Conceptos bsicos en Inmunohematologa

Dr E Muiz-DiazLaboratorio de Inmunohematologa

Banc de Sang i TeixitsBarcelona (Espaa)

Inmunohematologa La IH es la parte de la Hematologa que se ocupa de los

procesos inmunes relacionado con las clulas sanguneas.

Estos procesos estn producidos por anticuerpos (Acs) que reaccionan con antgenos (Ags) presentes en la membrana de las clulas sanguneas.

Los Acs son inmunoglobulinas: las de clase IgG e IgM son las ms habituales.

Los antgenos (Ags) son estructuras de la membrana (proteinas, glcidos, lpidos, o combinaciones de ellos) con capacidad inmunognica: capaces de desencadenar una respuesta inmune.

Inmunohematologa

Los Ags y los Acs son los grandes protagonistas de la IH, y los estudios inmunohematolgicos realizados para el diagnsticode los procesos inmunes de la sangre se basan en poner en evidencia la reaccin Ag-Ac.

Reaccin Ag-Ac

Ags en losHemates

Anticuerpos AglutinacinHemlisis

Inmunohematologa. Antgenos.

La parte del Ag que reacciona con el Ac es el determinante antignicoo eptopo.

Cada antgeno est constituido por un nmero variable de eptopos.

Inmunohematologa. Antgenos.

Los Ags presentes en los hematies son los Ags eritrocitarios.

Los Ags de las plaquetas son los Agsplaquetarios.

Los Ags de los granulocitos son los antgenosgranulocitarios.

GRUPOS

SANGUNEOS

Los Ags codificados por un mismo Gen, o por geneshomlogos muy prximos

entre s

Sistema degrupo sanguneo

Inmunohematologa. Anticuerpos.

Los Acs son proteinasplasmticas que se producenen respuesta a un antgeno.

Al realizar un proteinogramaaparecen varias bandas, con 2 grandes fracciones correspondientes a la albmina y a las globulinas(1, 2, 1, 2 y ).

Los Acs se sitan en la fraccin denominada , y por su relacin con la inmunidad se denominan Inmunoglobulinas (Ig).

Inmunoglobulinas

Las Igs est formadas por 4 cadenas, dos pesadas y dos ligeras, debido a su peso molecular, que estn unidaspor puentes disulfuro.

Cada cadena tiene una reginconstante en todas las Igs y una variable.

Se conocen 5 clases de Igs(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) que se diferencian entre s por la cadena pesada.

Regin Fab

Regin Fc

Inmunoglobulinas

Importancia clnica de los Acs

Los Acs ms importantes en transfusin e IH son los de clase IgG e IgM, y muy de lejos, IgA.

Los Acs de clase IgG son incompletos porque no son capaces de aglutinar espontneamente a los hematies.

Los Acs de clase IgM son completos o aglutinantesporque son capaces de aglutinar espontneamente a los hemates.

Clasificacin de los Acs segn su origen

Naturales. Aparecen sin estimulacin detectable. La mayora son IgM, o bien mezclas de IgG+IgM.

Regulares. Aparecen siempre que se carece del antgenocorrespondiente (ABO).

Irregulares. No siempre aparecen cuando no se posee el Ag (P1, Le, E...).

Inmunes. Se detectan despus de un estmuloantignico (transfusin, embarazo...). Son casi siempre IgG.

Tambin son Acs irregulares.

Clasificacin de los Acs segn el Agcontra el que van dirigidos

Aloanticuerpos: Dirigidoscontra un Ag extrao no presente en la persona que lo produce.

Los Acs dirigidos contra los Ags eritrocitarios. Anti-Rh(D) en un indivduo Rh(D-).

Autoanticuerpos: Dirigidoscontra un Ag propio.

Son los responsables de los procesos autoinmunes.

