conceptos basicos de quimiometria y control de calidad en quimica analitica

7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica

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CONCEPTOS B SICOS DE

QUIMIOMETRI Y

CONTROL DE C LID D EN

QUI MIC N LITIC

vLcell vte rerre ret <;oll vzaLez

Departamento de Quimica nalitica

Universidad de Zaragoza

f---.

studio interferencias adirivas

f---.

studio recuperacion

> o l

Estudio interferencias

c._____-- - - - 1 propcrcionales ,

efectos de matriz

y

otros)



CONCEPTOS B SICOS

DE

QUIMIOMETRI

Y

CONTROL DE

C LID D

EN

QUIMIC N LITIC

Vicente

erreira

onzalez

Departamento de Quimica nalitica

Facultad de Ciencias

Universidad de Zaragoza



Conceptos basicos de Quimiometrfa Control de Calidad en

Qufmica Analftica

©

2006

Vicente Ferreira Gonzalez

a

edici n

2006

Imprime: Servicio de Publicaciones de Ia Universidad de

Zaragoza

ISBN: 84 96214 70 2

Deposito legal: Z 727 2006



' - ' - '1•

L- 1• . . . . _ , ' - 1 '

Tema 1. Introducci6n

a Ia

quimiometria

1 Papel de Ia Qufmica Analftica 1

2 Conceptos fundamentales de Qufmica Analftica 4

3 Conceptos fundamentales de Ia teorfa de Ia

informacion: errores precision y exacti tud 15

4 Tests de significacion 37

Tema

2. Descomposici6n

de varianzas

aplicaciones analiticas 53

1 Concepto y util idad 53

2 Fuentes de variacion 53

3 Descomposicion de varianzas 55

4 ANOVA de un factor de efecto fijo o controlado 58

5 La tabla de analisis de Ia varianza 62

6 l modelo subyacente al ANOVA 6

7 Factor de efecto aleatorio/teorfa del muestreo 67

Problemas 70

Tema 3. Calibraci6n de metodos analiticos 73

1 Funciones de calibracion 73

2 Linealidad de

Ia

funcion de calibracion

7

3 La recta de regresion de y sobre x 75

4 l modelo subyacente a Ia regresion 78

5 Rectas de regresion ponderadas 81

6 Calibracion

por

adicion estandar 8

7 Rectas de calibrado como parametres de calidad

y diagnostico de metodos de analisis 86

Problemas

87

Tema 4. Validaci6n

Control

de

Calidad en

Quimica

Analitica

91

1 Introduccion 91

2 Validacion de metodos de analisis. Concepto 92

3

Validacion de

Ia

exactitud y trazabilidad de un

metoda 93

4 Vision general de Ia validacion de metodos de

analisis 102

5 Ensayos de control y puesta en marcha 105

Referencias recomendadas de quimiometria 109

Apendice :

Transparencias

control

de

calidad

Apendice

2: Tablas

estadisticas



lCUH:l

1

UlUUUUt...t ...lUU

4 1 4

\ lUll1UV111\ .U1Cl

QUIMICA

ANALITICA

A

VANZADA

TEMA

1 lntroducci n a Ia Quimiometria

Contenido

Papel

de

la

Quimica Analitica. Conceptos fundamentales: Metodo, proceso, instrumento, tecnica

..

; Conceptos

fundamentales

de

la teoria

de la

informacion: errores, precision y exactitud. Control

de la

exactitud. Fuentes

de

incertidumbre

en

Quimica Analitica.

Distribucion

de

errores aleatorios: distribucion normal y distribucion

t.

Teorema

del

limite central. Intervalos

de

confianza. Presentacion de resultados. Propagacion de

errores.

Tests de significacion: Test

t

test t por parejas, test

F

test

Q.

Verificacion de la normalidad

de

una poblacion.

1. PAPEL

DE LA

QUIMICA ANALITICA.

1.1. Obtencion de informacion

La funcion de la Quimica Analitica actual es proporcionar de manera optima la informacion de

caracter quimico de un sistema material que es necesaria para resolver un problema o cuestion que se

ha

generado sabre dicho sistema.

La

vision clasica y coloquial de la Quimica Analitica es la de la ciencia que "analiza" sin mas.

Esta vision presenta al profesional de la quimica analitica como una especie de mago al que se le Bevan

muestras para que, tras una serie de ensayos de naturaleza quimica y fisico-quimica, adivine que es lo que

contienen. Aun reconociendole valor romantico a esta vision es preciso reconocer que esta totalmente

pasada de moda. Como siempre, la realidad es alga mas prosaica y menos romantica pero no por ella

menos interesante.

Hoy se reconoce la importancia que

la

informacion tiene para abordar o resolver cualquier

proceso de produccion, de control, investigacion o desarrollo.

De

hecho, puede decirse que hemos vivido

y estamos viviendo una revolucion en el mundo del analisis y el control. £,Quien podia haberse imaginado

hace tan solo 20 aiios que iba a ser necesario analizar tantas cos as y tantos parametros de cada co sa?

j

Si

hasta la orina de los atletas puede sufrir mas de 20 analisis diferentes antes de una competicion Y lo

cierto es que vamos a mas: los alimentos, el agua, el aire, los juguetes, los materiales de construccion, los

embalajes, los plasticos y un largo etcetera de productos han de ser sometidos al analisis de numerosos

parametros acerca de su composicion quimica. Por no hablar del numero de parametros, cada

vez

mas

complejos, que han de ser controlados en un hospital.

Este cambia responde a toda una serie de causas y problemas relacionados con o generados por el

desarrollo y que,

en

parte, comentaremos posteriormente. Los analisis se realizan para resolver dichos

problemas, y la informacion que han de generar estos analisis no es cualquiera y a cualquier coste, sino

solo aquella que es precisa, justificada y suficiente para resolver el problema planteado acerca dicho

sistema material. Hay dos razones de peso para que esto sea asi: a) extraer informacion de un sistema

quimico puede costar mucho dinero, y tanto mas cuanto mas informacion y de mayor calidad sea; b) la

informacion ha de ser procesada, registrada y almacenada, y esto tambien cuesta dinero y ocupa mucho

tiempo. En ambos casas

un

exceso de informacion implica un coste y una perdida de eficiencia.

La

Quimica Analitica es la Ciencia cuya mision es generar esta informacion, tal y como puede verse en el

siguiente esquema:



QUIMICA

__,. - A ~ N : : = - c A ' = L ' = I T = I = - = C ~ A , - - - - - - ~ ~

•

INFORMACION

UTIL

RESULT

ADO)

Esta vision de Ia Quimica Analitica supera a Ia tradicional

en

Ia que habia simplemente

una

muestra

noun

sistema material) que era analizada no de Ia que se extraia informacion)

para

nose sabia

que fm en Iugar de en respuesta a un problema). Por tanto los principales protagonistas de nuestra

historia son los sistemas materiales, los interrogantes que sobre ellos se formulan, y

Ia

informacion que

ha

de generarse

para

resolverlos. Esta informacion habra de responder a ciertos requisitos de calidad y

cantidad que iremos viendo posteriormente, y ademas habra de haberse obtenido a

un

coste razonable.

Por tanto,

un

requisito adicional de Ia tarea de Ia Quimica Analitica es el proporcionar Ia informacion

requerida al menor coste posible.

Otra cuestion subyacente a Ia anterior es Ia diferencia entre lo que es un simple analisis,

entendido como una operacion eventual realizada

en

un laboratorio, de lo que es

un

sistema de analisis y

medida que funciona de manera continua o semicontinua.

En

dicho sistema Ia informacion tiene que fluir

en un continuo ya que dicha informacion puede ser parte de una cadena de operaciones exterior al

laboratorio) a un ritmo determinado, y siempre manteniendo bajo control su coste

y

su calidad. Esto

afiade una novedad mas. La tarea de un quimico analitico ya no es solo saber analizar o generar

informacion), sino saber gestionar un sistema de analisis y medida.

Un

ejemplo:

Los ayuntamientos de las ciudades estan obligados a velar por la seguridad e higiene de sus ciudadanos, lo que

incluye el asegurarse de que en el casco urbano no hay acumulacion importante de algunos productos que se sabe

contaminantes, particulannente los oxidos de Nitrogeno y

el

Ozono.

Sistema: Atmosfera urbana; Problema planteado: Vigilancia de niveles de oxidos de nitrogeno y de ozono;

Informacion requerida:

a

Concentracion promedio de oxidos de Nitrogeno en la ciudad contaminacion a largo

plazo); b) Determinacion del riesgo de que en alguna zona se supere el nivel de exposicion maximo permitido.

Observa que para resolver esta cuestion es preciso el concurso de numerosos profesionales quimicos, politicos,

estadisticos, medicos, especialistas medioambientales ..)

Observa tambien que la informacion requerida es cuantitativa pero no se limita solo a un dato de concentracion.

Observa, ademas, que no se trata

de

realizar un analisis eventual, sino de montar un sistema

de

medicion y control

que habra de funcionar de forma continua y en un plazo determinado no tiene sentido que la respuesta se produzca

despues

de

haber pasado la alerta.

Observa, finalmente, que los contribuyentes quieren estar protegidos del peligro de la contaminacion, pero no

quieren que su dinero se gaste en experimentos.

Ejercicio.- Busca unos cuantos ejemplos mas identificando en todos los casas el problema el sistema a

estudio Ia informacion requerida y su posible inserci6n n una cadena exterior allaborator io la

periodicidad de los ana/isis y las dificultades de gesti6n de dicho sistema. Resalta las diferencias

entre el sistema material

a

muestra entre

a

informacion requerida el dato

de

concentracion entre el amilisis

y l

sistema

de

medida.

En RESUMEN: La

Quimica Analitica es Ia ciencia que se ocupa de Ia generacwn de

informacion de sistemas materiales sobre los que se

ha

planteado

una

cuestion o problema.

La

informacion generada debe ser la necesaria y suficiente para resolver el problema, y debe ajustarse en

tiempo, calidad y coste a los requerimientos. Dicha informacion se producira en

un

sistema que

funcionara de manera continua o semicontinua y que debe

ser

gestionado de forma adecuada.

La

informacion que Ia Quimica Analitica suministra puede

ser

de caracter quimico basico, o elaborada.

La

informacion quimica basica puede ser de naturaleza cualitativa, cuantitativa o estructural. AI atomo,

molecula o especie objeto de Ia investigacion analitica se le conoce como analito. Pero tambien Ia

informacion generada puede ser mas elaborada, como ocurre

por

ejemplo, en el control antifraude. En



ema n roauccwn a

a

. . m mema

estos casos la informacion quimica no es relevante, se emplea la informacion quimica para obtener una

identidad de origen, marca o tipo, por ejemplo.

Tabla sinopsis de las diferencias entre la vision clasica y la actual de la Quimica Analitica y

de

su tarea

Vision clasica

Analizar

Conocimiento

Muestra

lndiferente

Metoda de analisis

Presencia o concentracion

Veracidad

Eventual

Calibracion

arametro

Funci6n

Raz6n

Objeto

Sujeto

Herramienta

Resu tado

Criteria de evaluaci6n

Frecuencia

Forma de control

1.2.- Grandes areas de trabajo de Ia

Quimica

Analitica

Vision actual

Proporcionar informacion optima

Resolver un problema

Sistema material

Cliente

Sistema de medida

Informacion

Utilidad/Coste

Continua o semicontinua

Continua sistematizada

retroalimentada

Como se deduce de lo expuesto en el epigrafe anterior, la Quimica Analitica no es solo una

Ciencia, rama de la Quimica, sino que es una profesion singular y en expansion. La Quimica Analitica

esta presente en muchas areas de actividad economica, cientifica o social, por

lo

que es muy dificil

describir de forma exhaustiva todas sus posibles aplicaciones. Sin embargo, si que conviene sefialar

algunas grandes areas y grandes retos.

Quimica Clinica: La medicina hospitalaria requiere informacion fidedigna y muy rapida de

muchos parametros quimicos y bioquimicos indicadores del estado de un paciente. Ademas del requisito

de rapidez y de gran nfunero de muestras, los ensayos quimicos se han de realizar con volumenes muy

pequefios de muestra. Casi todos los ensayos se realizan con sangre entera, plasma, suero u orina. Hay

mas de 50 parametros de naturaleza quimica que se analizan de forma rutinaria

en

el hospital, y el

numero de parametros que deben ser analizados se incrementa de forma continua conforme progresa la

ciencia medica. De esta forma, a\ln cuando los metodos de analisis tienden a ser mas sencillos y

automaticos, el flujo de informacion generado por ellaboratorio de un hospital es cada

vez

mas complejo

y dificil de gestionar. Para poder trabajar en el laboratorio de un hospital es preciso tener el Titulo de

Especialista correspondiente, regulado seg\ln el

Real

ecreto 1163 2002 de 8 de noviembre, B.O.E.

de 15 de noviembre.

En

mi conocimiento existe un curso magister de la Universidad Complutense de

Madrid. Se puede obtener mas informacion en la pagina Web de la sociedad Espafiola de Quimica Clinica

http://www.seqc.es/).

Quimica

Industrial:

En

casi todas las industrias de transformacion es preciso realizar de forma

rutinaria analisis

de

los productos de partida y del producto acabado. Estos analisis pueden tener la

funcion de aceptar/rechazar un lote determinado, lo que lleva asociada una decision de alta

responsabilidad. Otro area cada

vez ma:s

irnportante es el Control de Procesos, que si bien basta ahora se

realizaba con parametros exclusivamente fisicos densidad, temperatura, presion), cada vez se emplean

mas parametros quimicos medidas de infrarrojo, sondas de gases, sistemas sensores ..). Muchos de estos

sistemas de medida compleja un sistema de Infrarrojo Medio, o un conjunto de sensores de gases

denominados nariz electronica) se emplean no solo en las cadenas de produccion sino en la

caracterizacion del producto de partida o final. Ademas, el quimico analitico en una empresa se suele

hacer cargo de las reclamaciones de productos defectuosos o de procesos que no consiguen la calidad

deseada.

La

industria tambien analiza los productos propios y de la competencia, y emplea el analisis

como parte de la investigacion y desarrollo.

Medio ambiente: Cada vez hay mas parametros que es obligatorio controlar para proteger el

medio natural y la salud publica.

En el

agua y en algunos alimentos: pesticidas, compuestos

organoclorados, organofosforados, dioxinas, metales pesados;

en

el aire ,oxidos

de

nitrogeno, ozono,

oxidos de azufre, monoxido de carbono, etc. Este control suele realizarse en laboratorios publicos,

aunque existen cada

vez

mas laboratorios privados que emiten un certificado que solo sera valido si el

laboratorio esta acreditado) que puede ser irnprescindible para vender una mercancia, para conseguir



V.Ferreira

pasar un control aduanero o conseguir un certificado sanitario. La mayor parte de estos analisis se

ha

de

realizar siguiendo unas normas muy estrictas sometidas a control legal. Trabajar en estas areas es lo que

denominamos trabajo en entomos regulados, lo que exige una forma muy rigurosa de planificar, ejecutar,

controlar, evaluar y registrar todos los pasos y datos de un analisis.

Protecci6n al consumidor: Los alimentos pueden contener sustancias no autorizadas que pueden

dafiar al consumidor, que no estan permitidas, o que son simplemente distintas de o especificado

fraude). Tambien es cada vez mayor

el

mimero de parametros a determinar: drogas veterinarias

anabolizantes no autorizados), conservantes ilegales en alimentos, niveles maximos de conservantes y de

ciertas sustancias toxicas, contaminacion bacteriana, presencia de transgenicos, etc. Esta area de trabajo,

es tambien un area sensible sometida a control legal y el trabajo se ha de desempefiar en un entomo

regulado.

