Para imprimir esta pgina utilice la opcin de imprimir de su navegador. Luego oprima "Atrs" o "Back" para regresar a Portal Veterinaria

Su portal de Veterinaria desde 1997

Congelacin y vitrificacin de embriones ovinos. Aspectos bsicos y aplicados. Experiencias en Uruguay Fecha: viernes 7 de marzo de 2003 a las 17:29 Seccin: Ovinos y caprinos Autor/es: Juan Carlos Boggio Devincenzi, DMTV MsC(*) Area Biotecnologa de la Reproduccin Animal. Facultad de Veterinaria Universidad de la Repblica. Uruguay. (*) En defensa de Tesis. Universidad Austral de Chile. Extrado del libro Transferencia de embriones y biotecnologa. Avances.. Captulo 8. Editora: Dra. Clara Larocca, DMV, Msc. rea Biotecnologa de la Reproduccin. Facultad de Veterinaria. Universidad de la Repblica. Uruguay. Palabras clave: congelacin, vitrificacin, criopreservacin, embriones, transferencia embrionaria, reproduccin, ovinos Resumen: La congelacin de embriones permite que las ventajas que ofrece la tecnologa de la transferencia embrionaria aumenten significativamente. Segn la velocidad de enfriamiento, concentracin y tipo de crioprotector utilizado, hay varios mtodos para congelar embriones. Se han clasificado en dos grandes grupos: a) curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rpidas y b) curvas de enfriamiento no tradicionales de dos etapas a ultrarrpidas. La vitrificacin de embriones es un mtodo de congelacin en el que, debido a la alta concentracin de crioprotectores y ultrarrpida velocidad de enfriamiento, cuando se congela el sistema embrin-medio, se solidifica sin formacin de cristales de hielo. La vitrificacin tiene ventajas frente a la congelacin tradicional, pero el principal problema para la aplicacin a gran escala ha sido el control estricto del tiempo de exposicin de los embriones al crioprotector, ya que debido a la alta concentracin requerida del mismo, existen problemas de disminucin de la viabilidad embrionaria. Aqu se presentan trabajos realizados en los que se recolectaron embriones ovinos con la finalidad de congelarlos convencionalmente y vitrificarlos con el objetivo de comparar la sobrevivencia in vitro lograda con ambos sistemas de congelacin.

En 1683 Boyle dio a conocer el primer trabajo sobre congelacin, unos 250 aos ms tarde los trabajos de Belehradek y Luyet y Gehenio marcaron una poca al dejar las bases para las teoras actuales (Diller y col., 1972). El descubrimiento de Polge y col., en 1949 que el glicerol protege los espermatozoides de la congelacin fue seguido por el nacimiento de Frosty I en 1951; el primer ternero resultado del uso de semen congelado, inicindose as el uso en inseminacin artificial (Alta, 1994).

Luego se comenz a congelar varios tipos de clulas, sin embargo en las dcadas de los 50 y 60 muy pocos embriones sobrevivan la congelacin. Whittingham y col. (1972) por un lado y Wilmut (1972a y b) por otro, comunicaron el nacimiento de los primeros mamferos (ratn) provenientes de embriones congelados y conservados a -196C. Willadsen y col. (1976a y b) fueron quienes lograron los primeros corderos de embriones congelados.

Desde el punto de vista prctico la principal ventaja de la congelacin de embriones es que permite economizar

y aumentar el rendimiento del uso de receptoras; aspecto que significa la mayor inversin en la industria de la transferencia de embriones.

Desde 1972 grandes avances se lograron en el estudio de muchos mecanismos involucrados en la sobrevivencia del embrin al congelamiento y descongelacin, incluyendo curvas de enfriamiento, temperaturas de seeding e inmersin en nitrgeno lquido (N2L), tasas y temperaturas de descongelacin, tipo, concentracin y mtodos de exposicin a crioprotectores (Fahning y Garca, 1992), efectos txicos (Fahy, 1986) y protectores (Carpenter y Growe, 1988).

Aos atrs se afirmaba que para tener xito en la congelacin de embriones se requera de un lento, preciso y controlado descenso de temperatura y lenta descongelacin (Wilmut, 1972a y b). Willadsen y col. (1978a) demostraron que esto no era cierto.

Hoy es posible obtener embriones viables luego del descongelado utilizando nuevas tcnicas, entre ellas la vitrificacin, disminuyendo el tiempo de congelacin desde varias horas a cerca de dos en congelacin tradicional, poco ms de una en congelacin convencional y no mucho ms de treinta minutos en vitrificacin. Adems de los clsicos crioprotectores glicerol y dimetilsulfxido, actualmente se dispone de otros de variadas caractersticas, ritmos de enfriamiento cortos y descongelamiento rpido, buscndose mtodos simples, econmicos y rpidos para congelar embriones, especialmente en condiciones de terreno. La vitrificacin es una clara demostracin de lo anterior, con ventajas de ser muy prctica y econmica.

Hoy el comercio internacional de embriones est establecido, y rutinariamente en muchos pases del mundo se congelan embriones con fines comerciales con altas tasas de sobrevivencia. La congelacin de embriones es indispensable tanto por razones econmicas como cientficas.

1. Congelacin de embriones

1.1. Aspectos bsicos

Los principios de la criobiologa estudiados por muchos (Mazur, 1961a y b, 1963, 1965 y 1966; Leibo y Mazur, 1971; Meryman, 1971; Schneider y Mazur, 1984) han servido como base para el actual xito y se aplican en la congelacin de embriones mamferos, aunque no del todo generalizables, ya que el embrin es una organizacin multicelular y su viabilidad depende tanto de la integridad celular como del estado de desarrollo.

La sobrevivencia del embrin a la congelacin depende entre otros factores del tamao de sus clulas, relacin volumen superficie, permeabilidad al agua y el coeficiente de temperatura de dicha permeabilidad. Por eso, en una misma especie, caractersticas propias de un tipo celular o estado de desarrollo embrionario no puedan ser totalmente extrapoladas a otro tipo celular o estado de desarrollo embrionario; tampoco se pueden extrapolar totalmente caractersticas propias de un mismo tipo celular o estado de desarrollo embrionario pero de diferentes especies.

Se definir como congelacin tradicional y/o curva de enfriamiento (o congelamiento) tradicional al mtodo basado en la menor formacin de cristales de hielo intracelular con un enfriamiento a 0.3 - 0.6C por minuto (C/min) de -4.5 -7C a los -30 -35 C, con exposicin de los embriones al crioprotector y remocin en una o ms etapas. Se definir como curva de congelacin convencional y/o curva de enfriamiento (o congelamiento) convencional al mtodo basado en la menor formacin de cristales de hielo intracelular con un enfriamiento de 0.5 - 0.6C/min desde -6 -7C hasta los -30 -35C, con exposicin de los embriones al crioprotector y remocin del mismo en una etapa.

Los factores que producen lesin celular dependen de la temperatura, tiempo, velocidad del cambio de temperatura y el estado fsico del agua (Mazur, 1966). El efecto solucin y los cristales de hielo intracelular son los factores bsicos implicados en el dao celular y a pesar que fueron descritos hace ms de 30 aos se siguen considerando para obtener altas tasas de sobrevivencia luego del descongelamiento.

Figura 1: Grfica de temperatura de pajuelas de 0.25 ml conteniendo embriones durante su congelacin. Arriba: Durante la congelacin las pajuelas se mantienen a 7 C y se realiza el seeding. El aumento de temperatura subsiguiente es pequeo. Abajo: Si no se realiza el seeding las pajuelas llegan a mucho menor temperatura antes de la nucleacin con el subsiguiente gran aumento de la temperatura. Adaptado de www.asymptote.co.uk.

La solucin que est a temperatura inferior a su punto de congelacin, fenmeno conocido como superenfriamiento (supercooling), debe liberar suficiente energa para cambiar de estado fsico. Cuando sucede la cristalizacin espontnea (aproximadamente entre los -10 a -15C), la energa acumulada se libera en forma de calor y la temperatura llega hasta el verdadero punto de congelacin de la solucin (aproximadamente de -4 a -7C). Este brusco cambio de temperatura es letal para los embriones y para evitarlo se induce una cristalizacin en el medio extracelular a unos 2 a 4C por debajo del punto de congelacin del medio, es lo que se conoce por seeding (Figura 1).

El superenfriamiento del embrin a -6C no afecta su sobrevivencia, pero por debajo de los -7C disminuye abruptamente, el superenfriamiento por debajo de los -12C es letal (Ciba, 1977).

Luego que se realiza el seeding los embriones deben permanecer a temperatura constante durante unos minutos para lograr equilibrio en la osmolaridad y temperatura intracelular.

Figura 2: Curvas de sobrevivencia de clulas segn la velocidad de congelacin. Las dos teoras descritas por Mazur y col (1972) para las causas de lesin celular al congelamiento.

Un importante concepto es que para diferentes tipos celulares existe una velocidad de enfriamiento ptima (curva crtica) que vara de acuerdo al tipo celular (Mazur y col., 1972)., su representacin grfica es una curva en forma de "U" invertida (Figura 2).

A velocidad de enfriamiento ms rpida que la ptima hay formacin de pequeos cristales de hielo intracelular (Figura 3), lo que se combina con recristalizacin en el descongelamiento (Mazyr, 1977b). El potencial qumico del agua intracelular es mayor que el del agua y hielo extracelulares, entonces el agua tiende a fluir fuera de la clula y se congela externamente.

Si la congelacin es muy rpida no saldr suficiente agua de la clula y se congela dentro de ella formando cristales de hielo intracelular (Ciba 1977). La disminucin de sobrevivencia debido al incremento en la velocidad de enfriamiento es una manifestacin de lesin celular debido a la formacin de cristales de hielo intracelular (Mazur y col., 1972)

Figura 3: Esquema de los eventos fsicos ocurridos en el congelamiento. (hexgonos representan cristales de hielo de diferente tamao segn la velocidad de enfriamiento). Adaptado de Ciba, 1977.

A velocidad de enfriamiento ms lenta que la ptima no habr formacin de cristales de hielo intracelular, el agua intracelular superenfriada fluye de la clula y se congela en forma de cristales de hielo grandes (Figura 3). Esto produce alteraciones en la composicin y propiedades de las soluciones intra y extracelulares, proceso definido como efecto solucin. Al congelar el agua extracelular los solutos se concentran y fluye agua de la clula para equilibrar el medio (Ciba, 1977) De continuar el proceso habr hipertonicidad intracelular que causar lesin (Mazur, 1965 y 1966).

Para disminuir el efecto solucin se detiene la deshidratacin sumergiendo directamente la muestra en N2L.

Son varios los factores que producen lesin celular; fundamentalmente mecnicos o fsicos y qumicos o bioqumicos. La hipertonicidad causa desnaturalizacin proteica, disociacin de lipoprotenas e influye en la activacin, estabilizacin o inhibicin de enzimas (Meryman, 1966).

Los cristales de hielo intracelular causan ruptura y vacuolizacin del citoplasma y membranas (Mazur, 1961a y b y 1966). La ruptura de membranas y en especial la de liposomas est asociada a la liberacin de enzimas hidroflicas liposomales con la consiguiente destruccin qumica de la clula (Meryman, 1966). Los cristales de hielo intracelular causan tanto alteraciones como ruptura mecnica de las membranas y deformaciones irreversibles con prdida de funcin de las grandes molculas orgnicas de la clula (Diller y col, 1972).

Otro mecanismo de lesin celular es el llamado fase de separacin lateral de los lpidos de membrana, que causa modificaciones irreversibles en la estructura de la membrana celular y prdida de su funcin (Ciba, 1977). Durante el enfriamiento lento el pH disminuye mucho, lo que est relacionado a desnaturalizacin proteica (Meryman, 1966).