Procesos en IH que exigen la deteccin de Acs

IH eritrocitaria Pruebas de compatibilidad transfusionales Enfermedad hemoltica del RN Anemia hemoltica autoinmune

IH plaquetaria Trombocitopenia neonatal aloinmune Prpura postransfusional Prpura trombocitopnica autoinmune (PTAI)

IH granulocitaria Neutropenia neonatal aloinmune Lesin pulmonar aguda-AT (TRALI) Neutropenias autoinmunes

AloanticuerposAloanticuerpos

Aloanticuerpos

Aloanticuerpos

AloanticuerposAloanticuerpos

Autoanticuerpos

Autoanticuerpos

Autoanticuerpos

Una regla bsica en el diagnsticoinmunohematolgico

La deteccin de un aloanticuerpo en el suero de un paciente exige, siempre que sea factible, la confirmacinde la ausencia del correspondiente antgeno.

Por ej. Una gestante portadora de anti-D debe ser Rh(D-).

1. Investigaremos la presencia de anticuerpos en su suero

Suero problema + hematies de grupo conocido Rh(D+ y D-)

2. Comprobaremos la ausencia del Ag en la gestante

Ac conocido (anti-RhD) + hemates de la gestante

La reaccin Ag-Ac es la base del diagnstico inmunohematolgico

Los resultados posibles de la reaccin Ag-Ac puedenser: Aglutinacin Hemlisis.

Las tcnicas empleadaspara poner en evidencia estos fenmenos son fundamentalmente las tcnicas serolgicas.

Hemlisis

Aglutinacin

Tcnicas serolgicas: Aglutinacin

Es el agregado de hemates que se forma cuando las molculas de Ac se unen a los determinantes antignicos (Ags) de mltiples clulas adyacentes.

Algunas molculas son capaces de unirse a los Ags y de interaccionar con otras molculas induciendo la aglutinacin final (IgM).

Otras molculas slo se unen a su antgeno pero no son capaces de hacerlo con sus vecinas y de producir la aglutinacin (IgG).

Tcnicas serolgicas: Aglutinacin

La aglutinacin es un proceso qumico reversible que se produce en dos fases:

Fase de Sensibilizacin: unin del Ac con el Ag.

Fase de Aglutinacin: formacin de puentes entre las clulas sensibilizadas hasta constituir la red que conduce a la aglutinacin.

Son muchos los factores que inciden en estas dos fases y que podemos manipular para aumentar, o disminuir, la aglutinacin.

Factores que afectan a la fase de Sensibilizacin

1. Temperatura.

2. pH.

3. Tiempo de incubacin.

4. Tipo de anticuerpo: clase de Ig.

5. Proporcin de Ag y Ac.

6. Constante de afinidad del anticuerpo.

1. Temperatura Los Acs IgG reaccionan de

forma ptima a 37C (calientes).

Los Acs IgM reaccionan de forma ptima a 4C o a TA. (fros).

2. pH El pH ptimo para la reaccin

est entre 6.9 y 7.2. Algunos Acs necesitan de un

medio cido para actuar.

3. Tiempo de incubacin El estado de equilibrio sin

potenciadores es de 15 a 60 min.

4. Tipo de Anticuerpo IgM: aglutinante en solucin

salina. IgG: no aglutinante. Habr

que potenciar la aglutinacin.

5. Proporcin de Ag y Anticuerpo Tiene que haber una relacin

entre el nmero de molculasde Ac y el de lugaresantignicos.

6. Constante de afinidad del Ac A mayor afinidad del Ac mayor

es la velocidad de asociacin y ms lenta la disociacin.

Factores que afectan a la fase de Aglutinacin

++

+

++

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+

+

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++

+

+

+

CARGA POSITIVA:CATIONES DEL MEDIO

HEMATIECARGA NEGATIVA:SIALOGLICOPROTEINAS

DE LA MEMBRANA

1. Intensidad inica del medio (Potencial Z).

El potencial Z es la diferencia de potencial entre el hemate cargadonegativamente y la nube de cargas positivas del medio.

Es el responsable de la fuerza de repulsin de los hemates.

2. Tipo de Ac Los IgM siempre aglutinan. Los IgG raramente (segn la

localizacin del eptopo del Ag).

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+

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++

++

++

+

++

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+++

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+ +++

+

+

+

+

++

++

+

+++

+

nube deiones Ig G

Ausencia deaglutinacin

Ig M

Aglutinacin

35 nm

25 nm14 nm

anticuerpoincompleto

anticuerpocompleto

Potenciadores de la reaccin Ag-AcSouciones de baja fuerza inica (LISS)

- Aceleran la fase de sensibilizacin al disminuir la carga negativa.- Suele requerir una sustancia no inica para evitar la hemlisis (Glicina).