Certificaci6n y peritaje: En muchas transacciones comerciales, el precio de

un

producto es

funcion de su contenido en cierto metal, o en cierto compuesto. Su determinacion con exactitud es una

cuestion clave que se realiza en laboratories oficiales o acreditados.

Otras muchas areas en donde el analisis es fundamental son la quimica forense y de aduanas, el

control antifraude, el control antidoping, la quimica agricola, etc.

2.- CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE QUIMICA ANALITICA

2.1. Metrologia fisica

y metrologia

quimica

La metrologia es la ciencia, o el conjunto de ciencias, que se encargan de medir. En tanto y en

cuanto para obtener informacion de un sistema material es precise realizar alguna medicion sabre el,

puede decirse que la Quimica Analitica es una metrologia de sistemas quimicos. Medir es comparar un

objeto con otro de referenda.

La

metrologia fisica clasica desarrolla sistemas de medida de longitudes y

pesos, y posteriormente otros de unidades de iluminacion, electricidad, etcetera. A partir de ese sistema

metrologico, se pueden hacer numerosos ensayos sabre los sistemas materiales para obtener informacion

de los mismos. Por ejemplo, podemos determinar su densidad, su dureza, su resistencia a las fuerzas de

cizalla, la viscosidad, etcetera. Son ensayos de tipo fisico.

En

todos los ensayos el sistema es estimulado

y su respuesta se compara con la del sistema de referenda.

Por

ejemplo, en la medicion de la masa la

fuerza de gravedad acrua sabre el cuerpo, y su respuesta el peso), se compara con la de una masa

escogida como referenda el kilo). Algo parecido ocurre en los ensayos de dureza de materiales, etc.

La metrologia quimica cuantitativa) busca medir lo que denominamos analitos: atomos, iones,

moleculas, radicales, macromoleculas, grupos funcionales, impurezas, etcetera. Como

toda

metrologia ha

de estimular el sistema material y estudiar la respuesta, pero el proceso de medicion en general resulta

mucho mas complicado que en el caso de los ensayos fisicos, como se resume en la tabla siguiente.

Tabla. Algunas diferencias entre la metrologia quimica y la metrologia fisica

Sistemas

fisi os

Propiedades flsicas

Con sistemas

de

referencia

arbitrarios

Directos

Mecanicos

Estimulando TODO el sistema

Propiedad del sistema

Serial

lnstrumentos dedicados

Parametro

~ Q u e mide?

Comparaci6n

Caracteri sticas

~ C o m o

~ D n d e ?

Sistemas guimi os

Analitos

Gran numero operaciones

previas

Alta intervenci6n humana

Estimulando ANALITOS

Propiedad analitica

Serial Analftica

lnstrumentos versatiles

Una dificultad de la metrologia quimica es que la comparacion ha de hacerse con un sistema de

composici6n conocida, y no con un sistema de unidades arbitrarias, como ocurre

en

la metrologia fisica.

La

segunda dificultad esta asociada

ala

complejidad de algunas tecnicas de medida quimicas y a los altos



ema

:

n ro uccu:m a a . , mmwme na

requisitos de mantenimiento y preparacion de la muestra que llevan asociadas. Esto implica, por lo

general, que en la medicion quimica seni preciso incluir etapas de reduccion y pretratamiento de la

muestra. Otra caracteristica diferencial importante es que en la medicion quimica se precisa de la

participacion humana en un grado mayor, y ademas el tipo de profesional requerido es de una alta

cualificacion.

2.2.- Tecnicas de amilisis

Para obtener informacion quimica, ha de emplearse una propiedad del sistema material que este

relacionada de alguna manera con el analito.

Par

ejemplo, si la densidad de una disolucion esta

relacionada con la cantidad de analito que esta contiene, podemos emplear la determinacion

de

la

densidad para nuestros fmes. A esta propiedad la denominamos propiedad analitica y constituye el

principia de medida del analisis. Par ejemplo, muchos elementos de la tabla periodica tienen propiedades

de absorcion de luz muy atractivas para medirlos. Hay moleculas que tienen propiedades redox muy

defmidas que pueden ser explotadas en su medicion, otras tienen propiedades fluorescentes de interes, ...

instrumento

analftico

INFORMACION

UTIL

(RESULT

ADO

QUIMICA ANALITICA IDEAL

Como quiera que sea, la Quimica Analitica hace usa de una forma de materia o energia que es la

que emplea para estimular el sistema aprovechando una propiedad de este o de los analitos. La naturaleza

de esta forma de materia o energia y de la propiedad analitica empleadas en el proceso de medicion dan

origen a las Tecnicas de Analisis, que son todo un conjunto de estrategias de obtencion de sefiales

analiticas que emplean un principia de medicion similar.Por ejemplo, el usa de la capacidad de absorcion

de luz de longitud de onda defmida par los metales y otros elementos) da Iugar a las Tecnicas de

Analisis englobadas bajo el nombre Espectrofotometria de Absorcion Atomica. La respuesta generada

par el sistema es la que denominamos seiial analitica, que en el caso ideal anteriormente planteado

podria asimilarse al resultado buscado. Solo

en

casas muy particulares se pueden emplear tecnicas de

analisis basadas en una propiedad de la muestra y

no

del analito. Par ejemplo, la densidad o

el

indice de

refraccion se pueden emplear para conocer el contenido en azucar de un mosto o zumo de frutas, pero

solo porque en estos los azucares son un componente mayoritario el segundo en proporcion tras el agua).

Este ensayo

ya

no sirve si el contenido en azucares

es

inferior a 20 giL.

El tipo de sefial elegido para realizar la medicion es fundamental en quimica analitica, y de hecho

da Iugar a la clasificacion de las tecnicas y metodos de analisis.

En

primer Iugar puede hacerse la

siguiente division de tecnicas de analisis:

1.- Tecnicas clasicas de analisis, basadas en la medicion directa de alg\ln componente de una

reaccion de estequiometria conocida.

La

magnitud medida masa, volumen o cantidad de electricidad) es

una expresion directa caso de la masa), o relacionable a traves del conocimiento

de

la normalidad del

agente valorante volumetrias) de la concentracion de los analitos. Son las tecnicas que se estudiaron

fundamentalmente en el segundo curso del primer ciclo de la licenciatura.

2.- Tecnicas instrumentales de analisis, basadas en la interaccion de alguna forma de energia con

los analitos, y en la evaluacion de la forma e intensidad de la respuesta de los analitos a dicha forma de

energia. La magnitud medida guarda una relacion con la concentracion del analito y f c), que



6

V.Ferreira

habitualmente es determinada mediante un proceso de calibracion. Parte de estas tecnicas fueron

estudiadas en el tercer curso de Ia Licenciatura. Algunas otras senin ampliadas

en

este curso.

En el cuadro presentado en a pagina siguiente se muestra una clasificacion elemental de las

tecnicas de analisis. Es recomendable memorizar su contenido, pues constituye un esquema util sobre el

que construir de forma ordenada los conocimientos de Quimica Analitica que se han de adquirir durante

la asignatura y a lo largo de la licenciatura.

Los procesos de medicion se realizan por medio de

instrumentos analiticos

especialmente

disefiados para cada tecnica analitica en particular. Los instrurnentos mas sencillos son la

balanza

y

la

bureta.

Los instrurnentos mas comunes en los laboratorios actuates son:

•

cromatografos de

liquidos o de gases, para el analisis de moleculas organicas o de iones. Se

comercializan basicamente cuatro tipos de sistemas bien diferenciados:

o sistemas HPLC,

o sistemas GC,

o analizadores de iones, y

o sistemas GC-MS y HPLC-MS.

• espectrofotometros

de absorcion molecular uv-vis, para muchos tipos de analisis de rutina.

Muchos de los metodos enzimaticos de analisis emplean deteccion espectrofotometrica.

• electrodos

selectivos de iones, particularmente el pHmetro.

• espectrofotometros

de absorcion/emision atomica, para el analisis de rutina de la mayor parte de

elementos metalicos. El sistema mas frecuente en las empresas es el espectrofotometro de

absorcion atomica a

la

llama, en algunos casos tambien equipado con camara de grafito.

• sistemas de valoracion automatica

tituladores automaticos) que para la determinacion del

punto de equivalencia pueden emplear electrodos selectivos, o espectrofotometros uv-vis.

•

sistemas autoanalizadores

que generalmente hacen uso de una reaccion y de una determinacion

espectrofotometrica uv-vis, pero lo hacen de forma automatica.

•

analizadores multicomponente.

Cada vez mas frecuentes en las empresas. Se trata de sistemas

basados en la medicion de parametros cromaticos uv-vis, IR, NIR.

MIR

), en la presencia de

una serie de sensores de distinta selectividad oxidos metalicos, oxidos polimericos), o incluso en

la deteccion rapida del espectro de masas, que captan gran cantidad de informacion en poco

tiempo y que es procesada por sistemas inteligentes para dar una informacion elaborada o

cuantitativa.



tema

:

ntro ucc n a a mmwmetr a

Tabla de clasificaci6n de las tecnicas analiticas

Tecnicas Chisicas

Gravimetrias Miden una masa. Son De precipitacion Se emplean como metodos de referencia en

metodos absolutos

De volatilizacion

el analisis inorgamco. Analisis de Gases.

Determinacion formula empirica orgamcos.

Electrodeposicion

Volumetricas Miden

un

volumen de

Acido Base Se emplean como metodos de rutina en

reactivo que reacciona

Complexometrias

todas las ramas del analisis clasico

estequiometricamente con el inorgamco y orgamco)

analito

Redox

Precipitacion

Tecnicas Instrumentales

Cromatograticas

Separan todos los HPLC Cromatografia Analisis de rutina de todo tipo de especies

componentes en una

Liquida de Alta

orgamcas poco volatiles, analisis de

columna y

un

detector Resolucion) biomoleculas.

colocado a la salida los

detecta de forma continua

Analizadores de iones

Especificos para

Ia

determinacion

cuantitativa de aniones y cationes

CG

Cromatografia de

Analisis de todas las especies volatiles

Gases) basta puntos de ebullicion 400°).

Opticas Miden Ia Absorcion,

Espectrofotometria de Analisis no muy dificiles de especies

Emision, Fluorescencia,

Absorcion Molecular orgamcas e inorganicas uv-vis)

Dispersion de luz

Analisis de control y estructural IR).

Detector HPLC mas usado.

Fluorescencia

Detector HPLC de gran selectividad y

molecular sensibilidad. Analisis de biomoleculas.

Absorcion

y Emision Analisis de rutina de cationes y metales.

Atomica Tambien ultratrazas. Detector especifico

elementos

Electricas

Miden Potencial o Corriente Tecnicas

Medida de rutina de

pH

e iones mas

electrica

potenciometricas

comunes electrodos selectivos de iones .

Sensores de gases. Metodos de deteccion

punto final automatico. Detector HPLC.

Tecnicas Determinacion directa y selectiva de

voltamperometricas

especies con propiedades redox. Detector

HPLC altamente selectivo.

de Particulas

Emplean haces de particulas, Espectrometria de

Determinacion de estructuras orgamcas

iones, electrones y otras

Masas

Analisis de ultratrazas orgarucas e

especies

inorgamcas

Es

el detector mas potente de las tecnicas

cromatograficas



8

V.Ferreira

Otras tecnicas

Emplean una miscellinea de

Medici6n de densidad, Determinacion

de

la composici6n

de

basadas en

principios cientificos para

de indice de mezclas muy sencillas y bien conocidas

propiedades

de

medir.

refracci6n, de arucar, alcohol, mezclas de disolventes).

una disoluci6n

no

conductividad Algunos

se

pueden emplear

como

de un analito) electrica, de rotaci6n detectores cromatognificos caso

del

indice

©V.Ferreira

de luz polarizada,

de

refracci6n o

del

de conductividad

electrica)

Puesto que un analito puede poseer distintas propiedades analiticas, puede ser analizado mediante

diferentes tecnicas. Por ejemplo, el hierro presente en una aleacion o en un mineral puede ser

determinado a traves de sus propiedades redox tras ser disuelto) con una dicromatometria, o mediante

una polarografia voltamperometria). Podriamos tambien hacer uso de sus propiedades opticas y

determinarlo a traves de

la

absorcion molecular uv-vis de alguno de sus complejos ferrocianuro, o

tiocianato, ...

), o bien a traves de sus propiedades opticas atomicas y determinarlo por absorcion atomica

a la llama, o por emision atomica. Como puede verse, surgen muchas posibilidades de analisis y eso que

no las hemos agotado todas. Para poder elegir es preciso establecer terminos de comparacion entre las

tecnicas, lo

que

da

origen a los

parametros de calidad

analiticos de los que hablaremos posteriormente.

2.3. Proceso analitico

n realidad, en muy pocos casos es posible extraer la informacion adecuada del sistema material

sin nada mas que la tecnica, el instrumento y las condiciones operativas del mismo. A diferencia de lo

que ocurre en el caso de la metrologia fisica). Esto es por las siguientes razones:

1.- Cualquier instrumento analitico emplea cantidades de muestra muy pequefias en la medicion,

debido a la cantidad de energia necesaria para obtener la sefial analitica. Por ejemplo, un

espectrofotometro de Absorcion Atomica aspira caudales de 0,5-2 mL/min. Mayores caudales requeririan

una llama mucho mas energetica y grande. Una columna de cromatografia gas capilar se satura con masas

superiores al microgramo de analito y no tolera mas de 0,1-1 mg de muestra. Cuanto mas eficaz sea la

columna, menor cantidad de muestra y analito puede procesar. Esto es, los instrumentos analiticos

procesan masas de muestra raramente superiores al miligramo, cuando los objetivos del analisis se

refieren a un sistema material que puede tener una gran dimension y heterogeneidad. Necesariamente

ha

de haber etapas de muestreo a fm de obtener una muestra representativa y de reduccion de la muestra, a

fm de llevarla al nivel analitico.

2.- Por otra parte, los instrumentos analiticos requieren que la muestra que se les PRESENT

refula una serie de requisitos, como por ejemplo, que sea liquida, o que no tenga particulas solidas, o que

su pH este comprendido en cierto rango, ademas por supuesto de que los analitos esten en una

concentracion adecuada, que no haya interferencias, etc ...

3.- Los instrumentos de medida en todos los casos suministran sefiales que podemos Hamar

primarias, y que aunque estan relacionadas directamente con el dato de concentracion o masa, es preciso

el conocimiento de la ley que permita relacionar la sefial generalmente una corriente electrica o una

magnitud fisica) con el dato de concentracion. La tendencia general es a utilizar zonas de trabajo en las

que la relacion sefial/concentracion sea lineal, y a determinar la concentracion mediante interpolacion en

una recta de calibrado.

4.- Ademas, en muchas ocasiones el dato analitico no constituye la informacion buscada, sino que

ha

de ser procesado o comparado para generarla, o simplemente no existe tal dato analitico porque lo que

se busca es una informacion mas elaborada. Ejemplos: en un laboratorio industrial con la responsabilidad

de realizar el control de materias primas, el dato de composicion no es la informacion buscada, sino el

hecho de si

ellote

debe ser aceptado o rechazado; otro caso, es el de un analizador de Infrarrojo Cercano

programado para detectar la calidad de un producto fmal. n este caso, ni siquiera se genera un dato de

composici6n, los espectros de infrarrojo son directamente procesados para determinar dicha calidad.

5.- Una ultima pero no menos importante raz6n, es que los analisis no son hechos aislados, sino

que tienden a ser sistemas de medici6n continuos o semicontinuos que se repiten en el tiempo. Esto



ema n rooucc m a

a

., u m me na

implica que como todo sistema, debe ser continuamente controlado para asegurar que se mantiene bajo

control, y que el control debe estar disefiado de forma que pueda ser facilmente revisado y mejorado.

