conf cro mogen

ACTUALIZACIÓN SOBRE EL DESARROLLO DE MEDIOS DE CULTIVO CROMOGÉNICOS Y

FLUOROGÉNICOS

CUBADr.C.T.Claudio Rodríguez MartínezDirector de InvestigacionesCentro Nacional de Biopreparados

DISEÑO DE MEDIOS CULTIVO

BIOQUÍMICA QUÍMICAMICROBIOLOGÍA QUÍMICA

TECNOLOGÍA

NECESIDAD DE OPTIMIZAR LOS NECESIDAD DE OPTIMIZAR LOS MMÉÉTODOS DE AISLAMIENTO E TODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓNN

EMPLEO DE MEDIOS DE EMPLEO DE MEDIOS DE CULTIVO QUE CUMPLAN CULTIVO QUE CUMPLAN

CON LAS NUEVAS CON LAS NUEVAS EXIGENCIAS DEL EXIGENCIAS DEL

DIAGNDIAGNÓÓSTICO MODERNOSTICO MODERNO

MAYORMAYORRAPIDEZRAPIDEZ

¿¿CUCUÁÁLES SON LAS EXIGENCIAS MODERNAS PARA LES SON LAS EXIGENCIAS MODERNAS PARA EL DIAGNEL DIAGNÓÓSTICO MICROBIOLSTICO MICROBIOLÓÓGICO?GICO?

ELEVADAELEVADAESPECIFICIDADESPECIFICIDAD

ALTAALTASENSIBILIDADSENSIBILIDAD

AUMENTO DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNAUMENTO DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNÓÓSTICA STICA MEDIANTE MODIFICACIONES A LAS FORMULACIONES EXISTENTES MEDIANTE MODIFICACIONES A LAS FORMULACIONES EXISTENTES

MINIATURIZACIMINIATURIZACIÓÓNN

EMPLEO DE NUEVOS AGENTES GELIFICANTES Y SOPORTES QUE EMPLEO DE NUEVOS AGENTES GELIFICANTES Y SOPORTES QUE SUSTITUYAN EL AGARSUSTITUYAN EL AGAR

MEDIOS CON SUSTRATOS CROMOGMEDIOS CON SUSTRATOS CROMOGÉÉNICOS, FLUOROGNICOS, FLUOROGÉÉNICOS NICOS U OTROS OBTENIDOS POR SU OTROS OBTENIDOS POR SÍÍNTESISNTESISAUMENTO DE LA PRODUCCIAUMENTO DE LA PRODUCCIÓÓN DE MEDIOS LISTOS PARA EL USON DE MEDIOS LISTOS PARA EL USO

NUEVOS CONTENEDORES PARA LOS MEDIOSNUEVOS CONTENEDORES PARA LOS MEDIOS

NUEVOS MEDIOS PARA MICROORGANISMOS MANIPULADOS NUEVOS MEDIOS PARA MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENGENÉÉTICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O TICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O CULTIVADOS CULTIVADOS

NUEVOS MEDIOS PARA LA PRODUCCINUEVOS MEDIOS PARA LA PRODUCCIÓÓN DE METABOLITOS A NIVEL N DE METABOLITOS A NIVEL INDUSTRIALINDUSTRIAL

AUTOMATIZACIAUTOMATIZACIÓÓN DE LA INOCULACIN DE LA INOCULACIÓÓN, LECTURA DE RESULTADOS, Y N, LECTURA DE RESULTADOS, Y CCÁÁLCULOS DE LOS MEDIOSLCULOS DE LOS MEDIOS

TENDENCIAS ACTUALES EN EL DESARROLLO TENDENCIAS ACTUALES EN EL DESARROLLO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y SU EMPLEODE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y SU EMPLEO

Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB

MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

CROMOGCROMOGÉÉNICOS Y FLUOROGNICOS Y FLUOROGÉÉNICOSNICOS

MedioMedio

Medio

ETIOLOGETIOLOGÍÍAA

Pueden ser considerados, Pueden ser considerados, como tales, aquellos medios como tales, aquellos medios que incluyen, en su que incluyen, en su formulaciformulacióón final, uno o mn final, uno o máás s sustratos cromogsustratos cromogéénicos y/o nicos y/o fluorogfluorogéénicosnicos

