCR debe ser some-tido a un análisis específico (secuencia-ción, digestión con enzimas de restricción...etc.).

ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ADN MEDIANTE

PCR– La PCR convencional no es una téc-nica cuantitativa ya que la amplificaciónexponencial del ADN molde no se mantieneconstante especialmente en los últimosciclos de la reacción.Para poder realizar estimas cuantitativasse han desarrollado técnicas de PCR en“tiempo real” (PCR cuantitativa) en las quees posible determinar la fase exponencialde la amplificación y poder extrapolar deforma cuantitativa la cantidad de molde ini-cial que se esta amplificando.La metodología de PCR cuantitativa, facilitaademás la automatización y no suelerequerir el procesamiento ulterior del pro-ducto amplificado lo que reduce el riesgode contaminación. En la actualidad, existen en el mercadovarios equipos y protocolos para la realiza-ción de esta técnica. Desde el punto devista de la detección del producto amplifi-cado en cada ciclo, existen tres métodosprincipales de análisis de PCR cuantitativabasados en técnicas de fluorescencia yque se diferencian en el tipo de detecciónde los productos de PCR. Estos métodosson: el que emplea una sonda con doblemarcado fluorescente (TaqMan ®) especí-fica de la secuencia amplificada, los basa-dos en el uso de dos sondas que hibridande forma adyacente en el fragmento queamplificamos y, por último, el que utiliza unasustancia intercalante que se une a ladoble cadena de ADN denominado SYBRGreen I y produce emisión de fluorescen-cia.El método más difundido, es el que empleasondas TaqMan®. Este método se basa en

la actividad 5’-exonucleasa de la Taq poli-merasa y en la amplificación mediante PCRde una determinada secuencia diana enpresencia de una sonda fluorescente espe-cífica (sonda TaqMan®) que hibrida con lasecuencia diana que estamos amplifican-do. La sonda TaqMan®, de un tamaño apro-ximado de 20-30 bases, tiene unido un fluo-rocromo en posición 5’ y un segundo fluoro-cromo que actua por interferencia con elprimero cómo amortiguador de fluorescen-cia en posición 3’. Además, esta sonda estáfosforilada en 3’ para evitar su extensióndurante la reacción de PCR. Si la secuenciadiana está presente en la muestra, la sondaTaqMan hibridará específicamente conella, situándose entre los dos cebadores.Cuando se produce la etapa de extensiónen la reacción de PCR, la actividad 5’-exo-nucleasa de la Taq polimerasa degrada a lasonda TaqMan liberando el fluorocromo,que al quedar separado del amortiguadoremitirá una señal que puede ser captadapor el sistema óptico del equipo. Este pro-ceso de degradación de la sonda tienelugar en cada uno de los ciclos y es direc-tamente proporcional al número de molé-culas que están siendo extendidas en cadauno de ellos que podemos visualizar por elincremento de la señal de fluorescencia.Además, la Taq polimerasa no digiere lasonda libre sino únicamente la hibridada,por lo que la cantidad de señal fluorescen-te emitida es proporcional a la cantidad deproducto acumulado. La medición de laintensidad de fluorescencia se realiza deforma continúa lo que nos proporciona unainformación dinámica en tiempo real delproceso. El sistema de detección permiteestablecer el ciclo umbral (Ct-cycle thres-hold), ciclo de la PCR a partir del cual lacantidad de fluorescencia emitida alcanzael nivel de detección que hayamos fijado, loque a su vez se correlaciona directamentecon la cantidad de ADN molde de la mues-tra analizada. La cuantificación del númerode copias de una muestra se realizamediante la comparación de la Ct de lamuestra problema con la Ct de una serie dediluciones de una muestra-control positiva.La cuantificación de la muestra controlpositiva permite establecer una curvaestándar que refleja el número de copias yel número de ciclo en el que ha sido realiza-da la detección de forma objetiva y repro-ducible.Cuando se realiza la cuantificación de unamuestra problema, el ciclo umbral de sudetección se lleva a la curva estándar lo


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que permite conocer el número de copiasde la secuencia diana existente en la mues-tra analizada.El método de PCR cuantitativa basado en laquímica por hibridación de sondas, empleados sondas secuencia-específicas quehibridan en regiones adyacentes espacia-das entre uno y cinco nucleótidos. Unasonda está marcada con un fluorocromoemisor en posición 3’ y la otra sonda estámarcada con un fluorocromo aceptor en suextremo 5’. Esta sonda además tiene blo-queado su extremo 3’ con un grupo fosfatopara evitar su extensión. Sólo cuando lasdos sondas han hibridado y están próximasse origina una emisión de fluorescencia porel fluorocromo aceptor cuya intensidadaumenta proporcionalmente a la cantidadde secuencia diana formada en la reacciónde PCR. Esta metodología se diferencia dela química de sondas TaqMan® en que nose requiere la hidrólisis de sonda para laemisión de fluorescencia.

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TTRRAANNSSGGÉÉNNIICCOOSS,, NNUUTTRRIIGGEENNÉÉTTIICCAA YY NNUUTTRRIIGGEENNÓÓMMIICCAA EENN AALLIIMMEENNTTAACCIIÓÓNN

DDaanniieell RRaammóónn VViiddaall 11,,22

1Instituto de Agroquímica y

Tecnología de Alimentos (IATA)

Consejo Superior de Investigaciones

Científicas (CSIC)

[email protected]ópolis, SL

EL EMPLEO DIRECTO DE LA GENÉTICA EN LA

AGROLIMENTACIÓN: MEJORA GENÉTICA DE LOS

ALIMENTOS– La comunidad científica

entiende por biotecnología el uso de unorganismo vivo con un propósito industrial.Biotecnología de alimentos no es más queel uso de seres vivos en la producción dealimentos, lo que incluye toda la alimenta-ción, porque todo cuanto comemos son, ohan sido, seres vivos, ya sean animales,vegetales, o alimentos o bebidas fermenta-das por un microorganismo. Pero el consu-midor, sobre todo el europeo, tiene una per-

cepción distinta de lo que es y entiende queéste término hace referencia a la aplica-ción de la genética en la alimentación. Enotras palabras, los consumidores europeosentienden por biotecnología de alimentos“poner genes en su sopa”. Hay que recordar a los consumidores quela genética se ha aplicado en la alimenta-ción desde que comenzó la agricultura y laganadería. Desde entonces el hombre ha




mejorado empíricamente el genoma de lasvariedades vegetales comestibles, lasrazas animales y los fermentos. Esta mejo-ra se ha fundamentado en la aparición demutantes espontáneos, la variabilidadnatural, y la aplicación del cruce sexual ohibridación. De esta forma se han obtenidovariedades de trigo con espigas incapacesde dispersar sus semillas en la naturaleza,pero capaces de generar unas harinaspanaderas con inmejorable aptitud tecno-lógica, o patatas comestibles al contenerniveles mínimos de alcaloides tóxicos.Desde hace treinta años los científicos aís-lan en el laboratorio fragmentos concretosque portan genes determinados. Esosgenes se pueden variar en el tubo de ensa-yo y se pueden reintroducir en el organis-mo natural o en uno distinto generando untransgénico. Al global de estas técnicaslas llamamos ingeniería genética y cuandose aplica en el diseño de un alimento sur-gen los llamados alimentos transgénicos.Hoy se comercializan muchos alimentostransgénicos en todo el mundo, sobretodo en Estados Unidos, Australia, Canadáy China. Los más conocidos son la sojaresistente al herbicida glifosato y el maízBt aunque existen muchos más. Son degran importancia los que hacen referen-cia a la mejora nutricional de los alimen-tos. Desde algunas organizaciones ecolo-gistas se acusa a los alimentos transgéni-cos de ser un veneno para la salud y elmedioambiente. No es cierto. Desde hacemás de quince años, FAO, OCDE y OMShan establecido grupos de trabajo paraevaluar la seguridad para el consumidorde los alimentos transgénicos. Se ha lle-vado a cabo una evaluación de riesgossanitarios de todos los alimentos transgé-nicos comercializados atendiendo al con-tenido nutricional, la posible presencia dealérgenos y el nivel de toxicidad. Son losalimentos más evaluados de la historia dela alimentación y no disponemos de undato científico que indique que represen-ten un riesgo para la salud del consumidorsuperior al que implica la ingestión del ali-mento convencional correspondiente.Este hecho ha sido puesto de manifiestopor la OMS en su página de internet. Esinteresante destacar que tras la publica-ción de esta decisión dichos grupos hanvariado su estrategia y apenas hablan delos riesgos sanitarios de los transgénicospero si de los riesgos ambientales. Ahí lascosas son menos claras porque hay unafalta de metodologías para analizar este

tipo de riesgos que afectan tanto a lasplantas transgénicas como a las conven-cionales. Aun así debemos afirmar concontundencia que existen tres posiblesriesgos: la transferencia de los genes exó-genos desde la variedad transgénica avariedades silvestres, la pérdida de biodi-versidad y los efectos dañinos que ciertasplantas transgénicas resistentes a insec-tos pueden tener sobre poblaciones deinsectos distintos de aquellos contra losque protegen. Todos estos riesgos yaexisten con las variedades convenciona-les. Por ello, la cuestión clave es conocersi el empleo de transgénicos acelerará laaparición de estos riesgos. Parece queno, siempre que se mantengan y mejorenlas normas de evaluación que empleamosactualmente con las plantas transgéni-cas. Finalmente debemos considerar losriesgos económicos. El 90% de los agri-cultores que utilizaron semillas transgéni-cas en el 2006 eran agricultores pobres depaíses en desarrollo. Una realidad muylejana del estereotipo que hace de lotransgénico un negocio en manos depocas compañías multinacionales.Pero conviene debatir acerca de la opi-nión del consumidor sobre los transgéni-cos. En general, y destacando la falta deformación e información en biotecnologíade nuestra sociedad, así como la constan-te presencia de los grupos en contra enlos medios de comunicación, los percibencomo algo peligroso. Por ello resultaimportante la divulgación de los datosreales que desde la Ciencia tenemos deestos productos.

LAS NUEVAS APLICACIONES DE LA GENÉTICA

EN LA AGROALIMENTACIÓN: NUTRIGENÉTICA Y

NUTRIGENÓMICA– En el año 2003 se hizopública la secuencia que conforma nues-tro genoma, el genoma humano. Somospoco más de 23.000 genes interaccionan-do con el ambiente. Pero lo que somos nodepende de nuestro color de piel, ni denuestro credo político o religioso; estáescrito en ese alfabeto molecular y se tra-duce en función de nuestro ambiente físi-co o cultural. Es evidente el impacto de lagenómica en nuestra vida cotidiana y elloha dado lugar a la aparición de dos nue-vas disciplinas científicas: la nutrigenéti-ca y la nutrigenómica. Por nutrigenéticaentendemos la disciplina científica queestudia el efecto de las variaciones gené-ticas entre individuos en la interaccióndieta y enfermedad. Por nutrigenómica

aquella que estudia el efecto de losnutrientes de los alimentos sobre laexpresión de nuestros genes. Con suempleo empezamos a entender como seva a definir en el futuro una alimentacióna la carta en función de lo que podríamosllamar “pasaporte genético”. Puede que amuchos les aterre, pero quizás no lo veantan grave si piensan en la ventaja quepara un recién nacido puede suponer quesus padres sean informados sobre unaposible mutación en su genoma que lepredisponga a desarrollar una enferme-dad cardiovascular si su alimentación noes adecuada. Es claro el enorme potencial que el cono-cimiento del genoma humano puede teneren las pautas de alimentación, pero noserá menor el que tenga la secuenciaciónde los genomas de otros organismos vivosde interés agroalimentario. Hasta ahorase han secuenciado totalmente más dequinientos genomas distintos y hay másde setecientos proyectos de secuencia-ción en marcha. Algunos de ellos se refie-ren a animales, plantas o microorganis-mos de relevancia alimentaria, como porejemplo el arroz, la levadura panadera, labacteria Bifidobacterium bifidum (usadaen muchos productos probióticos) o pató-genos responsables de toxiinfeccionesalimentarias como Escherichia coli. Elconocimiento de los genes que componenel genoma de estos organismos permiteconocer sus genes clave para así definirestrategias de mejora por genética clási-ca (la llamada mejora asistida por marca-dores) o por ingeniería genética, desarro-llar mecanismos de defensa frente a supatogenicidad, o descubrir nuevas funcio-nes fisiológicas con impacto nutricional.La secuenciación de genomas ha sidohasta ahora una técnica costosa en tiem-po y dinero. Hace apenas un año se des-cribió una nueva técnica de secuencia-ción basada en el empleo de nanomate-riales. Dicha técnica se denomina pirose-cuenciación y permite secuenciar geno-mas de forma masiva en mucho menostiempo y a un menor costo. Por ejemplo, latecnología clásica de secuenciación apli-cada en un laboratorio convencional tar-daba en secuenciar el genoma de unabacteria láctica un tiempo variable entreuno y tres años. Con la tecnología de piro-secunciación es posible hacerlo en tansólo ocho horas y por un precio en costode materiales diez veces menor al de latecnología convencional. Sin duda la piro-


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secuenciación va a revolucionar lasecuenciación de genomas y también delos llamados metagenomas. Con este últi-mo sustantivo se hace referencia a lasecuenciación de DNA extraído de unecosistema, de forma que a partir de losdatos de secuencia es posible inferir losorganismos presentes en dicho nichoecológico. Su aplicación en alimentacióny nutrición es más próxima de lo quemuchos imaginan. Por ejemplo, reciente-mente se han llevado a cabo proyectos desecuenciación masiva en voluntarioshumanos, determinándose que más detrece mil cepas bacterianas distintas pue-blan nuestro tracto digestivo. Tambiénmediante el empleo de metagenómica sehan detectado diferencias en la composi-ción de la flora microbiana del tracto

digestivo de individuos obesos. Son losprimeros resultados de una tecnologíapotente que permitirá conocer aspectosnuevos de nuestra fisiología y su relacióncon la alimentación.Podemos concluir por todo lo expuestoque el futuro de la genética en la alimen-tación es importante. La época en que lostecnólogos de alimentos eran expertos enel manejo de las tuberías de las instala-ciones industriales ha quedado lejos. Lanueva tecnología de alimentos precisa denuevos profesionales que entiendan laimportancia de la biotecnología y la gené-tica y también puedan discutir sobreconocimientos de otros campos del sabercomo la farmacología, la nutrición, el con-trol automático de sistemas o las nanotec-nologías.