Por todas estas razones, el proceso de medicion analitica suele ser mas complejo queel expuesto

anteriormente, tal y como refleja la figura siguiente. En general habran de incluirse las siguientes etapas:

1.

Muestreo. Etapa cuya mision es proporcionar una fraccion del sistema representativa de

la propiedad a estudio.

2.

Reduccion de la muestra. Etapa importante solo en sistemas materiales grandes tipico de

solidos), en los que se

hade

triturar y mezclar los elementos que componen la muestra a

fm

de irla reduciendo en tamafio.

3. Acondicionamiento y preparacion

de

la muestra. Una etapa o con unto de etapas que en

muchos metodos pueden ser la parte mas complicada. Pueden incluir desde eliminacion

de humedad, hasta procesos de digestion, de puesta en disolucion, extraccion,

concentracion, transformacion quimica, etc

4. Medida. El proceso de medicion en el instrumento analitico en si. Esta etapa suele incluir

procesos de pretratamiento de la sefial.

5.

Calculo de la concentracion. En el caso mas com m, es la interpolacion en una recta de

calibrado.

6.

Procesado de la informacion. El conjunto de operaciones necesarias para transformar el

dato de concentracion o directamente la sefial)en la informacion requerida.

7. Evaluacion del sistema. El con unto de actividades que se realizan de forma continua y

que permiten determinar que la medicion se realiza en condiciones satisfactorias,

establecer su calidad y programar mejoras en el sistema.

A este proceso en etapas seguido por la Quimica Analitica para medir lo denominamosproceso

analitico y al conjunto de instrucciones concretas para la realizacion de un analisis particular,metodo de

analisis.

bruta

?

•

t

INFORMACION

UTIL

RESULTADO)

~

INFORMACION

r : : : : : : : = = ~ ~ S r A

DATO)

Muestra

preparada

PROCESO ANALITICO

INFORMACION

BRUTA SENAL)



10

V.Ferreira

2.4.- Definiciones

PRO ESO ANALITICO: Es el conjunto de etapas secuenciales que la Quimica Analitica sigue

para cumplir su mision, esto es, la de proporcionar la informacion requerida de un sistema material al

minima coste.

TECNICA ANALITICA: Es el principia de medida elegido para la realizacion de un analisis.

Par ejemplo, tecnica cromatogratica, o tecnica potenciometrica.

INSTRUMENTO ANALITICO: Es el sistema fisico empleado para realizar una medicion

analitica, es par tanto la materializacion de una tecnica analitica.

PRESENTACION de la muestra: Es la forma fisica en la que se debe encontrar la muestra que

va a medirse mediante una tecnica determinada, para que la medicion pueda realizarse con garantias de

exito y sin producir dafios al instrumento.

METODO ANALITICO: Es el conjunto de instrucciories necesarias para realizar un analisis

completo. Muy a menudo se equipara a PROTOCOLO, aunque este ultimo

es

mucho mas detallado.

PLAN

DE

MUESTREO: Es el conjunto

de

instrucciones y acciones necesarias para llevar a

cabo las operaciones asociadas a la toma de muestra.

ANALITO: Es la especie quimica atomo, molecula, ion, especie radical, agregado molecular,

macromolecula, etc ) que es objeto de un analisis.

2.5.- Metodos de amilisis

Aunque desde un punta de vista te6rico, el trabajo de la Quimica Analitica se realiza mediante la

cadena operacional conocida como Proceso Analitico, en la practica la cadena se separa en dos etapas

diferenciadas: Muestreo y Metoda de analisis. Esto es asi par razones estrictamente practicas y de

economia,

ya

que sabre una misma muestra se suelen realizar muchos analisis distintos, par lo que es mas

comodo archivar par un lado las instrucciones para realizar la toma de muestra, y

par

otro las de los

analisis correspondientes. Esto hace que en la practica, muchos metodos de analisis omitan la etapa de

obtencion de la muestra. Sin embargo, no debemos olvidar que los metodos estan disefiados para actuar

sabre un tipo de muestras particulares.

Un

ejemplo.

Un

metoda disenado para controlar

a

madurez de una fruta esta basado en

a

medida del

indice

de

refracci6n del zumo de dicha fruta. Sin embargo es de vital importancia especificar

a

forma en

a

que se debe obtener el zumo para que

a

medici6n sea correcta. Muchos metodos para

a

medici6n de ciertos parametros en sangre estan disenados para actuar sabre el suero sanguineo.

a forma en a que este se obtiene debe estar completamente especificada.

Los metodos de analisis contienen el conjunto de especificaciones necesarias para realizar la

determinacion de un analito en una muestra dada empleando una cierta tecnica de analisis, par

lo

que un

metoda viene defmido par un analito, un tipo de muestras y una tecnica de analisis.

Metoda espectrofotometrico para la determinacion de Calcio en agua.

Metoda colorimetrico para la determinacion de Calcio en cementos.

Muy probablemente existan muchos metodos distintos que permiten resolver un mismo problema

analitico. Los metodas pueden diferir en el tipo de tecnica analitica empleada en la medicion diferencia

sustancial), o en alguna otra etapa del proceso analitico diferencia secundaria). Los metodos de analisis

se clasifican seglin la calidad de los resultados que proporcionen, o mejor dicho, seglin el grado de

conocimiento que tengamos de ellos y el usa que pensemos darle. Pueden distinguirse las siguientes

categorias mas o menos bien definidas:



ema : n ro ucc n a

a

, u m me r a

Metodos de referenda: Son metodos cuya exactitud se ha demostrado y es universalmente aceptada

basta el punta de haber adquirido un valor legal y haber sido propuestos par distintos

organismos nacionales o internacionales dedicados a la normalizacion y validacion

metrologica, o a la supervision de la tarea de los laboratories de alglin area de interes social.

Par ejemplo ISO (International Organization for Standardization), OCDE (Organization for

Economic Cooperation and Development), FDA (US Food and Drug Administration), Ia

EPA (Enviromental Protection Agency), el NIOSH (National Institute of Occupacional

Safety and Health), las distintas comisiones de la Union Europea, o a un nivel mas local los

ministerios de agricultura, sanidad o industria espaiioles,.... En estos ultirnos casas se

denominan metodos oficiales de analisis. No todos los metodos de referenda son oficiales,

pero de alguna manera todos los metodos oficiales son metodos de referenda.

Metodos estandares: Son metodos de precision demostrada y son recomendados par alguna asociacion

profesional para Ia realizacion de un tipo de analisis. Existen varias asociaciones de mucho

prestigio que proponen metodos de estas caracteristicas como la ASTM (American Society

for the Testing of Materials), que se dedica al analisis de productos manufacturados y

materias prirnas de interes industrial, la AOAC (Association of Official Analytical

Chemists), que se dedica al desarrollo de metodos para el analisis de alirnentos,

Ia

APHA

(American Public Health Association) que se dedica al control del agua potable, y muchas

otras asociaciones de caracter sectorial mas restringido como la OIV (Office International de

la Vigne et du vin), el IB (Institute ofBrewing, Analysis Comitee),.y un largo etcetera

Metodos recomendados par autores de prestigio: Hasta hace no muchos aiios, eran pocas las personas

que se encargaban de realizar las tareas de analisis en ciertos sectores sociales o industriales.

Algunos profesionales e investigadores eran los responsables de laboratories con

responsabilidades clave y alcanzaban una gran experiencia en el analisis de todo tipo de

muestras. En ocasiones, estos autores han escrito Iibras que se han convertido en la biblia

del analisis de ciertos productos o de algunas industrias. En muchas ocasiones estos Iibras

han acabado siendo adoptados como textos base por las asociaciones profesionales citadas

anteriormente. Historicamente los textos de Fresenius, Vogel, Feigl, Kalthoff merecen ser

mencionados. En Espaiia el del profesor Bermejo (dentro de Ia categoria generales ).

Metodos publicados en las distintas revistas analiticas: Son metodos de reciente desarrollo y aplicacion,

y par tanto no existe un grado de conocirniento similar al de los anteriores. Sin embargo

pueden representar mejoras muy considerables frente a los metodos estandares o de

referenda. Los publicados en las revistas de mas prestigio suelen incluir un estudio de

validacion completo realizado par los propios autores, aunque en Ia inmensa mayoria de los

casas Ia validacion se ha realizado tan solo en un laboratorio, par lo que antes de aplicarlo

deben volver a validarse. Par supuesto nadie, excepto el prestigio y etica profesional de los

autores, avala que los detalles publicados sean correctos. A pesar de estas lirnitaciones

aparentes, estos metodos constituyen la reserva cientifica y el nucleo de desarrollo de Ia

ciencia analitica, y muchos de elias estan llamados tras algunas modificaciones a convertirse

en los metodos estandares, de referenda o incluso oficiales del futuro. Ademas, resulta

obvio que no existen metodos de referenda, oficiales o estandares para todos los casas, par

lo que en muchas ocasiones los metodos publicados en las distintas revistas cientificas son el

Unico antecedente en el que podemos apoyamos.

En general, el nivel de conocimiento que se tiene sabre un metoda esta relacionado con su

irnportancia social o economica,

ya

que los metodos que mas se conocen son los que mas se practican.

Casi todos los problemas analiticos relacionados con transacciones comerciales (par ejemplo

determinacion de

Ia

ley del oro, de la plata, de un mineral irnportante, del grado de riqueza de un

reactivo ), con cuestiones de seguridad alimentaria o medioambiental (par ejemplo, determinacion de

restos de plomo en alirnentos, en fangos o en tierras) ode seguridad general (par ejemplo, determinacion

de AI en cementa) poseen metodas amparados par la ley y existen miles de laboratories de todo el mundo

que los practican, par lo

que el grado de conocimiento que se tiene de estos metodos es muy grande.

Otros problemas analiticos que son de irnportancia para un determinado sector industrial o economico

tienen metodos de referenda o metodos estandares (par ejemplo la determinacion del extracto seco de



12 V.Ferreira

una cerveza) y tambien se practican en miles de laboratorios. Tambien nos encontramos con problemas

mucho mas especificos o mucho mas recientes que tan solo son resueltos analiticamente en uno o dos

laboratories, o que solo han sido abordados de forma experimental en laboratories universitarios o de

investigacion.

Ademas de Ia clasificacion anterior se pueden proponer muchas otras clasificaciones de tipos de

metodos analiticos. Por ejemplo podemos citar metodos de uso intemo, que son metodos disefiados para

el control de procesos o para el control intemo de una empresa y cuyo dato es simplemente orientativo,

podemos hablar de metodos de rutina, de metodos

de

screening rastreo, metodos modificados, metodos

automaticos, etc.

2.6.- Parametros de

calidad

de metodos, tecnicas y resultados

Como se afrrmo anteriormente, un mismo analito puede ser determinado empleando varias

tecnicas, o empleando una misma tecnica con distintas etapas de tratamiento de Ia muestra. Esto hace que

el nillnero

de

posibilidades para realizar un determinado analisis sea muy grande. Para poder establecer

comparaciones, necesitamos una serie de parametres o propiedades analiticas de los metodos que nos

permitan evaluar su calidad y compararlos entre

si En

este momento no vamos a dar defmiciones

estrictas de dichos parametres, sino que buscaremos comprender los parametres de forma intuitiva.

Defmiciones precisas se veran en secciones siguientes.

El

parametro de calidad analitico mas importante es Ia EXACTITUD. Puede aplicarse para

calificar tanto a un resultado como a un metodo e incluso a una tecnica. Puede comprenderse que es muy

dificil evaluar Ia exactitud de un resultado, puesto que esta se define como Ia similitud entre el valor

determinado y el valor real de Ia muestra. Pero claro, este valor real no se conoce nunca porque para algo

estamos analizando dicha muestra. Por ello suele aceptarse que un resultado es exacto si se ha realizado

siguiendo convenientemente

1

un

metodo de amilisis cuya exactitud

ha

sido

demostrada por

Ia

comunidad

analitica. La determinacion de Ia exactitud de un metodo es un tema complejo que conlleva

mucho trabajo y tiempo.

Otro parametro de calidad importante es la

PRE ISION

de un metodo

ode

un resultado, y mide

el grado de incertidumbre que tenemos sobre dicho resultado, o sobre los resultados generados por un

cierto metodo. Lo defmiremos con mas detalle posteriormente.

Los otros dos

parametros de interes son la SELECTIVIDAD y Ia SENSIBILIDAD de un

metodo. En este caso estos parametres se aplican a los metodos y tecnicas) y no a los resultados. La

Selectividad de un metodo mide su capacidad de que Ia sefial generada corresponda al analito y no a

posibles interferencias. Es por tanto un concepto relativo ya que dependera del caso concreto

en

que nos

encontremos. Ahora bien,

es

tambien correcto afirmar que hay tecnicas o metodos mas selectivos que

otros. Por ejemplo, puedo decir que los metodos de determinacion de Hierro basados en medidas de

Absorcion Atomica son mas selectivos que los basados

en

medidas de Absorcion Molecular, pero esto no

quiere estrictamente decir que todas las medidas de Absorcion Atomica del Hierro vayan a estar siempre

libres de interferencias. Esto dependera del caso concreto en que nos encontremos.

La SENSIBILIDAD de un metodo analitico se refiere a Ia cantidad de sefial producida por

unidad de masa de analito. Por tanto un metodo mas sensible que otro producira una sefial mucho mas

facil de medir. Aunque el concepto

es

facil de comprender, no es facil de medir por la sencilla razon de

que las sefiales pueden amplificarse tanto como queramos. Para medirlo

es

imprescindible especificar

perfectamente las condiciones de trabajo. Aun asi, en ciertos casos es mucho mas conveniente emplear el

parametro de limite de detecci6n o de

minima cantidad

detectable, que se defme como la masa minima

de analito que proporciona una sefial netamente diferenciable del ruido de fondo.

1convenientemente

hace

referencia a que

el

analisis

se

ha realizado en

un

laboratorio y

en

unas

condiciones en las que

se

pueda asumir que cumple los requisites de calidad



ema n roouccwn a a

. . mwmema

.

Las tecnicas de amilisis poseen una sensibilidad y selectividad intrinsecas, pero la sensibilidad y

selectividad del metoda puede mejorarse mediante el usa de etapas de tratamiento de la muestra o de

tratamiento de la informacion. Formas de mejorar la selectividad: incluir una etapa de separaci6n de

interferencias, derivatizar

al

analito transformandolo par reacci6n quimica) para poder emplear una

tecnica mas selectiva, enmascarar las interferencias, emplear estrategias matematicas para separar sefiales

superpuestas. Formas de mejorar la sensibilidad: lntroducir etapas de preconcentraci6n, derivatizar al

analito para poder emplear una tecnica o unas condiciones de trabajo) mas sensible, o emplear

algoritmos matematicos para reducir el ruido de fonda.

2.7. Cuestiones:

1.- Hemos dividido las tecnicas y metodos analiticos en clasicos e instrumentales, pero desde otro punta

de vista pueden dividirse en metodos absolutos miden directamente la masa de analito ), estequiometricos

miden la masa o volumen de un derivado de estequiometria conocida), o relativos miden un parametro

que esta relacionado con la concentraci6n de analito). Razona cual de ellos puede ser mas exacto.

2.- Trata de relacionar la clasificaci6n anterior de tecnicas absolutos, estequiometricos y relativos) con

Ia que hicimos anteriormente clasica e instrumental). Razona Ia respuesta.

3.- La selecci6n de un metoda de analisis es un asunto bastante delicado y cuyo comienzo siempre es Ia

elecci6n de la tecnica de medida. Lo que se hace

de acuerdo con criterios combinadas de caracteristicas

analiticas de cada tecnica y de asequibilidad y coste de las mismas. Una vez que se ha determinado Ia

tecnica de analisis que se ha de emplear, cual sera

Ia

cuesti6n clave siguiente en Ia selecci6n o disefio del

metoda.