Albmina- Reduce la repulsin entre clulas (potencial Z) favoreciendo la aglutinacin.- Hace posible que Acs IgG sean capaces de unir hemates adyacentes.

Enzimas- Bromelina, ficina, papaina,tripsina, pronasa y neurominidasa.- Reducen la carga negativa. Hacen aglutinantes a los Acs IgG.- Mejoran el acceso a los lugares antignicos.

Molculas cargadas positivamente- Son polmeros que aportan un exceso de carga positiva: polybrene, sulfato de protamina, poli-L-Lisina, que pueden producir una aglutinacin espontnea.- Pueden dar falsos positivos.

PEG- Es un polmero soluble que potencia la reaccin Ag-Ac eliminando el agua que hay alrededor de los hemates.- til para la deteccin de Acs de clase IgG.

El test de la antiglobulina (Test de Coombs)

En 1945 Coombs, Mourant y Race disearon una tcnica para poner en evidencia a los Acs que no eran capaces de aglutinar directamente a los hematies (IgG).

1. La base es la utilizacin de un suero anti-Inmunoglobulina humana o, anti-C, (suero antiglobulina) que acta como un puente de enlace entre los Acs que se han fijado.

2. Originalmente se emple para demostrar anticuerpos Rh(D) incompletos o no aglutinantes (IgG) en el suero.

3. Posteriormente, para detectar la sensibilizacin in vivo de hemates por anticuerpos, o factores del C, (autoanticuerpos) en pacientes afectos de Anemia hemoltica autoinmune.

Es el test ms importante en Inmunohematologa

Inyeccinplasma humano o de

Igs especficas

Suero de Coombs: anticuerpos contra las

fracciones Fc de las Igs humanas

Antiglobulina Poliespecifica / Polivalente: Anti-Igs (mayorit. IgG) + C3d

Antiglobulina Monoespecifica: Anti IgG, anti IgM, anti IgA, anti C3d

Cmo se obtiene la antiglobulina humana?

Aplicaciones de la tcnica de la antiglobulina

Prueba directa

AHAI: autoacs.

Hemlisis inducida por frmacos.

EHRN: RN con CD+.

Reacciones aloinmunes:- Ac fijado a hemates transfundidos.

Prueba indirecta

Tipificacin: -Ac conocido y Ag desconocido.

Deteccin e identificacin de Acs: -Ac desconocido y Agconocido.

Pruebas cruzadas.

TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA

Test directo:

Indicaciones:Anemia hemoltica autoinmuneEnfermedad hemoltica del recin nacidoHemlisis por frmacosReacci hemoltica post-transfusional

TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA

Test indirecto:

sueropaciente

hematiesreactivo

hematiessensibilizados

anticuerposanti-IgG y/o C

aglutinacin

Indicaciones:Deteccin e identificacin de anticuerpos anti-eritrocitariosPruebas de compatibilidad pre-transfusionalTipificacin de antgenos eritrocitarios que no son visualizadospor aglutinacin directa

Sensibilizacin: reaccin Ag-Ac

El suero antiglobulina se une al fragmento Fc de los Acs IgG

El suero antiglobulina acta como puente entre los Acs IgGfavoreciendo la aglutinacin

Aglutinacin final

Comparacin entre el Coombs Directoe Indirecto

La prueba exige una incubacin previa(suero+hemates) antes de aadir la antiglobulina humana.

Los hemates son examinadosdirectamente con la antiglobulinahumana.

La tcnica requiere 2 pasos.La tcnica requiere 1 paso.

La sensibilizacin de los hematesse ha provocado al incubar el sueroen estudio con los mismos.

La sensibilizacin se ha producidoespontneamente en el organismo del paciente.

Detecta Acs (IgG) y/o C fijadosa los hemates, procedentes del suero en estudio.

Detecta Acs (IgG) y/o C directamente fijados a los hemates en estudio.

Coombs IndirectoCoombs Directo

Mtodos para observar la Aglutinacin

La tcnica en tubo Es la tcnica estndar

VentajasSe pueden aadir aditivosPermite la manipulacinEs visible la hemlisis

DesventajasLa aglutinacin es inestableRequiere experiencia en la

manipulacin y lectura cuidadosa 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 0

Mtodos para observar la Aglutinacin

Aglutinacin en columna / tarjeta La columna contiene gel, microesferas...