BIBLIOGRAFÍA–1.- Fedoroff N. (2004). Mendel in the kitchen.Joseph Henry Press, Washington.2.- Pafundo S, Agrimonti C, Maestri E, MarmiroliN. (2007). Applicability of SCAR markers to foodgenomics: olive oil traceability. J. Agric. FoodChem. 55:6052-6059. 3.- Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA,Magrini V, Mardis ER, Gordon JI.(2006). An obe-sity-associated gut microbiome with increasedcapacity for energy harvest. Nature 444:1027-1031. 4.- Withee J, Dearfield KL. (2007). Genomics-based food-borne pathogen testing and diagnos-tics: possibilities for the U.S. Department ofAgriculture's Food Safety and InspectionService. Environ. Mol. Mutagen. 48:363-368.

IIMMPPLLEEMMEENNTTAACCIIÓÓNN DDEELL SSIISSTTEEMMAA TTEEMMPPOO EENN LLAA RRUUTTIINNAA DDEELL LLAABBOORRAATTOORRIIOO DDEE CCOONNTTRROOLL DDEE CCAALLIIDDAADD

GGRRUUPPOO GGAALLLLIINNAA BBLLAANNCCAA –– SSTTAARR

JJoosseepp--JJuulliiàà AAnnttóónn GGaarrccííaa Grupo Gallina Blanca – Star

[email protected]

OBJETIVO– compartir la experiencia de laimplementación del sistema Tempo deBioMérieux en el laboratorio de Control deCalidad de Gallina Blanca – Star en la fábri-ca de Sant Joan Despí y de esta maneraproporcionar elementos de juicio que ayu-den en la toma de decisiones similares.

EMPECEMOS CENTRANDO EL ENTORNO EN EL

QUE SE HA LLEVADO A CABO ESTA IMPLEMEN-TACIÓN– La fábrica del Grupo GallinaBlanca – Star en Sant Joan Despí en laactualidad está dedicada a al elaboraciónde caldos, sopas, sazonadores, platospreparados y salsas deshidratados pormezclado de ingredientes deshidratados yenvasado en múltiples formatos. La plan-ta, sus procesos y su sistema de calidad yseguridad alimentaria se encuentran cer-tificados por los estándares de BritishRetail Consortium e International FoodStandard. La complejidad viene dada por la extensagama de referencias de productos acaba-dos (unos 400) para lo cual es necesarioemplear alrededor de 60 materias primasde 200 proveedores diferentes.Disponemos de un laboratorio de controlde la calidad reconocido por el

Departamento de Agricultura, Ganaderíay Pesca de la Generalitat como capacita-do para la realización de controles decalidad sensoriales, microbiológicos yfísico-químicos. Centrando en los contro-les microbiológicos, el repertorio incluyepresencia/ausencia de Salmonella yListeria, y el recuento de flora total aero-bia, coliformes totales, Escherichia coli,enterobacterias, Bacillus cereus,Staphylococcus aureus, Clostridia,mohos, levaduras.Dentro de una fábrica toman especia rele-vancia las técnicas rápidas microbiológi-cas, en nuestro caso básicamente por lanecesidad de reducir al máximo el tiempode espera de dictamen para la acepta-ción/rechazo de las materias primas. Estapreocupación ha llevado a tomar iniciati-vas como la incorporación de un equipoMiniVidas BioMérieux para la determina-ción de presencia/ausencia de patógenos(Salmonella y Listeria) desde 2001, y dife-rentes alternativas para obtener elrecuento de indicadores de calidad:Malthus 2000 (de 1991 a 2002), BactometerBioMérieux (de 2002 a 2006) y TempoBioMérieux a partir de 2006.Bactometer BioMérieux, al igual queMalthus 2000, presentaban un claroinconveniente en nuestro caso: parapoder obtener un recuento era necesariorealizar una calibración que depende

fuertemente de la matriz, por lo tanto esinabordable para una planta con tantavariación. De esta manera, solamentepermiten utilizar un criterio pasa/no pasabasado en un tiempo sin señal de creci-miento. Este criterio obviamente se debefijar con un margen de seguridad muyalto, por lo que solamente permite descar-tar niveles de contaminación muy bajos.En el resto de casos (sobre un 15-20% enel caso de Gallina Blanca) es necesariorepetir la determinación mediante elmétodo tradicional. Como consecuencia,en una determinada proporción de mues-tras se gana tiempo, pero en el resto delos casos se pierde.Coincidiendo con un momento en el quese revisan los costes y cargas de estruc-tura de nuestra fábrica, BioMérieux iniciael proceso de desarrollo de un nuevo sis-tema destinado a remplazar Bactometer, ybasa su proyecto en conocer y dar satis-facción a las necesidades de los clientes.Obviamente los clientes de Bactometerexpresamos nuestras necesidades enfo-cadas a mejorar las limitaciones actuales:obtener un recuento validado con respec-to a los métodos oficiales salvando lanecesidad de calibraciones por tipo dematriz, o mejor aún, sin tener que efectuarcalibraciones, y que además pueda serrealizado por personal no especialista aun coste competitivo (ya puestos.....)




Conocer las expectativas de los clienteses fácil, pero para dar satisfacción hansido necesarios grandes esfuerzos cuyoresultado ha dado lugar al sistema Tempo.El sistema Tempo BioMérieux se basa enrecuento por la técnica del NMP de 48pocillos (16 x 3 volúmenes diferentes)miniaturizados e integrados en una tarjetade incubación, con un único protocolo detrabajo para todos los parámetros dispo-nibles:1. Preparación de la muestra en una

bolsa estéril provista de un filtro espe-cífico;

2. Inoculación/rehidratación del medio decultivo específico no selectivo pararecuento total de aerobios (TVC),selectivo para coliformes totales (TC),Escherichia coli (EC) y enterobacterias(EB) a la dilución establecida;

3. Llenado y sellado de las tarjetas enequipo automatizado;

4. Incubación de las tarjetas a la tempe-ratura y tiempo correspondientes;

5. Lectura por fluorescencia de los poci-llos con crecimiento positivo de las tar-jetas en equipo automatizado, con cál-culo del resultado expresado en ufc/gsegún tabla NMP y dilución empleada.

El medio específico utilizado incluye en suformulación un compuesto fluorescente,la 4-metil umbeliferona (4-MU). Para TVC yEC, la 4-MU se encuentra ligada a unsubstrato enzimático, no fluorescente. Laactividad bacteriana produce la hidrólisisde este substrato y se libera la 4-MU, pro-duciendo fluorescencia en los pocillosque son por lo tanto contabilizados comopositivos y los no fluorescentes, negati-vos. En cambio, para TC y EB el mediocontiene 4-MU libre a pH=7, presentando

fluorescencia inicialmente. En este caso,la acidificación del medio a causa de laactividad bacteriana es la que provoca laextinción de la fluorescencia ya que dejade serlo a pH inferior a 6. Así, los pocillosque presentan fluorescencia son negati-vos, y los que no presentan fluorescencia,positivos.El rango de lectura es ya de por si bastan-te amplio y varía según la dilución emple-ada, pero también puede ser ampliado encaso necesario encadenando dos o trestarjetas, es decir, utilizando 48, 96 o 144pocillos (Tabla 1)Los métodos Tempo han sido validadospor AFNOR como métodos rápidos alter-nativos con respecto al método tradicio-nal equivalente mediante la norma NF ENISO 16140 (octubre 2003) en productospara alimentación humana y de animalesde compañía, con excepción de bebidas,leche cruda y piensos (Tabla 2).La linealidad y exactitud de los métodosalternativos Tempo son equivalentes a lasde los métodos tradicionales en general,con una mejor reproducibilidad (con unatarjeta por parámetro, basta).La selectividad (TC, EC, EB) de los méto-dos alternativos Tempo son equivalentesa la de los métodos tradicionales, mos-trando una mejor recuperación para EC.Además de verificar las prestaciones delinealidad y exactitud, también se evalúanlas ventajas de índole práctico de los dife-rentes métodos:• Reducción del plazo de obtención de

resultados para TVC y EB.• Importante reducción del tiempo de tra-

bajo, considerando que además no esnecesaria la preparación de medios ymateriales, no es necesario preparar un

banco de diluciones ni inocular y trataruna serie de placas o tubos, no se reali-za la lectura e interpretación de colo-nias placa a placa, el tratamiento deresultados está integrado en la lectura,y se reduce enormemente la limpieza dematerial.

• Espacio de trabajo necesario menor quepor la técnica tradicional.

• Espacio de consumibles y espacio deincubación mucho menores que por latécnica tradicional.

• Formación analistas en menos de undía.

• Reducción del tratamiento de residuos.• Mantenimiento reducido (kit mensual

para verificación de la lectura de fluo-rescencia).

• Completa trazabilidad al identificarsedesde el principio la muestra con la tar-jeta y el vial utilizados por lector decódigo de barras y comunicación víaWifi entre la estación de llenado y la delectura.

Todos los compromisos tomados porBioMérieux con respecto a las necesida-des planteadas por sus clientes fueronpor lo tanto resueltas. Queda la última, yapuestos que fuese económicamente com-petitiva. En este punto es necesario revi-sar los costes internos que suponen lastareas y medios no necesarios con el sis-tema Tempo para compararlos con elcoste de los consumibles, la amortizacióny el mantenimiento del equipo, pero sí sepuede aportar un dato importante: un soloanalista entrenado puede realizar 500determinaciones Tempo en su jornada detrabajo.En el caso del laboratorio de control decalidad de Gallina Blanca se valorarontodos estos elementos y se tomó final-mente la decisión de implementar el siste-ma Tempo en junio de 2006.La implementación fue planificada cuida-dosamente, ya que obviamente su éxitoiba a contribuir a una reducción de losrecursos humanos necesarios en controlde calidad y dependía en gran medida de

Tabla 2.-

Método Tempo Método tradicional Validación AFNOR Incubación Procesado

TVC EN ISO 4833 7 Febrero 2003 BIO 12/15 – 09/05 40 h / 72 h 4 min/ 14 min

TC EN ISO 4832 7 Febrero 2003 BIO 12/17 – 12/05 24 h / 24 h 4 min / 10 min

EC NF ISO 16649-2 7 Julio 2001 BIO 12/13 – 02/05 24 h / 24 h 4 min / 11 min

EB NF ISO 21528-2 / Diciembre 2004 BIO 12/21 – 12/06 24 h / 72 h 4 min / 19 min

Tabla 1.-

Dilución 1 tarjeta 2 tarjetas 3 tarjetas

1/40 10-49.000 ufc/g 5-62.000 3-69.000

1/400 100-490.000 ufc/g 50-620.000 30-690.000

1/4000 1.000-4.900.000 ufc/g 500-6.200.000 300-6.900.000


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la aceptación por parte de las personasdirectamente implicadas. Para ello se realizó una primera presenta-ción del sistema al equipo de analistasunos días antes de la llegada del equipo,exponiendo todas las nuevas aportacio-nes con total transparencia, es decir,transmitiendo explicando el principio detrabajo novedoso, la sencillez de tareas queiba a comportar, eliminando o reduciendosubstancialmente aquellas más tediosas,pero también que el nuevo método de tra-bajo iba a transformar totalmente la rutinade trabajo y que iba a comportar ademásuna reducción de la carga de trabajo. La formación se realizó inmediatamentedespués de la preparación y entrega delequipo teniendo en cuenta que se trata deun equipo de analistas con experiencia entrabajo en laboratorio de control micro-biológico de alimentos, de formacióninterna y reacio a los cambios.En los primeros días tan solo se encuen-tran pequeños problemas:• Habituación a la rutina de tareas (lectu-

ra de tubo y placa, inoculación, agita-ción).

• Confusiones en las lecturas de tarjetasantes de tiempo (códigos de colores).

• Pérdida de lecturas de tarjetas cuandoha pasado el periodo máximo (habitua-ción al sistema de semáforos de adver-tencia en Tempo Reader).