4.- De los casas presentados a continuacion, nombra Ia tecnica de ami/isis, el anal to y el instrumento

con que se realiza

Ia

medicion:

Determinacion del contenido de azucar de un zumo de frutas

par

medicion de

Ia

densidad.

Determinacion de Hierro

par

medicion del color generado al formar un complejo con tiocianato.

Determinacion de Calcio par medicion del color generado al meter

Ia

disolucion en una llama.

Determinacion de Cloruro empleando un electrodo selectivo

Determinacion de pesticidas organoclorados

par

separacion en cromatografia gaseosa

empleando un detector selectivo de masas

Determinacion de cloruros del agua

par

pesada del precipitado de cloruro de plata obtenido

5.- Haz una visita a

Ia

pagina web de

Ia

asociaci6n ISO

b.ttp

: lwww.iso.ch/ ) y determina si hay a/gUn

metoda de ana/isis quimico para alimentos regulado par una norma ISO.

iQue

tipo de metodos?

6.- En

Ia

OCDE

b.ttp

:

www.oecd.org) hay un capitulo dedicado al tema de seguridad alimentaria. i Que

tipo de aspecto preocupa mas a Ia OCDE?

7

.-

iQue norma ASTM

b.ttp:

lwww.astm.org) tendrias que consultar para realizar un ana/isis de oxido

de cobre-I en tintas?

8.-

iEn

que esta basado el metoda propuesto

par Ia

EPA

b.ttp:

//www.epa.gov/) para determinar aniones

inorganicos en agua potable?

9.- iQue directiva de Ia

UE b.ttp:

europa.eu.int ) aborda el ana/isis de dioxinas y PCBs en piensos?

i Que recomienda esta directiva?

10.- i Como define Ia precision y Ia exactitud de un metoda bioanalitico Ia FDA b.ttp: lwww.(da.gov/)?

(una pista, busca validacion)



ema

:

ntro< ucc n

a

a

., momema

l

3.- CONCEPTOS FUNDAMENTALES

DE

LA

TEORiA

DE LA

INFORMACION: ERRORES, PRECISION Y EXACTITUD

Todas las decisiones que tomamos estan basadas en datos y el acierto de una decision depende de

Ia correcta interpretacion de estos datos. Un cientifico, al seguir el "metoda cientifico" busca disefiar un

experirnento que le proporcione los datos necesarios para aceptar o rechazar una hipotesis. El profesional

de una empresa recaba datos de composicion para aceptar o rechazar un lote de materia prima, o para

reformular un producto, o para cualquier otra cuestion, pero siempre se apoya en datos. El precio de

numerosos productos naturales e industriales se fija en funcion del contenido en ciertas sustancias, cuya

medicion puede resultar compleja, en fm, en un largo etcetera de actividades hay decisiones que deben

tomarse en funcion de datos obtenidos en un laboratorio o instrumento quimico de medida.

Silos

datos

fueran inequivocos tamar una decision seria facil, sin embargo, esto no

es

asi: los resultados

de

un

proceso analitico no son inequivocos, sino que existe una cierta probabilidad de que no coincidan

totalmente con los valores reales, por toda una seriede razones que vamos a estudiar. Las distintas causas

que pueden hacer que un resultado no concuerde exactamente con el valor cierto son analizadas,

clasificadas y tratadas por Ia teoria de los errores y

de las medidas repetidas.

3.1.- Errores exactitud

y

precision

resultado

i

i

incertidumbre

R

±

t

t

exactitud precision

t

t

Crasos Sistematicos Aleatorios

El grado de acuerdo entre el resultado de un

analisis y el valor cierto (el valor que es

aceptado como cierto) de composicion es lo que

denominamos exactitud. Dicha exactitud puede

verse alterada, de acuerdo con Ia teoria de

errores, por dos tipos de errores, los

denominados errores crasos y los denominados

errores sistematicos.

Un error craso es el resultado de un accidente o confusion fortuitos, por ejemplo el derrame de un

liquido,

Ia

confusion de un bote de reactivo, un error de transcripcion. Son errores que pueden ser

facilmente detectables por su magnitud (solo en un sistema bien organizado, clara) y se resuelven

repitiendo el analisis. Afectan a Ia exactitud. No son achacables al metoda de analisis, sino a un analisis o

tanda de analisis

en

concreto. Aparecen

de

forma fortuita y son, en principia, hechos muy poco

frecuentes. Su estudio e interpretacion puede realizarse a partir de

Ia

teoria de probabilidades y existen

una serie de tests especialmente diseiiados para detectar este tipo de errores.

La

probabilidad de

ocurrencia de estos errores es dificil de conocer durante Ia puesta en marcha de unmetoda de analisis, ya

que para medirla hacen falta tiempos muy largos de estudio y series muy grandes de datos. Sin embargo,

un laboratorio que realice con frecuencia un cierto tipo de analisis y lleve un sistema de control y archivo

adecuado, puede hacerse al cabo del tiempo una buena idea de su frecuencia

de

aparicion y

de

los

factores que en ello inciden.

La

frecuencia de aparicion de este tipo de errores esta ligada a Ia

complejidad y grado de manualidad del trabajo, y al nivel de organizacion dellaboratorio. Cuanto mas

largo y complicado sea un proceso de analisis,

y

cuanto mas desorganizado sea el trabajo de un

laboratorio tanto mas probable sera que se produzca un errorde este tipo.

Ejemplo. Un laboratorio que realiza un ana/isis de forma automatizada, ha llegado a

a

conclusion de que

I de cada 75 veces, hay un error en a introducci6n de muestra. Cuando ocurre esto, el sistema introduce entre un

2 un 90 menos de ana/ito en el sistema analitico, lo que produce un error

por

defecto de entre el 20 el 90

del resultado total. Puesto que los ana/isis se realizan por duplicado, t,cual es a probabilidad de que el

laboratorio de un resultado err6neo?



16

V Ferreira ·

AI realizarse los ana/isis

por

duplicado, detectaremos Ia presencia de dicho tipo de error si observamos

una divergencia de mas del 10 entre los valores de las replicas. Tan solo podria pasarnos inadvertido un error

de este tipo, si el fallo del inyector ocurre de forma simultanea en las dos replicas Y ademas fuera de Ia misma

magnitud). Esto ocurrira 1/

75/

de las veces. Por tanto, Ia probabilidad de que

el

resultado vaya afectado de

dicho error craso sera inferior a/

0,

17por mil.

Un

error sistematico ( o determinado) es aquel que introduce una desviacion del resultado frente

al valor real como consecuencia de un paso del analisis defectuoso:

por

ejemplo una

mala

calibracion,

una interferencia, adsorcion y perdida de analitos por almacenar las muestras en recipientes inadecuados.

Como puede verse, no son errores fortuitos, sino que si no se corrigen afectaran aproximadamente por

igual a TODAS las muestras que se analicen siguiendo el mismo protocolo (por eso se Haman

sistematicos). Tienen un signo defmido (haran que los resultados se desvien del valor real por exceso o

por

defecto ). Se Haman sistematicos porque afectim a una parte del sistema de medida, o sea a un metodo

de analisis (p.e. un metodo de analisis que no tenga en cuenta

la

existencia de

una

interferencia) o a su

implantacion concreta en un laboratorio (p.e.

Un

laboratorio que tenga contaminado el patron de

referenda, o que tenga mal calibrada la balanza). Afectan a Ia exactitud. (afectan al resultado

directamente . Algunos errores sistematicos se corrigen mediante una calibracion, pero otros requeriran

distintas acciones correctivas que pueden implicar el cambio de m6todo o incluso de tecnica.

Por

ejemplo, los errores sistematicos consecuencia de contaminaciones en los materiales o

reactivos requieren el analisis de lo que se denomina blanco de analisis para poder detectarse y

corregirse. Finalmente, hay otros errores sistematicos cuyo descubrimiento y correccion son bastante mas

complicados. Se trata de errores asociados a Ia contaminacion del propio patron (que solo se corrige

conociendo su pureza), a Ia presencia de interferencias (cuya correccion muy probablemente requiera el

cambio de metodo , o a Ia presencia de lo que denominamos efectos de Ia matriz (

cuya

presencia se

detecta y corrige con mucho esfuerzo mediante una tecnica de calibracion denominada adicion estandar).

ncertid

ur

bre

La

incertidumbre se refiere al grado de claridad de nuestro conocimiento.

En

ausencia de

incertidumbre cualquier conocimiento no admite matices y tiene contomos perfectamente defmidos. En el

caso de

un

resultado analitico, sino hubiera incertidumbre un resultado de 26,0 mg/L seria estrictamente

26,0000000

mg/L

y lo podriamos considerar diferente de otro de 26,01 mg/L.

En

presencia de

incertidumbre, no es que dudemos de Ia veracidad, sino que admitimos que nuestro conocimiento no tiene

una claridad total, que existe un pequefio intervalo en tomo a nuestro resultado

en

el que es igualmente

probable que se encuentre

la

respuesta real. Por eso hablamos de precision de nuestro metodo de analisis

o de nuestro resultado.

25 26 27

I

) ~

I

I I I I

) . ~

Un mundo sin incertidumbre nuestro

conocimiento sabre cualquier resultado

o medida tiene claridad absoluta

2 5

\,

7

I

I.. ...

~

Un mundo con incertidumbre nuestro

conocimiento sabre cualquier resultado

admite que n sus cercanias es

probable que se encuentre el valor

cierto

La existencia de incertidumbre es una ley natural, y en el limite particular viene expresada por el

principio de Incertidumbre de Heissenberg, que establece que nuestro conocimiento sobre un sistema

particular nunca puede ser total, ya que al medir debemos interaccionar sobre nuestro sistema, lo que

provoca su cambio de estado. Este concepto puede chocar con algunas de nuestras experiencias con Ia

medicion, sobre todo si nos hemos desenvuelto desde el comienzo en

un

entomo digital. AI tomar el peso



QUiMIC N LiTIC AV NZ D

tema 1: lntroducc i6n a Ia (..?mmwmetria

1

I

de un objeto de forma repetida, la balanza arroja el mismo resultado, lo que falsamente nos puede hacer

creer que no hay incertidumbre en esta medicion.

La

hay, lo que pasa

es

que en este caso es muy

pequefia, para detectarla solo tendremos que emplear una balanza mucho mas precisa.

En realidad, el proceso de medicion debe ser considerado como un proceso de reduccion de la

incertidumbre (mejora de nuestro conocimiento) del sistema objeto

de

la medicion. Antes

de

realizar la

medicion nuestra incertidumbre sobre la composicion de un sistema puede ser muy grande (aunque casi

nunca es infmita). Tras la medicion, nuestra incertidumbre acerca del conocimiento de ese sistema se

hace menor.

En

todos los casos incertidumbre hace referenda al intervalo de valores

en

el cual esperamos

que se encuentre el verdadero resultado de la medicion. Este intervalo de valores sera tanto mas estrecho

(y la incertidumbre sera menor) cuanto con mas cuidado realicemos la medicion, esto es, cuanto mas

control ejerzamos sobre el proceso de medicion. Este aumento del control requiere complicar y encarecer

de forma progresiva el proceso de medicion, lo que implica que debe alcanzarse siempre un punto de

equilibrio en el que el esfuerzo invertido proporcione la reduccion de incertidumbre imprescindible para

que el resultado de la medicion sea util. Una incertidumbre mas pequefia de la realmente necesaria

siempre supone un sobreprecio innecesario. Por el contrario, una incertidumbre mayor de la requerida

puede arruinar la fmalidad del analisis.

Un ejemp/o, en una determinacion volume/rica est(mdar (cuya incertidumbre o prec ision en terminos relativos se

situa en torno a 0.5-1 ), Ia pesada de muestra suele estar entre 0,1 y 1 g y

se

realiza en una balanza

analitica cuya precis ion es de ±0, 0001 g. La incertidumbre de Ia pesada en terminos re/ativos es

por

tanto

menor de un 1

por

mil, suficiente para considerarla despreciable frente a otras fuentes de incertidumbre

(por ejemplo Ia determinacion del

punto

final). No tendria sentido emplear

una

ba/anza de alta precision

(hay balanzas con precisiones ±0, 00001 g e inferiores), que es mucho mas cara y en Ia que Ia medicion es

mas lenta. Pero tampoco tendria sentido emplear un granatario (cuya precision se situa

en

torno a ±0,OJ g),

ya que esto aumentaria de forma indebida Ia incertidumbre del ana/isis.

La teoria cientifica asocia la incertidumbre a la existencia de unos errores denominados aleatorios

o indeterminados. El termino error no se maneja aqui como sinonimo de equivocacion, sino de

introduccion de error o incertidumbre. Un error aleatorio es aquel que introduce una desviacion del

resultado consecuencia de nuestra incapacidad para controlar todas las variables que afectan a nuestro

proceso de analisis. Los errores aleatorios se deben tanto a la variabilidad, temporal y/o espacial, del

sistema material que estamos estudiando ( errores

de

muestreo ), como a la imprecision del sistema de

medicion. Los errores aleatorios hacen que aumente la incertidumbre de un resultado, esto es, que se haga

mas amplio (difuso) el intervalo de valores en el cual sabemos que esta el valor real. Por esta razon no

tienen signo defmido y se denotan con un ±.

El control de estos errores es fundamental para

Ia

toma de decisiones y para el disefio de los

sistemas analiticos. Por ello los objetivos

de

este capitulo son comprender las razones de su existencia,

aprender la forma de medirlos, conocer en

que medida afectan al grado de conocimiento del sistema a

estudio y de que manera pueden mantenerse bajo control. Veamos un ejemplo que aclara a donde

queremos llegar y la importancia de su control.

El departamento de medio ambiente del ayuntamiento de una gran ciudad informa de que el contenido de oxidos de

Nitrogeno en la atmosfera es de 2,5 ppm. La medicion se realiza mediante unos sensores situados en media docena

de puntos de la ciudad y el promedio de los valores da la citada cifra de 2,5 ppm. l Cmiles son las posibles fuentes

de error de este resultado y como afectan a su credibilidad . ·

fuente de error

los sensores estan mal calibrados

los sensores no dan una respuesta constante

los sensores estan colocados en puntos de la ciudad que no son

representativos

tipo de error

Sistematico

( analitico)

Aleatorio

( analitico)

Sistematico (de

muestreo)

afecta a

exactitud

precision

exactitud



18

los sensores

estin mal aislados termicamente y

su

respuesta depende

de la temperatura del dia

solo se recogen las mediciones a las 8 de la maiiana

en

una

zona de

la

ciudad hay

un

compuesto que produce

una

sefial

interferente

por muy representatives que sean los puntos de analisis en realidad

solo representan una fraccion infima de toda la atmosfera urbana

un sensor se estropea y arroja medidas erroneas

Aleatorio y

sistematico

analitico)

Sistematico de

muestreo)

Sistematico

analitico)

Aleatorio de

muestreo)

Craso

V Ferreira ·

precision y

exactitud

exactitud

exactitud

precision

exactitud

Tanto

los

errores

crasos

como

los sistematicos se

pueden

eliminar o al

menos reducir) siguiendo

un

trabajo riguroso y

empleando

metodos de analisis bien conocidos. Los errores

aleatorios

siempre

existiran y haran

que

el resultado tenga una cierta incertidumbre. Esta incertidumbre afecta a las

decisiones que

tomamos en base

a

los

resultados, como

lo

demuestran las siguientes

cuestiones:

Supongamos que

la

incertidumbre del resultado del ejemplo anterior fuera 1 ppm esto quiere decir que, evaluadas

las posibles fuentes de error aleatorio, el valor real de concentracion

se

encuentra con probabilidad en el intervalo

resultado obtenido±1 ppm). Si el nivel toxico de los oxidos deN es de 2,7±1 ppm, l,accionarias la alarma? l Y si

fuera la incertidumbre de ±0,001 ppm?