Se puede simplificar que la congelacin no es ms que la remocin de agua pura de una solucin y su aislamiento en forma de cristales de hielo; ste es el concepto ms simple e importante. Todas las secuelas bioqumicas, anatmicas y fisiolgicas de la congelacin son directa o indirectamente consecuencia de este simple evento fsico (Meryman, 1966); debe ser suficientemente rpido para evitar el efecto solucin y suficientemente lento para que se forme la menor cantidad posible de cristales de hielo intracelular.

El embrin se coloca en un medio de congelacin compuesto por crioprotectores, nutrientes y sustancias tampn, la mayora se utilizan adems para cultivos celulares o fecundacin in vitro. La ms utilizada es el Dulbecco fosfato buffer salino (PBS). El medio con el embrin debe mantenerse a un pH de 7.4 0.5 y osmolaridad de 285 - 300 miliosmoles (mosm). El PBS tiene como sustancia tampn fosfato y su pH cambia muy poco en el medio ambiente, lo que no sucede con otros medios como TCM-199 y otros, que tienen tampn bicarbonato y pH no es controlado, se los debe mantener con alto nivel de CO2. Por lo anterior el PBS es el medio ms usado, tanto en la solucin crioprotectora como en el medio de recoleccin de embriones.

Al medio de congelacin se le adiciona entre 10 % y 20 % de suero sanguneo o 4 % de albmina srica bovina fraccin V (BSA). Tambin se ha usado suero fetal de ternero (FCS), de novillo, de ternero recin nacido o vaca dadora (Palasz y Del Campo, 1995), oveja (Willadsen y col., 1978a) o carnero con deferectoma (Ciba, 1977).

1.2. Aspectos aplicados

El embrin mantenido entre 18 y 20C comienza a sufrir dao a las 5 - 8 horas (h) de recolectado (Willadsen y col., 1978a). En medios de cultivo a 37C se logra sobrevivencia hasta unas 48 h (Willadsen y col., 1978a). Entre 0 y 5C puede mantenerse de 24 a 96 h (Leibo y Winninger, 1986). Se ha comprobado que en estado superenfriado (supercooling) a temperatura entre -5C y -15C es posible mantener los embriones durante 24 - 72 h (Ramsbottom y col., 1993). Bajo los -130C las reacciones biolgicas son prcticamente nulas (Mazur, 1966). Mediante congelacin y posterior conservacin a -196C en N2L se logran detener los procesos biolgicos del embrin quedando en estado de animacin suspendida, permitiendo que la congelacin sea, en trminos prcticos, indefinida (Palasz y Del Campo, 1995).

Segn Seidel (1991), en los aos 50 los investigadores soaban cundo y cmo se podran aplicar tcnicas como la sincronizacin de estro y superovulacin, sexaje de semen y embriones, maduracin y fecundacin in vitro, transferencia nuclear y la congelacin de embriones. Actualmente estas tcnicas ya estn disponibles, y muchas se aplican a nivel comercial.

Se ha avanzado a tal punto que hoy es posible transferir un embrin descongelado de la misma manera que una comn inseminacin artificial, con gran seguridad y sin necesidad de previa evaluacin.

La congelacin de embriones permite que las ventajas que ofrece la tecnologa de la transferencia de embriones aumenten significativamente.

Permite el comercio internacional de material gentico de gran valor, pudindose transportar embriones congelados por mucho menor costo que el de animales en pie y con mucho menor riesgo de accidentes y transmisin de enfermedades. Exhaustivas revisiones sobre enfermedades transmisibles por semen y embriones (Gurin y col., 1997) concluyen que el riesgo de transmisin por medio de embriones es insignificante, siempre y cuando se sigan estrictas normas de manejo. El embrin es la forma ms segura de mover material gentico internacionalmente.

Ventajas adicionales al comercio internacional son la adaptacin de la cra al medio ambiente de la receptora, no slo en trminos agroclimticos, sino tambin debido al aporte de anticuerpos maternos durante la gestacin y lactancia (Seidel 1991). Tambin es posible cambiar totalmente la raza de un establecimiento o introducir nuevas razas en una regin o pas. A modo de ejemplo, en abril del 2000 la firma Albanell Hnos. realiz la primer importacin al Uruguay de embriones ovinos de las razas Samm y Dorper, llevndose a cabo el primer programa comercial de multiovulacin y trasferencia de embriones (MOET) aplicado a gran escala en Uruguay.

La congelacin de embriones tambin permite conservar especies silvestres o poco comunes, en peligro de extincin o animales de gran valor gentico que no pueden reproducirse por vejez, traumatismos u otros motivos.

Con respecto a actividad enzimtica y crecimiento las clulas que sobreviven la congelacin son genticamente idnticas a la poblacin original (Mazur, 1966). El potencial de aparicin de mutaciones o enfermedades por otras causas es cientos de veces mayor que el mximo de 1/10000 que puede llegar a producir la congelacin de embriones (Ciba, 1977). Este concepto, en la ciencia de la gentica, permite conservar animales con mutaciones, consanguneos o con combinaciones de genes especiales (Maurer, 1978) y protegerlos de enfermedades o accidentes.

Para estudios de seleccin natural y/o por razones de tipo comercial sera ms conveniente la congelacin de embriones que la de semen y ovocitos, ya que el embrin conserva el genoma completo diploide (Barros, 1985), pudiendo transferirse sin riesgos de cambio gentico. La congelacin de embriones permite acumularlos en gran cantidad para ser utilizados cuando sea necesario, ahorrando espacio y dinero, adems de protegerlos de enfermedades o desastres naturales. Los embriones congelados se pueden mantener con seguridad mientras a sus parientes se les realizan pruebas de enfermedades; se pueden mantener en cuarentena mientras se examina el estado sanitario de la dadora, o unos se pueden transferir y otros congelar hasta analizar los registros de produccin de la descendencia y evaluar mrito gentico. Es posible descongelar un embrin, realizarle biopsia y volverlo a congelar mientras se descartan enfermedades genticas.

Desde el punto de vista prctico, la ventaja ms importante es la reduccin de receptoras, haciendo ms eficiente su uso, ya que representan la mayor inversin en la industria de la transferencia de embriones, aumentando la eficiencia del proceso ya que se pueden transferir embriones a medida que hay receptoras en un apropiado estado del ciclo estral. Esto significa disminucin de costos y uso ms eficiente del capital al aplicar menos hormona y necesitar menos horas hombre para el manejo de las receptoras. El mantenimiento de receptoras y su estado de salud son costosos y de principal importancia para el buen resultado de la transferencia de embriones.

1.3. Crioprotectores

Polge y col. (1949) descubrieron accidentalmente la accin del glicerol al comprobar que agregndolo al medio de congelacin de semen ofreca proteccin a los espermatozoides de gallo evaluado en trminos de recuperacin de la motilidad y capacidad fecundante luego de la descongelacin. La presencia de crioprotectores es fundamental para la sobrevivencia del embrin congelado (Schneider y Mazur, 1984).

Cualquier clula de mamfero congelada sin crioprotector muere entre los -5C y -20C, con el agregado de crioprotectores disminuye progresivamente la temperatura letal hasta que la muerte celular ocurre an por debajo de los -100C (Ciba, 1977).

Los crioprotectores disminuyen el punto de fusin de las soluciones, reducen la concentracin intra y extracelular de electrolitos y la excesiva deshidratacin celular a temperaturas bajo cero (Ciba, 1977), reducen el hielo durante la congelacin e influyen en su forma (Mazur, 1966). Tambin inhiben la actividad de muchas enzimas disminuyendo o eliminando la actividad de radicales libres responsables de lisis celular, antes, durante y luego de la congelacin y descongelacin (Carpenter y Crowe, 1988), estabilizan protenas celulares (Fahy y col., 1987), mantienen en equilibrio el potencial qumico del agua intra y extracelular (Ciba, 1977), reemplazan las molculas de agua removidas durante la congelacin (Meryman, 1966) y bloquean la toxicidad de otros crioprotectores (Fahy y col., 1987).

Los crioprotectores no son panaceas y a pesar de sus varias funciones y caractersticas, la sobrevivencia embrionaria a la congelacin difcilmente llega al 100 %, an aplicando ptimas tasas de enfriamiento y descongelacin (Fahy, 1986). Reducen el dao celular del efecto solucin y cristales de hielo intra y extracelular, pero se debe considerar que tienen caractersticas txicas para las clulas.

Los crioprotectores pueden producir dos tipos de toxicidad, una directa o bioqumica y otra osmtica.

La toxicidad directa o bioqumica produce inactivacin y/o desnaturalizacin proteica y enzimticas, interfiere con bombas inicas y solubiliza lpidos de membrana; toxicidad relacionada a interacciones entre crioprotector, protenas y membranas (Fahy y col., 1987).

Los crioprotectores protegen la clula durante el enfriamiento al estabilizar protenas, aunque paradojalmente, a temperaturas fisiolgicas producen desnaturalizacin proteica porque la interaccin crioprotector-protena depende de la temperatura. Los crioprotectores poseen caractersticas hidrofbicas e hidroflicas, a baja temperatura las uniones hidrofbicas son mnimas, predominando las hidroflicas, el crioprotector queda excluido de la protena y sta mantiene su forma natural, a alta temperatura son favorecidas las uniones hidrofbicas y el crioprotector se une a la protena causando desnaturalizacin (Arakawa y col., 1990).

La toxicidad directa o bioqumica depende de la concentracin del crioprotector, temperatura del sistema, presencia de otros crioprotectores o sustancias y de la hidrofobicidad relativa de la protena (Fahy y col., 1987).

La toxicidad osmtica se debe a cambios de volumen experimentados por el embrin, que tiene un lmite tolerable para su sobrevivencia (Ciba, 1977; Schneider y Mazur, 1984). Cierta proporcin de agua es esencial para mantener y estabilizar protenas celulares. La lesin de membrana est relacionada con el estrs osmtico, ya que toda clula tiene un mnimo tolerable de volumen (Meryman, 1971b).

Otra causa de lesin osmtica es que al existir excesiva deshidratacin las protenas celulares se concentran y disminuye el espacio citoplasmtico, formndose fuertes uniones bisulfuro que no se separan cuando la concentracin de agua se restablece. La formacin de fuertes uniones bisulfuro altera la estructura proteica y produce su desnaturalizacin (Meryman, 1966).

Se debe destacar que muchas de las causas de lesin suceden durante el congelamiento y descongelamiento y no dependen exclusivamente del crioprotector.

Un buen crioprotector debe tener alta solubilidad y baja toxicidad a altas concentraciones y si es penetrante bajo peso molecular para entrar fcil y rpidamente a la clula y obtener el mximo efecto protector.

Comnmente se utiliza el trmino permeable para referirse a un crioprotector que tiene la capacidad de entrar a la clula e impermeable o no permeable cuando no lo hace. Se piensa que el trmino permeable no sera correcto, ya que no es el crioprotector el que tiene esta caracterstica, sino que la membrana celular es la que permite (de la interaccin con el crioprotector) que entre o no a la clula. El trmino penetrante es el que mejor describe el comportamiento del crioprotector. Su accin puede considerarse como intracelular (penetrantes) o extracelular (no penetrantes).

Se han usado hasta la fecha unos 60 crioprotectores de muy variadas caractersticas. Se clasifican en dos grupos: a) Penetrantes de bajo peso molecular (glicerol y etilenglicol entre otros) y b) no penetrantes, de bajo (sucrosa y trehalosa entre otros) o alto (ficoll, polivinilpirrolidona y otros) peso molecular.