El resultado global de la implementaciónes que en tan solo 2 semanas el equipoTempo estaba totalmente integrado en larutina de trabajo del laboratorio, cuandopor experiencias previas con el mismoequipo de analistas, jamás se disminuíade un periodo de adaptación de 4-5 sema-nas en el mejor de los casos.A las ventajas establecidas para el siste-ma Tempo BioMérieux en los protocolosde validación de métodos alternativoscitados anteriormente, en el caso particu-lar del laboratorio de control de calidad enla fábrica de Gallina Blanca se deben aña-dir unas cuantas:• Robustez del sistema informático.• Eliminación de las repeticiones de

resultados “no pasa”.• No necesario consultar colonias.• Mayor confianza en los resultados obte-

nidos

A su vez, también se presentan algunaslimitaciones:.• Reducción de sensibilidad para TC y

EB en muestras fuertemente colorea-das, especialmente en tonos marrones(caramelo, champiñón, cacao) hastael punto de ser inviable la determina-ción.

• Aparición de resultados inválidos paramuestras con elevado contenido engrasas, como en el caso de bacon,probablemente debido a la separaciónde la grasa.

• Necesidad de compaginar métodoTempo y método tradicional ya que elrepertorio de indicadores disponibleses por el momento reducido. El des-arrollo de nuevos proyectos está lógi-camente ligado a la viabilidad comer-cial para BioMérieux y a su vez a lasignificación del indicador para laindustria. En el momento de redacciónde esta ponencia es inminente el lan-zamiento de kit para el recuento deStaphylococcus aureus y de bacteriasacidolácticas, y está en desarrollo elrecuento de mohos.

TTHHEE AAOOAACC IINNTTEERRNNAATTIIOONNAALL RRAAPPIIDD MMEETTHHOODDSS VVAALLIIDDAATTIIOONN PPRROOCCEESSSS

ZZeerrlliinnddee BB.. JJoohhnnssoonn AOAC Research Institute

[email protected]

This presentation will describe themethod validation and consensus pro-grams that AOAC International andAOAC Research Institute offers. Themethod approval process is described aswell as the publication and certificationdocuments. This presentation alsoincludes a survey of the approvedOfficial Methods of AnalysisSM methodsand approved Performance TestedMethodsSM methods. Please check thewebsite for an updated list of approvedPerformance Tested MethodsSM

methods. AOAC member have freeaccess to all approved Official Methodsof AnalysisSM methods on the AOAC web-site (www.aoac.org).AOAC International is a non-profit orga-nization with international membership.The organization was established in 1874to review, validate and publish analyticalmethods. Next year, 2009, will be our125th Anniversary. We are best known in

the food and agriculture communities forvalidating and publishing the OfficialMethods of Analysis book; also known asthe big red book of methods. Mostrecently AOAC has done many valida-tions for the rapid microbiology methodsfor the US government. The OfficialMethods of AnalysisSM methods aredefensible in many courts worldwide.The AOAC Research Institute is a sma-ller, sister non-profit organization ofAOAC International which was foundedin 1991. The AOAC Research Instituteadministers the Performance TestedMethodsSM program, which provides anindependent third-party review of pro-prietary test kit performance claims. TheAOAC Research Institute has staff withindustry experience; which ensure thatthe validations are conducted withscientifically-sound validation studydesigns.AOAC has scientific members worldwidewhich we use as independent scientificvolunteer experts to help regulatory ortrade issues centered on the performan-

ce parameters of analytical methods inuse. AOAC has lead efforts to set accep-tance criteria for target analytes such asB. anthracis and other biological threatagents as well as drug residues in com-modities. AOAC has three validation programs forthe evaluation and certification of analyti-cal methods. The AOAC INTERNATIONALadministers the Official Methods ofAnalysisSM program; which is denoted bythe blue logo. The AOAC ResearchInstitute administers the PerformanceTested MethodsSM program; which isdenoted by the green logo and the appro-ved methods are denoted by the blackcertification logo. The combination of thetwo programs is called the harmonizedprogram. The AOAC expert reviewers and methodscommittees for both the Official Methodsof AnalysisSM and Performance TestedMethodsSM program follow the microbio-logy and chemistry guidelines sited here.Both microbiology guidelines (AOAC &ISO 16140) are under revision and it is anti-




cipated that AOAC would approve therevised ISO 16140 for the validation ofmicrobiological methods.

OMA PROGRAM– The Official Methods ofAnalysisSM method validation programconsists of a two phase validation: 1) pre-collaborative study and 2) the collaborati-ve study. Quantitative collaborative stu-dies require a minimum of eight laborato-ries and qualitative collaborative studiesrequire a minimum of ten laboratories.The validation study data is reviewed bythe appropriate methods committee andgeneral referee. The approximate timefrom start of a method validation to anapproved first action Official Methods ofAnalysisSM status is twelve to eighteenmonths. The first phase of the Official Methods ofAnalysisSM method validation study designis the pre-collaborative study. Data forthe inclusivity, exclusivity, method com-parison of 15-20 foods with an appropria-te reference method (USDA, FDA, ISO orother) is collected in the pre-collaborativestudy. The second phase of the OfficialMethods of AnalysisSM method validationstudy design is the collaborative study.Data on the method comparison of sixfoods with an appropriate referencemethod (USDA, FDA, ISO or other) iscollected from eight to ten laboratoriesduring the collaborative study. The method comparison study is animportant parameter in a method evalua-tion. It must be noted that a method cannot be validated for a claim of all foods.For qualitative pre-collaborative andPerformance Tested MethodsSM studiesrequire 20 replicates at each inoculationlevel with five control samples OR 20replicates of naturally contaminatedsamples. The collaborative study requi-res six replicates at each inoculationlevel and six control samples per labora-tory. Fractional positive results must beobtained for Official Methods ofAnalysisSM and Performance TestedMethodsSM consideration; that means 5-15 positive samples. For quantitative stu-dies five replicates at three inoculationlevels and five controls or three lots ofnaturally contaminated foods are requi-red. For Official Methods of AnalysisSM

and Performance Tested MethodsSM

approval the candidate method must per-form equal to or better than the referencemethod.

The AOAC Research Institute administersthe Performance Tested MethodsSM pro-gram which evaluates proprietary micro-biology and chemistry test kits for theirperformance claims. The validation iscomprised of a two part validation studydesign with an internal study and inde-pendent study. The validation study reportis reviewed by two Expert Reviewers andthe General Referee; all reviewers mustunanimously agree to grant the candidatemethod Performance Tested MethodsSM

certification. Once the method has beenPerformance Tested MethodsSM approvedthe test kit manufacturer is licensed touse the AOAC Performance TestedMethodsSM certification mark with the kitsspecific certificate number on marketingadvertisements and packaging for oneyear increments. Each PerformanceTested MethodsSM method is reviewedannually for modifications. Validationtime can be less than six months depen-ding on the readiness of the company.The AOAC Research Institute offers aconsulting package where our projectmanagers draft the validation studydesign. All Performance TestedMethodsSM methods are published on theAOAC website and are continually upda-ted. Please visit the website for the list ofapproved methodshttp://www.aoac.org/testkits/testedme-thods.html.Foods”, “Select Foods”, “IndividualFoods” and/or “Environmental Surfaces”.To claim a “Variety of Foods” data must becollected from two foods per food groupsfor a total of ten foods. To claim “Groups ofFoods” data must be collected from seve-ral foods in the particular the food group.To claim “Select Foods” data must becollected from each food which is beingclaimed. To claim an “Individual Food”data must be collected from the specificfood. To claim “Environmental Surfaces”data must be collected from one or moresurfaces. A method may also be evalua-ted for a claim from pure and/or mixed cul-tures. The food categories are as follows: 1)meat products; 2) poultry products; 3) fish& seafood products; 4) dairy products; 5)chocolate & bakery products; 6) animalfeeds; 7) pasta and miscellaneous (dres-sings, spices, mayonnaise, eggs/egg deri-vates, cereals and rice). The environmen-tal surfaces are as follows: 1) stainlesssteel; 2) food-grade painted surfaces; 3)

ceramic, glass or other earthen-glazedmaterial; 4) cast iron; 5) plastic; 6) rubber;7) sealed concrete; 8) wood and 9) air fil-ter material.The internal study for the PerformanceTested MethodsSM program is conductedby the test kit manufacturer. The test kitmanufacturer collects data on inclusivity,exclusivity, method comparison to anappropriate reference method, rugged-ness, stability and lot-to-lot variation ofthe test kit.The independent study is conducted by alaboratory that is contracted by the AOACResearch Institute. The independentstudy is intended to verify the internalstudy data; therefore, a portion of theinternal method comparison matrices arerequired.The AOAC Research Institute has severallaboratories that have experience con-ducting AOAC validations. All new inde-pendent laboratories are required toattend the Microbiology ValidationWorkshop hosted by the AOAC ResearchInstitute. Bids are gathered from indepen-dent laboratories and laboratory is con-tracted by the AOAC Research Institute onbehalf of the test kit manufacturer. Theindependent study report is submitted tothe AOAC Research Institute.The Performance Tested MethodsSM pro-gram requires that the General Refereereview and approve all testing protocolsad validation study reports. In addition tothe General Referee, two other expertsreview the validation study reports forPerformance Tested MethodsSM approval.Many of our expert reviewers are outsideof the US.The test kit manufacturer compiles theinternal study data and the independentstudy data into one report and submits it tothe AOAC Research Institute. The expertreviewers provide comments on thereport and the test kit user guide for thetest kit manufacturer to consider. Thestudy report and user guide is revisedaccording to the reviewers’ comments.The test kit is granted Performance TestedMethodsSM certification when the revie-wers reach consensus.When a test kit is approved as aPerformance Tested MethodSM manufac-turer reviews and approves of all certifi-cation documents (certificate, certifica-tion mark, website entry and studyreports) prior to the use of the certificationmark. The manufacturer publishes an arti-


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cle in the AOAC magazine InsideLaboratory Management and the studyreport is published in the Journal ofAOAC INTERNATIONAL. The test kit islisted on the AOAC validated methodswebsite which includes links to the certi-ficate and the study report. The abilityfor users to download the certificationdocumentation for each validatedmethod makes it very useful to end usersand accredited laboratories which musthave documentation on the methodsthey employ. Lastly, all approved testkits undergo an annual review to ensurethat the test kits have not been changedsince the original validation. Shouldchanges in the approved method beidentified, a method modification maybenecessary to retain the PerformanceTested MethodsSM status. Test kits thatdo not renew their certification areremoved from the list of AOAC validatedmethods.This is an example of a Certificate ofPerformance TestedSM status.The AOAC Harmonized program is admi-nistered by the AOAC Research Institute,mainly because the method enters the

validation process through the PTM pro-gram. An approved Performance TestedMethodsSM is equivalent to the OMA pre-collaborative study. The advantage tothis program is that the manufacturerobtains the Performance TestedMethodsSM certification mark before con-tinuing onto the collaborative study toobtain an Official Method of AnalysisSM

first action status.The AOAC Harmonized program consistsof four phases: 1) AOAC ResearchInstitute Consulting for the drafting of thevalidation protocols; 2) PerformanceTested MethodsSM study; 3) The OfficialMethods of AnalysisSM collaborativestudy and 4) Official Methods ofAnalysisSM approval. The outcomes aretwo AOAC approvals (PerformanceTested MethodsSM and Official Methodsof AnalysisSM), two published studies inthe Journal of AOAC INTERNATIONALand the use of the AOAC ResearchInstitute Performance Tested MethodsSM

certification mark.The methods are evaluated for the follo-wing performance indicators: Inclusivityrate; Exclusivity rate; Sensitivity rate;

Specificity rate; False Positive rate; FalseNegative rate; Repeatability;Reproducibility; Method Agreement orMcNemar’s Chi-Square; Limit ofDetection or Limit of Quantitation andRelative Standard Deviation.Approved Official Methods of AnalysisSM

methods are published in three places: 1)in the Official Methods of AnalysisSM ofAOAC INTERNATIONAL “the big redbook of methods”; 2) in the Journal ofAOAC INTERNATIONAL and 3) in the U.S.Code of Federal Regulations. The appro-ved Performance Tested MethodsSM

methods are also published in three pla-ces: 1) in the Journal of AOAC INTERNA-TIONAL; 2) in the AOAC magazine InsideLaboratory Management and 3) on theAOAC validated methods website.The following slides are meant to providea survey of the approved PerformanceTested MethodsSM methods. The survey isnot all inclusive, but is intended to providea snap-shot of the current approved kits.Please visit the AOACRI website to find acurrent listing of the approved methods.http://www.aoac.org/testkits/testedme-thods.html.

AAPPLLIICCAACCIIÓÓNN DDEE LLAA MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGÍÍAA PPRREEDDIICCTTIIVVAA EENN LLAA IINNDDUUSSTTRRIIAA AALLIIMMEENNTTAARRIIAA

MMoonnttsseerrrraatt VViillaa BBrruuggaallllaa SAICA Entitat de Control, SL

[email protected]

En esta charla se hace una breve intro-ducción teórica a la microbiología predic-tiva (historia, clasificación de modelos,utilización en el APPCC); en su segundamitad se muestra su aplicación medianteejemplos usando el software COMBASEde libre acceso en la red.

1. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA PRE-DICTIVA–

EELL RREEGGLLAAMMEENNTTOO ((CCEE)) nnºº 22007733//22000055El Reglamento (CE) de la Comisión de 15de noviembre de 2005, relativo a los ccrriittee--rriiooss microbiológicos aplicables a los pro-ductos alimenticios, establece una seriede criterios para algunos alimentos y tiposde microorganismos que, de forma com-plementaria a las normas nacionales,implican un nuevo enfoque, dado que

introduce ccoonncceeppttooss ddiinnáámmiiccooss relacio-nados con los controles de producción, lavida útil del alimento, el uso que se va ahacer del mismo, así como el riesgo aso-ciado al microorganismo a controlar.AArrttííccuulloo nnºº 55, sobre normas específicaspara las pruebas y la toma de muestras:“Se autorizará el uso de métodos analíti-cos alternativos cuando los métodosestén validados con respecto al métodode referencia establecido en el anexo I ysi se utiliza un método registrado, certifi-cado por terceros conforme al protocolode la norma EN/ISO 16140 u otros protoco-los similares internacionalmente acepta-dos. Si el explotador de la empresa alimentariadeseara utilizar métodos analíticos distin-tos a los validados y certificados tal comose ha descrito en el párrafo anterior, losmétodos deberán validarse conforme aprotocolos internacionalmente aceptadosy su uso deberá ser autorizado por laautoridad competente.”

AArrttííccuulloo 33, punto 2, sobre condicionesgenerales y AAnneexxoo IIII:“Cuando sea necesario, los explotadoresde las empresas alimentarias responsa-bles de la fabricación del producto reali-zarán estudios conforme a lo dispuesto enel anexo II para investigar el cumplimien-to de los criterios a lo largo de toda la vidaútil. Esto es aplicable especialmente a losalimentos listos para el consumo que pue-dan permitir el desarrollo de Listeriamonocytogenes y puedan suponer unriesgo para la salud pública en relacióncon dicha bacteria.”“Cuando sea necesario, basándose en losestudios antes mencionados, el explota-dor de la empresa alimentaria realizaráestudios complementarios, entre los quepueden incluirse los siguientes:• elaboración de modelos matemáticos

de pronóstico establecidos para el ali-mento de que se trate, utilizando facto-res críticos de crecimiento o supervi-vencia aplicables a los microorganis-




mos en cuestión presentes en el pro-ducto,

• pruebas para investigar la capacidadque tiene el microorganismo en cues-tión, adecuadamente inoculado, paracrecer o sobrevivir en el producto endiferentes condiciones de almacena-miento razonablemente previsibles,

• estudios para evaluar el crecimiento osupervivencia de los microorganismosen cuestión que puedan estar presentesen el producto durante su vida útil encondiciones razonablemente previsi-bles de distribución, almacenamiento yutilización.”

DDEEFFIINNIICCIIÓÓNN“Every model is wrong. The quesion is,how much wrong still useful it can be”(Box and Draper)El término MMiiccrroobbiioollooggííaa PPrreeddiiccttiivvaa surgióal aplicar una serie de técnicas matemáti-cas y estadísticas a la Microbiología quepermitían predecir la respuesta de unapoblación microbiana a partir de observa-ciones previas. Whiting (1995) la describecomo el ccaammppoo ddee eessttuuddiioo qquuee ccoommbbiinnaaeelleemmeennttooss ddee mmiiccrroobbiioollooggiiaa,, mmaatteemmááttiiccaassyy eessttaaddííssttiiccaa ppaarraa ddeessaarrrroollaarr mmooddeellooss qquueeddeessccrriibbaann yy pprreeddiiggaann mmaatteemmááttiiccaammeennttee eellccrreecciimmiieennttoo oo mmuueerrttee ddee mmiiccrroooorrggaanniiss--mmooss,, ccuuaannddoo ssee lleess ssoommeettee aa ccoonnddiicciioonneessaammbbiieennttaalleess eessppeeccííffiiccaass.Hoy en día, la Microbiología Predictiva seengloba dentro de la emergente EccoollooggííaaMMiiccrroobbiiaannaa CCuuaannttiittaattiivvaa, que comprendetodas aquellas técnicas que permitencuantificar un proceso microbiológico enun ecosistema. El interés generado enesta área ha conducido a la rápida crea-ción de una subespecialidad en microbio-logía alimentaria caracterizada por suinterdisciplinariedad: microbiólogos, tec-nólogos alimentarios, matemáticos, esta-dísticos o ingenieros colaboran compar-tiendo ideas, conceptos, técnicas mate-máticas y bases de datos para generar yvalidar más modelos y más efectivos.En Microbiología Alimentaria, los modelospredictivos constituyen un método rápido,relativamente económico y no invasivopara la determinación objetiva de la cali-dad de los alimentos. Se adopta general-mente un punto de vista reduccionista ylas respuestas de los microorganismosson medidas bajo condiciones controla-das. Los resultados se resumen en formade ecuaciones matemáticas que, porinterpolación, pueden predecir respues-

tas en condiciones nuevas, no testadasanteriormente.

HHIISSTTOORRIIAALa posibilidad de predecir el comporta-miento microbiano en los alimentos no esnueva, y ya se pueden encontrar referen-cias al uso de la microbiología predictivaen literatura de los años 1920, cuando Estyy Meyer (1922) establecieron la metodolo-gía predictiva para un enlatado seguro dealimentos bajos en acidez con respecto alC. botulinum. La industria conserveraadoptó el concepto de las 12 reduccionesdecimales propuesto por ellos (12D). Ensus trabajos presentaron numerosascombinaciones de tiempo y temperaturacapaces de causar 12 D en C. botulinum.Estos valores D eran predecidos a partirde modelos matemáticos. En los años1930, Scott (1937) escribió sobre el efectode la temperatura sobre el crecimiento demicroorganismos en musculatura debuey. En la introducción de su artículodemuestra entender perfectamente el usopotencial del conocimiento de la cinéticadel crecimiento microbiano para predecirla vida útil y la seguridad de los alimentos.Tras esos primeros años, el uso de mode-los matemáticos en microbiología alimen-taria se ha extendido hallándose bienestablecidos en procesos productivos defermentación de alimentos y conserva-ción mediante tratamientos térmicos. Durante los años 1960 y 1970, se desarro-llaron dos líneas de investigación distintasen microbiología predictiva:• El control de la alteración del pescado,

(Spencer and Baines, 1964).• La prevención del botulismo y otras into-

xicaciones microbianas. El grupo deGenigeorgis en la Universidad deCalifornia buscó en el trabajo de otrosinvestigadores combinaciones de facto-res que podrían prevenir el crecimientode patógenos y la formación de toxinas.Modelizaron la reducción decimal delrecuento microbiano como consecuen-cia de factores intrínsecos y extrínse-cos de la comida, como la temperatura,el pH, la concentración de NaCl, etc. Lareducción decimal fue entonces rela-cionada con la probabilidad de creci-miento bacteriano o de producción detoxina. Estos estudios desarrollaron losllamados mmooddeellooss pprroobbaabbiillííssttiiccooss, basa-dos en un cálculo de probabilidades: deiniciación de crecimiento de un micro-organismo o de producción de una toxi-

na a partir de una célula. (Genigeorgis1993).

Pero no fue hasta los años 1980 cuandosurgió un nuevo interés en la microbiolo-gía predictiva, debido a tres causas prin-cipales (Buchanan, 1993):• La disponibilidad de ordenadores cada

vez más potentes.• El incremento de la demanda por parte

de los consumidores de alimentos másfrescos, menos procesados. Esto haresultado en la aplicación de sistemasde preservación multi-barrera en losque la combinación de varios factores,más que la acción individual de cadauno de ellos controla la alteración delalimento. En estos casos, los modelosmatemáticos ayudan a tratar cuantitati-vamente la interacción entre múltiplesfactores.

• La imposibilidad, tanto científica comoeconómica, de tener la informaciónmicrobiológica cuantitativa de todos losalimentos presentes en el mercadonecesaria para la toma de decisionessobre la seguridad de los productos ali-mentarios. Esta limitación esta siendocompensada por la identificación de unnúmero limitado de factores clave res-ponsables en gran parte del comporta-miento de los microorganismos en lacomida. A través de la cuantificaciónsistemática y la comprensión del impac-to de estos factores en sistemas mode-lo y productos prototipo, es posiblegenerar modelos efectivos que estimenel comportamiento microbiano en unrango amplio de productos.

En este contexto, uno de los factoresclave que ha contribuido al rápido pro-greso de la microbiología predictiva enlos últimos años ha sido la identificaciónde modelos que describen las curvas delcrecimiento bacteriano. Se trata de losllamados mmooddeellooss cciinnééttiiccooss que, bajocondiciones ambientales determinadas,describen curvas sigmoideas medianteparámetros con significado biológicocomo la duración de la fase de latencia(_), la velocidad máxima de crecimiento(_max) o la densidad máxima de población(ymax), entre otros. El recuento de microor-ganismos puede llegar a presentar unafase de decrecimiento o declivio, quenormalmente no es considerada porestos modelos.Pero los modelos deben de ser usadoscon cautela. En su fase de desarrollo esnecesario ser especialmente cuidadoso


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con las etapas de validación, y realizar unmuestreo control de forma paralela(Campden & Chorleywood Food ResearchAssociation, 1997). Los que son escépti-cos con la microbiología predictiva tienenargumentos en la variabilidad que pre-senta el crecimiento microbiano, causa-da tanto por factores intrínsecos comoextrínsecos. Conviene tener en cuentaque los experimentos basados en condi-ciones laboratoriales pueden no reflejarel comportamiento de los microorganis-mos en los alimentos. La flora microbianade un alimento es un sistema complejo:las interacciones microbianas puedencambiar con variaciones de temperaturay las condiciones fisiológicas previas delmicroorganismo pueden afectar su com-portamiento en el nuevo ambiente. Estoplantea un dilema en los que quieren apli-car la microbiología predictiva al creci-miento microbiano en los alimentos: o setrabajo con modelos complejos, que tie-nen en cuenta las propiedades conocidasdel sistema, o se hacen ciertas simplifica-ciones justificables biológicamente,modelizando medidas relativamente sim-ples en función de pocas variablesambientales. Esta segunda aproximaciónha conducido a estimaciones útiles de larespuesta de los microorganismos en unamplio margen de alimentos y circunstan-cias relativas tanto a la microbiologíacomo en la industria alimentaria (Baranyii Roberts, 1995).

CCLLAASSIIFFIICCAACCIIÓÓNN DDEE MMOODDEELLOOSSDiferentes esquemas han sido propuestospara categorizar los modelos predictivos.A continuación se describen cuatro deellas, que no son excluyentes entre si.

Según el ssuucceessoo mmiiccrroobbiioollóóggiiccoo que des-criben , encontramos:• Modelos de crecimiento: Modelan el

crecimiento de la población microbiana.• Modelos de in activación: Modelan la

destrucción microbiana o la in activa-ción de sus toxinas.

En función de la aapprrooxxiimmaacciióónn mmaatteemmááttii--ccaa usada, se dividen en:• Modelos probabilísticos: La variable en

estudio es la probabilidad de inicio decrecimiento de una célula, o la probabi-lidad de producción de una toxina.

• Modelos cinéticos: Las variables sonuna serie de parámetros de la cinéticamicrobiana y sus transformaciones.

La mmeettooddoollooggííaa usada en su creación losdivide en:• Modelos empíricos: Derivan de una

perspectiva esencialmente pragmática.Simplemente describen los datosmediante una expresión matemáticaadecuada; por eso, a menudo dan pocao ninguna información del proceso sub-yacente.

• Modelos mecanicistas: También llama-dos deterministas, se construyen desdeuna base teórica y, si son correctamen-te formulados, pueden permitir la inter-pretación de la respuesta modelada entérminos de fenómenos y procesosconocidos.

El núúmmeerroo yy ttiippooss ddee vvaarriiaabblleess que inclu-yen, los diferencian en:• Modelos primarios: Describen los cam-

bios en el recuento microbiano o enotras respuestas microbianas en eltiempo. El modelo puede cuantificar lasunidades formadoras de colonias porml, la formación de toxina, o los nivelesde substrato (que son medidas directas

de la respuesta), o absor-bancia o impedancia (queson medidas indirectasde la respuesta). Unaecuación o función mate-mática describe el cam-bio en la respuesta en eltiempo dadas unas condi-ciones ambientalesdeterminadas. Son ejem-plos de modelos prima-rios la curva de creci-miento exponencial, lafunción de Gompertz, y lainactivación térmica deprimer orden. • Modelos secundarios:Describen el impacto de

las variables ambientales como la tem-peratura, el pH o la aw en las caracte-rísticas de crecimiento o supervivenciadel microorganismo. Ejemplos de mode-los secundarios son la relación deArrhenius o el modelo de la raíz cuadra-da.

• Modelos terciarios: Son resultado de laincorporación de modelos primarios,secundarios o una combinación deambos en aplicaciones informáticas ysistemas expertos. Estos programaspueden calcular la respuesta microbia-na a condiciones ambientales que fluc-túan, comparar el efecto de diferentescondiciones o contrastar el comporta-miento de varios microorganismos. Unejemplo de modelo terciario es el llama-do Pathogen Modelling Program, crea-do por USDA.