Reducir Ia

incertidumbre

cuesta

esfuerzo

y dinero. Una

forma obvia de reducir

Ia

incertidumbre

en

Ia

toma de muestra es

colocar

mas

sondas

en muchos puntos de

Ia

ciudad,

pero

esto

implica una

mayor

inversion

en

sondas

y un

mayor esfuerzo derivado de

Ia recolecci6n y manipulaci6n

de

un

conjunto

mayor

de

datos y del mantenimiento

de

un

sistema de medida mas complejo.

Si el nivel toxico fuera 100 ppm,

no

tendria mucho sentido invertir dinero para que la incertidumbre del resultado

fuera 0,001 ppm. l,Cual es la incertidumbre que mejor se adapta al coste y a las necesidades?

Todas estas cuestiones las iremos resolviendo en esta secci6n.

1°.- Clasifica los siguientes errores en las categorias craso, sistematico y aleatorio:

a) l matraz de aforo utilizado en un ana/isis contenia en realidad 250, mL (en Iugar de 250,

0

debido

a haber sido conge/ado.

b

En un ana/isis dado se estan utilizando disolventes organicos de tension superficial, viscosidad y

densidad muy distintas a las del agua. Se emplea material volumetrico normal (disenado y calibrado

para trabajar con disoluciones acuosas). Se observan los siguientes fen6menos:

1.- Quedan gotitas de disolvente agarradas a las paredes del material volumetrico.

2.- No ocurre lo anterior, pero el volumen remanente en la punta de la pipeta es casi nulo.

c) Tras realizar una medida en un instrumento cientifico, percibes que

Ia

celda (del detector) se

encuentra a una temperatura de trabajo incorrecta.

d AI concentrar una muestra por evaporaci6n del disolvente, se observa que e l ana/ito que se esta

analizando se co-evapora perdiendose parte. Haces cinco experiencias y encuentras que la cantidad

perdida es el 25, 26, 30, 24, y 22 .

e) Se desea determinar el contenido en Fe de un vag6n de piritas, y

Ia

sonda con que

Ia

que se extrae

Ia

muestra del vag6n es excesivamente estrecha, de forma que los trozos de mineral mas grandes no cab en

(el contenido en mena de un mineral no es el mismo

en

particulas grandes que en las pequenas) .

f En el caso anterior,

Ia

sonda es del tamano adecuado. l vag6n contiene 30

Tm

de mineral y se extrae

una muestra de 1

Kg

para su ana/isis.



... ..

; .: ,; ,

:

1 bis.- Enumera y clasi.fica seg Un su importancia relativa todas las fuentes de incertidumbre que puede

haber

en l

determinacion de:

a tu

propio peso

b el contenido en Sn de una aleaci6n

c Ia temperatura de un habitaci6n

d las dioxinas presentes en el

gu

de un rio

e las dioxinas presentes en un tipo de productos alimenticios

3.2. Control de

a

exactitud

Para controlar la exactitud de un trabajo analitico son precisas tres cuestiones:

a) Que la muestra sea representativa del objeto y propiedad a estudio

b) Que el metodo de amilisis escogido tenga una exactitud adecuada y a ser posible, contrastada

c) Que la aplicacion del metodo a las muestras en nuestro laboratorio se realice de forma

adecuada y con garantia de calidad

La representatividad de la muestra se define como el grado de acuerdo entre la propiedad de la

muestra tomada y la del objeto o sistema material que representa. Esto es, la representatividad de la

muestra es la propiedad equivalente a la exactitud del resultado. Su medicion

es

dificil,

ya

que no

disponemos de sistemas materiales grandes de composicion controlada, lo que explica que se dedique un

gran esfuerzo al estudio de los sistemas de muestreo que proporcionan mejores resultados y que muchos

de los sistemas de muestreo esten regulados por ley como habras podido comprobar en los temas

legislados por la Comunidad Europea, ministerio de Sanidad y Consumo, ministerio de Industria .. ).

La exactitud de un metodo de analisis se determina en los estudios de validacion del metodo, que

veremos con algo mas de detalle en el Tema

4

Los estudios de validacion tienen como objeto verificar

que la sefial es proporcional a la cantidad de analito, determinar el rango de concentraciones en que se

verifica dicha proporcionalidad, verificar que la constante de proporcionalidad no cambia de muestra a

muestra efectos de la matriz), que no hay interferencias, y determinar

cual debe ser la funcion de

calibracion. En general, los metodos de analisis tienen una exactitud asociada, como

ya

discutimos en el

epfgrafe 2 de este capitulo. Esto quiere decir que hay metodos que son mas exactos que otros, bien

porque emplean una tecnica mas exacta de por si, o porque son menos sensibles a cierto tipo de

interferencias. Ahora bien, la exactitud de un metodo no

es

un absoluto, sino que es un atributo que

depende de la muestra y del problema analitico concreto. La aplicacion de un metodo conocido a un

nuevo tipo de muestras o de problemas analfticos requiere verificar que su exactitud sigue

manteniendose. ·

Otro parlimetro relacionado con la exactitud de los metodos de analisis es la robustez, que se

defme como la resistencia al cambio de la sefial al cambiar alguno de los parlimetros de analisis. Este

termino sera defmido con mayor precision posteriormente y aqui solo haremos un uso intuitivo del

mismo. Hay metodos analiticos que son muy robustos,

16

que significa que su aplicacion a un laboratorio

concreto no representa mayores problemas. Por el contrario, hay metodos analiticos muy poco robustos

que requieren un elevado control de las condiciones operacionales y ambientales, un elevado

adiestramiento de los operadores de laboratorio y un esfuerzo de calibracion muy riguroso. La

transferencia de un metodo poco robusto de un laboratorio a otro puede ser muy costosa.

La

exactitud del trabajo de un laboratorio concreto que emplea un metodo previamente validado)

se puede verificar mediante el uso de muestras certificadas, de estlindares quirnicos, por comparacion con

metodos contrastados oficiales o estlindares), o mediante ensayos

de

colaboracion. Se mide comparando

el

resultado medio

con el valor real. La forma mas directa es, desde luego, el uso de una muestra

certificada, aunque no existen muestras para todos los problemas posibles. Una muestra certificada es una



20

V Ferreira ·

muestra tipo cuyas propiedades de composicion son perfectamente conocidas. Por ejemplo, una muestra

de polvo de granito con contenido certificado en Estafio. Las muestras certificadas son producidas

por

alguno de los organismos de acreditacion y normalizacion y se pueden adquirir solicitandolas a dichos

organismos, o bien a alguna empresa especificamente dedicada a ello (podnis encontrar un directorio

en

la pagina http://www.labcompliance.com/ref-compounds/suppliers.htm). Los dos organismos mas

importantes que producen muestras certificadas son el americana y el europeo, cuyos datos se facilitan a

continuacion.

''National Institute

of

Standards and Technology (NIST) , que produce mas de 1200

SRM

(Standard Reference Materials) URL: http://ts.nist.gov/srm

Bureau Commounaitaire de Reference (BCR) - Certified Reference Materials; Institute of

Reference Materials and Measurements (IRMM) http://www.irmm.jrc.be/

Otros, Laboratorio del Government Chemist , http://www.lgc.co.uk/; Laboratorio Nacional de

Ensayos (Francia), http://www.lne.fr/.

Para que el trabajo de un laboratorio sea satisfactorio, es preciso que la organizacion y forma de

trabajo del mismo se ajusten a una serie de normas de calidad. n particular, es preciso que ellaboratorio

garantice que la

sefi al

de analito obtenida en el analisis de

una

·muestra se pueda relacionar de forma

inequivoca con la sefial de estandares de concentracion perfectamente conocida. A este concepto se le

denomina TRAZABILIDAD del resultado. Para garantizar la trazabilidad del resultado es preciso

introducir todo el sistema analitico en un sistema de calidad (proceso de acreditacion de un laboratorio o

de un metodo particular). Este proceso puede ser largo pero supone determinar cuales son los puntos

criticos del sistema y establecer los controles de calidad y de verificacion que se consideren pertinentes,

ademas del establecimiento de una cadena jerarquica, de estructuras de responsabilidad, etc... Puede

considerarse necesario el establecimiento de auditorias extemas (una empresa experta en calibracion que

periodicamente revisa el material de vidrio, las balanzas, instrumentos, etc, ), ademas de establecer

controles propios (muestras de referenda intema, blancos, controles de pesada ...).

Hablaremos con mas extension en el capitulo 4.

3.3.-

edida dea precision

Una

de las consecuencias de la existencia de incertidumbre es que,

por

lo general, cuando

realizamos medidas repetidas de

una

muestra, no obtenemos una serie estrictamente identica de

resultados. El grado de dispersion obtenido

en una

serie de medidas repetidas es una estimacion de la

precision de nuestro metodo. Hay varios parametros que se pueden emplear para medir la dispersion. l

mas importante es la desviacion estandar, ya que esta relacionado con las propiedades matematicas

fundamentales de las distribuciones. La desviacion estandar se denota con S y se calcula con la conocida

formula:

S

n l

[1]

don de i es un dato de una serie de n datos con media

Un

metodo de medida preciso es aquel que va afectado de pocas variaciones aleatorias, por lo que

al repetir un proceso de medicion deberan obtenerse valores muy proximos entre si y consiguientemente,

una desviacion estandar pequefia. Por el contrario, en un metodo impreciso acruan muchas fuentes de

variacion aleatorias (fuera de nuestro control) que hacen que medidas repetidas de un mismo objeto

arrojen resultados dispares y muy disperses. Por consiguiente, la desviacion estandar sera muy grande.

Esta misma observacion es valida para un metodo de muestreo determinado: Un metodo de muestreo

preciso nos proporcionara resultados replicados con una S menor que uno imprecise.

La

desviacion



t:: :

:

.; ;

i

u

lQ

estandar se expresa a menudo como tanto por ciento de

la

media, y entonces se le denomina Coeficiente

de Variaci6n o

RSD

Relative Standard Deviation).

En ocasiones puede ocurrir que la desviaci6n estandar de

una

serie replicada de medidas sea cero.

Esto no quiere decir que la precision analitica sea infmita y la incertidumbre sea cero, lo U nico que quiere

decir es que

la

incertidumbre de dicho proceso de medici6n es muy pequefia y nose ha podido medir.

Ejemplo. AI medir de forma replicada el peso de una moneda cuyo peso real es 0,4500

g

en

un

granatario, se obtiene Ia siguiente serie de medidas: 0,45; 0,45; 0,45; 0,45; 0,45; 0,45. La

media de esta serie es 0,45 y su desviacion estandar

0.

Esto no quiere decir que Ia medicion en

el

granatario

no

tenga imprecision, lo unico que quiere decir es que

su

imprecision es inferior

a 0 01 g y no Ia hemos

podido

medir.

Ejercicios:

2°.- Cinco laboratorios distintos estan realizando un ensayo de colaboracion

en el

que se analizan par

sextuplicado unas muestras certificadas

con un

contenido de 16.5 Jig L-1 de un pesticida organo

fosforado metilparation) . La tabla siguiente resume los resultados obtenidos par los distintos

laboratorios:

A 15,8 15,3 16,3 15,9 16,0

16,2

B 17,9 18,3 18,2 17,9 18,0 18,1

15,1 16,7 17,1

15,9 16,9 16,9

D 12,8 10,9 13,5 11,3 12,0 11,9

E 16 6

16,9

16,4

16 6 16,5 16,4

Empleando Ia media y Ia desviacion estandar de cada sexteto de resultados, califica el trabajo

de los laboratorios en cuanto a su precision y exactitud.

iA

que tipos de errores pueden ser debidas las

desviaciones observadas? Representa

en

un eje cada una de las series

de

medidas obtenidas par cada

laboratorio junto con el valor central y Ia desviacion estandar.

3°.-

Un

ingeniero quimico desea conocer Ia concentracion de un

producto

de reaccion

que

se genera en

tres reactores de 200.000L. Para ella toma seis muestras aleatorias de distintas

partes

de cada reactor y

las analiza

par

un metoda analitico

muy

preciso. Los resultados

que

obtiene en las seis muestras de cada

reactor son los siguientes:

A 15,8 15,3

16 3

15,9 16,0 16,2

B 17,9

18,3 18,2 17,9 18,0 18,1

c

15,1 16 7 17,1 15,9 16,9 16,9

iCual es el reactor que produce mayor rendimiento? iCual es el que genera un producto de

calidad

mas

uniforme?

iA que piensas

que

pueden

deberse las diferencias encontradas? iCual es Ia

diferencia entre Ia variabi lidad aleatoria) analitica y Ia muestral?

4°

La

siguiente tabla muestra los resultados obtenidos en Ia medicion repetida de Ia Absorbancia de una

muestra. Construye

el

histograma correspondiente a

Ia

distribucion de los resultados y calcula

su

valor

central promedio) y su dispersion desviacion estandar).

medida valor medida valor medida valor

1

0.341 7 0.347 13 0.363

2 0.335 8 0.346 14

0.353

3

0.347

9

0.343

15

0.

348

4 0.359 10 0.342

5

0.353 11 0.356



22

V Ferreira ·

6 0 346 12

0 350

3.4. Distribuciones de resultados. Distribuci6n normal propiedades

En las series de medidas repetidas las distribuciones de resultados que se obtienen no siguen

distribuciones caprichosas, sino que se pueden observar distribuciones tipo en funcion de Ia naturaleza de

los factores causantes de Ia desviacion. De todas las distribuciones tipo Ia mas importante es Ia

distribucion normal o de Gauss. Otras distribuciones de resultados posibles son Ia log-normal, Ia

distribucion binomial y la de Poisson.

La distribucion normal o gaussiana es una distribucion simetrica en

Ia

que el suceso mas probable

es el central, y Ia probabilidad de ocurrencia de un hecho disminuye de forma exponencial conforme nos

alejamos del centro. Esta distribucion es Ia que mejor representa

Ia

distribucion posible de resultados

afectados por una serie de fuentes aleatorias de incertidumbre, tal y como ocurre con los resultados

proporcionados por un metodo analitico. Esta observacion puede considerarse una verdad empirica acerca

de la naturaleza general de la realidad. En la figura siguiente se muestran cuatro distribuciones gaussianas

tipicas.

N(30,1 2)

- - - - - - - - - - - - - - - ~

- - - - - - - A ~ - - - - ~

:E

0,6

-1-- ------ - -----------1

c

0

a

o 4 ---------'- \-'- 'rJ+-------

- -------,1---\------l

0 10 20

30

40

Figura 5: Ejemplos de distribuciones gaussianas

Cada una de las distribuciones viene defmida por tan solo dos parametros, que son los que

figuran entre parentesis. El primero es el que denominamos centroide y coincide con el centro de la

distribucion y valor maximo, y el segundo es el que denominamos

a

(sigma) o desviacion tipica de

Ia

distribucion. Este parametro es el que determina la anchura de Ia distribucion tal y como puede verse por

comparacion entre las cuatro distribuciones. El significado de estas distribuciones es el siguiente: Si

tuvieramos un metodo de analisis cuya precision fuera ±1,2 y analizaramos repetidamente (infinitas

veces) una muestra cuyo valor de composicion real fuera 30,0, obtendriamos una distribucion de

resultados como la indicada por la gaussiana N(30,1 '2). De acuerdo con esta distribucion, el valor que

obtendriamos un nfunero superior de veces es 30,0, y el 50% de los valores serian superiores a 30,0 y un

porcentaje similar serian inferiores a 30,0. Como puede verse de forma aproximada en Ia figura,

practicamente todos los valores estarian comprendidos entre 26 y 34. Por el contrario, si nuestro metodo

tuviera una precision de ±3,0, la distribucion de resultados esperada seria la marcada como N(30,3). En

esta distribucion el valor mas probable sigue siendo 30,0, y de nuevo el 50% de los valores son

superiores a este valor, y el otro 50% inferiores. Sin embargo, puede observarse que el intervalo en que se

encuentran la mayor parte de los valores es muy superior (aproximadamente entre

21

y 39), siendo

relativamente probable encontrar valores como 24 o 36

Estas distribuciones no solo pueden describir la distribucion de resultados potenciales de un

analisis de precision conocida, sino que tambien pueden describir

Ia

distribucion del valor de un cierto

atributo en una poblacion. Por ejemplo, si tenemos un lote

de

pastillas de un farmaco que deben contener

30,0 mg de principia activo por pastilla, es mas que probable que no todas las pastillas tengan



,

f \ 1 ~ 1 \ L l l l \ f \

~ L i t i - 1 . / ' \

LCHH:l 1 l .UU

UUUt...\ .lUll

a

\ {U1111lVUlto..U.