1.3.1. Crioprotectores penetrantes

La mayora son alcoholes. Reemplazan osmticamente el agua intracelular antes y durante el congelamiento y disminuyen el punto de congelacin del agua, lo que combinado a una lenta tasa de enfriamiento disminuye la formacin de cristales de hielo (Palasz y Del Campo, 1995). Sus pesos moleculares varan entre 32 y 212 Daltons.

1.3.2. Crioprotectores no penetrantes

Por el gran tamao de su molcula no entran a la clula o lo hacen con extremada dificultad; son azcares y macromolculas. Reducen las fuerzas inicas fuera de la clula e influyen en la formacin de cristales de hielo (Palasz y Del Campo, 1995). Segn el tamao de la molcula se clasifican en bajo y alto peso molecular.

i. Crioprotectores no penetrantes de bajo peso molecular. Son azcares. Inducen deshidratacin celular antes del enfriamiento, reduciendo la formacin de cristales de hielo en la congelacin (Palasz y Del Campo, 1995). Sus pesos moleculares son de 150 a 614 Daltons.

ii. Crioprotectores no penetrantes de alto peso molecular. Son macromolculas. Protegen los embriones durante el congelamiento y descongelamiento alterando la formacin de cristales de hielo intracelular a un tamao y caractersticas tales que no producen dao celular (Palasz y Del Campo, 1995). Sus pesos moleculares son mayores a 1000 Daltons.

Para que los crioprotectores no penetrantes expresen al mximo sus caractersticas deben ser mezclados con crioprotectores penetrantes (Palasz y Del Campo, 1995).

El ms usado ha sido el glicerol, aunque hoy en da se le ha prestado especial atencin al etilenglicol (Voelkel y Hu, 1992; McGinnis y col., 1989 y 1993; Songsasen y col., 1993) que ha demostrado su efectividad en los trabajos ms recientes (Martnez y col., 1997; Naitana y col., 1997). El etilenglicol, comparado con otros crioprotectores penetrantes, tiene ventajas por su alta velocidad de penetracin y muy baja toxicidad a las clulas embrionarias (Tervit y Goold, 1984; Heyman y col., 1987; Cocero y col., 1988; Szll y col., 1989; Brebion y col., 1992; McGinnis y col., 1993; Songsasen y col., 1993). Segn McGuinnis y col. (1993), el etilenglicol es el crioprotector ms apropiado para congelar embriones ovinos de manera tradicional.

Se han usado gran diversidad de curvas de enfriamiento, temperaturas de seeding e inmersin en N2L, tasas y temperaturas de descongelacin y tipo, concentracin y mtodos de agregado de crioprotectores. Pero independiente de la especie y mtodo de congelacin hay pasos comunes: a) Exposicin del embrin al crioprotector; b) envasado; c) enfriamiento y congelacin de temperatura ambiente hasta -196C; d) conservacin en N2L; e) descongelamiento de -196C hasta temperatura ambiente y f) remocin (dilucin) del crioprotector.

1.4. Exposicin al crioprotector

Cuando se expone al crioprotector el embrin pierde agua y se encoge, el agua sale para equilibrar el medio. Luego de cierto tiempo el crioprotector comienza a penetrar en la clula y el embrin comienza a expandirse debido a la entrada de agua para mantener el equilibrio osmtico; se alcanza el volumen isotnico (equilibrio) cuando no hay ms entrada de agua ni crioprotector (Leibo, 1989).

La penetracin del crioprotector depende del coeficiente de permeabilidad, temperatura, concentracin, de la superficie del embrin, especie y estado de desarrollo (Niemann, 1991). Lo anterior explicara las diferencias en los resultados cuando se aplica un mismo mtodo de congelacin a embriones de diferentes especies, o cuando se usa un mismo crioprotector en diferentes estados de desarrollo embrionario.

La evolucin con respecto a los crioprotectores utilizados y mtodos de exposicin del embrin a los mismos, buscndose ahorro de tiempo y facilidad, ha sido sorprendente.

Inicialmente se expuso el embrin al crioprotector a concentraciones molares decrecientes desde seis y luego a tres etapas. Del Campo y col. (1988b) concluyeron que no es necesario el lento y complicado proceso de adicin del crioprotector en varias etapas (5 a 10 min cada una) al no haber diferencias entre ese mtodo y adicionar el crioprotector en una sola etapa.

El embrin tiende a deteriorarse a medida que el proceso de congelacin progresa, indicando que cada etapa tiende a causarle dao, para ahorrar tiempo y para que el mtodo sea ms prctico los embriones se exponen al crioprotector en una sola etapa ((Niemann, 1991).

Luego de la exposicin al crioprotector, el embrin debe cargarse en un envase adecuado para comenzar con su enfriamiento (curva de congelacin o enfriamiento).

Antes se usaban ampolletas de vidrio; desde 1984 el envase de eleccin es la pajuela de plstico de 0.25 ml (pajuela francesa), que tiene ventajas de dimetro muy pequeo, pared delgada, poco volumen y gran superficie de contacto, propiedades que resultan en un seeding ms rpido y efectivo y en la disminucin de la curva de enfriamiento crtica, implicando mayor sobrevivencia embrionaria (Niemann, 1991; Schiewe y col., 1991).

1.5. Curvas de enfriamiento (mtodos de congelacin)

De acuerdo a la velocidad de enfriamiento, concentracin y tipo de crioprotector utilizado, hoy da hay disponibles varios mtodos y variaciones para congelar embriones.

Los procedimientos que utilizan enfriamiento controlado requieren que se realice la induccin de formacin de cristales de hielo (seeding), involucrando curva de enfriamiento, mquina congeladora, volumen de la muestra, el instrumento con que se realiza y su temperatura (Niemann, 1991) y el lugar donde se provoca. Generalmente el seeding se hace mediante el contacto con una pinza previamente enfriada en N2L.

Desde que separadamente Whittingham y col. (1972) y Wilmut (1972a y b) utilizaron una velocidad lenta de enfriamiento de 0.1 - 0.3C/min desde la temperatura ambiente hasta los -60 a -80C, se estn haciendo modificaciones continuamente en las curvas de enfriamiento. La curva debe ser suficientemente lenta para prevenir formacin de cristales de hielo intracelular y suficientemente rpida para minimizar la exposicin de la clula al efecto solucin.

Buscando que la congelacin de embriones sea simple y rpida, se han usado distintas concentraciones y combinaciones de crioprotectores, agregados y extrados en una o ms etapas. Los embriones han sido congelados a diferentes velocidades, curvas de congelacin y temperaturas de inmersin en N2L. Esto implica que sea difcil clasificar lo publicado. La confusin aumenta cuando se quieren clasificar en idioma espaol trminos definidos en idioma ingls. Por ejemplo, quick, fast y rapid, que para el idioma espaol son sinnimos, no lo son para el idioma ingls. Se han publicado trabajos de congelacin quick, que quedaran mejor definidos como congelacin ultrarrpida, o two-step, quedando mejor definida como rpida. Algunos clasificaron la congelacin one-step refirindose a la velocidad de enfriamiento; cuando actualmente la congelacin one-step es conocida con respecto a la exposicin de los embriones al crioprotector y transferencia del embrin descongelado sin necesidad de extraer el crioprotector.

Con la intencin de aclarar la situacin, en la presente revisin se clasifican los mtodos de congelacin de embriones (o curvas de congelacin, o enfriamiento) de acuerdo al tipo de crioprotectores y concentracin

utilizada y la temperatura de inmersin en N2L. Se han clasificado en dos grandes grupos: a) curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rpidas (lenta, rpida con enfriamiento en dos etapas, rpida con enfriamiento en una etapa, muy rpida y convencional) y b) curvas de enfriamiento no tradicionales de dos etapas a ultrarrpidas (dos etapas, directa, ultrarrpida y vitrificacin).

1.5.1. Curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rpidas

En estas curvas de enfriamiento (o congelacin) se han usando crioprotectores penetrantes a concentraciones de 1.5 - 2.0 molar (M), variando la velocidad de enfriamiento (de 0.1 a 0.6C/min) y la temperatura de inmersin en N2L (de -30C a -120C).

Figura 4 (pulse para agrandarla): Curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rpidas. Ntese como a lo largo de los aos el tiempo requerido para congelar embriones disminuy desde aproximadamente 5h 20min en congelacin lenta hasta no mucho ms de una hora en congelacin convencional.

i. Congelacin tradicional lenta. (Figura 4, curva amarilla). Con esta curva se logr por primera vez sobrevivencia de embriones mamferos. El enfriamiento es lento, de 0.1 - 0.3C/min de temperatura ambiente a los -60 a -120C y luego inmersin en N2L; la descongelacin se ha hecho de 4 a 25C/min. El tiempo requerido para congelar los embriones es de unas 4.0 - 6.5 h. En embriones ovinos la sobrevivencia vara de 33.0 % - 80.0 % in vitro y 25.7 % - 44.4 % de preez (Willadsen y col., 1974; Merry y col., 1984).

ii. Congelacin tradicional rpida con enfriamiento en dos etapas. (Figura 4, curva verde). Willaden (Ciba, 1977) basado en trabajos con embriones ovinos y bovinos fue el primero en desarrollar una congelacin rpida en embriones bovinos con enfriamiento lento en dos etapas (Willadsen y col., 1978a). La velocidad de enfriamiento fue de 1C/min de temperatura ambiente a -7C; permaneciendo 10 min (a los cinco min seeding), luego a 0.3C/min hasta -30C, despus a 0.1C/min hasta -36C luego inmersin en N2L. Obtuvieron 76.2 % de sobrevivencia in vitro. Esta curva disminuye tanto el efecto solucin como la formacin de cristales de hielo intracelular, demostrando as que no es necesario llegar a los -60 o -80C para sumergir los embriones en N2L. El tiempo requerido para congelar los embriones disminuy a unas 3 h. En embriones ovinos la sobrevivencia ha variado entre 39.0 % - 93.0 % in vitro, 23.0 % - 64.0 % de preez y 47.6 % - 85.0 % de nacimientos (Merry y col., 1984; Tervit y Goold, 1984; Martnez y col., 1993; Sakul y col., 1993).

iii. Congelacin tradicional rpida con enfriamiento en una etapa. (Figura 4, curva azul). Lehn-Jensen y col. (1981) publicaron una congelacin en dos etapas (two-step). Hoy quedara mejor definida como congelacin rpida con enfriamiento en una etapa. La curva de enfriamiento fue: de temperatura ambiente a -6 -7C a 1C/min, mantenimiento de la temperatura por 10 min, seeding, luego a 0.3C/min hasta -30, -35 o -40C e inmersin en N2L. Cuando los embriones fueron sumergidos en N2L a -30C hubo 63.0 % de sobrevivencia in vitro y 59.0 % de preez. Con este mtodo el tiempo requerido para congelar los embriones disminuy aproximadamente a 2 h, aumentando considerablemente el aspecto prctico de la congelacin de embriones. En embriones ovinos la sobrevivencia vara entre 0.0 % y 80.0 % in vitro y 20.0 % a 73.0 % de preez (Ware y Boland, 1987; Schiewe y col., 1991; Shelton, 1992; McGinnis y col., 1993).

iv. Congelacin tradicional muy rpida. (Figura 4, curva roja). Los embriones son colocados directamente desde -4 a -7C (o luego de un enfriamiento a ms de 2C/min), se mantiene la temperatura por 10 min (a los cinco min seeding) y luego se aplica un enfriamiento a 0.3 - 0.4C/min hasta -30 a -35C y posterior inmersin en N2L. As el tiempo requerido para congelar los embriones lleg a ser 1.5 h; simplificndose an ms la congelacin de embriones. En embriones ovinos la sobrevivencia ha variado entre 23.3 % - 76.7 % in vitro, 44.4 % - 82.0 % de preez y 0.0 % - 78.0 % nacimientos (Heyman y col., 1987; Cocero y col., 1988; Czllonkowska y col., 1991; Joly y col., 1992; Nellenschulte y Niemann, 1992).

v. Congelacin convencional. (Figura 4, curva negra). La aplican hoy casi todos. Los embriones se colocan directamente a -7C, permanecen durante 10 min (a los cinco min seeding), y luego se hace un enfriamiento a 0.5 - 0.6C/min hasta los -35C; despus se sumergen en N2L. El avance logrado con esta curva reduce el tiempo de congelacin a no mucho ms de una hora. En ovinos la sobrevivencia ha variado entre 53.3 % - 83.0 % in vitro, 22.7 % de preez y 62.5 % de nacimientos (Songsasen y col., 1993 y 1995; Boggio Devincenzi, 1997 y 2001).