DEFINICIDEFINICIÓÓN No. 1N No. 1


DEFINICIDEFINICIÓÓN No. 2N No. 2Pueden considerarse aquellos medios de cultivo que están destinados a identificar los microorganismos sobre la base de reacciones enzimáticas típicas, dando lugar a la rotura del enlace entre el sustrato de la reacción enzimática y un grupo cromóforo o fluoróforo unido a dicho sustrato y provocando con ello un cambio de color o emisión de luz.

AguaAguaSustratos cromogSustratos cromogéénicos y/o fluorognicos y/o fluorogéénicosnicosSustancias Sustancias opacantesopacantes o contrastanteso contrastantesIndicadoresIndicadoresBases nutritivasBases nutritivasFuentes de carbono (azFuentes de carbono (azúúcares, alcoholes, etc.)cares, alcoholes, etc.)AgarAgarSales mineralesSales mineralesInhibidores selectivos (sales, antibiInhibidores selectivos (sales, antibióóticos, etc.)ticos, etc.)Otras sustancias (proteOtras sustancias (proteíínas, aminonas, aminoáácidos, etc.)cidos, etc.)

COMPONENTESCOMPONENTES FUNDAMENTALESFUNDAMENTALES


ENZIMAS CARACTERÍSTICAS

SUSTRATOS CROMOGÉNICOS Y/O FLUOROGÉNICOS

GRUPOS CROMÓFOROS Y/O FLUORÓFOROS

INDICADORES SUSTRATOS COLONIAS

degradan

liberando

provocan cambios en características cromáticas de:

PRINCIPIOSPRINCIPIOS


1.1. Cambio de la intensidad de la fluorescencia Cambio de la intensidad de la fluorescencia o de las caractero de las caracteríísticas cromsticas cromááticas de las cticas de las céélulas, lulas, por la absorcipor la absorcióón de los compuestos derivados de n de los compuestos derivados de los sustratos por diferentes componentes los sustratos por diferentes componentes celulares.celulares.

2.2. Aumento de la fluorescencia y de la Aumento de la fluorescencia y de la absorciabsorcióón de luz de los sustratos.n de luz de los sustratos.

3.3. Cambio de los atributos cromCambio de los atributos cromááticos ticos (absorbancia y/o fluorescencia) de los (absorbancia y/o fluorescencia) de los indicadores.indicadores.

PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN


SUSTRATO SINTÉTICOENZIMAS BACTERIANAS HIDROLIZAN

CAUSAN

1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE LOS SUSTRATOS

2. INCREMENTO DE LA ABSORCIÓN DE LUZ DE LOS SUSTRATOS


No. 1


HIDROLIZAN

CAUSA

1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE UN INDICADOR

2. INCREMENTO DE LA ABSORCIÓN DE LUZ DE UN INDICADOR


No. 2

ENZIMAS BACTERIANAS

SUSTRATO SINTÉTICO


COLORANTE FLUORESCENTE

DENTRO DE ALGUNO DE SUS COMPONENTES

Célula bacteriana ABSORBE

CAUSA

INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA


No. 3

EJ. COLORANTES

a) Naranja acridina (AO) – se une al DNA

b) Ácido sulfónico 8-anilinonaftaleno(ANS) se une a las proteínas

Microscopio de epifluorescencia

Técnica de filtro directo epifluorescente

Citometría de flujo


Célula de bacteria Gram +


sustrato

Difusión pasiva

Célula de bacteria Gram -

sustrato

permeasa u otros(ej. sales biliares)

Difusión activa

osmosis


Célula de bacteria


Gradiente de iones

•Inactivo en la fase estacionaria•Amplia especificidad•Baja sensibilidad•Requiere altas concentraciones•Se inactiva con el estrés celular

Sistema de transporte mediado por elfosfoenol piruvato (fosfo-transferasa)

•Activo en todas las fases•Menor especificidad•Mayor sensibilidad•No requiere de altas concentraciones•Más sensible a las estructuras de aplicones

DIFUSIÓN ACTIVA



CADENA DE REACCIONES

Enzima

+Permeasa + Inductor

Ejemplo: β-galactosidasa + lactosa (inhibición competitiva)ó IPTG (acelerador)

lac-operon

+ X-Gal + sales biliares

Precipitado azul


∗Permiten una detección visual de los productos de la actividad enzimática, ya sea directamente, o con una fuente de luz ultravioleta o con un fluorómetro.