JU

exactamente 30,0 mg, sino que apareceni una distribuci6n parecida a alguna de las de la figura, mas o

menos ancha segful sea la homogeneidad dellote.

L,Siempre

aparece una distribuci6n gaussiana?

No. Hay ocasiones en las que no aparece una distribuci6n gaussiana, pero esto siempre es debido

ados

posibles razones. En primer Iugar, existe la posibilidad de que los datos no pertenezcan a una unica

misma serie (poblaci6n). Par ejemplo, si en el caso del metoda analitico en el que has analizado

repetidamente una muestra certificada, este analisis se realiza en dos dias distintos y el metodo se

descalibra, obtendrias una distribuci6n suma de dos distribuciones. Lo mismo ocurriria si el late de

pastillas incluyera pastillas producidas por dos fabricantes distintos. Este efecto se puede observar en la

figura siguiente. Observa que la distribuci6n de resultados suma de las dos distribuciones individuales es

marcadamente asimetrica. Decimos que los resultados no se distribuyen de forma normal.

1,2

g

0,8

g

:g 0,6

.c

[ 0,4

0,2

0

0 10

20

sum

\

I\

\ N(32'5,1

5

N 30,1 ,2)

h \

}

30 40

Figura

6:

Una funci6n suma de 2 gaussianas de distinto centro noes una gaussiana

Existe una segunda posibilidad. Hay ocasiones en las que son otras distribuciones de

probabilidad las que aparecen. Por ejemplo, en distribuciones de atributos que par naturaleza no pueden

ser simetricas aparece una distribuci6n muy importante denominada log-normal. Este es el caso de la

distribuci6n del atributo peso en la poblaci6n humana. Esta distribuci6n no puede ser simetrica ya que

sabemos que siendo el peso medio 70Kg, existen individuos cuyo peso es superior a 140Kg, pero no

pueden existir individuos con peso negativo (que tendrian que existir para que la distribuci6n fuera

simetrica). La distribuci6n del peso tiene que ser una distribuci6n asimetrica con una cola hacia la

derecha, tal y como muestra la figura

7.

Sin embargo, la distribuci6n dellogaritmo del peso si que es una

distribuci6n normal (par eso se llama log-normal).

0,4

0,35

0,3

0

0,

25

;g

0,2

:c

0,15

c

e

c

0,1

0,05

0

-0,05

10 20 30

Figura

7:

Otras distribuciones importantes

Otras distribuciones importantes son la de Poisson, que es la que

se

obtiene cuando un hecho es

poco frecuente. Por ejemplo, podriamos obtener una distribuci6n de ese tipo al muestrear particulas de

mineral con distinto contenido en mena y ganga. Habria una composici6n media, pero algunas particulas



24 V Ferreira ·

que tuvieran mas mena que ganga darian contenidos muy superiores. Otra distribuci6n posible es Ia

binomial, que es Ia que aparece cuando hay dos sucesos posibles (por ejemplo, blanco o negro) cada uno

con una probabilidad asociada, y realizamos extracciones de N elementos.

Una

comparativa de estas

distribuciones se puede

ver

en Ia figura 7.

Aparte de porque se trata de una distribuci6n natural , Ia distribuci6n gaussiana es muy

importante porque Ia mayor parte de los tests estadisticos estan basados en esta distribuci6n o en otras de

ella derivada. Ademas, y como veremos posteriormente, bajo ciertas circunstancias , incluso

distribuciones marcadamente asimetricas pueden ser convertidas en distribuciones normales.

Por

todas

estas razones es vital para cualquier cientifico (mas para aquel cuyo trabajo este relacionado con datos y

mediciones) el comprender y saber manejar las propiedades de esta distribuci6n.

La formula de Ia distribuci6n gaussiana es Ia siguiente:

Las poblaciones distribuidas normalmente se caracterizan por el valor central de

Ia

distribuci6n,

f.l

y por su desviaci6n estandar poblacional,

cr

, que determina Ia amplitud de Ia distribuci6n.

En

dichas poblaciones se cumple que:

aproximadamente 2/3 (67%) de todos los individuos estan en el intervalo f.l±cr

aproximadamente el 95% de todos los individuos estan en el intervalo f.l±2cr

aproximadamente el99,7 de todos los individuos estan en el intervalo f.l±3cr

0,35

0,3

C 0,25

;g 0,2

:c

8

0,15

:

Q .

0,1

0,05

0

15,9%

___;

/

_ / f

0

/ \

\

\

15,9%

6

\

5 0

\

2 3

J.L 2a

Figura :

r

o

pied d

es de las distribuciones normales

Todas las distribuciones normales cumplen las propiedades anteriores, independientemente de

cuales sean su centroide y desviaci6n tipica.

De hecho, todas las distribuciones normales son exactamente iguales si se normalizan de Ia

siguiente manera: Para cada punto de Ia poblaci6n normal se calcula el siguiente parametro que

denominamos z:

X -

f 1

Z

=

[3]

a

Este parametro no es mas que Ia distancia al centroide normalizada por Ia desviaci6n tipica de Ia

distribuci6n (distancia al centro normalizada por el error) y si ahora para cada z representamos su

probabilidad de ocurrencia, obtenemos Ia distribuci6n normal estandarizada o distribuci6n z.



(. , U M CA

AN AL CA

A V

ANL. A J A

ema muoauccwn a

a

., m m :ana

Distribuci6n

nonnal

estandar

045

.z

.........

/ '

'

\

\

,

\

/

\.,

/

: .

.........

-5

-3 -2 -1 2 4 5

Figura

9:

Distribucion normal estandar

La ecuaci6n de la distribuci6n normal estandar es la siguiente:

1

(

z/{

p y) =

2

[4]

-

Lo que nos muestra, tal y como se ve tambien en la figura 9, que la distribuci6n z es una

distribuci6n normal de cr=l y centroide f-1.=0.

Cualquier hoja de calculo o paquete estadistico nos permite conocer cual es el porcentaje de

individuos de dicha distribuci6n que se encuentran a una cierta distancia z del centroide.

La tabla de z

adjunta a este material tambien permite conocer este valor. De manera similar, es posible conocer el

porcentaje de individuos que se encuentra en un cierto intervalo, simetrico o no, en tomo al centroide.

Ejemplo. En la distribucion N(30,1 '2) que manejamos anteriormente, el 67 de los elementos se

encuentran en torno a 30±1,2, y el 95 de los elementos en torno a 30±2,4. Si queremos saber

cuimtos elementos (que porcentaje) son mayores de

32,

es preciso hacer el siguiente calculo. La

distancia

a[

centroide es 2. Esta distancia expresada en unidades de sigma es la que denominamos

z yes z=211,2=1,67. Buscando en la tabla zen lafila de z 1,6, columna 0,0

7

se obtiene un valor

0,0475, lo que quiere decir que un 4, 75 de elementos son mayores de 32. Si desearamos conocer

la proporcion de elementos que estan en el entorno 30±2, solo hay que descontar los que estan a

la derecha de

J-L

+1,6a- (4 ,75 ) y los que estan

ala

izquierda de

J-L-1,6a-

(4

7

5 ),

por

lo que el

90,50 de elementos se encuentran en el intervalo pedido.

En

general, el intervalo simetrico que ·contiene a un cierto porcentaje de individuos en tomo al valor

central se calcula con la ayuda de la tabla y la formula,

x=p±za- [5]

Conocido este intervalo podemos inferir que si de la poblaci6n normal extraemos al azar un elemento, la

probabilidad de que se encuentre

en

el intervalo anterior es la asociada a z.

SO.- Si el nivel diario de impurezas de un deposito de agua se distribuye de forma normal con una media

4,

0 giL y con una desviacion estandar

0,

3 giL:

a)

;,Que porcentaje de dias encontraremos una concentracion comprendida entre 3,7y 4,3 giL?

b);, Y entre 3,4 y 4,6 giL?

c);, Y que porcentaje de dias encontraremos un nivel de impurezas superior a 4,9 giL?

6°.- Si un metodo para la determinacion de Cloruros en agua tiene una precision de

0,

02 giL y

analizamos un estandar certificado de 1,28 giL; ;,Cual es la probabilidad de que por causas puramente

aleatorias obtengamos un valor inferior a 1,24 giL?



26

V Ferreira ·

r.-

La poblacion de marcianos tiene un tamano que se distribuye norma/mente con media 6 em y

desviacion estandar 1. 1 Cual es Ia probabilidad de que el primer marciano que encuentre Ia NASA tenga

un tamano comprendido entre 5 y

7

em?

3.5. Teorema del limite central

La

siguiente propiedad fundamental de las poblaciones normales es

la

conocida como

teorema

del limite central

Esta propiedad establece que si de una poblacion dada con valor central

J l

y

desviacion

cr

extraemos grupos de n elementos y determinamos

su

media la nueva poblacion formada

por las medias de dichos grupos se distribuye tambien de forma normal con

un

valor medio

J l

y con una

desviacion

cr/...Jn.

Esto es

la

distribucion de las medias tiene el mismo valor central y una dispersion que

se ha reducido en un factor

Jn

Por ello en la distribucion de las medias se cumple que:

- aproximadamente 2/3 de todas las medias de n individuos estan en el intervalo f.J±cr

J

n

- aproximadamente el 95 de todas las medias de n individuos estan en el intervalo f..l±2cr/...Jn

- aproximadamente el99,7 de todas las medias den ind ividuos estan en el intervalo

f.J±3cr/...Jn

- en general el x de todas las medias de n individuos estan en el intervalo

f.J±zcr/...Jn

donde z es

un valor que se encuentra tabulado en tablas estadisticas.

Lo que se expresa de manera analoga a como hicimos anteriormente mediante la formula:

8°.-

1

Cuales seran las nuevas

J1

y a de los niveles semanales (en Iugar de diarios) de impurezas del

deposito de agua del problema 4 JL 4,0 y a= 0,3 giL)?

9°.- 1 Cual es el intervala de concentraciones que se espera que se encuentren los niveles de impurezas

del deposito el 95% de las semanas?

10°.- Si los marcianos del ejercicio via} an siempre en grupos de cuatro, 1 cual sera Ia probabilidad de

que

Ia

media de tamano del primer cuarteto encontrado par Ia NASA sea inferior a 5 em?

El teorema del limite central tiene una consecuencia practica de gran importancia para la

medicion: Es posible regular

la

incertidumbre de un resultado controlando el nfunero de mediciones

replicadas realizadas sobre una misma muestra o en su caso controlando el nfunero de incrementos

muestrales extraidos de un sistema para estimar su composicion media.

Ejemplo. Si

Ia

imprecision de un metoda de ana/isis es de 10 ppm (a=10 ppm), un resultado de ana/isis

de una muestra dada en el 95% de los casas contendra al valor real de composicion de dicha

muestra en el intervalo x±2a.

sta

quiere decir, que si el resultado es, par ejemplo, 220 ppm,

tenemos el 95% de probabilidad de que el valor real de

Ia

muestra este en el intervalo 220±20. Si

par

el contrario, realizamos 4 ana/isis de dicha muestra (lo que denominamos replicas) , enemas

el 95% de probabilidad de que el valor real de

Ia

muestra este en el intervalo

220±(20/raiz(4))=220 ± 5. Hemos reducido Ia incertidumbre del resultado en unfactor 2.

10bis.- Si se desea conocer el contenido media en co/estero de un late de alimento producido en un

proceso continuo de variabilidad 10 , con una precision superior al 1 , 1 cuantas muestras de alimenta

tendre que tamar? Nota: Debe suponerse que Ia imprecision analitica es despreciable.



tema ntro< ucc n a a

~ m m w m e m a

Observa que estamos diferenciando la precision del metoda de analisis de la incertidumbre del

resultado. Igualmente, estamos diferenciando entre la precision de un

metoda de muestreo y la

incertidumbre de la muestra fmal recogida.

Un segundo efecto de gran importancia que se observa en las distribuciones de las medias de

poblaciones que no se distribuyen de una forma normal es que la distribucion de las medias es siempre

mucho mas normal que la distribucion de partida y tanto mas cercana a la normal cuanto mayor es el

nllinero de elementos que componen la media.

Esta aflrmacion puede ser ilustrada con algunos ejemplos.

En

primer lugar consideremos la

distribucion derivada dellanzamiento de un dado. Se trata de una distribucion uniforme con 6 resultados

posibles y equiprobables. Bastante lejos de una distribucion normal. Si lanzamos el dado dos veces y

sacamos la media del resultado obtenido, la distribucion deja de ser uniforme, ya que algunos resultados

son mas probables que otros como consecuencia del juego de combinatoria.

Par

ejemplo, el resultado 1

solo se obtiene si tanto el primer dado como el segundo sacan

1.

Su probabilidad es 1/36 (ya que hay 36

resultados posibles).

Par

el contrario, el resultado 3,5 se obtiene con mas combinaciones de dados

(1

y 6,

2 y 5, 3 y 4, 4 y 3, 5 y 2, 6 y 1) . Su probabilidad es 1/6. Si lanzamos el dado 5 veces,

el

nllinero de

resultados posibles es 5

6

= 15625 par lo que la probabilidad de sacar un 1 ( o un 6) pasan a ser

practicamente nulas mientras que la probabilidad de ocurrencia de los hechos centrales es superior.

Tambien muchas distribuciones marcadamente asimetricas se convierten en distribuciones

simetricas muy similares

ala

normal. Considera el ejemplo de una distribucion tipo Poisson, como la que

se obtiene al muestrear particulas de un mineral que contiene particulas de mena y particulas de ganga,

siendo las prim eras 999 veces mas frecuentes que

las

segundas. Si extraemos al azar 1000 particulas (que

podrian ser las que caben en la punta de espatula que empleamos para pesar y comenzar el analisis) , el

nllinero de particulas de mena presentes en el analisis sigue una distribucion muy sesgada denominada

distribucion de Poisson que es la que se ve en la flgura

9-1

mostrada a continuaci6n. Como puede verse,

aunque la media de la distribucion

es

1, la probabilidad de extraer 0 particulas es exactamente igual a la

de extraer 1, que representaria el

1lnico

resultado correcto. Extraer dos particulas pasa aproximadamente 2

de cada 6 veces (dariamos un resultado doble del real), y extraer 3 ocurre todavia un 6,

1%

de las

ocasiones.

Extrocci6n de 1000

portlculos

2 replicas

0,4

0,3

0,35

0,25

-

0,3

0,25

r-

11

0,2

-

-

:

i 0 2

0 15

r- r

0,1

0,05

r-

r

l l

0 15

-=-

-

-

::

0,1

-

-

-n n

,05

r -

- -

0

0 1 2 3 4

5 6

7

8

g

10

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

•

4,5

5

5,5

n• partfculas men

n• med io de partfcula s de men

Figura

10-1

Figura 10-2

10 replicas

2

replicas

0 14

0,1

0,

12

0,09

0,08

11

0,1

0 08

:

0

1 5

itn- llnn

0

G.