Entre las diferentes variaciones clasificadas, los porcentajes de sobrevivencia obtenidos han sido muy similares, lo que ha variado es la velocidad y temperatura final e inicial de congelacin, llegndose a disminuir el tiempo de unas cinco horas inicialmente requerido a muy poco ms de una hora. Esto ha significando un gran ahorro de tiempo y aumento en el aspecto prctico de la congelacin de embriones, permitiendo que en muchos lugares se haga rutinariamente.

1.5.2. Curvas de enfriamiento no tradicionales

Se ha usado crioprotectores penetrantes de 1.5 a 8.0 M asociados o no a crioprotectores no penetrantes 0.25 y 2.0 M. Se han desarrollado otros mtodos (2 etapas, directa, ultrarrpida, vitrificacin) basados en disminuir la deshidratacin celular durante el congelamiento antes de sumergir los embriones en N2L.

i. Congelacin en dos etapas. En embriones mamferos la aplicaron Wood y Farrant (1980) con 1.5 M dimetilsulfxido. Enfriaron los embriones hasta 0C y colocaron ampolletas en bao de alcohol preenfriado a -9C, mantuvieron la temperatura por 15 min y dos minutos despus realizaron el seeding, posteriormente las transfirieron a otro bao de alcohol con temperatura constante de -20 o -25C y se mantuvieron durante 10 a 30 min antes de ser sumergidas en N2L.

ii. Congelacin directa. Bui-Xuan-Nguyen y col. (1984) desarrollaron un mtodo muy rpido buscando una rpida deshidratacin del embrin exponindolo durante unos minutos a una solucin 1.0 - 2.0 M glicerol + 0.5 - 1.0 M sucrosa; produciendo. Antes de la inmersin en N2L los embriones permanecen 30 min a -30C. La velocidad de enfriamiento fue de 12C/min. Con este mtodo obtuvieron 63.3 % de sobrevivencia in vitro y 33.3 % de preez en embriones bovinos. Los resultados de sobrevivencia embrionaria logrados con esta curva son buenos, aunque ltimamente no se han publicado muchos trabajos que hayan aplicado esta tcnica.

iii. Congelacin ultrarrpida. Se busca la deshidratacin del embrin previa a su congelacin, con la diferencia que luego de la exposicin al crioprotector los embriones son sumergidos directamente en N2L o previamente expuestos durante unos segundos a vapores y luego sumergidos. No se necesitan sofisticados equipos de congelacin, es muy prctica y no requiere de mucho tiempo. La congelacin por este mtodo es tan rpida que se forman cristales de hielo intracelular, pero tan pequeos (

iv. Vitrificacin. Curva ultrarrpida y altas concentraciones de crioprotector donde no se forman cristales de hielo. Es un mtodo diferente a los dems; se tratar aparte y en detalle ms adelante.

Hay variaciones difcil de clasificar y no han llegado a ser tan usadas como otras. En embriones ovinos la sobrevivencia in vitro ha variado entre 31.0 % y 75.0 % (De Paz y col., 1994).

1.6. Descongelacin de embriones

La tasa ptima de descongelamiento depende de la velocidad de congelacin. Para lograr buena sobrevivencia los embriones congelados lentamente deben descongelarse lentamente y los sumergidos en N2L a los de -30C deben descongelarse rpidamente a 300C/min (Ciba, 1977; Fahning y Garca, 1992). Cuando la velocidad de descongelacin es lenta las clulas congeladas rpidamente tendrn mayor lesin que clulas congeladas lentamente porque durante la descongelacin lenta la lesin se incrementa como resultado de pocos y grandes cristales de hielo a partir de muchos y pequeos ncleos, fenmeno conocido como recristalizacin (Ciba, 1977).

Se ha demostrado que los daos en la zona pelcida son mnimos si la pajuela es descongelada directamente en aire o si primero es expuesta al aire durante 15 - 20 seg y luego se sumerge en bao de agua de 30 a 35C durante 15 - 20 seg (McGinnis y col., 1993).

1.7. Remocin del crioprotector

El crioprotector se puede extraer:

a. Usando altas temperaturas. La permeabilidad de las clulas embrionarias al crioprotector incrementa al aumentar la temperatura (Leibo, 1989). Debe aplicarse con cuidado; a alta temperatura tambin incrementa la toxicidad del crioprotector.

b. Pasaje del embrin por concentraciones molares decrecientes de crioprotector desde seis hasta tres etapas (Elhordoy y col., 1990). As se obtienen buenos resultados de sobrevivencia, pero implica un trabajo tedioso y de mucho tiempo al permanecer los embriones entre cinco y diez minutos en cada etapa. Actualmente muy pocos lo hacen de esta manera.

c. Pasaje del embrin por concentraciones molares decrecientes de un crioprotector penetrante ms otro no penetrante (comnmente sucrosa). Se ha hecho en cuatro, dos o una etapa, pero lo ms comn han sido tres (Palasz y Del Campo, 1995). Este mtodo no ha sido muy usado.

d. Usando un crioprotector no penetrante como sucrosa. Conocido como one-step, descrito por Leibo y Mazur (1978). En ovinos lo aplicaron por primera vez Merry y col. (1983). Si el embrin descongelado es colocado en una solucin isotnica, las clulas se hincharn y desintegrarn por violenta entrada de agua. La sucrosa acta como tampn osmtico, por su accin extracelular mantiene el medio extracelular hiperosmtico y el agua no entra, sale de la clula para equilibrar el medio y el embrin se encoge. El crioprotector tambin difunde al medio extracelular y si el embrin se transfiere a una solucin isotnica, o es transferido a la receptora, el agua vuelve a entrar para lograr el equilibrio osmtico (Schneider y Mazur, 1984). A pesar de los buenos resultados logrados de manera one-step, no ha sido aplicada a gran escala, posiblemente por la complicacin prctica en el llenado de la pajuela; se debe mantener una relacin 1:10 entre el medio con crioprotector que contiene el embrin y el volumen de sucrosa. Muchos trabajan en investigacin y comercialmente extraen el crioprotector con la ayuda de sucrosa pero no la usan para transferir directamente los embriones sin evaluacin previa.

e. Usando crioprotectores de muy rpida penetracin como etilenglicol. Por sus propiedades no es necesario extraerlo, es posible transferir el embrin directamente a la receptora. El mtodo con etilenglicol es conocido como transferencia directa (direct transfer). Lo usaron Voelkel y Hu (1992) para transferir directamente embriones bovinos sin extraccin del crioprotector; sin diferencias con sucrosa y dilucin en tres etapas (50.0 % de preez en ambos mtodos).

En embriones ovinos Songsasen y col. (1993) lograron 83.0 % de desarrollo in vitro y 22.7 % in vivo (5 corderos nacidos de 22 embriones transferidos). Los autores concluyeron que se logran altas tasas de

sobrevivencia utilizando etilenglicol y transfiriendo directamente el embrin. En embriones ovinos, con etilenglicol se obtienen mejores resultados que con glicerol (Tervit y Goold, 1984; Cocero y col., 1988).

En los primeros trabajos realizados en Uruguay sobre congelacin de embriones ovinos, Boggio Devincenzi (1997) obtuvo 64.3, 53.3 y 60.0 % de sobrevivencia in vitro en mrulas compactas, blastocistos y blastocistos expandidos respectivamente; los embriones tambin fueron preparados para transferencia directa, pero los resultados se evaluaron in vitro.

Congelar embriones, descongelarlos y transferirlos directamente a sin extraer el crioprotector, como si fuera una inseminacin artificial, hoy es posible. Se ha cumplido uno de los sueos de muchos investigadores y tcnicos que trabajan en transferencia de embriones a nivel comercial.

2. Vitrificacin de embriones

2.1. Introduccin

Se ha definido de varias maneras (Diller y col., 1972). Es un mtodo de congelacin en el que debido a la alta concentracin de crioprotectores y ultrarrpida velocidad de enfriamiento, cuando se congela el sistema embrin-medio las molculas se disponen de manera similar a las del vidrio (Rall, 1987), solidificando sin formacin de cristales de hielo (Fahy y col., 1984). Para tener xito, el embrin debe suspenderse en una solucin crioprotectora suficientemente concentrada como para evitar la cristalizacin y solidificar como vidrio a velocidades de congelamiento practicables y tolerar la adicin y extraccin de dicha solucin (Rall, 1987).

A pesar que el concepto de vitrificacin fue propuesto por primera vez en 1937 por Luyet para congelacin de clulas y tejidos, por muchos aos no tuvo el desarrollo que hay actualmente, porque no se conoca tanto como hoy la tendencia a formar vidrio de las soluciones crioprotectoras acuosas y porque los investigadores se orientaban ms al enfriamiento y descongelacin rpidos de las clulas (Fahy y col., 1987).

Rall y Fahy (1985) vitrifican por primera vez embriones de ratn. Schiewe y col. (1990) y Szll y col. (1990) fueron los que comunicaron el nacimiento de corderos.

2.2. Aspectos bsicos

El vidrio tiene igual disposicin molecular e inica que el lquido, sus propiedades estructurales son iguales que las del lquido con propiedades mecnicas de slido. Los tomos y molculas del vidrio estn "arrestadas" porque han perdido el del lquido; la estructura al azar de las molculas de lquido se mantiene en el vidrio, a diferencia de la disposicin regular de los cristales de hielo (Fahy y col., 1984). Aunque la inspeccin visual sea un criterio de vitrificacin (Fahy y col., 1984; Ali y Shelton, 1993c), sin otras evidencias puede llegarse a conclusiones errneas debido a que muy pequeos cristales de hielo (

disminuye su concentracin o se usan crioprotectores poco txicos, pero capaces de vitrificar (Fahy y col., 1987). La elevada concentracin de crioprotectores puede llegar a causar daos irreversibles en el citoesqueleto celular adems de las lesiones descritas en la congelacin tradicional. La toxicidad est directamente relacionada con la concentracin del crioprotector y por cuanto tiempo se exponga el embrin a l. Hay varias maneras de evitarla o reducirla: a) reduccin de la concentracin del crioprotector, b) disminucin de la temperatura durante la exposicin del embrin al crioprotector, c) reduccin del tiempo de exposicin, d) usar crioprotectores poco txicos y e) usar mezclas de crioprotectores (Rall, 1987).

2.3. Aspectos aplicados

Son casi los mismos que la congelacin tradicional y/o convencional. Algunos investigadores (Dobrinsky y col., 1991) usan la vitrificacin rutinariamente en embriones bovinos, recientemente Mahomoudzadeh y col. (1995) comunicaron por primera vez la transferencia directa de embriones bovinos producidos in vitro, vitrificados con 40 % etilenglicol2 + 18 % ficoll + 10.26 % sucrosa, logrando 51.0 % a 58.0 % de sobrevivencia in vivo.