∗Pueden ser acoplados a un amplio rango de sustratos para diferentes rutas metabólicas.

∗Estos sustratos no son carcinogénicos.

CARACTERÍSTICAS DE LOS SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS

indicadores fluorescentes con diferentes pH óptimos

4-MU como indicador para la detección de un incremento en el pH

quinina para la detección de una disminución del pH

• Actividad de ureasa

• Formación de ácido de mono y disacáridos

• Descarboxilaciónde la lisina y ornitina



Naturaleza quNaturaleza quíímica de los grupos crommica de los grupos cromóóforosforos

SustratosSustratos Color de los Color de los precipitadosprecipitados

AbsorbciAbsorbcióónn, , λλmax max ((nm)nm)

X (5X (5--bromobromo--44--clorocloro--33--indolil)indolil) Azul turquesaAzul turquesa 615615

Y ( Y ( indoxilindoxil)) AzulAzul 680680

Magenta (5Magenta (5--bromobromo--66--clorocloro--33--indolil)indolil) MagentaMagenta 565565

SalmonSalmon (6(6--clorocloro--33--indolil)indolil) SalmSalmóónn 540540

Iodo (5Iodo (5--iodoiodo--33--indoxilindoxil)) PPúúrpurarpura 575575

GreenGreen (N(N--metilmetil--indolil)indolil) VerdeVerde 665665

o o óó pp--nitrofenolesnitrofenoles AmarilloAmarillopp--nitroanilinanitroanilina AmarilloAmarillo 390390CHE CHE ((cicloesculetinacicloesculetina + iones)+ iones) NegroNegro




Alizarina 3Alizarina 3’’,4,4’’--dihidroxiflavonadihidroxiflavona--44’’-- (DH)(DH) NegroNegro

RojoRojo BrillanteBrillante 3B3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter RojoRojo

CibacronCibacron AzulAzul 3GA3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter AzulAzul

Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter NaranjaNaranja

77--NN--((ββ--alanil)aminoalanil)amino--11--pentilfenoxazinapentilfenoxazina--33--unouno--trifluoroacetatotrifluoroacetato salsal

RojoRojo

HexacianoferratoHexacianoferrato III + FIII + Fee IIIIII AzulAzul



SustratosSustratos

44-- [2[2-- (4(4--octanoiloxioctanoiloxi--3, 53, 5--dimetoxifenildimetoxifenil))--vinilvinil]]--quinolinoquinolino--11--(propano(propano--33--ilil))-- sal del sal del áácido cido carboxilicocarboxilico88--hidroxiquinolinahidroxiquinolina


HH

BrBrClCl

NN

OOOO

OHOH

OHOH

OHOH

CHCH22OHOH

XX--GalGal (5(5--BromoBromo--44--clorocloro--33--indoxilindoxil--ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido óó XX--betabeta--DD--galactgalactóósido sido óó XX--ßß--DD--galgal))

•Grupos capturadores de electrones unidos al O2del nitrofenol•Poco sensible•Bajo costo de producción•Adecuado para medios líquidos•Difunde la reacción al medio

-o -p nitrofenoles

Unión del oxigeno a:ácidos inorgánicos o carboxílicos (estearasas, fosfatasas, sulfatasas)sacáridos (glucósidos)


Difosfato de fenolftaleína

Difosfato de fenolftaleína

Fosfatasa

pH>7 Fenolftaleína 530 nm

4 Nitrofenil fosfatosal disódica

Fosfatasa alcalina

H3PO4

4-Nitrofenol

Mecanismo de la reacción

•Grupos capturadores de electrones unidos al O2 de la nitroanilina•Uniones con péptidos o aminoácidos (más común para detectar actividad L-alanina-aminopeptidasa)•Común para bacterias Gram –•Bajo coeficiente de extinción•Soluble en agua•Poco sensible•Adecuado para medios líquidos•Difunde la reacción al medio