0 )4

n i l ~

,02

0

11 0,07

:

0,

06

i

0 05

g 0 04

a

ooJ

n1

0,02

n1 11

0,01

, nil IIII I

0

'

,'1- ,' >

\.

'

,'?

,' >

~ < ? ~ 1 '

~ ' ?

'

' "'

'

'

• med io de partfcul sde men

n•

med

io

de

partfculas

de

m

n

Figura 10-3

Figura 10-4



28

V Ferreira ·

Si este analisis lo replicarnos (esto es, para carla muestra de mineral realizarnos dos

determinaciones que comienzan cogiendo 1000 particulas carla una). La distribucion de resultados

posibles pasa a ser la mostrada en la figura 9-2, si realizarnos 10 replicas del analisis, la distribucion de

resultados (expresada como nfunero de particulas de mena carla 1000 particulas) seria la que

se

muestra

en la figura 9-3, y si lo replicararnos 20 veces, obtendriarnos la distribucion de resultados mostrados en 9-

4. Las dos ultimas distribuciones de resultados son muy parecidas a la normal, a pesar de que dado el

ejemplo escogido, se trata de distribuciones discontinuas. Como quiera que sea, su consecuencia es de

gran importancia practica,

ya que si realizarnos el nfunero suficiente de replicas, la distribucion de

resultados va a ser normal. Esto refuerza la importancia de esta distribucion y de su uso practico.

3.6.- Intervalos de confianza

La introduccion de la distribucion z nos esta permitiendo conocer de antemano en que intervalo

en tomo a un valor medido, o a una media de valores medidos, esperarnos con una cierta probabilidad

que este contenido el valor real. Esto es un gran avance,

ya

que desde que introdujimos el concepto de

imprecision e incertidumbre hablarnos de la existencia de un intervalo de valores en el cual acepto que

existe una probabilidad de que se encuentre nuestro valor real. Ahara podemos darle extension numerica,

y lo unico que hacemos es darle la vuelta a la formula

-

( j

- ( j

=

J 1

± z Fn ,para pasar a

J 1

= ± z Fn

[7]

Estos intervalos se denominan intervalos de confianza de una media o de un valor.

Esta idea puede ser explotada para saber si una media o un valor son normales , o si por el

contrario, son tan poco probables que lo

mas seguro es que procedan de una poblacion distinta. Esto se

utiliza directarnente en la toma de decisiones.

Par ejemplo, en el deposito de agua de los ejemplos anteriores, sabemos que de forma natural, el

99, 7

de las semanas el nivel de impurezas estara en el intervala 4, 0 ± 0, 34 giL que es el intervala de

confianza de la media semanal del

99, 7 ).

Si una semana en particular encontramos un nivel de

impurezas de 4, 5 giL sabemos que es tan poco probable que de forma natural se encuentre un

nivel tan alto

(Ia

sabemos despues de estudiar dicho sistema durante mucho tiempo, obviamente),

que es practicamente seguro que ha pasado alga en el sistema; como que se han obturado los

filtros,

a

que el metoda de ana/isis esta fallando;

par

lo que el data nos indicaria que debemos

iniciar alguna acci6n al respecto.

1JD Sabemos que un matraz aforado de 2 mL tipo B tiene una tolerancia que podemos asimilar

ala

desviaci6n de la poblaci6n) de 0, 03 mL. Deseamos saber si el matraz se ha descalibrado par su usa.

Para ella lo aforamos con agua densidad 1,0000 glmL) y determinamos supeso: 20,0610 g. ;,Cual es la

probabilidad de que el matraz se haya descalibrado?

3.7.- distribuci n t

La

cuestion siguiente es que en ocasiones no conocemos los parametros que defmen a la

poblacion.

n

realidad es justarnente al reves: si mido es para averiguarlos. Esto nos obliga a estimar la

desviacion estandar poblacional,

cr

a partir de la desviacion estandar de un numero limitado de

mediciones, s (desde el punto de vista practico, podemos considerar

a

como una s con mas de 50 grados

de libertad). Ahora bien, al realizar esta estimacion aumenta mi incertidumbre, por lo que cuando manejo

desviaciones estandar, s,

ya

no puedo emplear la distribucion normal, sino una muy parecida que se

denomina funcion de distribucion t. Para comprender su origen y uso es conveniente que resolvamos

primero el siguiente ejercicio:



(.)U M CA

ANAL CA

A V

ANLAUA

ema

:

muoaucc n a a

. m omema

bis.- ;,Que tipo de distribuci6n se obtiene si de una poblaci6n que en cierto parametro se distribuye de

forma normal (con centro

J

y desviaci6n tipica

CY ,

extraemos n elementos, calculamos su media y

calculamos el cociente

para cada extracci6n aleatoria

den

elementos?

Resulta obvio que la distribuci6n que se obtiene es la distribuci6n z, o distribuci6n normal

estandar,

ya

que el panimetro anterior es justamente la distancia de cada media al centroide de la

distribuci6n normalizado por la desviaci6n (en este caso de las medias).

Pues bien, si en la formula anterior reemplazamos

cr

por s, se obtiene Ia distribuci6n t. Esto es, t

es l a distribuci6n estadistica derivada de Ia distribuci6n normal que aparece cuando de una poblaci6n que

se distribuye de forma normal, extraemos n elementos, calculamos su media y su desviaci6n estandar y

representamos

la

distribuci6n de probabilidades del panimetro t calculado segun

j l

X

t

[8]

f n

Como se puede apreciar en la ecuaci6n anterior, t es un parcimetro de distancia al centroide

normalizada

por

el error, de manera exactamente amiloga a z.

Lo

que ocurre es que en el caso de t el error

se estima por s/raiz(n), mientras que en el caso de z (para una media) el error es cr/raiz(n)

La

forma de la distribuci6n t es muy s imilar a la de la funci6n normal, si bien siempre es mas

ancha, y se obtiene una distribuci6n t para cada n. Esto es, si de la poblaci6n normal extraemos grupos de

2 elementos, calculamos su media y su desviaci6n estandar, obtenemos la distribuci6n t con un grado de

libertad (el nUII1ero de grados de libertad de s es n-1 .

En

esta distribuci6n el intervalo que contiene al

95 de los elementos de la poblaci6n es ±12,7 (frente a 1,96 de

la

distribuci6n z). Si se realizan

extracciones de 3 elementos, se obtiene

la

distribuci6n t con 2 grados de libertad, en la que el 95 de los

elementos estan en el intervalo ±4,3, si de 4 elementos la de 3 grados de libertad (±3,18), y asi

sucesivamente. Si se extrae un

nUII1ero

muy grande de elementos la distribuci6n t se superpone a la z

(ya

que s tiende a cr cuando n tiende a

oo

.

lPor que la distribuci6n t es siempre mas ancha que z? Porque el numerador del cociente que

defme a t es el mismo que el que defme a z, pero en el denominador t depende de s. S es un estimador de

cr, cr es fijo, pero s puede variar tanto mas cuanto menor sea el numero de grados de libertad de

su

estimaci6n. Esto implica que s puede ser mas pequefio (y mas grande) que sigma, lo que hara que valores

de t grandes sean probables. En la figura 11 se muestran distribuciones t de distintos tamafios que ilustran

este efecto.

..

..

g

:a

•

a

e

Q.

I

:F:\.

,1/.

,//1

.\\

l ;

\\

~ : <

..

f

:

..

/

-

~

-" r

1

t

0

z

·

de 1

--tde2

t

deS

-tde50

dens

idad z



30

V Ferreira ·

Figura

11

Las dos expresiones que defmen los resultados mas probables de una determinacion para una

medida y para una media) se convierten en:

x = J1 ± ts [9] para un linico dato, y x = J1 ± t n [10] para una media

Y las correspondientes expresiones de los intervalos de confianza de

una

media o de

un

valor se

convierte en las expresiones:

J1 = x ± ts [11] y J1 = x± t n [12], respectivamente.

n estas formulas,

t

depende tanto del nivel de probabilidad empleado al igual que z) como del

nfunero de medidas que hay amos empleado en Ia estimacion de s: en realidad del nfunero de grados de

libertad empleado en el calculo de s

=no

de medidas empleadas

-1 .

12°.- En Ia determinacion de Sn en un vegetal, seis determinaciones han dado los siguientes resultados

(expresados en ppm): 24,4; 24,0; 24,1; 24,3; 24,2; 24,5 ;,Cwil es el intervalo de valores en el que existe

un 95 de probabilidades de que se encuentre

Ia

concentracion real de Sn en el vegetal?

La media es 24,25 ppm, y

Ia

desviacion estandar 0,187 ppm. El numero de grados

de

libertad es

el numero de datos empleados en

Ia

determinacion de s menos 1, esto

es,

5. Para un 95 de

probabilidades y 5 grados de libertad, el valor de t es 2,571 (el valor de z era aproximadamente 2 . El

intervalo de confianza de

Ia

media es par tanto ±ts/

J z

± 2,571 0,1871 J6 ± 0,196 ppm. Par tanto

en el intervalo comprendido entre 24,05 y 24,45 tenemos un 95 de probabilidad de que se encuentre el

valor real de Sn.

Como

ya

establecimos anteriormente, Ia amplitud del intervalo depende del nfunero de

mediciones, por lo que se puede regular el nivel de incertidumbre de nuestro resultado con el nfunero de

mediciones replicadas realizadas, o con el nfunero de muestras extraidas. En el caso de Ia distribucion t,

al aumentar el numero de mediciones tambien aumenta el nfunero de grados de libertad del calculo de s,

par lo que t para un mismo nivel de confianza es menor.

13°.-t,Cuimtas mediciones mas del vegetal anterior tendrias que r_ealizar para reducir

Ia

longitud de este

intervalo a

Ia

mitad?

14°.-t,Cual es

Ia

diferencia existente entre JlY

x 1

Y entre

CYy

s?

1

Tiene sentido dar signa a

CYo

s? ;,Par

que?

1

Yunidades?

15°.- Nos dice el analista que el contenido de un colorante en un alimento es de 5 ppm.

1

Que mas datos

necesitamos para conocer Ia precision del data?

1

Ypara Ia exactitud?

16°.- En un Espectrofotometro de Absorcion Atomica estamos midiendo el contenido en Cu de un

mineral. Obtenemos los siguientes valores de Absorbancia:

0,546; 0,560; 0,576; 0,551; 0,556; 0,549;

;,Cual es el valor media,

cualla

precision, y cuales los intervalos de confianza al 95 y al 99 . ;,Que

quieren decir estos parametros?

17°.- Un quimico necesita hacer unos ana/isis de un producta industrial que se encuentra en varias ppm.

El

error tolerado es de 1,0 ppm. En una muestra patron ensayada 10 veces se obtienen los siguientes

resultados:



..

:: : :

U U U ~ \ ; 1 U H

i: a

.uuuu

u

t

25,8; 26,3; 25,0; 24,9; 25,6; 25,9; 26,2; 25,3; 25,5; 25,0

a) 1 Cucintos datos tendrci que tamar cada vez para tener Ia conjianza P=O ,05) de que el valor real

se

encuentra en el intervalo requerido?; b) 1 Y si el error tolerado fuera de 0,3 ppm?; c) 1 Y si siguiera

siendo de 1,0 ppm pero se requiriera el 99,9 de probabilidad?;

d)

t,Despues de esto que pensarias al

descubrir que

el

analista

para

ahorrar tiempo solo tomaba uno de los datos?

18°.- Se tomo Ia temperatura en puntas distintos de un bio-reactor, dando los siguientes resultados: 33,0;

33, ; 32,5; 33,9t,Cucil es

Ia

temperatura real del reactor con sus intervalos de confianza a/95 y a/99 ?

19°.- t,Bajo que circunstancias podemos conocer el intervalo de conjianza de un ana/isis del que solo se

ha realizado una replica?

La cuestion planteada en el ejercicio 19 es de gran importancia para la Quimica Analitica, ya que

a menudo los analisis son caros y dificiles de replicar. Suele ser comlin entre los quimicos no muy

familiarizados

con

la quimiometria pensar que si no se han hecho replicas de una medida, no es posible

obtener

una

estimacion de su incertidumbre. Seglin esta concepcion

no

tendria valor realizar analisis con

una linica replica. Esto es cierto, sin embargo,

tan

solo en el caso de que no se tenga realmente ninguna

estimacion de Ia incertidumbre, lo cual ocurre las primeras veces en que se emplea

un

metodo de analisis.

No hay que olvidar, sin embargo, que muy a menudo

si

que disponemos de

una

evaluacion de

la

incertidumbre

con

base

en

Ia experiencia previa y que como dijimos en la introduccion, los metodos

analiticos se hacen funcionar de forma semicontinua para formar autenticos sistemas analiticos de los que

estamos siempre aprendiendo.

Cuando empleamos una distribucion t es porque asumimos que no tenemos

un

conocimiento

preciso de

la

desviacion tipica de

la

poblacion y manejamos

una

s, desviacion estandar, que es una

estimacion de a con n-1 grados de libertad. Dicha estimacion puede servir para mediciones subsiguientes

siempre que

sea

razonable pensar que ambos sets de datos proceden de

una

poblacion con identica sigma.

Esto es, si al poner en marcha un metodo de analisis en ellaboratorio se realiza un estudio de su precision

analizando de forma replicada 6 muestras, las obtenida vamos a llamarla s

1

puede considerarse que es

una estimacion de la precision

del

metodo con 5 grados de libertad. Si se emplea ese metodo para analizar

una

segunda muestra con resultado x

2

,

y no se tienen razones para pensar que Ia precision del metodo

vaya a ser diferente en esa segunda muestra, se puede y debe) aprovechar la estimacion anterior de la

precision para establecer los intervalos de confianza de esta segunda medicion:

De

la misma manera, si a continuacion se analiza una muestra 3 y en esta ocasion se realizan dos

replicas de media x y desviacion s3), podria pensarse que la expresion del intervalo de confianza para

el resultado obtenido en

su

analisis viene defmida por:

Donde t

se mide con un grado de libertad, lo que haria que el intervalo de confianza fuera muy

ancho. Sin embargo esta aproximacion no es correcta, ya que obvia el conocimiento previo de sigma que

tenemos. Si s

3

y s

1

son ambas estimaciones de la misma a,

no

hay razon para emplear la que es

una

estimacion mas debil basada en menos grados de libertad). Seria mas correcto escribir entonces:

Observa que el nfunero de grados de libertad de t siempre se corresponde con el de s, y raiz de n se corresponde con el nfunero

de mediciones empleadas para obtener Ia media).



32

V Ferreira ·

n realidad, y como veremos posteriormente, si tanto s

3

como s

1

son ambas estimadores de la

misma desviacion tipica (con 5 y 1 grados de libertad, respectivamente), lo mejor que podemos hacer es

combinarlas para obtener una s combinada con 6 grados de libertad, de forma que nuestro conocimiento

mejore.

Los intervalos de confianza nos pueden servir tambien para detectar la presencia de errores

sistematicos. Gracias a ellos podemos decidir con una probabilidad adecuada si una media de resultados

esta alejada de un valor real o no de forma significativa.

20°.-

El

analista del ejemplo 17, introduce algunas semanas despues una disoluci6n de concentraci6n

conocida C= 25,3 ± 0,1 ppm proveniente de una muestra certificada, y encuentra los siguientes datos:

26,2; 25,3; 26,8; 26,0; 26,1; 26,3; 25,8

t,Se puede afirmar la existencia de un error sistematico?, ;,Con que grado de confianza? ;,Que

decision debe tomarse?