Utilizan aditivos (LISS) para potenciar la reaccin Ag-Ac y reducir el tiempode incubacin.La reaccin es semipermanente y puede evaluarse horas-das despus.

VentajasEntrenamiento mnimo y poca

manipulacin.Se requieren pocos reactivos.

DesventajasRequiren equipamiento

Muy sensibles

Equipamiento en la tcnica de aglutinacin en columna

Prinicipio de la aglutinacin en Gel

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

Hemates K+

Hemates K-

Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+y de unos hemates Kell- con anti-K

8888 Se utilizan microplacas

de plstico con 96 pocillos.

8888 Permite automatizacin.

8888 Muy til para grandes series.

Tcnica en fase slida en microplacas

Mtodos para observar la Aglutinacin

Tcnica en Fase Slida (Microplaca)

Hemates o estromas eritrocitarios de composicinantignica conocida, fijados en los pocillos de una microplaca.

Se aade el suero a estudiar y se incuba; posteriormentese lava la placa para eliminar el exceso de anticuerpo.

El anticuerpo fijado se detecta aadiendo un reactivo de antiglobulina conjugado en enzima o con hemates sensibilizados recubiertos con antiglobulina.

Ventajas:- Sensibilidad parecida al PEG- Larga caducidad- Lectura de resultados automatizable.

Desventajas:

- La fase de lavado de las microplacas es delicado. - Se puede automatizar, pero encarece los costes.- No es prctica para muestras aisladas.- Ideal para series largas de muestras.

Tcnica en Fase Slida (Microplaca)

El Complemento Es un sistema de 25-30 proteinas sricas y de la membrana que

actan en cascada para producir diversos efectos biolgicos, entre ellos la lisis de los hemates.

Se encuentran en estado inactivo o de proenzimas, y tras suactivacin se convierten en enzimas activos.

La activacin se produce:

por va clsica: reaccin Ag-Ac por va alternativa: bacterias, virus, proteinas o carbohidratos ajenos.

Nueve componentes estn numerados de C1 a C9.

Activacin completa del Complemento

C1qrs rompe C4 y C2 en 2 fragmentos: C4a y C4b y C2a y C2b. C4b y C2a se unen para formar la C3 covertasa que rompe C3 en C3a y C3b. C3 convertasa se une a C3b para formar la C5 convertasa que rompe C5 en dos

fragmentos, etc. El complejo de proteinas de ataque lo forman el grupo de C5 a C9 que acaban

produciendo agujeros en la misma y la hemlisis subsiguiente.

Activacin incompleta del Complemento (C3d)

Jka

Macrfago

Fc de Igs

Hemate

Receptor macrofgico para el receptor Fc

Jka Jka

C1qC1r

Ca ++C1s

Ca ++

C4bC2a

C3b

Receptor macrofgico para C3b

Macrfago

Hematie

Reaccin transfusional

Reaccinretardada

Reaccininmediata

Habitualmente extravascularAnti-Jka y anti-Jkb

Intravascular / Extravascularanti-A y anti-B

IgG

IgMActivacin completa del C

Activacin incompleta del C

Tcnicas moleculares. Aplicaciones

1. En pacientes transfundidos o con Coombs directo positivo podemos determinar el genotipo. (Ej. Hemoglobinopatas).

2. Definir las variantes RhD y confirmar el carcter positivo o negativo de la muestra.

3. Confirmar el grupo ABO en las discordancias srico-hemticas.

4. Buscar donantes con determinados genotipos (Ej. Dombrock) cuando no se dispone de antisueros.

5. Determinar la zigosidad exacta de clulas de Panel (Ej. Fy(a+b-) puede ser Fya/Fya, Fya/Fy, Fya/Fyx.

6. Anlisis del genotipo fetal: RhD, Rhc, K. Permite aplicar un programa profilctico racional.

La tcnica ms comn es la PCR: PCR-ASRA, PCR-ASP, Discriminacin allica con tecnologa Taqman.

Gracias por su atencin

Barcelona vista desde el Parque Gell

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