Hay diferencias en los embriones producidos in vitro o in vivo. Embriones producidos in vitro tienen variaciones en su metabolismo, son ms oscuros y tienen masa celular menos compacta, mayor vacuolizacin de blastmeras, cantidad de granos lipdicos y complejos lisosomales y menor sobrevivencia (Guocheng y col., 1997). En vitrificacin, como no hay cristales de hielo la lesin es menor; por eso el mtodo debe mejorarse para lograr buena sobrevivencia de los embriones producidos in vitro. Los resultados con embriones vitrificados producidos in vitro han sido mejores que los logrados con congelacin tradicional. Dinnys y col. (1992) lograron con diferentes estados de desarrollo 97.0 %, 97.0 % y 93.0 % vs. 92.0 %, 87.0 % y 94.0 %.

La vitrificacin tiene ventajas frente a la congelacin tradicional y/o convencional, aunque an no se aplica en tanta cantidad de embriones, una de las causas principales es que se debe controlar muy precisamente el tiempo de exposicin de los embriones al crioprotector, ya que debido a la alta concentracin requerida para lograr la vitrificacin existen problemas de disminucin de viabilidad embrionaria debido a la toxicidad provocada por los crioprotectores; este ha sido el principal problema para la aplicacin a gran escala de esta tcnica. Se ha avanzado mucho y la tcnica parece ser mejor aprovechada en la congelacin de ovocitos y embriones producidos in vitro, ya que debido a sus diferencias morfolgicas y fisiolgicas con los embriones producidos in vivo, los porcentajes de sobrevivencia logrados con la congelacin tradicional y/o convencional no son muy buenos con respecto a los logrados con la vitrificacin.

2.4. Crioprotectores

Los primeros crioprotectores fueron 20.5 % dimetilsulfxido + 15.5 % acetamida + 10 % propilenglicol + 6 % polietilenglicol (Rall y Fahy, 1985). Massip y col. (1986) simplificaron al utilizar 25 % glicerol + 25 % propilenglicol. En vitrificacin de embriones ovinos, con asociaciones como glicerol, propilenglicol o polietilenglicol a distintas concentraciones, los resultados han variado entre 0.0 y 87.5 % in vitro, 0.0 y 90.0 % de preez y entre 18.5 y 100.0 % de nacimientos (Tabla 1). Comparada con la congelacin tradicional (28 aos de desarrollo) la vitrificacin solo 15 aos. Queda mucho camino por recorrer y aspectos que mejorar.

Tabla 1: Soluciones vitrificantes y porcentajes (%) de sobrevivencia in vitro, in vivo (preez) y nacimientos (NACIM.) obtenidos por distintos autores en embriones ovinos.

SOLUCIN VITRIFICANTE % IN VITRO

% IN VIVO

% NACIM.

AUTOR

35 % GLI + 30 % P 25 % GLI + 25 % PP

25 % + 25 % PP 6.5 M GLI

5.5 M EG + 1.0 M S 6.0 M EG + 1.8 M GLI

5.5 M EG + 1.0 M S 3.5 M GLI + 3.5 M PP 3.5 M GLI + 3.5 M EG 4.5 M GLI + 4.5 M PP 4.5 M GLI + 4.5 M EG 25 % GLI + 25 % EG

3.4 M GLI + 4.6 M EG

--- 33.0 31.4

20.0 - 60.0--- --- ---

48.0 12.0 17.0 43.0

12.0 - 19.082.8

0.0 - 75.0 ---

38.0 --- ---

78.6 81.8 36.0 21.0 --- --- ---

54.5 - 90.0

--- ---

18.5 28.6 100.0

--- ---

52.0 --- --- --- ---

45.4 - 80.0

Gadja y col., 1989 McGuinnis y Youngs, 1990 Szll y col. 1990 Schiewe y col. 1990 Ali y Shelton, 1993b Ali y Shelton, 1993b Ali y Shelton, 1993c Szll y Windsor, 1994 Szll y Windsor, 1994 Szll y Windsor, 1994 Szll y Windsor, 1994 De Paz y col. 1994 Naitana y col. 1995

En vitrificacin se ha evolucionado a mtodos ms prcticos y crioprotectores ms efectivos. El etilenglicol ha sido el crioprotector de eleccin para vitrificar embriones (Tabla 1).

Ali y Shelton (1993c) con embriones de ratn us 6000 combinaciones de crioprotectores y evalu vitrificacin y toxicidad, los mejores resultados los tuvo con etilenglicol: a) 5.5 M etilenglicol + 2.5 M glicerol; b) 6.0 M etilenglicol + 1.8 M glicerol y c) 5.5 M etilenglicol + 1.0 M sucrosa. Ali y Shelton (1993a y b) concluyeron que la mezcla menos txica es 5.5 M etilenglicol + 1.0 M sucrosa; tambin concluyeron que se puede utilizar para vitrificar embriones ovinos en una sola etapa y justifica mayor investigacin. Las concentraciones 5.5 M etilenglicol y 1.0 M sucrosa, solas o combinadas, no son txicas para embriones murinos y ovinos.

El etilenglicol ha demostrado ser el mejor crioprotector, la sucrosa permite deshidratacin celular favoreciendo la vitrificacin. La asociacin de ambos posibilitara obtener buenos porcentajes de sobrevivencia. El nico trabajo publicado (Ali y Shelton, 1993b) reporta 100.0 % de nacimientos y aunque slo obtuvo dos corderos de dos embriones transferidos, deja abierta una puerta para seguir investigando. Continuando con lo comunicado por Ali y Shelton (1993b), Boggio Devincenzi (2001) tuvo 13.3 % de desarrollo in vitro en mrulas compactas y blastocistos ovinos y no obtuvo sobrevivencia en blastocistos expandidos. Concluyendo que se deben realizar ms trabajos en el tema para que la vitrificacin pueda ser aplicada a gran escala y a campo.

2.5. Exposicin al crioprotector

Por la toxicidad de los crioprotectores, cuando comenz la vitrificacin Rall y Fahy (1985) expusieron a los embriones en tres etapas de 5 min a concentraciones crecientes de crioprotector (25, 50 y 100 %). Durante unos aos se continu igual, aunque algunos incursionaron en la exposicin en una etapa, a partir de 1990 muchos han expuesto los embriones en una sola etapa (Ali y Shelton 1993a, b y c; McGuinnis y col., 1993) facilitando la tcnica.

2.6. Descongelacin de embriones

Los embriones que han sido vitrificados se descongelan comnmente en bao de agua a 20 - 25C durante 6 - 15 seg (Szll y col., 1990; Ali y Shelton, 1993a, b y c).

2.7. Remocin del crioprotector

Se utilizan crioprotectores no penetrantes y los embriones son colocados en PBS para que recuperen la isotonicidad y ser transferidos o llevados a cultivo (Schiewe y col., 1990 y 1991; Ali y Shelton, 1993a, b y c).

3. Evaluacin de embriones

Cualquier tcnica, incluso congelacin, implica obviamente evaluacin morfolgica. Hay varias maneras de evaluar viabilidad y calidad embrionaria. Tincin fluorescente y/o supravital, actividad enzimtica o metabolismo. Estos mtodos requieren complejos equipos y largos perodos de cultivo, y aunque muy precisos tienen poco valor a nivel de terreno.

La clasificacin propuesta por Linder y Wright (1983) ha sido tomada por muchos autores como patrn y tiene en cuenta forma, color, nmero y compactacin de las clulas, tamao del espacio perivitelino, cantidad de clulas degeneradas y/o destruidas y cantidad y tamao de vesculas.

25 % GLI + 25 % PP 40 % EG + 18 % F + 0.3 M S

4.6 M EG + 3.4 M GLI 40 % EG + 18 % F + 0.3 M S

4.6 M EG + 3.4 M GLI 25 % GLI + 25 % EG

5.5 M EG + 1.0 M S

58.0 54.0

30.0 81.8---

87.5 66,0

13.3

--- ---

6.0

72.7 90.057,1 60.0

--- ---

32.0

45.4 - 80.023,8 ---

Martnez y col., 1996 Martnez y col., 1996 Naitana y col., 1996 Martnez y col., 1997 Naitana y col., 1997 Ptak y col., 1999 Riha y Cunat, 1999 Boggio Devincenzi, 2001

GLI=Glicerol P=1-2 Propanediol PP=Propilenglicol DMSO=Dimetilsulfxido S=Sucrosa EG=Etilenglicol A=Acetamida F=Ficoll 70 # Congelacin tradicional 1.5 M GLI o 1.5 M PP 74.0% in vitro con c/u; 12.0 % y 42.9 % in vivo respectivamente.

Los embriones se clasifican subjetivamente de acuerdo a su calidad:

z Excelente: Embrin ideal. Esfrico, simtrico, clulas igual tamao, color y textura (Figura 5).

z Buena: Algunas imperfecciones como pocas blastmeras separadas, de forma irregular y con algunas vesculas (Figura 5).

z Regular: Problemas definidos pero no severos; presencia de blastmeras separadas, vesculas y algunas clulas degeneradas (Figura 6).

z Pobre: Problemas severos, muchas blastmeras separadas, clulas degeneradas, de tamao diferente, grandes vesculas; pero macizo celular aparentemente viable (Figura 7).

Otros autores agregan la calidad degenerado o muerto (Figura 8) para el embrin con graves signos de degeneracin y un macizo celular que parece claramente inviable.

Aunque el trabajo publicado por Linder y Wright (1983) fue realizado en embriones bovinos, los parmetros descritos pueden ser aplicados sin problema a embriones ovinos (Schiewe y col., 1991). Lo que vara es la velocidad de desarrollo embrionario. En ovejas al da 5 del estro la mayora de los embriones son mrulas compactas (Witenberger-Torres y Sevellec, 1987). Witenberger-Torres y Sevellec (1987) describieron en detalle la morfologa del embrin ovino aunque no dieron ninguna clasificacin de calidad.

La calidad embrionaria es lo que predice con mayor seguridad el resultado de la transferencia de embriones. Se ha comprobado que existe correlacin positiva con respecto a calidad antes y despus de la descongelacin (Kennedy y col., 1983).

Al no haber diferencias de sobrevivencia en embriones calidad E y B, la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (Stringfellow y Seidel, 1998), clasific la calidad embrionaria en cuatro grados: Grado 1 (calidad excelente y buena), grado 2 (calidad regular), grado 3 (calidad pobre) y grado 4 (calidad degenerado o muerto).

4. Evaluacin de la congelacin de embriones Para evaluar el resultado de la congelacin, los embriones pueden transferirse a madres sustitutas (in vivo), , o cultivarse (in vitro). In vivo se tienen en cuenta porcentajes de sobrevivencia segn desarrollo, porcentajes de preez y/o nacimientos de animales viables. In vitro se tiene en cuenta sobrevivencia embrionaria desde una etapa inicial de desarrollo a una final ms avanzada. La habilidad de formar blastocele en mrulas compactas y la eclosin del blastocisto temprano indican un buen criterio de sobrevivencia (Willadsen y col., 1978a) y hay alta correlacin entre sobrevivencia in vitro y viabilidad luego de la transferencia (Willadsen y col., 1976a y b).

El mejor parmetro para evaluar los resultados de la congelacin de embriones es el nacimiento de animales viables. El xito y el fracaso dependen obviamente tanto del embrin como de la receptora. El fracaso debido a la receptora (y su ambiente) es prcticamente imposible determinarlo debido a mltiples factores que interactan, por lo que se estara castigando al mtodo de congelacin. De manera que para evaluar real y cientficamente la sobrevivencia embrionaria, y que sta dependa exclusivamente del embrin, en una primera etapa sera mejor cultivarlo in vitro y evaluar su sobrevivencia.

Sin embargo, desde el punto de vista econmico los resultados de la congelacin de embriones deben evaluarse siempre segn nacimiento de animales viables.