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGÍÍAA PPRREEDDIICCTTIIVVAA YY AAPPPPCCCCMuchos microbiólogos y responsables delcontrol de calidad en las industrias ali-mentarias intuyen que los modelos pre-dictivos publicados tienen un gran poten-cial de uso, pero desconocen cómo apli-car un modelo particular a sus procesos yproductos. La generación de modelos pre-dictivos con programas informáticosaccesibles (user-friendly) potenciará en elfuturo su aplicación.En el diseño e implantación de sistemasAPPCC, los modelos de MicrobiologíaPredictiva constituyen una buena herra-mienta para:• La toma de decisiones respecto a la

valoración del riesgo asociado a cadapeligro detectado.

• La toma de decisiones respecto a ladeterminación de PCC, aportando infor-mación para responder a cuestiones qeaparecen en el árbol de decisión res-pecto a probabilidad de ocurrencia deun peligro, o el nivel aceptable /inacep-table de un peligro.

• El establecimiento de límites críticos.Decidir respecto al destino de un pro-ducto que se ha desviado de un límitecrítico..

• Valorar la seguridad de un producto trasun cambio en la formulación o procesa-do sin necesidad de realizar análisislaboratoriales.

Los modelos predictivos proporcionanayuda a los equipos APPCC en la toma dedecisiones sobre la seguridad durante laproducción de alimentos. En algunoscasos pueden ser inexactos a causa de la

Fig 1.- Parámetros clásicos del crecimiento bacteriano (Baranyiy Pin, 2001)




falta de conocimiento de las propiedadesfísicas, químicas o microbiológicas del ali-mento, de forma que habrá que realizarigualmente pruebas de laboratorio paravalidar los PCC. Aun así, aappoorrttaann iinnffoorrmmaa--cciióónn oobbjjeettiivvaa qquuee ppeerrmmiittee rreeaalliizzaarr uunn aannáá--lliissiiss ddee ppeelliiggrrooss ccoommpplleettoo,, nnoo lliimmiittaaddoo úúnnii--ccaammeennttee aa vvaalloorraacciioonneess ccuuaalliittaattiivvaassbbaassaaddaass eenn jjuuiicciiooss ssuubbjjeettiivvooss oo eenn llaaeexxppeerriieenncciiaa ppeerrssoonnaall ddee llooss mmiiccrroobbiióólloo--ggooss iinntteeggrraanntteess ddeell eeqquuiippoo AAPPPPCCCC.

2. APLICACIÓN DE LAMICROBIOLOGÍA PREDICTIVA: COMBASE (HTTP://WWW.COMBASE.CC/)– COMBASE es una iniciativa fruto de lacolaboración entre la Food StandardsAgency y el Institute of Food Research enel Reino Unido: el USDA AgriculturalResearch Service y su Eastern RegionalResearch Center de los Estados Unidos; yel Australian Food Safety Centre ofExcellence.Su propósito es elaborar herramientaspredictivas sobre las respuestas de losmicroorganismos en los alimentos, delibre uso en software disponible en laweb. La base de datos ComBase (accesi-ble via el ComBase Browser) consiste enmiles de curvas de crecimiento e inactiva-ción que han sido reunidas a partir de ins-tituciones de investigación y publicacio-nes. Son la base para los numerososmodelos microbianos presentados en el

ComBase Predictor, una herramienta muyútil tanto para la industria (en el desarrollode nuevas tecnologías manteniendo laseguridad de os alimentos ) y administra-ción (estableciendo nuevos límites micro-biológicos), como a nivel académico(tanto en docencia como en investiga-ción).

BIBLIOGRAFÍA– • Baranyi, J. Roberts, T.A.,McClure, P.J. (1993): A non-autonomous diffe-rential equation to model bacterial growth.Food Microbiology, 10, 43-59.• Baranyi, J. Roberts, T.A. (1994): A dynamicapproach to predicting bacterial growth infood. International Journal of FoodMicrobiology, 23, 277-294.• Baranyi, J. Roberts, T.A. (1995): Mathematicsof predictive food microbiology. InternationalJournal of Food Microbiology, 26, 199-218.• Baranyi, J. ,Pin, C. (2001): Primer curso teóri-co-práctico en Microbiología Predictiva deAlimentos. Facultad de Veterinaria,Universidad Complutense de Madrid.• Buchanan, R.L. (1993): Predictive food micro-biology. Trends in Food Science andTechnology Vol 4: 6-11.• Buchanan, R.L., Whitting, R.C. (1996): Riskassesment and predictive microbiology.Journal of food Protection, 1996 supplement,31-36.• Buchanan, R.L., Whiting, R.C., Damert, W.C.(1997): When is simple good enough: a compa-raison of the Gompertz, Baranyi, and three-

phase linear models for fitting bacterialgrowth curves. Food Microbiology, 14: 313-326• Campden & Chorleywood Food ResearchAssociation (1997): Evaluation of Shelf Life forChilled Foods. Technical Manual nº 28 • Garthright, W.E. (1991): Refinements in theprediction of microbial growth curves. FoodMicrobiology, 8, 239-248.• Genigeorgis, C. (1993): Avances en microbio-logía de los alimentos: significado para losproblemas de salud alimentaria de la micro-biología predictiva. Simposium commemorati-vo del Bicentenario de la Facultat deVeterinaria, Universidad Complutense,Madrid.• Elliot, P. (1996): Predictive microbiology andHACCP. Journal of food Protection, 1996 sup-plement, 48-53.• Man C.M.D. et al (1994). Shelf life valuation offoods. Chapman & Hall• McMeekin, T.A. et al (1993): Predictive micro-bology: Theory and Application. ResearchEstudies Press, LTD• Ratkowsky, D.A., Olley, J., McMeekin, T.A.,and Ball, A.. (1982): Relationship between tem-perature and growth rate of bacterial cultures.Journal of Bacteriology, 149, 1-5.• Ross, T. i McMeekin, T.A. (1994): PredictiveMicrobiology. Review paper. InternationalJournal of Food Microbiology, 23: 241-264.• Zweitering, M.H., Jongenburger, I.,Rombouts, F.M., van't Riet, K. (1990): Modellingof the bacterial growth curve. Applied andEnvironmental Microbiology, 56, 1875-1881.

CCrriissttiinnaa RRoommeerroo GGoonnzzaallooINGENASA (Inmunología y Genética Aplicada, SA)

[email protected]

1. INTRODUCCIÓN– La entrada en vigorDirectiva Europea 2003/89/EC, que obligaa declarar en el etiquetado de los ali-mentos los ingredientes causantes de lamayoría de las alergias e intolerancias, ysu última modificación (Directiva2007/68/CE), implican la necesidad dellevar a cabo un autocontrol por parte delas industrias agroalimentarias, así comopor los responsables del control oficial ytécnicos en el manipulado de los alimen-tos. Para poder asegurar este autocontrol, esnecesario disponer de los métodos y sis-

temas analíticos adecuados, que puedanser utilizados tanto por las empresascomo por los laboratorios, y que permi-tan identificar de forma rigurosa losingredientes, componentes y aditivos delos alimentos durante todo el proceso deproducción de los mismos. De igual forma, las Directivas yReglamentos relativos al muestreo yanálisis de toxinas procedentes deFusarium y Aspergillus, establecen loslímites máximos aceptables de estostóxicos en diversas matrices alimenta-rias y piensos animales. Para el cumpli-miento de dichos límites, es indispensa-ble llevar a cabo las correspondientesanalíticas, que permitan asegurar a lasempresas agroalimentarias un adecuado

control de calidad de sus productos. De entre todos los sistemas existentesactualmente en el mercado, son losELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssays), los que reúnen las característi-cas necesarias para llevar a cabo lamonitorización de todo el proceso defabricación y distribución del productoalimentario de forma rápida y eficaz.Dichas características son las siguien-tes: alta sensibilidad, posibilidad de apli-cación en un amplio rango de matrices,facilidad de uso, rapidez y robustez deresultados.Los ensayos ELISA están basados en eluso de Anticuerpos conjugados conenzimas. En la mayor parte de los casosestos anticuerpos son Monoclonales,

PPRROODDUUCCCCIIÓÓNN DDEE AANNTTIICCUUEERRPPOOSS MMOONNOOCCLLOONNAALLEESS ((AACCMM)) YY SSUU AAPPLLIICCAACCIIÓÓNN EENN EELL AANNÁÁLLIISSIISS DDEE AALLEERRGGEENNOOSS YY

MMIICCOOTTOOXXIINNAASS


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por lo que el objetivo del presente artícu-lo es explicar cómo se lleva a cabo laproducción de dichos anticuerposmonoclonales, y cómo se pueden aplicarposteriormente en el análisis de alérge-nos y micotoxinas en alimentos.

2. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONO-CLONALES–

DDeeffiinniicciióónn ddee AAnnttiiccuueerrppoo MMoonnoocclloonnaallLos anticuerpos son producidos por elorganismo como respuesta a la entradade un antígeno en el mismo. Dicha res-puesta es policlonal: distintos clones delinfocitos B generan una amplia variedadde anticuerpos, los cuales reconocendiferentes epítopos del mismo antígenocon objeto de potenciar la efectividaddel Sistema Inmune.Se define como Anticuerpo Monoclonalaquel que es producido por un mismoclon de Linfocito B y que reconoce lamisma región (determinante antigénico)de un antígeno en concreto.

FFoorrmmaacciióónn ddee hhiibbrriiddoommaassEl primer paso para llevar a cabo la pro-ducción de AcM es la inmunización deun ratón, a partir del cual se extrae elbazo con objeto de obtener los LinfocitosB del mismo. Dichos linfocitos presentanuna vida media en cultivo extremada-mente corta, por lo que, paralelamente ala inmunización del animal, se realiza uncultivo de células de mieloma, cuya prin-cipal característica es presentar unaproliferación indefinida en cultivo. La posterior fusión de las células de mie-loma y de los linfocitos B da lugar a laformación de los HIBRIDOMAS (célulasque conservan ambas características:producción de anticuerpos y vida mediaindefinida en cultivo).

AAiissllaammiieennttoo ddee hhiibbrriiddoommaassEl rendimiento de la fusión mencionadaen el punto anterior no es del 100%; porello, tras la misma, se obtiene una mez-cla de células (linfocitos B + células demieloma + hibridomas). La corta vidamedia de los Linfocitos B en cultivo haceque desaparezcan por sí solos. Paraseparar los hibridomas de las células demieloma se preseleccionan células demieloma deficientes en HGPRT (unaenzima que participa en la síntesis depurinas a partir de hipoxantina). En con-

diciones normales, la célula sobrevivegracias a la utilización de una ruta alter-nativa para la síntesis de las purinas. Enel momento del aislamiento, se cultiva lamezcla de células en medio HAT (hipo-xantina/aminopterina/timidina), que fuer-za a las células a seguir la ruta de lahipoxantina, provocando la muerte delas células de mieloma, ya que éstascarecen de la enzima necesaria para lle-var a cabo la síntesis. De esta forma, trasla eliminación de los Linfocitos B y de lascélulas de mieloma, se logra aislar loshibridomas de forma eficaz.

SSeelleecccciióónn ddee hhiibbrriiddoommaassDel aislamiento de la fase anterior seobtienen diversos hibridomas, que portanto, producen anticuerpos policlona-les. Dentro de este pool de hibridomas,para seleccionar los que produzcan anti-cuerpos monoclonales, se realizan dilu-ciones seriadas hasta obtener coloniasque produzcan un solo tipo de anticuer-po. A continuación es necesario llevar acabo el análisis de los anticuerpos pro-ducidos (dicho análisis se realiza nor-malmente por ELISA), para confirmarque se trata de los anticuerpos de inte-rés. El último paso en esta fase sería laclonación de los hibridomas productoresdel AcM en cuestión.

PPrroodduucccciióónn ddee llooss AAccMMUna vez que se dispone de los hibrido-mas seleccionados, la producción de losanticuerpos a partir de los mismos sepuede realizar de dos maneras:a. In Vivo: inyectando los hibridomas de

nuevo en ratones. Dichos hibridomasproducen tumores en el ratón, loscuales segregan un líquido muy ricoen anticuerpos (líquido ascítico).

b. In Vitro: mediante el uso de cultivoscelulares. En la actualidad tiende autilizarse esta segunda técnica paraminimizar en lo posible el uso de ani-males.

Como último paso es necesario realizaruna purificación de los Anticuerpos asíobtenidos (mediante columna de inmu-noafinidad o mediante precipitación).

3. APLICACIONES DE LOS ACM– La versa-tilidad de los anticuerpos permite quepuedan diseñarse frente a prácticamen-te cualquier estructura química, por loque presentan numerosas aplicaciones,entre las que podemos destacar:

Diagnóstico• Detección de hormonas, vitaminas y

citoquinas.• Monitorización de drogas.• Detección de enfermedades infeccio-

sas.• Detección de alergenos, marcadores

tumorales, etc.

BBiioosseennssoorreessLos biosensores son instrumentos analí-ticos formados por un material biológicoinmovilizado, en contacto con un sistematransductor adecuado que convierte laseñal bioquímica en una señal eléctricacuantificable. Se aplican en la deteccióny cuantificación de moléculas orgánicaso inorgánicas (metales pesados, gasestóxicos, etc.).

TTeerraappiiaa• Tratamiento de enfermedades infec-

ciosas.• Tratamiento de enfermedades autoin-

munes.• Tratamiento del cáncer.• Para evitar rechazo tras los transplan-

tes.