Sustratos de nitroanilina


Quelatos de metales

Sustrato (ej. esculina)

Enzima (ej. β-galactosidasa)

Grupo activo + (ej. esculetina, cicloesculetina,8-Hydroxyquinolina-β-D-glucosido8-Hydroxyquinolina-β-Dglucuronido,alizarina)

Iones en el medio(ej. hierro férrico)

Precipitado negro


Quelatos de metales

Precipitado negro


AbsorbciAbsorbcióónn, , λλmax max ((nm)nm)

X (5X (5--bromobromo--44--clorocloro--33--indolil)indolil)

Azul turquesaAzul turquesa 615615

Y (Y (indoxilindoxil--)) AzulAzul 68068055--BromoBromo--33--indolil indolil AzulAzulMagenta (5Magenta (5--bromobromo--66--clorocloro--33--indolil)indolil)

MagentaMagenta 565565

SalmonSalmon (6(6--clorocloro--33--indolil)indolil) SalmSalmóónn 540540Iodo (5Iodo (5--iodoiodo--33--indolilindolil PPúúrpurarpura 575575

GreenGreen (N(N--metilindolilmetilindolil)) VerdeVerde 665665

Sustratos Sustratos IndoxiloIndoxilo


•Se oxidan con facilidad•Insolubles en forma de glucósidos o ésteres, aunque algunos pueden ser solubles (SLPA)•No apropiados para anaerobiosis

Sustratos de indoxilos

β-galactosidasa

X-Gal Precipitado azul

oxidación

Actividades enzimáticas a detectar

Alfa-L-arabinosidasa Alfa-glucosaminidasaBeta-D-celobiosidasa Beta-glucosaminidasaAlfa-L-fucosidasa Beta-glucosidasaBeta-D-fucosidasa Alfa-glucosidasaBeta-L-fucosidasa Beta-D-glucuronidasaAlfa-galactosaminidasa Beta-lactosidasaBeta-galactosaminidasa Alfa-maltosidasaAlfa-galactosidasa Beta-D-maltosidasa

Beta-galactosidasa Alfa-mannosidasaBeta-xylosidasa Beta-mannosidasaBeta-ribosidasa

GLICOSIDASAS


Carboxil-esterasa (C2-C18) ColinesterasaButirasa PalmitasaCaprilasaFosfodiésteres (Inorgánicos) Fosfatasas, sulfatasas (Inorg.)

ESTERASAS

FOSFATASAS y SULFATASASFosfatasa alcalina Sulfatasas varias

Fosfatidilinositol fosfolipasa


AMINOPEPTIDASASCatepsina Dipeptidil-aminopeptidasa II

G-glutamil-transpeptidasa Piroglutamil-peptidasa

Otras peptidasas

SustratoSustrato EnzimaEnzima Microorganismos a Microorganismos a diferenciardiferenciar

OrtoOrto--nitrofenilnitrofenil--ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido (ONPG) (ONP(ONPG) (ONP-- ββ--DD--gal)gal)

55--bromobromo--44--clorocloro--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido

(X(X--gal) (Xgal) (X-- ββ--DD--gal)gal)

ββ--DD--galactosidasagalactosidasa DiferenciaciDiferenciacióón de n de coliformescoliformes

ParaPara--nitrofenilnitrofenil--ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido (PNPGAL)(PNPGAL)(PNP(PNP-- ββ--DD--gal)gal)66--bromobromo--22--naftilnaftil-- ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido (BNGAL)(BNGAL)

SUSTRATOS CROMOGSUSTRATOS CROMOGÉÉNICOSNICOS

SustratoSustrato EnzimaEnzima Microorganismos Microorganismos a diferenciara diferenciar

ColoresColores

ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa

AmarilloAmarillo

AzulAzul

55--bromobromo--66--clorocloro--33--indolilindolil-- ββ--DD--glucurglucuróónido (Magentanido (Magenta--GLR)GLR)