5. Experiencias en Uruguay sobre congelacin y vitrificacin de embriones ovinos

En Uruguay se comunic la primer sobrevivencia de embriones ovinos congelados convencionalmente en 1997 (Boggio Devincenzi, 1997). Desde diciembre de 1995 a setiembre de 1996 se realizaron trabajos para recolectar embriones ovinos con la finalidad de congelarlos convencionalmente y vitrificarlos con el objetivo de comparar la sobrevivencia in vitro lograda con ambos sistemas de congelacin. Un total de 159 ovejas Corriedale de

Granja Roland (Trinidad, Flores, Uruguay) fueron seleccionadas completamente al azar para aplicarles tratamiento de sincronizacin de estro, superovulacin y recoleccin de embriones.

A los 6-6.5 das del servicio se recolectaron embriones in vitro o quirrgicamente y se clasificaron en grados (Stringfellow y Seidel, 1998): a) Grado 1, calidad excelente y buena (Figura 5); b) Grado 2, calidad regular (Figura 6); c) Grado 3, calidad pobre (Figura 7) y d) Grado 4, calidad degenerado o muerto (Figura 8).

Figura 5: Embriones grado 1 (calidad excelente y buena). A) Mrulas compactas, 60x. B) Blastocistos tempranos, 20x. C) Blastocisto, 20x. D) Blastocistos expandidos, 60x.

Figura 6: Embriones grado 2 (calidad regular). A) Mrula compacta, 60x. B) Blastocisto, 100x. C) Blastocisto expandido, 200x.

Figura 7: Embriones grado 3 (calidad pobre). A) Mrulas compactas, 100x. B) Blastocistos, 100x.

Figura 8: Embriones grado 4 (calidad degenerado o muerto). A) Sin fecundar, 60x. B) 2-12 clulas, 60x. C) Mrulas compactas, 20x (flecha) y 60x. D) Blastocisto temprano, 60x. E) Blastocistos, 60x. F) Blastocistos expandidos, 100x y 150x (flecha).

Se congelaron mrulas compactas (MC), blastocistos (BL) y blastocistos expandidos (BLEX) grado 1. Las MC y BL se dividieron en dos grupos (Exp. I), uno se congel convencionalmente (TRA) y otro se vitrific (VIT). Los BLEX se dividieron en tres grupos (Exp. II), uno se congel convencionalmente (grupo CON) y los otros se vitrificaron con una solucin crioprotectora (SV1) o con otra (SV2).

Los grupos TRA y CON se expusieron a 1.5 molar (M) etilenglicol (Voelkel y Hu, 1992; McGuinnis y col., 1993). Los grupos VIT (Exp. I) y SV1 (Exp. II) se expusieron a 5.5 M etilenglicol + 1.0 M sucrosa (Ali y Shelton, 1993b). Tomando como base lo publicado por Ali y Shelton (1993b) en BLEX ovinos y por Valdz y col. (1992), se formul un solucin compuesta de 5.5 M etilenglicol + 1.0 M trehalosa (grupo SV2).

5.1. Congelacin de embriones

5.1.1. Congelacin convencional

La curva de congelacin aplicada fue similar a la de Schiewe y col. (1990) con modificaciones. Se comenz con

un enfriamiento rpido a velocidad de 1.4 0.4C/min (0.9-2.2C/min) de temperatura ambiente hasta -7C y estable (0.5C). A los 5 min de estabilizarse la temperatura en -7C se realiz el seeding, se mantuvo la temperatura estable durante 5 min y posteriormente se realiz un enfriamiento a promedio de 0.6 0.1C/min (rango 0.3 - 1.1C/min) hasta los -35C. Luego las pajuelas se sumergieron directamente en N2L.

5.1.2. Vitrificacin

Cada pajuela se mantuvo horizontalmente a 4.0 0.5 cm sobre el nivel de N2L durante 10 seg. Luego se sumergi directamente en N2L.

5.2. Descongelacin de embriones y evaluacin de desarrollo

Las pajuelas congeladas se almacenaron en bistato de N2L durante un perodo mnimo de 56 das y mximo de 9 meses. Cada pajuela con embriones congelados de manera convencional fue retirada del bistato de N2L, se mantuvo durante 10 seg en aire y luego se sumergi en bao de agua a 35C durante 10 seg. Cada pajuela con embriones vitrificados fue retirada del bistato de N2L y se sumergi en bao de a 25C durante 10 seg.

La evaluacin de los resultados se realiz in vitro mediante cultivo en estufa. Todo embrin que no demostr desarrollo durante 48 h se retir del cultivo. Los estados de desarrollo embrionario evaluados fueron MC, BL, BLEX y blastocisto en eclosin y/o eclosionado (BLL). La evaluacin de sobrevivencia embrionaria in vitro se realiz mediante observacin con microscopio invertido de contraste de fases de 100x a 400x cada 12 h desde la descongelacin hasta la detencin del desarrollo. El desarrollo embrionario se evalu segn sobrevivencia in vitro desde etapas iniciales de MC, BL, y BLEX hacia BL, BLEX y/o BLL segn grupo. Todo embrin que continu su desarrollo in vitro, evolucionando de una etapa inicial a otra ms avanzada fue considerado viable y sobreviviente a la congelacin. Todo embrin que no demostr desarrollo durante ms de 24 h se consider como no viable y por lo tanto no sobreviviente a la congelacin. La sobrevivencia embrionaria se expres en porcentaje.

Se trabaj con un total de 102 embriones. Grupo TRA 29 embriones, grupo VIT 30, grupo CON 15, grupo SV1 14 y el grupo SV2 por 14 embriones.

5.3. Resultados y discusin

Tabla 2: Resumen de resultados obtenidos. Los datos se presentan segn cantidad (n), dato por oveja (/oveja) y en porcentaje segn el total correspondiente.

Se crey conveniente tratar los embriones congelables como categora aparte, ya que el trabajo se bas en congelacin de embriones y no en transferencia, lgicamente la categora congelable+transferible es la que otros llaman transferible. Los embriones congelables fueron MC, BLT, BL y BLEX grado 1. Los transferibles fueron Mrulas (Mo) y BLL grado 1, MC, BLT, BL, BLEX y BLL grado 2 y 3 y BLLC.

De 132 embriones grado 1, fueron tiles 113, 35 MC, 2 BLT, 30 BL y 46 BLEX (Tabla 3). Segn grado de calidad y tamao del blastocele incipiente un BLT se tom como MC (Figura 5B izquierda) y otro como BL (Figura 5B derecha). Por distintas circunstancias se perdieron 11 embriones. Debido a no diferencias

Dato n /oveja % Total de ovejas sometidas a recoleccin de embriones Total de cuerpos lteos observados Total de ova3 recolectados en ambos mtodos Ova que no se pudieron evaluar por cada al piso de placasOva que se evaluaron segn estado de desarrollo y grado Embriones congelables Embriones transferibles (sin tener en cuenta los congelables) Embriones congelables + transferibles Ova desechables Embriones fecundados

99 645 412 21 391 113 87 200 191 265

6.5 4.2 3.9

1.1 0.9 2.0 1.9 2.7

63.9 5.1 94.9 28.9 22.3 51.2 48.8 67.8

significativas (P>0.05) en porcentajes de sobrevivencia in vitro de MC, BL y BLEX entre ambos experimentos (Tabla 3), ni en congelacin convencional (grupos TRA y CON) ni en vitrificacin (grupos VIT, SV1 y SV2), se agruparon los resultados independientemente de experimentos.

Tabla 3: Cantidad de embriones cultivados y porcentaje de sobrevivencia en ambos mtodos de congelacin (CONVENCIONAL y VITRIFICACIN) segn desarrollo in vitro de mrulas compactas (MC), blastocistos (BL) y blastocistos expandidos (BLEX). Entre parntesis, a la derecha embriones cultivados, a la izquierda sobrevivientes.

5.3.1. Congelacin convencional

i. Experimento I. En MC, BL y BLEX congelados convencionalmente la sobrevivencia in vitro ha variado entre 63.0 % y 83.0 % (Songsasen y col., 1993 y 1995), y a pesar que el 59.1 % obtenido (Tabla 3) es ligeramente inferior al mnimo, est dentro de los rangos con otras curvas de congelacin. McGinnis y col. (1993) comunican 72.8 % de sobrevivencia in vitro de MC, BL y BLEX, superior al 59.1 % obtenido por nosotros (Tabla 3); y aunque utilizaron 1.5 M etilenglicol, los embriones no fueron transferidos directamente.

En congelacin tradicional lenta la sobrevivencia in vitro ha variado entre 33.0 % y 80.0 % (Willadsen y col., 1974; Merry y col., 1984), de 39.0 % a 93.0 % en congelacin tradicional rpida con enfriamiento en dos etapas (Merry y col., 1984; Tervit y Goold, 1984; Sakul y col., 1993), en congelacin tradicional rpida con enfriamiento en una etapa ha variado entre 0.0 % y 80.0 % (Ware y Boland, 1987; Schiewe y col., 1991; Shelton, 1992; McGinnis y col., 1993) y en congelacin tradicional muy rpida se ha reportado entre 23.3 % y 76.7 % (Czllonkowska y col., 1991; Joly y col., 1992; Nellenschulte y Niemann, 1992).

Con otras curvas de congelacin tradicional con 1.5 M etilenglicol se han obtenido porcentajes de sobrevivencia in vitro poco mayores al 58.6 % en MC y BL logrado por Boggio Devincenzi (2001). Martnez y col. (1993) en congelacin tradicional rpida con enfriamiento en dos etapas lograron 64.0 %. Con una curva de congelacin tradicional muy rpida Cocero y col. (1988) obtuvieron 62.5 % y con 1.5 M glicerol slo 23.3 %.

Comparado con los datos antes discutidos, el 59.1 % total de sobrevivencia in vitro y los porcentajes de sobrevivencia de MC (64.3 %), BL (53.3 %) y BLEX (60.0 %) demuestran mediante sobrevivencia in vitro que es posible congelar embriones ovinos convencionalmente y transferirlos a medio de cultivo inespecfico directamente sin extraccin del crioprotector. Sera interesante lograr los mismos resultados (o mejores) en desarrollo in vivo mediante transferencia de embriones y confirmacin con nacimiento de animales viables.

En la Figura 9 se observa una MC durante su cultivo in vitro.

MTODO DE CONGELACIN EMBRIN CONVENCIONAL VITRIFICACIN TOTAL

MC 64.3a (9/14) 13.3b (2/15) 37.9* (11/29) BL 53.3a (8/15) 13.3b (2/15) 33.3* (10/30)

BLEX 60.0a (9/15) 0.0b (0/28) 20.9* (9/43) TOTAL 59.1a (26/44) 6.9b (4/58) 29.4 (30/102)

Letras diferentes P

Figura 9: Fotografas seriadas del desarrollo in vitro de una mrula compacta congelada convencionalmente. A) Mrula compacta (flecha) antes de ir a cultivo, 60x. B) Blastocisto desarrollado a las 24 h de cultivo, 60x. C) Blastocisto en eclosin a las 48 h de cultivo, 60x. E) Blastocisto libre a las 96 h de cultivo, 100x.

ii. Experimento II. La figura 10 muestra el desarrollo de un BLEX.

Figura 10: Fotografas seriadas del desarrollo in vitro de un blastocisto expandido congelado convencionalmente. A) Blastocisto expandido antes de ir a cultivo, 100x. B) Blastocisto en eclosin a las 24 h de cultivo, 60x. C) Blastocisto libre a las 36 h de cultivo, 50x.

5.3.2. Vitrificacin

i. Experimento I. Se logr 13.3 % de sobrevivencia y desarrollo in vitro (Tabla 3), sin diferencias (P>0.05) entre MC y BL. No se encontraron datos de sobrevivencia in vitro de MC y BL ovinos vitrificados con 5.5 M etilenglicol + 1.0 M sucrosa.