4. VENTAJAS DE LOS ANTICUERPOS MONO-CLONALES FRENTE A LOS POLICLONALES–• Mayor homogeneidad en los resulta-

dos, ya que todos los anticuerpos sonexactamente iguales.

• Mayor reproducibilidad de sus efec-tos, en base a su mayor homogenei-dad.

• Mayor capacidad potencial paraseleccionar los de mejor afinidad.

• Mayor especificidad, puesto que todosreconocen la misma región (determi-nante antigénico).

5. APLICACIONES EN EL ANÁLISIS DE ALÉR-GENOS– En el caso de la detección dealergenos, los AcM se diseñan frente aproteínas diana con alta capacidad aler-génica, térmicamente estables y repre-sentativas del total del contenido protei-co del alimento. Por ello, en el caso delos ensayos de INGENASA para el análi-sis de alergenos, las proteínas seleccio-nadas son las que figuran en la Tabla 1,permitiendo los siguientes Límites deDetección.

UUnn ccaassoo pprrááccttiiccoo:: eell aannáálliissiiss ddee gglluutteennEl ensayo diseñado para la determina-ción de proteínas de gluten en muestras




alimentarias está basado en el uso delAnticuerpo Monoclonal R5. Dicho anti-cuerpo ha sido aprobado como MétodoTipo I por la Comisión de CODEX ALI-MENTARIUS, y es el exigido por la FACE,SMAP y resto de Asociaciones deCeliacos Europeas para ser usado porlos laboratorios acreditados en este tipode analítica.

FFuunnddaammeennttoo ttééccnniiccooEl ensayo es un ELISA sándwich dedoble anticuerpo (DAS), cuya base técni-ca puede resumirse en el siguienteesquema (Figura 1).

IInntteerrpprreettaacciióónn ddee rreessuullttaaddoossEl procedimiento descrito en la Figura 1se lleva a cabo tanto con los estándarescomo con las muestras. A partir dedichos estándares (5), se realiza larepresentación gráfica de la DensidadÓptica (DO) frente a concentración(ng/mL), obteniendo la siguiente gráfica(Figura 2).A continuación, interpolando en la curvalos valores de DO de las muestras, seobtienen directamente sus correspon-dientes valores de concentración enng/mL. Para expresar estos valores enpartes por millón (ppm), es necesarioaplicar la siguiente fórmula:

ppm = (C x D x 2 x 40) / 1000

Donde:CC:: es la concentración de gliadina dela muestra determinada en la curva

DD:: es el factor de dilución de la mues-tra (25, 50, 100, 200, 400, 800, etc. 22:: factor que se aplica para conver-tir gliadina en gluten.4400:: factor que se aplica porque0.25g de alimento son extraídos con10 ml de solución de extracción11//11000000:: factor que procede de laconversión de ng/ml en ppm

6. APLICACIONES EN EL

ANÁLISIS DE MICOTOXI-NAS– Las micotoxinasson metabolitos secun-darios producidos pordiversos tipos de hon-gos. Son altamentetóxicas y se generan engran variedad de mer-cancías. En la tabla quefigura a continuación(Tabla 2) se indican lostipos de alimentos enlos que pueden gene-rarse las distintasmicotoxinas; qué varie-dades de hongos y enqué condiciones seproducen; y cuáles sonlos principales riesgospara la salud en cadacaso:

aa.. DDiiffiiccuullttaaddeess eenn eellaannáálliissiiss ddee mmiiccoottooxxiinnaassLas principales dificul-tades a las que hay quehacer frente a la hora

de llevar a cabo el análisis de micoto-xinas son las siguientes:- Son muy estables a tratamientos tér-

micos, por lo que su eliminación esdifícil.

- Suelen aparecer con bajos nivelesde contaminación, por lo que esnecesario disponer de ensayos conLímites de Detección adecuados.

- Aun siendo similares, cada tipo deMicotoxina presenta una estructuradistinta, por lo que es necesariodiseñar anticuerpos específicospara cada una de ellas.

- Suelen estar distribuidas de maneramuy heterogénea en el alimento, porlo que es fundamental aplicar unadecuado protocolo de muestreo (elcual figura estandarizado en la legis-lación); y homogeneizar la muestra lomáximo posible antes de llevar acabo la extracción.

bb.. FFuunnddaammeennttoo ttééccnniiccoo ddeell eennssaayyooEl ensayo es un ELISA de competición,cuya base técnica puede resumirse en elsiguiente esquema (Figura 3).

cc.. IInntteerrpprreettaacciióónn ddee rreessuullttaaddoossA partir de los valores de DO de las

Tabla 1.- Ejemplos de aplicación de los AcM en el diseño de ensayos para el análisis de alergenos.

ALÉRGENO PROTEÍNAS DETECTADAS LÍMITE DE DETECCIÓN(ppm)

Gluten Gliadinas, secalinas y hordeínas 3.0

Crustáceo Tropomiosina 0.05

Huevo Ovoalbúmina y ovomucoide 1.0

Leche (suero) b-lactoglobulina 0.1

Leche Caseína (Alpha S1 y Alpha S2) 0.27

Cacahuete Ara h1 y Ara h2 1.0

Semilla de sésamo Albúmina 2S 1.0

Soja Inhibidor de Tripsina de Soja 2.5

Proteína de Harina de Soja

Almendra Proteína de Almendra 0.5

Avellana Proteína de Avellana 0.5

Semilla de Mostaza Proteína de Semilla de Mostaza Blanca 1.0

y Mostaza Negra

Fig 1.- ELISA DAS para el análisis de gluten.

Fig 2.- Ejemplo de curva estándar para el análisis de gluten.


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muestras, estándares y control negativo,se determina el cálculo del % deAbsorbancia Máxima aplicando lasiguiente fórmula:

% Abs Máx. =DO (Estándar/Muestra) x 100DO (Control Negativo)

El cálculo del % de Abs Máxima se llevaa cabo para homogeneizar los diferentesresultados del ensayo. Mientras que los

valores de DO del Control Negativo,Estándares y Muestras pueden diferir deun análisis a otro (por ligeras variacio-nes en las condiciones del ensayo), larelación % Abs Máxima para cadaEstándar debe permanecer constante. A continuación se representa gráfica-mente los valores de %Abs Máx de losestándares frente a su concentración,de forma que, interpolando en la curvalos % Abs Máx de las muestras, se obtie-

nen directamente suscorrespondientes con-centraciones (ver Figura4).

dd.. RReegguullaacciióónn ddee llooss llíímmii--tteess ddee ddeetteecccciióónn ddeemmiiccoottooxxiinnaass ppoorr llaa UUnniióónnEEuurrooppeeaa La Unión Europea tieneactualmente los límitesde detección más estric-tos a nivel mundial en loque a presencia de mico-toxinas se refiere. En la

Tabla 4 se muestran los valores de sensi-bilidad de los ensayos ELISA para lasdistintas micotoxinas, en comparacióncon los límites de detección exigidos porla legislación. Estos altos valores de sen-sibilidad, se logran gracias al uso de losAnticuerpos Monoclonales.

CONCLUSIÓN– Tras lo expuesto en el pre-sente artículo, se puede concluir que eluso de Anticuerpos (Monoclonales) en eldiseño de ensayos ELISA para el análisisde alergenos y micotoxinas les confiereunas propiedades de sensibilidad yespecificidad que hace que sean losmás utilizados tanto por LaboratoriosEspecializados como por EmpresasAgroalimentarias.

BIBLIOGRAFÍA– • DIRECTIVA 2003/89/CE DELPARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de10 de noviembre de 2003 por la que se modifi-ca la Directiva 2000/13/CE en lo que respectaa la indicación de los ingredientes presentesen los productos alimenticios.• DIRECTIVA 2007/68/CE DE LA COMISIÓN de27 de noviembre de 2007 que modifica elanexo III bis de la Directiva 2000/13/CE delParlamento Europeo y del Consejo por lo quese refiere a determinados ingredientes ali-mentarios.• REGLAMENTO (CE) No 683/2004 DE LACOMISIÓN de 13 de abril de 2004 que modifi-ca el Reglamento (CE) no 466/2001 por lo querespecta a las aflatoxinas y a la ocratoxina Aen los alimentos destinados a lactantes yniños de corta edad.• DIRECTIVA 2005/38/CE DE LA COMISIÓN de 6de junio de 2005 por la que se establecen losmétodos de muestreo y de análisis para elcontrol oficial del contenido de toxinas deFusarium en los productos alimenticios.• REGLAMENTO (CE) No 1126/2007 DE LACOMISIÓN de 28 de septiembre de 2007 quemodifica el Reglamento (CE) no 1881/2006 por

Tabla 2.- Características principales de las micotoxinas.

Tabla 3.- Sensibilidad de los ensayos en comparación con la legislación. (*)Los Límites varían en función del alimento. El Límite más estricto suelecoincidir con el correspondiente al de los alimentos infantiles

Fig 3.- ELISA de competición para análisis de micotoxinas.

Fig 4.- Ejemplo de curva estándar para la Fumonisina.




el que se fija el contenido máximo de determi-nados contaminantes en los productos ali-menticios por lo que se refiere a las toxinasde Fusarium en el maíz y los productos delmaíz• Cecilia E. Coto. “Curso de ConocimientoCientífico Experimental: los AnticuerposMonoclonales”. Revista Electrónica del Dpto.

de Química Biológica, Facultad de CienciasExactas y Naturales, Universidad de BuenosAires, Argentina.• Enrique Méndez, Carmen Vela, Ulrike Immerand Frederik W. Janssen. “Report of a colla-borative trial to investigate the performanceof the R5 enzyme linked immunoassay todetermine gliadin in gluten-free food”.

European Journal of Gastroenterology &Hepatology 2005, 17:1053–1063• REPORT OF THE TWENTY-SEVENTH SES-SION OF THE CODEX COMMITTEE ONMETHODS OF ANALYSIS AND SAMPLING.Budapest, Hungary 15 - 19 May 2006.• “Transia Plate Total Aflatoxin TechnicalFile”. Biocontrol, Ltd.

DDaavviidd TToommááss FFoorrnnééssainia.centro tecnológico

[email protected]

1.- INTRODUCCIÓN– El empleo de métodosalternativos supone considerables venta-jas frente a los métodos convencionales ode referencia, como son la rapidez, auto-matización, interpretación de resultados,etc. No obstante, pueden darse situacio-nes que limitan su uso en determinadascondiciones o presentan limitaciones quedeben ser evaluadas en cada caso parti-cular, debiendo demostrarse que estosmétodos permiten obtener resultadosequivalentes al método de referencia yque presenta ventajas frente al mismo.Estos métodos alternativos para el análisismicrobiológico de alimentos ya es en laactualidad una realidad siendo amplia-mente empleados tanto por laboratorios deautocontrol como en laboratorios de con-trol oficial de alimentos. En este sentido, elactual Reglamento relativo a los criteriosmicrobiológicos aplicables a los productosalimenticios (Reglamento (CE) nº 2073/2005de 15 de noviembre de 2005, DOCE L 33822/12/05) recoge en su considerando 24que “los explotadores de las empresas ali-mentarias pueden usar métodos analíticosdiferentes a los métodos de referencia, enparticular métodos más rápidos, siempreque estos métodos alternativos produzcanresultados equivalentes” y posteriormenteincluye en el artículo 5 punto 5 que “Seautorizará el uso de métodos alternativoscuando los métodos estén validados conrespecto al método de referencia estable-cido en el Anexo I y si se utiliza un métodoregistrado, certificado por terceros confor-me al protocolo de la norma EN/ISO 16140u otros protocolos similares internacional-mente aceptados”.Así pues, existen referencias legislativas

que reconocen el empleo de los mismos sibien con limitaciones como la necesidadde evidenciar la validez de estos métodosempleando un procedimiento claramenteestablecido así como, en el caso de méto-dos registrados, la necesaria certificaciónde terceros que avalen esta validez deforma independiente, como puede ser loscertificados de validación emitidos porAFNOR (www.afnor.fr) MicroVal(www.microval.org) NordVal(www.nmkl.org) o AOAC (www.aoac.org).También la Norma ISO 17025:2005 queestablece los requisitos generales parala competencia de los laboratorios deensayo y calibración, indica en su apar-tado 5.4.5.2 que “se deben validar losmétodos no normalizados, los métodosdiseñados/desarrollados internamente,los métodos normalizados utilizadosfuera de su campo de aplicación previstoy las ampliaciones y modificaciones delos métodos normalizados con el fin decomprobar que son apropiados para eluso previsto”. Dicha validación puedehaber sido realizada previamente por elorganismo que ha desarrollado el méto-do, por el laboratorio o bien por organis-mos de certificación.Así pues, un requisito imprescindiblepara poder emplear estos métodos ylograr su reconocimiento (lo que enmuchos casos limita su implantación) esla necesaria validación del mismo.Esta validación debe ser contempladadesde dos perspectivas diferentes:• VVaalliiddaacciióónn iinniicciiaall oo ccoommpplleettaa, realizada

con un protocolo extenso en el que secontempla una primera fase de valida-ción por parte de un laboratorio exper-to y una segunda fase que incluye larealización de un ejercicio colaborativocon la participación de varios laborato-rios, y que utiliza un diseño de expe-

riencias y unos criterios de evaluaciónde resultados preestablecidos y reco-nocidos internacionalmente (como porejemplo los recogidos en la Norma UNEEN ISO 16140:2003)

• VVaalliiddaacciióónn iinntteerrnnaa oo vveerriiffiiccaacciióónn porparte del laboratorio de control que vaa utilizar el método alternativo, que con-siste básicamente en comprobar que ellaboratorio es capaz de cumplir con losrequisitos de funcionamiento del méto-do previamente establecidos en lascondiciones habituales de trabajo.