MagentaMagenta

E. coliE. coliParaPara--nitrofenilnitrofenil--ββ--DD--glucurglucuróónido (PNPGLR)nido (PNPGLR)55--BromoBromo--44--clorocloro--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónido (Xnido (X--GLR)GLR)



SustratoSustrato EnzimaEnzima

33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónidonido

55--BromoBromo--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónidonido

66--BromoBromo--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónidonido



SustratoSustrato EnzimaEnzima

55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil--NN--acetilacetil--ββ--DD--galactosaminidina galactosaminidina ((XX--ββ--DD--galactosaminidinagalactosaminidina))

ββ--DD--GalactosaminidasaGalactosaminidasa

ββ--DD--FucopiranosidasaFucopiranosidasa

ββ--DD--CelobiasaCelobiasa

55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil--NN--acetilacetil--ββ--DD--fucopiranosidofucopiranosido(X(X-- ββ--DD--fucosidofucosido))55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil--NN--acetilacetil--ββ--DD--celobiosidocelobiosido

Sustratos cromogénicos (para glicosidasas)

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para esterasasesterasas))55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil butirato (Xbutirato (X--butirato)butirato)55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil caprilatocaprilato (X(X--caprilatocaprilato))55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil palmitatopalmitato (X(X--palmitatopalmitato))33--IndoxilIndoxil butirato (Ybutirato (Y--butirato)butirato)

55--BromoBromo--6 cloro6 cloro--33--indoxilindoxil butirato (Magentabutirato (Magenta--butirato)butirato)55--BromoBromo--6 cloro6 cloro--33--indoxilindoxil caprilatocaprilato (Magenta(Magenta--caprilatocaprilato))55--BromoBromo--6 cloro6 cloro--33--indoxilindoxil--palmitatopalmitato (Magenta(Magenta--palmitatopalmitato))

66--CloroCloro--33--indoxilindoxil butirato (Salmbutirato (Salmóónn--butirato)butirato)66--CloroCloro--33--indoxilindoxil caprilatocaprilato (Salm(Salmóónn--caprilatocaprilato))66--CloroCloro--33--indoxilindoxil palmitatopalmitato (Salm(Salmóónn--palmitatopalmitato))

4- [2- (4-octanoiloxi-3, 5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolino-1-(propano-3-il)- sal del ácido carboxilico


SustratoSustrato55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal fosfato, sal disdisóódicadica (X(X--phosphos··diNadiNa) ) 55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Xtoluidina (X--phosphos··pp--toltol))

33--IndoxilIndoxil fosfato, sal fosfato, sal disdisóódicadica (Y(Y--phosphos··diNadiNa) ) 33--IndoxilIndoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Ytoluidina (Y--phosphos··pp--toltol))

55--BromoBromo--66--clorocloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Magentatoluidina (Magenta--phosphos··pp--toltol))

66--CloroCloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Salmtoluidina (Salmóónn--phosphos··pp--toltol))

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para fosfatasasfosfatasas))

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para sulfatasassulfatasas))

SustratoSustrato

55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil sulfato, sal potsulfato, sal potáásica (Xsica (X--sulfatosulfato··K) K) 33--IndoxilIndoxil sulfato, sal potsulfato, sal potáásica (Ysica (Y--sulfatosulfato··K)K)

55--BromoBromo--66--clorocloro--33--indoxilindoxil sulfato, sal potsulfato, sal potáásica (sica (MagentaMagenta--sulfatosulfato··K)K)

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para sialidasassialidasas))

SustratosSustratos

MetilMetil NN--acetilacetil--.beta..beta.--DD--neuraminatoneuraminato, , MetilMetil NN--acetilacetil--4,7,8,94,7,8,9--tetratetra--OO--acetilacetil--22--clorocloro--22--deoxideoxi--DD--neuraminatoneuraminato, , MetilMetil NN--acetilacetil--4,7,8,94,7,8,9--tetratetra--OO--acetilacetil--22--OO--(4(4--formilfenilformilfenil))--alfaalfa--DD--neuraminatoneuraminato y Ny N--acetilacetil--22--OO--(4(4--formilfenilformilfenil))--alfaalfa--DD--ÁÁcido cido neuraminneuraminíícoco