Con la solucin 25.0 % glicerol + 25.0 % propilenglicol (la ms usada en vitrificacin de embriones mamferos), Szll y col. (1990) lograron 36.0 % de sobrevivencia in vitro, De Paz y col. (1994) slo 12.0 % y McGinnis y Youngs (1990) 0.0 %. Szll y Windsor (1994) con 3.5 M glicerol + 3.5 M propilenglicol tuvieron 48.0 % y 17.0 % con 4.5 M glicerol + 4.5 M propilenglicol. Los mismos autores con 3.5 o 4.5 M glicerol + etilenglicol tuvieron respectivamente 12.0 % y 43.0 %. Hsu (1993) tuvo 0.0 % de sobrevivencia in vitro de MC

usando DMSO + acetamida + propilenglicol (Tabla 3).

El 13.3 % obtenido por Boggio Devincenzi (2001) est dentro de los antecedentes publicados, aunque se debera realizar el experimento con mayor cantidad de embriones o probar otra solucin o variaciones y/o modificaciones en el procedimiento, como el tiempo de exposicin del embrin en la solucin o realizar la exposicin a la solucin vitrificante en etapas.

Se destaca que en la literatura no se encontraron fotografas seriadas del desarrollo y sobrevivencia in vitro ni de embriones ovinos vitrificados - desvitrificados ni congelados - descongelados convencionalmente. En las Figura 11 y Figura 12 se observa una MC y un BL fotografiados durante su cultivo in vitro. Se hace notar la sobrevivencia y desarrollo in vitro de un BL que fue a cultivo y presentaba aspecto regular (Figura 12).

Figura 11: Fotografas seriadas del desarrollo in vitro de una mrula compacta vitrificada. A) Mrula compacta antes de ir a cultivo, 100x. B) Blastocisto desarrollado a las 24 h de cultivo, 40x. C) Blastocisto expandido a las 36 h de cultivo, 150x. D) Blastocisto libre a las 60 h de cultivo, 100x.

Figura 12: Fotografas seriadas del desarrollo in vitro de un blastocisto vitrificado. A) Blastocisto antes de ir a cultivo, 100x. Ntese su aspecto regular. B) Blastocisto expandido a las 24 h de cultivo, 100x. C) Blastocisto en eclosin a las 36 h de cultivo, 200x.

ii Experimento I

Tanto en el grupo SV1 como SV2 hubo 0.0 % de desarrollo in vitro de BLEX (Tabla 3). Ali y Shelton (1993b) con igual solucin crioprotectora que el grupo SV1 tampoco tuvieron sobrevivencia. No se encontraron publicaciones de la solucin 5.5 M etilenglicol + 1.0 M sucrosa (grupo SV1) en embriones ovinos. Con 25.0 % glicerol + 25.0 % propilenglicol, Szll y col. (1990) lograron 68.9 % de sobrevivencia in vitro de BLEX, 33.0 % McGinnis y Youngs (1990) y 19.0 % De Paz y col. (1994), superiores al 0.0 % de sobrevivencia de embriones vitrificados - desvitrificados comunicado por Boggio Devincenzi en el 2001 (Tablas 10 y 11).

El uso de 5.5 M etilenglicol + 1.0 M trehalosa (grupo SV2) se comunica aqu por primera vez, lamentablemente hubo 0.0 % de sobrevivencia (Tabla 3). Segn los resultados obtenidos, los embriones ovinos seran muy sensibles a la exposicin en una etapa a 5.5 M etilenglicol + 1.0 M sucrosa. Se debera repetir el ensayo con ms embriones, ya que factores individuales pudieron tener influencia. Tambin se debera exponer los embriones a la solucin vitrificante en dos o ms etapas. De no obtener buenos resultados se debera probar otra solucin.

Las diferencias entre la congelacin convencional y vitrificacin oscilan entre 56.4 % y 17.4 % ms de sobrevivencia in vitro a favor de la congelacin convencional, Boggio Devincenzi (2001), en los estados de desarrollo MC y BL tuvo una diferencia de 45.3 %, porcentaje dentro del rango de otros investigadores, aunque podra mejorarse.

La vitrificacin de embriones mamferos slo lleva unos de 15 aos de desarrollo, mientras que la congelacin tradicional tiene 28 aos, y ya es posible transferir embriones congelados de la misma manera que una inseminacin artificial. En el mtodo de vitrificacin quedan muchos aspectos a mejorar, por lo que todas las investigaciones sobre el tema son tiles. El 13.3 % de sobrevivencia in vitro obtenido en MC y BL demostr la posibilidad de vitrificar embriones en condiciones de terreno, el porcentaje puede mejorarse para que la vitrificacin pueda aplicarse de igual forma que la congelacin convencional.

El 59.1 % total de sobrevivencia in vitro obtenido en congelacin convencional demuestra la posibilidad de congelar embriones ovinos preparados para transferencia directa; por el momento parecera ser el mtodo de eleccin para congelar embriones ovinos en condiciones de terreno. Los resultados deben evaluarse con el nacimiento de animales viables.

Notas

1. Devitrificacin no es lo mismo que desvitrificacin. Devitrificacin es cuando se forman cristales de hielo. Desvitrificacin sera cuando algo vitrificado se calienta (descongela) a temperatura ambiente.

2. 40 % de etilenglicol (EG) equivalente a 7.2 M. Explicacin y forma de clculo: Para preparar una solucin 1 molar de EG se deben tomar 55.92 ml de EG y completar con solvente hasta 1000 ml de solucin.

Volumen = Peso molecular / densidad = 62.07 / 1.11 = 55.92 ml de EG.

55.92 ml de EG en 1000 ml equivalen a 5.92 ml en 100 ml; corresponden a 5.59 % de EG.

5.50 % de EG es una solucin 1 M; 40 % EG equivalen a: (5.59 % x 1 M) / 40 % = 7.2 M.

3. El trmino ova se usar para referirse a cualquier estado de desarrollo, fecundado o no, de cualquier calidad

6. Bibliografa z ALI, J. y J.N. SHELTON. 1993a. Vitrification of preimplantation stages of mouse embryos, J. Repr.

Fertil. 98: 459-465

z ALI, J. y J.N. SHELTON. 1993b. Successful vitrification of day-6 sheep embryos, J. Repr. Fertil. 99: 65-70

z ALI, J. y J.N. SHELTON. 1993c. Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos, J.Repr. Fertil. 99: 471-477

z ALI, J.. 1992. Factors affecting ultrarrapid vitrification and cryopreservation of embryos. Ph.D. Thesis. Australian National University, Canberra, Australia. Cit. por Ali y Shelton, 1993b

z ALTA GENETICS Inc.. 1994. Embryo Transfer Course. Calgary, Alberta; Canada. 305 pp.

z ARAKAWA, T.; J.F. CARPENTER; Y.A. KITA y J.H. CROWE. 1990. The basis for toxicity of certain cryoprotectants: A hypothesis, Cryobiology 27: 401-415

z BARROS, C.. 1985. Visin histrica de los gametos, Arch. Med. Vet. XVII: 13-23

z BOGGIO DEVINCENZI, J.C.. 2001. Vitrificacin y congelacin convencional de embriones ovinos. Comparacin de ambos mtodos segn sobrevivencia y desarrollo in vitro. Tesis de Magister en Ciencias Mencin Reproduccin Animal. Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. En prensa. 280pp.

z BREBION, P.; G. BARIL; Y. COGNIE y J.C. VALLET. 1992. Embryo transfer in sheep and goats, Ann. Zoot-. 41: 3-4, 331-339

z BUI-XUAN-NGUYEN, N.; Y. HEYMAN y J.P. RENARD. 1984. Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature, Theriogenology 22: 389-395

z CARPENTER, J.F. y J.H. CROWE. 1988. The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes, Cryobiology 25: 244-255

z CIBA. 1977. The freezing of mammalian embryos. Ciba Found. Symp. 52 (new series). Elseiver, Excerpta Medica, North-Holland, Amsterdam. 330 pp.

z COCERO, M.J.; R. PROCUREUR; J. DE LA FUENTE y D. CHUPIN. 1988. Glycerol or ethylene glycol for cryopreservation of deep frozen ewe embryos, Theriogenology 29: 238 (Abstr.)

z CZLLONKOWSKA, M.; K. PAPIS; A. GUSZKIEWICZ; M. KOSSAKOWSKI y U. EYSYMONT. 1991. Freezing of sheep embryos in 3.0 M methanol, Cryo-Letters 12: 11-16

z DE PAZ, P.; A.J. SNCHEZ; J.G. FERNNDEZ; M. CARBAJO; J.C. DOMINGUEZ; C.A. CHAMORRO; L. ANEL y P. DE PAZ. 1994. Sheep embryo cryopreservation by vitrification and conventional freezing, Theriogenology 42: 327-338

z DEL CAMPO, M.R.; P.E. LEAL; J.M. RISOPATRN y M.J. REIMER. 1988b. Effect of adition and removal of cryoprotectant on in vitro survival of bovine embryos. En: 11th. Intern. Congr. on Anim. Repr. and Art. Ins., Dublin, Ireland, Vol.2 paper 151

z DILLER, K.R.; E.G. CRAVALHO y C.E. HUGGINS. 1972. Intracellular freezing in biomaterials, Cryobiology 9: 429-440

z DINNYS, A.; G.A. WALLACE y W.F. RALL. 1992. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation and banking by vitrification or slow freezing methods, Cryobiology 29: 755-756 (Abstr.)

z DOBRINSKY, J.R.; F.F. HESS; R.T. DUBY y J.M. ROBL. 1991. Cryopreservation of bovine embryos by vitrification, Theriogenology 35: 194 (Abstr.)

z ELHORDOY, D.M.; A. FERNNDEZ; J. COELHO y A. GONZLEZ. 1990. Cryopreservation of bovine embryos. En: Joint of Int. Found. Sci. - Swedish Int. Program Anim. Repr. (IFS-SIPAR), Sem.onAnim. Repr. Montevideo-Paysand, Uruguay 250 pp.

z FAHNING, M.L. y M.A. GARCA. 1992. Status of cryopreservation of embryos from domestic animals, Cryobiology 29: 1-18

z FAHY, G.M.. 1986. The relevance of cryoprotectant "toxicity" to cryobiology, Cryobiology 23: 1-13

z FAHY, G.M.; D.I. LEVY y S.E. ALI. 1987. Some emerging principles underlying the physical properties, biological actions, and utility of vitrification solutions, Cryobiology 24: 196-213

z FAHY, G.M.; D.R. McFARLANE; C.A. ANGELL y H.T. MERYMAN. 1984. Vitrification as an approach to cryopreservation, Cryobiology 21: 407-426

z GAJDA, B.; Z. SMORAG; S. WIERZBOWSKI; J. JURA y B. WIECZOREK. 1989. Transfer of vitrified sheep morulae. Zuchthygiene 24: 97-100 (Abstr.)

z GURIN, B.; M. NIBART; B. MARQUANT-LE GUIENE y P. HUMBLOT. 1997. Sanitary risks related to embryo transfer in domestic species, Theriogenology 00: 33-42

z GUOCHENG, J.; S. YANXIANG; Y. ZHONGHUA; Ch. TOCHARUS; Y. KITIYANANT y K. PAVASUTHIPAISIT. 1997. The differences of osmotic behaviors of bovine embryos from in vitro and in vivo and their quality evaluation, Theriogenology 47: 307 (Abstr.)