2.- DEFINICIONES– VVaalliiddaacciióónn:: Confirmación mediante elexamen y la aportación de evidenciasobjetivas que demuestren el cumplimien-to de ciertos requisitos para el uso espe-cífico previsto (ISO 17025 apdo. 5.4.5.1).EEffiiccaacciiaa rreellaattiivvaa:: Grado de concordanciaentre la respuesta obtenida por el méto-do a validar y el valor verdadero obtenidoen muestras idénticas.DDeessvviiaacciióónn ppoossiittiivvaa:: Se produce cuandoel método a validar da un resultado posi-tivo y el valor de referencia es negativo.Una desviación positiva se convierte enuna ffaallssoo ppoossiittiivvoo cuando se puededemostrar que el resultado verdadero esnegativo.DDeessvviiaacciióónn nneeggaattiivvaa:: Se produce cuandoel método a validar da un resultado nega-tivo y el valor de referencia es positivo.Una desviación positiva se convierte enuna ffaallssoo nneeggaattiivvo cuando se puededemostrar que el resultado verdadero espositivo.SSeennssiibbiilliiddaadd rreellaattiivvaa:: Capacidad delmétodo a validar de detectar el microor-ganismo cuando está presente en lamuestra a analizar o no diferir de manerasignificativa del valor de referencia(<30%).

VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN DDEE MMÉÉTTOODDOOSS MMIICCRROOBBIIOOLLÓÓGGIICCOOSS AALLTTEERRNNAATTIIVVOOSS


25


EEssppeecciiffiicciiddaadd rreellaattiivvaa:: Capacidad delmétodo a validar para no detectar el ana-lito cuando no es detectado por el méto-do de referencia.NNiivveell ddee ddeetteecccciióónn: Menor número demicroorganismos que puede detectarseen una muestraIInncclluussiivviiddaadd:: Capacidad para detectar elanalito entre un amplio grupo de cepasdiana. EExxcclluussiivviiddaadd:: Ausencia de interferenciaen el método de un grupo de cepas nodiana.LLiinneeaalliiddaadd:: Aptitud del método para darresultados que están en proporción conla cantidad de microorganismos presen-tes en la muestra.EExxaaccttiittuudd rreellaattiivvaa:: Grado de concordan-cia entre un resultado de análisis y elvalor de referencia aceptado.LLiimmiittee ddee ccuuaannttiiffiiccaacciióónn:: La menor canti-dad de microorganismos que puede sermedido con una precisión y exactituddefinidas.RReeppeettiibbiilliiddaadd:: Realización de los ensayosen las mismas condiciones (mismo ana-lista, equipos, medios de cultivo…).RReepprroodduucciibbiilliiddaadd:: Realización de losensayos en las condiciones más diversas(distinto analista, equipos, dias, mediosde cultivo…).

3.- VALIDACIÓN DE MÉTODOS

ALTERNATIVOS–Fig 1.

33..11..-- MMAATTRRIICCEESSLo ideal es trabajar conmuestras naturalmentecontaminadas o al menosque tengan una distribu-ción lo más amplia posi-ble.Si no es posible trabajarcon alimentos contami-nados naturalmente sedebe recurrir a la conta-minación artificial. Losniveles de contaminacióndeben permitir simular elcomportamiento demuestras naturales.En el caso de alimentos,se deben estudiar 5 cate-gorías de alimentos. Estenúmero puede reducirse si el método seaplica a un ámbito restringido. (Puedeconsultarse en Anexo B de la NormaUNE-EN ISO 16140:2003) (Tabla 1).Una validación completa debería incluiral menos 60 resultados por cada catego-ría de alimentos, siendo deseable que un50% estén contaminados y otro 50% sennegativos pero con contaminación natu-ral.

33..22..-- PPRREEPPAARRAACCIIÓÓNN DDEE IINNÓÓCCUULLOOSSComo se ha indicado anteriormente, lautilización de muestras para el estudio devalidación debe ser por orden de prefe-

rencia:• Muestras naturalmentecontaminadas• Muestras contamina-das por mezcla (a partirde otras muestras conta-minadas)• Muestras contamina-das artificialmente conmicroorganismos diana.En caso de no disponerde muestras naturalmen-te contaminadas y seanecesario contaminarartificialmente con cepas

de referencia (www.cect.org) o cepassalvajes aisladas del mismo tipo de pro-ductos que se van a analizar (las cualesdeben ser previamente caracterizadas).Se debe asegurar que el inóculo eshomogéneo y de una concentraciónconocida. Para ello se puede establecerla concentración del mismo mediantesiembra de 5-10 replicados en mediosóptimos no selectivos.La homogeneidad puede considerarseadecuada si la desviación estándar de lareproducibilidad (RSD) es inferior o iguala la de una distribución ideal de Poissonsegún las siguientes fórmulas (Fig 2a yFig 2b).También pueden utilizarse material dereferencia certificado con una concen-tración y pureza conocida comercializa-do en diversos formatos por diferentesorganismos y empresas (HealthProtection Agency“http://www.hpa.org.uk/”, LABAQUAhttp://www.labaqua.com/ oMicroBiologics “http://www.microbiolo-gics.com/)

33..33..-- EESSQQUUEEMMAASS DDEE VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN PPOORRCCOOMMPPAARRAACCIIÓÓNN FFRREENNTTEE AALL MMÉÉTTOODDOO DDEERREEFFEERREENNCCIIAADuplicación de muestras cuando ambosmétodos tienen una primera etapacomún Fig 3.Duplicación de muestras cuando ambosmétodos tienen diferentes etapas inicia-les Fig 4.

4.- VALIDACIÓN DE MÉTODOS CUALITATIVOS–Parámetros a evaluar en la validación Fig5.

Fig 1.-

Fig 2a.-

Fig 2b.-

Tabla 1.-

Carnes y producto cárnicos Pescados y mariscos

Aves de corral Frutas y verduras

Productos lácteos Chocolate/productos panadería

Otros productos (especias, salsas, Alimentación animal

huevos, pastas, cereales, bebidas)




44..11..-- RREENNDDIIMMIIEENNTTOO DDEELL MMÉÉTTOODDOO

Se deben analizar al menos 60 muestraspor cada método y categoría de alimen-tos, las cuales, idealmente, debe estarcontaminadas en una proporción del50%.A partir de los resultados obtenidos conambos métodos se construye la siguientetabla Fig 6.Con los datos obtenidos se estiman losparámetros que caracterizan el rendi-miento del método.• EFICACIA RELATIVA (AC) Fig 7a.• ESPECIFIDAD RELATIVA (SP) Fig 7b.• SENSIBILIDAD RELATIVA (SE): Fig 7c.

Como criterioarbitrario AC, SP ySE deberían ser >90% y ND y PD <10%, aunquedebería conside-rase una valida-ción estadística-mente adecuadacomo el estudiode datos discre-pantes medianteel Test McNemar(Anexo F en ISO

16140:2003).

44..22..-- NNIIVVEELL DDEE DDEETTEECCCCIIÓÓNN RREELLAATTIIVVAA4.2.1.- Estimación del nivel de inóculoFig 8.4.2.2.- Estimación de la concentraciónde microorganismos en la muestra Fig 9.4.2.3.- Resultados obtenidosResultados a concentración de 13ufc/25g Fig 10.Resultados a concentración de 3 ufc/25gFig 11.Resultados muestras negativas Fig 12.4.2.4.- ConclusiónEl límite de detección para la técnica dePCR es inferior a 3 ufc/25g

44..33..-- IINNCCLLUUSSIIVVIIDDAADD YY EEXXCCLLUUSSIIVVIIDDAADDConsiste en evaluar la detección de 30(50) cepas diana y 30 cepas no dianasin estimar el efecto matriz.El nivel de concentración de cepasdiana debe ser de aproximadamente 10veces el nivel de detección.Para muestras no diana se inoculará alnivel habitualmente esperable en fun-ción del tipo de microorganismo.

44..44..-- EESSTTUUDDIIOO IINNTTEERRLLAABBOORRAATTOORRIIOOSu objetivo es determinar la variabili-dad de los resultados obtenidos pordiversos laboratorios empleando mues-tras idénticas y comparando los resul-tados.Se debe contar con la participación deal menos 10 laboratorios que tenganresultados no discrepantesEn el interlaboratorios se emplean 3niveles de contaminación (negativo,ligeramente superior al límite de detec-ción y 10 veces superior a este valor),asegurando la homogeneidad y estabi-lidad de las muestras.En cada laboratorio se analizan 8 repli-cados de cada nivel de contaminacióncon los dos métodos (método de refe-rencia y método alternativo)

Fig 3.- Fig 4.-

Fig 5.-

Fig 6.-

Fig 7a.- Fig 7b.-


27


El número total de resultados a evaluar esde 480 (240 por cada método)

5.- MÉTODOS CUANTITATIVOS– Parámetrosa evaluar en la validación Fig 13.

55..11..-- PPRREECCIISSIIÓÓNNA partir de muestras con diferentes 5niveles diferentes de concentración, rea-lizar 5 replicas de cada muestra (mínimo 2,e idealmente 10) en condiciones de repro-ducibilidad y estimar RSD, comparándolocon el del método de referencia o bien

con el valor RSDteórico.La precisión delmétodo es acepta-ble si es inferior ono se desvía enmás de un 30% dela del método dereferencia o la RSDteórica para cadanivel de inóculo.El cálculo de lai n c e r t i d u m b r e

mediante la desviación estándar de lareproducibilidad también puede permitirrealizar una estimación de la precisión delmétodo. Para ello es necesaria la realiza-ción de análisis por duplicado en condi-ciones de reproducibilidad de al menos 10muestras por grupo de alimentos y poste-riormente evaluar la diferencia entre elloscon la fórmula (ISO/TS 19036:2006) Fig 14.Donde YiA e YiB son respectivamente losrecuentos de los duplicados de cadamuestra el log ufc/g y n el número total demuestras analizadas.

55..22..-- EEXXAACCTTIITTUUDD YY LLIINNEEAALLIIDDAADDSe requiere trabajar con 5 niveles dife-rentes del analito, preferiblemente con-taminada naturalmente, para estableceruna curva de calibración. Cada muestrase analiza por duplicado como mínimo eidealmente de 5 a 10 replicas, lo quesupone que se analizan un mínimo de 10mediciones e idealmente de 25 a 50medidas con el método alternativo aevaluar.Si se dispone de valores de referencia(ver 3.2) es posible determinar la exacti-tud del método. En caso de que no sedisponga de dichos valores, se analizanlas mismas submuestras con el métodode referencia, en cuyo caso estimare-mos la exactitud relativa.Representar un gráfico donde el eje y serepresentan los resultados obtenidoscon el método alternativo (en valor loga-rítmico) y en el eje x el valor obtenidocon el método de referencia (o con elmaterial de referencia utilizado). En basea este gráfico se obtiene una estimacióndel método de regresión Fig 15.

Fig 8.-

Fig 9.-

Fig 10.-

Fig 11.-

Fig 13.- Fig 14.-

Fig 7c.-

Fig 12.-




A partir de la recta de calibración se estu-dia el ajuste de la ecuación de la recta: y= a + bx, donde no solo debe estudiarse elcoeficiente de correlación sino también elajuste de la ordenada en el origen (a) quedebe ser teóricamente nula en el modeloideal y de la pendiente (b) que debe serigual a 1.Las desviaciones de estos valores puedenestimarse mediante modelos de regresiónlineal ortogonal o de mínimos cuadrados yla F de Snedecor.

55..33..-- LLIIMMIITTEE DDEE CCUUAANNTTIIFFIICCAACCIIÓÓNN

El límite de cuantificación puede estimar-se mediante el análisis de diluciones (1:2 a1:10) de bajas concentraciones de micro-organismos.Podremos establecer el límite de cuantifi-cación en aquel valor donde la precisióndel método se desvía entre un 30% y 50%con respecto a la precisión teórica delmétodo.También se puede estimar a través delcálculo de la estimación de la dispersiónen el Límite de crítico o del ruido de fondo(S0) o blanco (analizando al menos 6muestras sin el microorganismo diana) ya través de este se fija el límite de cuanti-ficación LQ = 10S0 que, según AOACequivale al nivel donde el coeficiente devariación es inferior al 10% (CV =Sr/X <10).

55..44..-- EESSPPEECCIIFFIICCIIDDAADD YY SSEELLEECCTTIIVVIIDDAADDConsiste en evaluar, al igual que se harealizado en el punto 4.1 y 4.3, mediante elanálisis por duplicado de cepas dianapositivas y negativas y la comparaciónentre el valor obtenido con el método dereferencia y con el método alternativo

55..55..-- IINNTTEERRLLAABBOO--RRAATTOORRIIOOTiene como objeti-vo determinar com-parativamente lascaracterísticas derendimiento (exac-titud y precisión)del método alterna-tivo frente al méto-do de referencia.Deben participar almenos 8 laborato-rios que aportendatos no discre-pantes.Se preparan tres

concentraciones de microorganismos asícomo controles negativos, analizandocada laboratorio 4 submuestras en cadanivel de forma que 2 se miden con elmétodo de referencia y otras 2 con elmétodo alternativo.En total para cada nivel se requieren 96resultados.