((neuraminidasasneuraminidasas, , acilneuraminilacilneuraminil hidrolasashidrolasas)

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para degradacinicos (para degradacióónnde polisacde polisacááridos)ridos)

SustratoSustrato

Brilliant Red 3BBrilliant Red 3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereterCibacronCibacron Blue 3GABlue 3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter

Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter

AmilosaXilosaHidroximetil-celulosa

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para degradacinicos (para degradacióónnde protede proteíínas)nas)

SustratoSustrato

Brilliant Red 3BBrilliant Red 3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereterCibacronCibacron Blue 3GABlue 3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter

Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter

Colágeno

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para recuento nicos (para recuento de aerobios)de aerobios)

SustratoSustrato

Cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio

Colonias negras al consumirse OColonias negras al consumirse O22 y producirse COy producirse CO22

Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para alanilalanil--aminopeptidasaaminopeptidasa))

SustratoSustrato

77--NN--((ββ--alanil)aminoalanil)amino--11--pentilfenoxazinapentilfenoxazina--33--oneone trifluoroacetatotrifluoroacetato salsal

((FenoxazinonaFenoxazinona))

MetilumberiferilMetilumberiferil (4(4--MUMU--) sustratos) sustratos

SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS

44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--ββ--DD--áácido cido glucurglucuróóniconico (MUG) (MUG) (4(4--MUMU--ββ--DD--glcUAglcUA))


66--clorocloro--44--metilumbeliferonametilumbeliferona (CMUG)(CMUG) ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa44--TrifluorometilumbeliferonaTrifluorometilumbeliferona (4(4--TMU)TMU) ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--NN--acetilacetil--ββ--DD--galactosaminidina (4galactosaminidina (4--MUMU-- ββ--DD--galactosaminidina) galactosaminidina)

ββ--DD--GalactosaminidasaGalactosaminidasa

44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--NN--acetilacetil--ββ--DD--glucosaminidinaglucosaminidina(4(4--MUMU-- ββ--DD--glucosaminidina) glucosaminidina)

ββ--DD--glucosidasaglucosidasa

44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil palmitatopalmitato(4(4--MUMU--palmitatopalmitato))

EsterasasEsterasas

44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil fosfato, fosfato, áácido libre cido libre (4(4--MUMU--phosphos))

FosfatasasFosfatasas

44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--sulfato, sal de potasio (4sulfato, sal de potasio (4--MUMU--sulfatosulfato··K)K)

SulfatasasSulfatasas


44--trifluorometilumbeliferonatrifluorometilumbeliferona Sustrato fluorogSustrato fluorogééniconico

88--anilinoanilino--11--naftalenonaftaleno--áácido cido sulfsulfóóniconico Colorantes fluorogColorantes fluorogéénicosnicos

AcridinaAcridina, 7, 7--hidroxicumarinahidroxicumarina Indicadores de pH Indicadores de pH fluorescentesfluorescentes

OTROS COMPUESTOS FLUOROGÉNICOS

VENTAJAS DE LOS COMPUESTOS FLUOROGÉNICOS

•ESTABLES AL CALOR (PUEDEN ESTERILIZARSE)

•SOLUBLES EN AGUA

•ALTAMENTE SENSIBLES

•BAJO COSTO

•NO TÓXICOS


SustratoSustrato

DD--AlaninaAlanina 77--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina, sal de , sal de trifluoroacetatotrifluoroacetato(H(H--DD--AlaAla--AMCAMC··TFA). TFA). FluorescenciaFluorescencia azulazulLL--Histidina 7Histidina 7--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina(H(H--HisHis--AMC)AMC)

LL--Leucina 7Leucina 7--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina(H(H--LeuLeu--AMC). Fluorescencia verdeAMC). Fluorescencia verde

Producen seProducen seññales fluorescentesales fluorescentes

Sustratos AMC (7Sustratos AMC (7--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina))

Aminopeptidasa B

Lisina

7-amino-metilcumarinaLisina-7-amido-4-metilcumarina

Mecanismo de reacciMecanismo de reaccióónn

ATP ATP + Luciferina + O+ Luciferina + O2 2 (en presencia de (en presencia de LuciferasaLuciferasa y Mgy Mg2+2+)) –– emisiemisióón de luz en n de luz en forma de destello o incandescencia forma de destello o incandescencia amarilloamarillo--verdosa.verdosa.