z HEYMAN, Y.; C. VINCENT; V.GARNIER y Y.COGNIE. 1987. Transfer of frozen-thawed embryos in sheep,Vet.Rec.120:83-85

z JOLY, TH.; M. NIBART y M. THIBIER. 1992. Hyaluronic acid as a substitute for proteins the deep-freezing of embryo from mice and sheep: An in vitro investigation, Theriogenology 37: 473-479

z LEHN-JENSEN, H.; T. GREVE y A.P. NAVAS. 1981. Two step freezing of cow embryos, Theriogenology 15: 427-432

z LEIBO, S.P. y D. WINNINGER. 1986. Production of bovine pregnancies from embryos transported at 0 C by air, Theriogenology 25: 165 (Abstr.)

z LEIBO, S.P. y P. MAZUR. 1971. The role of cooling rates in low temperature preservation, Cryobiology 8: 447-452

z LEIBO, S.P. y P. MAZUR. 1978. Methods for the preservation of mammalian embryos by freezing. En: DANIEL Jr., J.C. (Ed.). Methods in mammalian reproduction. Academic Press, New York, USA. pp. 179-201

z LEIBO, S.P.. 1989. Equilibrium and nonequilibrium cryopreservation of embryos, Theriogenology 31: 85-93

z MAHMOUDZADEH, A.R.; A. VAN SOON; P. BOLS; M.T. YSEBAERT y A. DE KRUIF. 1995. Optimization of a simple vitrification procedure for bovine embryos poduced in vitro: effect of developmental stage, two-step addition of cryoprotectant and sucrose dilution on embryonic survival, J. Repr. Fertil. 103: 33-39

z MARTNEZ, A.G.; A.G. FURNUS; M. MATKOVIC y M. and de MATOS D.G.. 1997. Lambing from transfer of in vivo and in vitro produced fresh or vitrified ovine embryos, Theriogenology 47: 351 (Abstr.)

z MARTNEZ, A.G.; M. MATKOVIC; M. PESSI y H. BALDASARRE. 1996. Cryopreservation of ovine embryos: Slow freezing and vitrification, Theriogenology 00: 161 (Abstr.)

z MARTNEZ, A.G.; M. MATKOVIC; T.E. CASTRO y H. BALDASARRE. 1993. Evaluacin de diferentes mtodos de remocin de etilenglicol en la criopreservacin de embriones ovinos. En: Simp. Int. de Repr. Anim. Crdoba, Argentina, 88 pp.

z MASSIP, A.; P. VAN DER ZWALMEN; B. SCHEFFEN y F. ECTORS. 1986. Pergnancies following transfer of cattle embryos preserved by vitrification, Cryo-Letters 7: 270-273

z MAURER, R.R.. 1978. Freezing mammalian embryos: A review of the techniques, Theriogenology 9: 45-68

z MAZUR, P.. 1961a. Manifestations of injury in yeast cells exposed to subzero temperatures. I. Morphological changes in freeze-substituted and in frozen-thawed cells, J. Bacteriol. 82: 662-672

z MAZUR, P.. 1961b. Manifestations of injury in yeast cells exposed to subzero temperatures. II. Changes in specific gravity and in the concentration and quality of cell solids, J. Bacteriol. 82: 673-684

z MAZUR, P.. 1963. Kinetics of water loss cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing, J.Gen.Physiol. 47: 347-369

z MAZUR, P.. 1965. Causes of injury in frozen and thawed cells, Fed. Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. 24: 175-182

z MAZUR, P.. 1966. Physical and chemical basis of injury in single-celled micro-organisms subjected to freezing and thawing. En: MERYMAN, H.T. (Ed.). Cryobiology. Academic Press, London and New York. pp. 213-315

z MAZUR, P.; S.P. LEIBO y E.H.Y. CHU. 1972. A two-factor hypothesis of freezing injury, Exp. Cell Res. 71: 345-355

z McGINNIS, L.K. y C.R. YOUNGS. 1990. Vitrification of ovine embryos, Theriogenology 33: 287 (Abstr.)

z McGINNIS, L.K.; S.C. DUPLANTIS Jr. y C.R. YOUNGS. 1993. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol, Anim. Repr. Sci. 30: 273-280

z McGINNIS, L.K.; S.C. DUPLANTIS Jr.; S.L. WALLER y C.R. YOUNGS. 1989. The use of ethylene glycol for cryopreservation of sheep embryos, Theriogenology 31: 226 (Abstr.)

z MERRY, D.A.; K.R. BONDIOLI; R.L. ALLEN y R.W. WRIGHT Jr.. 1983. One-step sucrose dilution of frozen-thawed sheep embryos, Amer. Soc. Anim. Sci. 34: 256-259

z MERRY, D.A.; K.R. BONDIOLI; R.L. ALLEN y R.W. WRIGHT Jr.. 1984. One-step sucrose dilution of frozen-thawed sheep embryos, Theriogenology 22: 433-443

z MERYMAN, H.T.. 1966. Cryobiology. Academic Press, London and New York. pp. 1-114

z MERYMAN, H.Y.. 1971. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury, Cryobiology 8: 489-500

z NAITANA, S.; M. DATTENA; M. GALLUS; P. LOI; A. BRANCA; S. LEDDA y P. CAPPAI. 1995. Recipient synchronization affects viability of vitrified ovine blastocysts, Theriogenology 43: 1371-1378

z NAITANA, S.; P. LOI; S. LEDDA; P. CAPPAI; M. DATTENA; L. BOGLIOLO y G. LEONI 1996. Effect of biopsy and vitrification on in vitro survival of ovine embryos at different stages of development, Theriogenology 00: 353 (Abstr.)

z NAITANA, S.; S. LEDDA; L. BOGLIOLO; G. MAROGNA; G. LEONI; P. CAPPAI y L. LOI. 1997. Ovine embryos viability after serum replacement with polyvinyl alcohol in vitrification solution, Theriogenology 47: 353 (Abstr.)

z NELLENSCHULTE, E. y H.NIEMANN. 1992. Collection andtransferofovineembryosbylaparoscopy, Anim.Repr.Sci. 27:293-304

z NIEMANN, H.. 1991. Cryopreservation of ova and embryos from livestock: Current status and reserch needs, Therio. 35:109-123

z PALASZ, A.T. y M. DEL CAMPO. 1995. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: Recent advances. En: Sem. Int. de Transfrencia de Embriones Biotec. y Tecn. Avanzadas. Montevideo, Uruguay, pp. 78-85

z POLGE, C.; A.U. SMITH y A.S. PARKS. 1949. Revival of spermatozoa after vitrification and dehidratation at low temperatures, Nature 164: 666 (Abstr.)

z PTAK, G.; M. DATTENA; P. LOI; M. TISCHNER y P. CAPPAI. 1999. Ovum pick-up in sheep: Efficiency of in vitro embryo production, vitrification and birth of offspring, Theriogenology 52: 1105-1114

z RALL, W.F. y G.M. FAHY. 1985. Ice-Free cryopreservation of mouse embryos at -196 C by vitrification, Nature 313: 573-575

z RALL, W.F.. 1987. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification, Cryobiology 24: 387-402

z RAMSBOTTOM, G.; A. ARAV; A. BAGUISI; B. RUBINSKY; J.F. ROCHE y M.P. BOLAND. 1993. Hypotermic preservation of ovine embryos with antifreeze proteins, Cryobiology 30: 631 (Abstr.)

z RIHA, J y L. CUNAT. 1999. Superovulation, embryo yield, quality, and embryo transfer in sheep. Czech J. Anim. Sci. 44: 1, 19-24; 40 (Abstract)

z SAKUL, H.; G.E. BRADFORD; R.H. BONDURANT; G.B. ADERSON y S.E. DONAHUE. 1993. Cryopreservation of embryos as a means of germ plasm conservation in sheep, Theriogenology 39: 401-409

z SCHIEWE, M.C.; W.F. RALL; L.D. STUART y D.E. WILDT. 1990. In situ straw dilution of ovine embryos cryopreserved by conventional freezing or vitrification, Theriogenology 33: 321 (Abstr.)

z SCHIEWE, M.C.; W.F. RALL; L.D. STUART y D.E. WILDT. 1991. Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos, Theriogenology 36: 279-294

z SCHNEIDER, U. y P. MAZUR. 1984. Osmotic consequences of cryoprotectant permeability and its relations to the survival of frozen-thawed embryos, Theriogenology 21: 69-79

z SEIDEL Jr., G.E.. 1991. Embryo transfer: The next 100 years, Theriogenology 35: 171-180

z SHELTON, J.N.. 1992. Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos, Theriogenology 37: 713-721

z SONGSASEN, N.; B. BUCKRELL y S.P. LEIBO. 1993. Lambs produced by direct transfer of cryopreserved ovine embryos, Cryobiology 30: 646 (Abstr.)

z SONGSASEN, N.; B.C. BUCKRELL; C. PLANTE y S.P. LEIBO. 1995. In vitro and in vivo survival of cryopreserved sheep embryos, Cryobiology 32: 78-91

z SZLL, A.; J. ZHANG y R. HUDSON. 1990. Rapid cryopreservation of sheep embryos by direct transfer into liquid nitrogen vapour at -180 C, Repr. Fert. Dev. 2: 613-618

z SZLL, A.; J.N. SHELTON y K. SZELL. 1989. Osmotic characteristics of sheep and cattle embryos, Cryobiology 26: 297-301

z TERVIT, H.R. y P.G. GOOLD. 1984. Deep freezing of sheep embryos, Theriogenology 21: 268 (Abstr.)

z VOELKEL, S.A. y Y.X. HU. 1992a. Direct transfer of frozen-thawed bovine embryos, Theriogenology 37: 23-37

Este artculo proviene de Portal Veterinaria Su portal de Veterinaria desde 1997 http://www.PortalVeterinaria.com

La direccin de este artculo es:

http://www.PortalVeterinaria.com/sections.php?op=viewarticle&artid=169

z VOELKEL, S.A. y Y.X. HU. 1992. Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females, Theriogenology 37: 687-697

z VOELKEL, S.A. y Y.X. HU. 1992c. Effect of gas atmosphere on the development on one-cell bovine embryos in two culture systems, Theriogenology 37: 1117-1131

z WARE, C.B. y M.P. BOLAND. 1987. Effect of varing glycerol and sucrose concentration combinations on embryo survival rate in a one-step cryoprotectant removal from frozen-thawed ovine embryos, Theriogenology 27: 721-729

z WHITTINGHAM, D.G.; S.P. LEIBO y P. MAZUR. 1972. Survival of mouse embryos frozen to -196 C and -269 C, Science 178: 411-414

z WILLADSEN, S.M.; A.O. TROUNSON; L.E.A. ROWSON; C. POLGE y R. NEWCOMB. 1976b. Preservation of cow embryos in vitro. Proc. VIIIth Int. Congr. Anim, Repr. & A.I. Krakow III, 329-332. Cit. por Willadsen y col., 1978a

z WILLADSEN, S.M.; C. POLGE y L.E.A. ROWSON. 1978a. In vitro storage of cattle embryos. En: SREENAN, J.M. (Ed.). Control of reproduction in the cow. Martinus Nijhoff, The Hague, EUR, pp. 427-436

z WILLADSEN,S.; C.POLGE; L.E.ROWSON y R.M.MOOR. 1976a. Deep freezing of sheep embryos, J.Repr.Fertil. 46:151-154

z WILMUT, I.. 1972a. The effect of cooling rate, warming rate, cryprotective agent and stage of development on survival of mouse embryo during freezing and thawing, Life Sci. 11 part 2: 1071-1079

z WILMUT, I.. 1972b. The low temperature preservation of mammalian embryos, J. Repr. Fertil. 31: 513 - 415

z WOOD, M.J. y J. FARRANT. 1980. Preservation of mouse embryos by two-step freezing, Cryobiology 17: 178-180

z WURTH, Y.A.; J.M.C. REINDERS; W.F. RALL y TH.A.M. KRUIP. 1994. Developmental potential of in vitro produced bovine embryos following cryopreservation and single-embryo transfer, Theriogenology 42: 1275-1284