6.- VALIDACIÓN INTERNA O VERIFICACIÓN – Ellaboratorio que finalmente va a utilizar elmétodo alternativo debe evaluar la ade-cuación del método de forma que puedagarantizar que se cumplen con los requisi-tos del mismo en las condiciones realesde uso, considerando de forma particularla influencia de:• Matrices habitualmente empleadas por

el laboratorio.• Microorganismos diana y flora interfi-

riente.• Analistas que ejecutan los ensayos.• Equipos y condiciones ambientales.• Medios de cultivo y reactivos.En este sentido, y siempre que se dispon-ga de una validación previa (tal y como seha descrito anteriormente) no es necesa-rio que el laboratorio realice de nuevo unavalidación sino que compruebe que encondiciones reales, el rendimiento delmétodo es adecuado.Para ello podemos partir de los valoresque caracterizan al método que debenvenir descritos previamente (bien en elcertificado de validación del método en sucaso o en los datos científicos publicadosque garanticen la validez del mismo).Dichos valores deben ser consideradoscomo una referencia puesto que enmuchas ocasiones son demasiadoamplios como para ser utilizados como uncontrol de calidad interno, por lo que

deben revisarse para poder establecer sisuponen una referencia adecuada paraque el laboratorio verifique su cumpli-miento.La verificación debe ser planificada enfunción de las características particula-res de aplicación del método, siendo deespecial interés eell eemmpplleeoo ddee mmaattrriicceessque habitualmente vaya a analizar el labo-ratorio. Estas matrices han podido serpreviamente estudiadas durante la valida-ción del método o, como sucede enmuchos casos, ser matrices que no hansido evaluadas, por lo que puede que elmétodo alternativo aunque disponga deun estudio de validación previo, no seaadecuado para el uso específico que va ahacer de él el laboratorio de control.

6.1.- MÉTODOS CUALITATIVOS– La verifica-ción puede consistir en comprobar que sepuede lograr un adecuado líímmiittee ddee ddeetteecc--cciióónn con las matrices habitualmenteempleadas.Para ello no es necesario realizar dilucio-nes sino únicamente verificar que sepuede detectar una concentración demicroorganismos igual o inferior a la quese ha obtenido en la validación del méto-do.La preparación del inóculo se puede reali-zar como se ha descrito en el punto 3.2Dicho inóculo se aplica a las matrices aevaluar, empleando 10 replicados. Almenos el 50% de las muestras analizadasdeben ser detectadas para poder consi-derar que el límite de detección relativaes el adecuado.

6.2.- MÉTODOS CUANTITATIVOS– Debeverificarse que el rreennddiimmiieennttoo ddeell mmééttoo--ddoo (exactitud y precisión) es el adecua-do.Para ello puede utilizarse los criteriosestablecidos anteriormente, estimandola pprreecciissiióónn a partir del análisis porduplicado 10 muestras de cada una delas matrices habitualmente analizadasen el laboratorio y estimando sus valoresacorde a la fórmula incluida en 5.1 ycomprobando que su valor es igual oinferior al valor de referencia. Debe considerarse que dicho valor dereferencia ha sido obtenido en condicio-nes de reproducibilidad con datos pro-cedentes de varios laboratorios, mien-tras que en este caso solo se ha emple-ado los valores de nuestro laboratorio,por lo que debe ponerse el máximo énfa-

Fig 15.-


29


sis de aplicar las condiciones más diver-sas posibles (diferentes analistas, equi-pos, lotes de medios de cultivo…).La eexxaaccttiittuudd puede estimarse mediantela comparación de los valores de tstu-dent tabulados para una distribución dePoisson y la tstudent obtenidos por lamedia de las diferencias entre el valorde referencia y el obtenido en las diver-sas réplicas analizadas con el métodoalternativo. No obstante este enfoque está siendomodificado dado que pueden producirsecasos en los que se aprecien diferenciasestadísticamente significativas que indi-can que la exactitud de un método no esla adecuada y sin embargo desde elpunto de vista microbiológico, dichométodo es válido e incluso mejor que

otros, como se puede observar en lossiguientes esquemas Fig 16a y Fig 16b.Aunque el método A es más exacto y pre-ciso que el B, sin embargo el método Apresenta diferencias estadísticas frente alvalor de referencia mientras que el méto-do B no presenta diferencias estadísticas.

7.- INFORME DE VALIDACIÓN– Finalmente,en todos los casos es importante elaborarun informe de validación, además de con-servar los datos primarios a partir de loscuales se han realizado estas validacio-nes.Este informe de validación debe incluir(siempre que proceda) los siguientesdatos:• Nombre del laboratorio.• Fechas de realización del ensayo.

• Número, tipo y procedencia de lasmuestras utilizadas.

• Resultados de los ensayos de selectivi-dad.

• Número y nombre de cepas diana y nodiana utilizadas.

• Resultados de los ensayos de amplifica-ción

• Resultados de los ensayos de sensibili-dad.

• Información sobre la robustez del méto-do.

• Información sobre los controles de cali-dad utilizados.

• Información sobre los equipos utiliza-dos.

• Cualquier otra observación sobre lasdesviaciones surgidas durante el estu-dio de validación.

Oxoid, SA (parte de Thermo Fisher Scientific, Inc)

DuPont Qualicon,ESL Bldg 400, PO Box 80400,

Wilmington, DE, 19880-0400 E.E.U.U., www.quali-

con.com

PARA CONTROLAR EL RIESGO DE LISTERIOSIS

ES NECESARIA LA DETECCIÓN TEMPRANA– Lamayoría de los productores de alimentosy, básicamente, todos los fabricantes decarnes preparadas efectúan determina-ciones ambientales de Listeria. El hecho de efectuar análisis ambientalesnormalmente permite a los fabricantesdetectar los problemas con mayor rapidezy tomar las medidas correctoras necesa-rias antes de efectuar pruebas a los pro-

ductos. Otra ventaja esque incluso en una situa-ción muy desfavorablecon alta presencia deListeria, solo aproximada-mente el 10% de los pro-ductos envasados tendráuna contaminación denivel detectable. Por lotanto, un mayor númerode productos envasadosdeberían ser analizados para que sepudiera detectar la contaminación antesde liberar el producto para su distribución.Lo ideal es que los resultados estén dispo-

nibles en menos de ocho horas, para quelos problemas que surjan puedan abor-darse durante el mismo turno en que setoman las muestras y puedan tomarse

LLAA TTEECCNNOOLLOOGGÍÍAA TTRRAANNSSCCRRIIPPCCIIÓÓNN RREEVVEERRSSAA -- PPCCRRPPEERRMMIITTEE UUNNAA DDEETTEECCCCIIÓÓNN MMÁÁSS RRÁÁPPIIDDAA DDEE LLIISSTTEERRIIAA

Fig 16a.- Fig 16b.-




Strategic Diagnostics, Inc

INTRODUCTION– The National PoultryImprovement Plan (NPIP) is a cooperati-ve Federal-State-Industry program deve-loped for controlling certain poultry dise-ases.NPIP samples tend to be high in back-ground flora, and there several issueswith available rapid methods includinghigh false positive rates which areencountered with these sample types.For this reason only a handful of rapidmethods are officially approved by theNPIP technical committee. For the mostpart, these methods are complicated andcostly, so the vast majority of NPIP tes-ting is performed with cultural methods.The RapidChek® SELECT™ Salmonellasystem offers a simple, yet highly speci-fic solution for these sample types.Two proprietary media have been uni-quely formulated to allow maximumselection of the target while inhibitingclosely related bacteria, facilitating opti-mal productivity. The RapidChek®

SELECT™ media has been supplementedwith a cocktail of antibiotics and specificphage which prevent the growth of crossreactors. This is a patented media tech-

nology and a novelapproach to the enrich-ment of Salmonella incomplex matrices. Thisnovel media combinedwith a newly optimizedlateral flow strip, allowsthe best recovery anddetection of Salmonellaspp.

AIM– To evaluate theuse of the RapidChek® SELECT™ for therecovery and detection of Salmonellaspp in NPIP samples. EXPERIMENTAL PROTOCOL– Three inde-

pendent NPIP approved laboratoriesevaluated the SELECT™ product on rou-tinely submitted chicken house environ-mental swab samples. A side-by-side

EEVVAALLUUAATTIIOONN OOFF TTHHEE UUSSEE OOFF TTHHEE RRAAPPIIDDCCHHEEKK®® SSEELLEECCTT™™ SSAALLMMOONNEELLLLAA SSYYSSTTEEMM

FFOORR IINN NNPPIIPP EENNVVIIRROONNMMEENNTTAALL SSAAMMPPLLEESS

Tabla 2.- Comparison between the RapidChek® SelectTM Salmonella Strip Test andMicrobiological Culture.

RapidChek Select+ - Total

All Culture + 90 2** 92

- 10* 269 279

Total 100 271 371

* Apparent RapidChek Select False Positive samples.

** This could also be due to Salmonella distribution between NPIP samples

and RapidChek Select samples.

medidas correctoras el mismo día.

UN USO INNOVADOR DE TECNOLOGÍA COM-PROBADA, LA TRANSCRIPCIÓN REVERSA

PCR– La nueva determinación genética,que emplea la transcripción reversa-PCRpara detectar todas las especies deListeria presentes en las superficiesambientales, permite disponer de losresultados ocho horas después del mues-treo. De manera muy parecida a lo que ocurrecon el ADN, las bacterias poseensecuencias específicas de ARN que sonúnicas de un organismo diana. Aunquecada célula bacteriana tiene una o talvez unas pocas moléculas de ADN, nor-malmente puede contener miles demoléculas de ARN.La transcripción reversa-PCR se empleapara sintetizar inicialmente al ADN com-

plementario de las cadenas de ARN. Elproceso luego continúa con la amplifica-ción estándar de ADN y la detección. Elinmenso número de fragmentos de ARNpresentes al inicio de la PCR conduce aun aumento notable de la sensibilidadfrente a otros métodos de detección. Dehecho, la transcripción reversa-PCRpuede detectar especies de Listeria pre-sentes en concentraciones extremada-mente bajas (< 10 UFC/ml, excepto L.grayi en < 50 UFC/ml).Más importante aún, es el hecho de quecon la transcripción reversa-PCR lasmuestras no necesitan el enriquecimien-to habitual de uno o dos días en un caldonutritivo. En cambio, las células deListeria se resucitan por calentamientoen la solución tampón donde se recogendurante unas pocas horas, lo que pro-porciona al proceso un «despegue ini-

cial» y facilita la obtención de los resul-tados en apenas ocho horas. El kit deobtención de muestras, que tambiéncontiene guantes estériles, puedeenviarse por separado del kit de análisis,lo que facilita el muestreo en muchossitios y el envío al laboratorio centralpara las pruebas.No se necesita ninguna habilidad espe-cial y las tabletas de PCR eliminan lospasos adicionales de pipeteo necesariospara la extracción manual del ARN.Además, se obtienen respuestas de «sío no» claras y fiables que prácticamenteeliminan la necesidad de que expertosinterpreten los resultados.El sistema BAX® para determinar en 8horas Listeria ha sido certificado porAOAC-RI como Método de rendimientocomprobado (PerformanceTestedMethod) nº. 030801


31


comparison was run with the test kitmethod and standard NPIP culturemethods.

RESULTS– False positive and false negati-ve are based on discrepancybetween strip results and culture confir-mation from secondary media.

DISCUSSION AND CONCLUSIONS– Basedon these data, it is concluded that theRapidChek® SELECTTM product workswell for NPIP samples. As evident fromthe data, the RapidChek® SELECTTMcorrelated well with the NPIP approvedcultural methods. RapidChek® SELECTTM provide and

easy to use cost effective method for therecovery of Salmonella species fromthese high burden samples.PARA CONSULTAS TÉCNICAS: – BBiioosseerr,, SSAA.c/ Tarragona, 106; 08015 Barcelona. Tel:932264477; fax: 932267979; e-mail: biose-r o n l i n e @ b i o s e r . c o m ,[email protected]; www.bioser.com.

Table 1.- Results of Side-by-Side Method. Comparison by three independent NPIP labs.

NPIP Method RapidCheck MethodLab Total Pos Neg Reported Confirmed Confirmed FP FN Accuracy

Sample Nº Pos Pos Neg

1 184 42 142 69 60 124 9 0 95%

2 97 8 89 8 7 90 1 0 99%

3 90 21 69 23 23 67 0 0 100%

Total 371 71 300 100 90 281 10 0 98%

Becton Dickinson, SA

• Esta fórmula Campy-Cefex Agar fueadoptada por el "National AdvisoryCommittee on Microbiological Criteria

for Foods" para el aislamiento deCampylobacter en cadáveres de pollospara consumo.

• Con Cefoperazona y Cicloheximida,como agentes selectivos.

• Reduce la carga de trabajo y mejorala recuperación con respecto aotros medios como el mCCDA,Karmali, Campy Line y otros mediossimilares.

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