La cantidad de luz es directamente La cantidad de luz es directamente proporcional a la cantidad de ATP proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra, y esta cantidad presente en la muestra, y esta cantidad de ATP, a su vez, depende de la cantidad de ATP, a su vez, depende de la cantidad de cde céélulas. lulas.

Sustratos Sustratos BioluminiscentesBioluminiscentes

ATP + O2+Luciferina

Mg 2+

Oxiluciferina+AMP+PPi+CO2

Mecanismo de reacciMecanismo de reaccióónn

560 nm – centelleo

Microorganismos o grupos detectadosMicroorganismos o grupos detectados

Aeromonas Aeromonas sppspp..Bacillus cereusCampylobacter spp.Candida Candida albicansalbicansCandida Candida sppspp..Cellulomonas spp.CellulosimicrobiumClostridium difficileClostridium perfringensColiformesColiformesE. coliE. coliE. coli E. coli O157:H7O157:H7Enterobacter sakazakiiEnterobacterias β-lactamasa positivasEnterococusEnterococus sppspp..Enterococus Vancomicina resistentes

Klebsiella Klebsiella sppspp..Listeria monocytogenesMycobacteriaPseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas Pseudomonas sppspp..Salmonella Salmonella sppspp..Serratia Serratia marcecensmarcecensShigella sonneiShigella sonneiShigella spp.Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus MRVibrio parahaemolyticus y V. cholerae


EVOLUCIEVOLUCIÓÓN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGÍÍA DIAGNA DIAGNÓÓSTICASTICA

EN 1962, LeMinor Y Hamida DEMOSTRARON QUE LA ENZIMA β-GALACTOSIDASA DE LOS MICROORGANISMOS DEGRADABAN UN SUSTRATO (α-nitrophenyl-β-D-galactopIranosido)

EN LOS AÑOS 70 – MARCADORES DE TRANSFORMACIONES GENÉTICAS

EN LOS AÑOS 80 – SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS (MUG) PARA E. coli (MERCK)

EN LOS MEDIADOS DE LOS 80- SUSTRATOS CROMOGÉNICOS PARA E. coli (MANAFI M.)

EN LOS 90- PRIMEROS MEDIOS PARA OTROS m.o. (ALAIN RAMBACH- Salmonella)

FINALES 90-ACTUALIDAD- COMBINACIONES DE CROMOGÉNICOS-FLUOROGÉNICOS- “SUSTRATOS TRADICIONALES”


EVOLUCIEVOLUCIÓÓN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGÍÍA DIAGNA DIAGNÓÓSTICASTICA

SU EMPLEO HA CONLLEVADO A LA RE-CLASIFICACIÓN DE GRUPOS IMPORTANTES

M. Manafi: Rapid testing methods using fluorogenic and chromogenicMedia. Conference

COMO INGREDIENTES CONSTITUTIVOS DE LOS MEDIOSCOMO INGREDIENTES CONSTITUTIVOS DE LOS MEDIOSCOMO INGREDIENTES CONSTITUTIVOS DE LOS MEDIOS

CromoCen AGNCromoCen AGN®®: contiene : contiene una mezcla de sustancias una mezcla de sustancias

cromogcromogéénicas nicas

FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO

Agar Violeta Rojo Bilis con MUG

FORMANDO PARTE DE MEDIOS TRADICIONALES MODIFICADOSFORMANDO PARTE DE MEDIOS TRADICIONALES MODIFICADOS

CROMOCEN CCCROMOCEN CCCROMOCEN SCCROMOCEN SCCROMOCEN ECCSCROMOCEN ECCSCROMOCEN AGNCROMOCEN AGN

FORMANDO PARTE DE NUEVOS MEDIOSFORMANDO PARTE DE NUEVOS MEDIOS

CromoCen CND-C

MEDIOS PARA UNA ESPECIE O GMEDIOS PARA UNA ESPECIE O GÉÉNERO ESPECNERO ESPECÍÍFICOFICO

MEDIOS PARA MMEDIOS PARA MÁÁS DE UNA ESPECIE O GS DE UNA ESPECIE O GÉÉNERO NERO

CROMOCEN AGN

Como suplementos de los medios, adicionando en el laboratorioComo suplementos de los medios, adicionando en el laboratoriolos sustratos: los sustratos:

MacConkey con Sorbitol MacConkey con Sorbitol + 100 + 100 μμg/mL Xg/mL X--GluGlu


MEDIO PARA SISTEMA DE FILTRACIMEDIO PARA SISTEMA DE FILTRACIÓÓN POR MEMBRANA N POR MEMBRANA CON SUSTRATO FLUOROGCON SUSTRATO FLUOROGÉÉNICO QUE SE LIGA AL NICO QUE SE LIGA AL CITOPLASMA DE LA CCITOPLASMA DE LA CÉÉLULA O ESPORA SIN DESTRUIRLALULA O ESPORA SIN DESTRUIRLA

En forma de soluciones que se aEn forma de soluciones que se aññaden a los medios de aden a los medios de filtracifiltracióón por membranan por membrana


En la composiciEn la composicióón de los n de los medios para filtracimedios para filtracióón por n por membranamembrana


Formando parte de los medios o pruebas miniaturizadas Formando parte de los medios o pruebas miniaturizadas en los sistemas de identificacien los sistemas de identificacióónn


En forma de soluciones que se aEn forma de soluciones que se aññaden a las coloniasaden a las colonias

SOLUCISOLUCIÓÓN N FLUOROGFLUOROGÉÉNICA QUE SE NICA QUE SE

ADICIONA A LA CEPA ADICIONA A LA CEPA SOSPECHOSASOSPECHOSA

Y LA LECTURA SE REALIZA DIRECTAMENTE

POR LA APARICIÓN DE LA FLUORESCENCIA


•• Mayor especificidad y sensibilidad diagnMayor especificidad y sensibilidad diagnóósticassticas•• Generalmente mayor rapidez en las respuestasGeneralmente mayor rapidez en las respuestas•• Posibilidad de diferenciar un mayor nPosibilidad de diferenciar un mayor núúmero de especies en mero de especies en una misma placauna misma placa•• Sencillez en la identificaciSencillez en la identificacióónn•• Los resultados pueden ser analizados en algunos casos por Los resultados pueden ser analizados en algunos casos por personal no especializado (spersonal no especializado (síí entrenado)entrenado)•• No se necesita en la mayorNo se necesita en la mayoríía de los casos de medios para a de los casos de medios para aislamiento primarioaislamiento primario•• Por lo general, las coloraciones de las colonias se mantienen Por lo general, las coloraciones de las colonias se mantienen estables por mestables por máás de 48 horass de 48 horas•• Ahorro de recursos para la identificaciAhorro de recursos para la identificacióón posterior por n posterior por pruebas bioqupruebas bioquíímicasmicas•• Ahorro en medios y recursos en general al prescindir del Ahorro en medios y recursos en general al prescindir del empleo de otros medios diferenciales o selectivosempleo de otros medios diferenciales o selectivos

VENTAJAS DE LOS MEDIOS CROMOGVENTAJAS DE LOS MEDIOS CROMOGÉÉNICOS Y FLUOROGNICOS Y FLUOROGÉÉNICOSNICOS


MMÁÁS PRECISOSS PRECISOS

MMÁÁS RS RÁÁPIDOSPIDOS MMÁÁS S ECONECONÓÓMICOSMICOS

MMÁÁS CONFIABLESS CONFIABLES

MMÁÁS S ESPECESPECÍÍFICOSFICOS

VENTAJASVENTAJAS

FINALMENTEFINALMENTE……………………………………


PARA LOS LABORATORISTAS………...

MAYOR CONFIANZA

Muchas Gracias ...................Muchas Gracias ...................


conf cro mogen

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