3.8.-

Presentaci n de resultados

n

la practica real, tanto si se han obtenido en

un

sistema analitico de precision conocida como si

se han obtenido de un metodo poco conocido, los resultados no se suelen presentar empleando la

expresion del intervalo de confianza en funcion de t ni en funcion de z. En la practica se suele dar el

resultado medio como una estimacion del valor verdadero y una estimacion de la precision del metodo en

forma des ode

cr

segful el conocimiento que tengamos del metodo. Es preceptivo indicar el numero de

elementos que componen la media, y el

nl1mero de

grados de libertad con que se conoce s (como

indicamos con anterioridad, si el nl1mero de grados de libertad es superior a 50, entonces s y a son

practicamente coincidentes). Si el resultado es la media de varias replicas en ocasiones no se da la

desviacion estandar, sino el parametro s/raiz(n) o cr/raiz(n), que se conoce como error estandar de la

media. n estos casos se pueden presentar los resultados como

Resultado=media ± error estandar

de

la media

En cualquier caso, y al no existir un convenio universalmente aceptado, debe explicarse el que se

esta empleando.

El valor medio tiene que escribirse con un numero de cifras significativas que sea coherente con

la precision del experirnento. Si se incluyen cifras significativas de mas, no solo se dificultara la lectura y

la interpretacion, sino que inducira a pensar que los resultados tienen una precision mayor de la que en

realidad tienen. Si se incluyen cifras significativas de menos se perdera informacion de forma

injustificada.

l Que entendemos por cifras significativas? Las cifras de un resultado que conocemos con certeza

suficiente. Si obtenemos un resultado 16,5412 ppb y nuestra incertidumbre es ±1,3, debemos expresar el

resultado como 16,5

i. Por

que? Porque aceptamos que nuestro intervalo de confianza tiene una extension

de ±1,3 unidades y su centro

lo

situamos en 16,5. Si lo situamos en 16, nos distanciamos

innecesariamente media unidad del centro mas probable. Si

lo

situamos en 16,54 lo estamos situando con

una precision muy superior a la que en realidad somos capaces, lo cuallleva a engafio. Siguiendo con el

mismo razonamiento, si nuestra incertidumbre es ±0,13, el resultado debe expresarse como 16,54. Si

nuestra incertidumbre es ±0,013, lo escribiremos como 16,541.

Observa que el nl1mero de cifras significativas no coincide con el nl1mero de cifras decirnales.

Por ejemplo, el resultado anterior expresado en ppm es 0,0165, 0,01654 o 0,016542, segnn sea la

precision. Esta es Ia utilidad de Ia notacion denominada cientifica, en la que las cifras significativas se

incluyen como prefijo y se afiade un exponente para indicar Ia posicion de la coma. n los tres casos

anteriores, el resultado en notacion cientifica seria 1,6 10

2

; 1,65 10·

2

y 1,654 10·

2

ppm, respectivamente o

1,6 10

; 1,65 10

y 1,654 10

•



ema

:

m roauccwn

a

a

., mwmema

El mantener la coherencia de las cifras significativas nos obligani a prescindir de algunas cifras

obtenidas en nuestras mediciones y en ocasiones a redondear. Ambas cosas deben realizarse

exclusivamente al presentar los resultados. Nunca debe prescindirse durante los ca.lculos previos de cifras

cuya falta pudiera afectar al resultado. En la pnictica esto quiere decir que para los calculos debemos

preservar tantas cifras como las significativas mas dos.

21°.-1, Tiene sentido

sis

=

0,01 ppm, escribir

el

resultado como 2,0263 ppm?

1,

Y como 2 ppm?

En cuanto a las desviaciones estandar y las incertidumbres, no tiene sentido expresarlas con mas

de dos cifras significativas. La razon es clara: una desviacion estandar es una medida de la incertidumbre

de una medicion, es por naturaleza un ±algo. Por ejemplo 13,2±1,1 tiene sentido y nos indica que la cifra

3 oscila una unidad y algo mas, pero 13 ,2± 1,12 no tiene sentido, ya que no tenemos en realidad ninguna

posibilidad efectiva real de conocer la segunda cifra decimal ( cuarta significativa) del resultado.

AI

expresar la desviaci6n estandar o la incertidumbre en forma relativa, la cuestion se simplifica.

Si nuestra imprecision es superior al 10 , solo podremos dar dos cifras significativas. Si esta entre 1 y

10 , podremos dar 3, y si esta entre 0,1 y 1 , podremos dar 4.

3.9.- Propagacion combinacion de errores

Cualquier resultado analitico tiene una incertidumbre y error fmales que son consecuencia de las

incertidumbres y errores cometidos en cada uno de los pasos del analisis. Es necesario conocer como se

suman

o

propagan) los errores sistematicos o aleatorios de cada una de las etapas para determinar tanto

cual es la incertidumbre o error fmal esperados, como en cual de las etapas del analisis debe realizarse un

mayor esfuerzo para disminuir la incertidumbre o el error fmal.

Los errores se propagan de una forma muy diferente si son aleatorios o sistematicos, puesto que

los ultimos tienen signa defmido y los primeros

no.

Si al realizar una medida se realizan una serie de

operaciones aditivas (o consecutivas) que introducen cada una un cierto error aleatorio, el error aleatorio

fmal no es la suma de los errores aleatorios cometidos en las distintas operaciones, sino que son las

varianzas (

2

las que son la combinacion lineal de las varianzas.

220.-

Se tiene una bureta cuyo error de lectura que podemos asimilar a CY es

±0

02 mL,

1,

cual es el error

introducido

par

la bureta en una valoraci6n?

Hay que recordar que en la bureta se realiza la operaci6n de lectura dos veces: una cuando

enrasamos a cera y otra cuando tomamos el volumen consumido. l error total es debido a las dos

operaciones:

cr

2

=

cr

2

+

cr

2

= 0 02

2

+

0 02

2

= 0 0008=>

cr

= 0 028 mL

, , . , ,

Nos interesa particularmente conocer cual es la incertidumbre de un metoda de analisis en

funcion de la incertidumbre introducida en las distintas etapas del analisis. Veamos lo que ocurre en una

cierta determinacion volumetrica. Como ejemplo supongamos que pesamos

0,1 g de muestra, se afora a

100

mL,

se pipetean 10

mL

de muestra y se consumen alrededor de 20 mL de agente valorante.

Supongamos tambien que la Normalidad del agente valorante es conocida con una gran precision

(incertidumbre despreciable) y que el error de viraje es nulo. La incertidumbre del resultado de la

valoracion

es

funcion de las incertidumbres introducidas en la operacion de pesada, aforo, transferencia y

valoraci6n.

1.

Incertidumbre de la pesada: Podemos asimilarla a la incertidumbre de lectura, que para

una balanza analitica normal es de ±0,0001

g.

2. Incertidumbre del aforo: Podemos asimilarla a la tolerancia del matraz, que para un

matraz aforado de 100

mL

de clase B es de ±0,2 mL

3. Incertidumbre del pipeteo: Podemos asimilarla ala tolerancia de la pipeta, que para una

pipeta normal de 10

mL

de clase B es de ±0,04

mL.



34

V Ferreira ·

4. Incertidumbre de Ia

valoraci6n: Con los condicionantes previamente descritos, podemos

asimilarla al error de lectura ya calculado en el ejercicio 22, ±0,028 mL.

Para combinar todas estas incertidumbres debemos pasarlas primero a desviaciones relativas, ya

que se encuentran en unidades

no

homogeneas y posteriormente sumamos sus cuadrados

ya

que se trata

de errores aleatorios

. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Inc.Global=± (

0

•

0001

]

2

0

•

2

]

2

0

•

04

]

2

0

•

028

]

2

= ± ~ 1

+0,002

2

+0,004

2

+0,0014

2

=±0,48

0,1

100 10 20

Este resultado nos indica que la incertidumbre de la operaci6n global (expresado como RSD( )) es el

0,48 y que pnicticamente toda la incertidumbre se

ha

introducido en la e tapa de pipeteo.

23°.- Calcula el efecto que sabre la precision global tendria en el caso anterior: a) sustituir

Ia

pipeta de

tipo B (tolerancia ±0,04)

por

una tipo A (tolerancia ±0,02),· b) sustituir el matraz aforado tipo B

(tolerancia ±0,2)por uno tipo A (tolerancia ±0,

1).

Este mismo razonamiento puede aplicarse para el calculo de la incertidumbre de una operaci6n de

medida compuesta de una toma de muestra y de una determinacion analitica.

23bis

0

Si estamos determinando cual es el contenido media en Sn de un carnian cargado de casiterita y

para ella empleamos un metoda analitico cuya

cr

es 1 g/Kg y ademas sabemos que el metoda de muestreo

empleado tiene una

cr

de 3 g/Kg,

1

cual es el error aleatorio que se comete al extraer una muestra y

analizarla una vez?.

24°.- Expresa de forma precisa el significado de cada una de las crdel ejemplo anterior.

Cuando lo que queremos determinar son los errores sistematicos, el error de la medida fmal es la

suma de los errores sistematicos cometidos en las etapas individuales (recuerda que los errores

sistematicos tienen signo). El calculo hay que hacerlo con cuidado, ya que es facil confundir los signos.

Ejemplo. En una determinacion volumetrica la pesada de muestra se realiza con un error sistematico del

-1 (por una mala calibraci6n de la balanza) y el aforo a volumen con un error

del 1

(por

una mala calibraci6n del matraz aforado). Determina cual es el error del resultado si el resto

de la valoraci6n (pipeteo, titulaci6n y calculo de los equivalentes) ya no va afectada de mas

errores.

Un error sistematico del -1 en la pesada, quiere decir que la masa medida es un 1 inferior

a la real. Un error sistematico del +1 en el aforo a volumen, quiere decir que el volumen

contenido en

el

matraz de aforo es un

1

superior al nominal. Veamos como afectan estos

errores

al numero de equivalentes de ana/ito presentes en la alicuota de muestra analizada:

Si tomamos una mas a real de 100

mg, Ia

lectura de Ia balanza sera de 99 mg; Esta mas a se

disuelve ahara en un matraz de 100 mL nominales, que contiene en realidad 101

mL.

A

continuaci6n se taman por ejemplo 10 mL de este volumen y se valoran con agente valorante,

dandonos un resultado de

X mequivalentes. Nuestro resultado sera que Ia cantidad total de

equivalentes seran 1OXpresentes en 99 mg de muestra.

Sin embargo, el numero de equivalentes presentes rea/mente seran 10,

IX

en 100 mg de

muestra. El error final cometido es:

q

1

0 / J 1 l c

1

)

'

E=JOX/99-JO,JX/100= (10/99-10,1/JOO)X= (0,10101-0,JOJ)X= 1,01

J0-

5

X

E(O/o)=l,OJJ(J

/0,101

X

100 = 0,01

;::: 0

I

Esto es, el Error relativo final es aproximadamente Ia suma de los errores relativos.

Si el matraz de aforo tuviera un error del -1 , el resultado seria sin embargo un error por

exceso del

2,

03 . Calculalo como ejercicio.

E -

\0

1 \l y

) ,_

1

y

'



..

ema

: lnlTUUUl:l:IUH

a a

\,lUlliiiUIIlt;U

1<1 J J

25°.- Si en la determinacion del contenido de Pb de un maiz se introduce un sesgo (error sistematico) en

la etapa de muestreo del maiz de 2,2 ppm. Y que el metoda analitico empleado, esta mal calibrado,

introduciendo un error p r exceso

de 1,1

ppm.

1,Cual

es el error sistematico total del resultado?

Otra situacion de combinacion y propagacion de errores que debemos considerar es aquella en la

que el resultado analitico depende de uno o varios datos o parametres que son procesados con un

operador matematico. Por ejemplo, para calcular la densidad, nos apoyamos en dos datos la masa y el

volumen), y dividimos el dato del primero por el segundo. Un segundo ejemplo, la Absorbancia es en

realidad el logaritmo de la Transmitancia, que a su vez es el cociente de los dos parametres medidos I e

1

0

•

Existen muchos casos de este tipo y nos interesa conocer como un error aleatoric en uno de los

parametres se transmite al resultado

fmat

Para ello es preciso echar mano del calculo diferencial, y averiguar como una variacion en un

parametro x, afecta a mi resultado y, que es fun cion de x.

y=f x)

una variacion diferencial en x, introduce la siguiente variacion en y:

d y ~ d x l

Ahora bien, como las varianzas estan relacionadas con el cuadrado de las variaciones:

por lo que

a

=

(:)'a;

[ 4]

Esto es, como era de esperar, la imprecision en el parametro x se transmite al resultado fmal a

traves de

la

derivada de la funcion con respecto a x al cuadrado.

En el caso mas general, si un resultado analitico es dependiente de m factores xi de acuerdo con la

expresion:

y = f X1,

X2

XJ...Xm),

una variacion diferencial en cada uno de los factores, introduce una variacion en el resultado dada por:

dy =l

1

dx

dxm

bY

I, lo que conlleva que la varianza del resultado se relaciona con la

tlxl tlx2 &m

varianza de cada factor seglin:

siempre que los factores m sean independientes solo en este caso podemos despreciar los productos

cruzados que aparecerian al elevar al cuadrado la expresion diferencial.

La

aplicacion de la expresion anterior a distintas relaciones matematicas entre y

y

x nos lleva a

las expresiones que se muestran en la tabla mostrada en la pagina siguiente.

26°.- En los metodos opticas, lo que se mide rea/mente es el porcentaje de luz absorb ida

p r

Ia muestra

(I = Trcmsmitancia), pero el parametro que manejamos p r ser lineal con

Ia

concentracion es

Ia

Absorbancia, que se define como A =-logT. Calcula el interval

a

en el que

Ia

desviacion estandar relativa

es minima.

1

Que implicaciones tiene esto?

27°.- Se h de determinar una constante de reparto de un equilibria de extraccion de un ana/ito entre dos

fases. Para ella medimos las concentraciones en el equilibria

de

ana/ito en ambas fases. Para Ia

determinacion del ana/ito en fase organica se emplea un metoda

de

RSD conocida del

10 .

Para Ia



6

V Ferreira ·

determinacion

enf se

acuosa se emplea un metoda

de

RSD del 5 . ;,Cual

es Ia

imprecision (en RSD) de

Ia

determinada?

27bis.- Aplica

Ia

expresion p r deducir que

Ia

varianza de una poblacion de medias de n elementos

(que se distribuyen norma/mente con sigma

Ci

es igual a

Ia

varianza de

Ia

poblacion original reducida

en n

TIPODE

RELACION

y

= X1 X2

y

= X

X2

y

X1 X2

y

= X1 X2

y=log x

I

FORMA

DE

LA

INCERTIDUMBRE



tema

:

ntro ucc n a

a

, m metr a

j

4.- TESTS DE SIGNIFICACION

4.1.- Concepto

y estructura

general

Como hemos vista en las secciones anteriores, la existencia de lo que denominamos errores

aleatorios no nos permite conocer con absoluta certeza el valor real de un panimetro. Mas bien hemos de

conformarnos con delimitar un intervalo mas o menos estrecho en el que dicho valor real se halle con una

cierta probabilidad. Este hecho repercute fuertemente en todos los procesos de toma de decision y los

convierte en procesos relacionados con el calculo

de

probabilidades. Desde el punta de vista conceptual

esto supone un vuelco que es muy importante meditar y comprender: Las casas no van a ser ya blancas o

negras, sino que

diremos que algo es blanco si Ia probabil idad de

que nolo

sea a partir de los datos

observados, es despreciable. El investigador es quien delimita lo que considera despreciable o no.

Siempre habremos de admitir la probabilidad de que los datos observados sean fruto de la variabilidad

aleatoria.

En la actualidad, los procedimientos mas utilizados para realizar el contraste de hipotesis son los

denominados test o contrastes de hip6tesis , cuya caracteristica mas especifica es que parten de la teoria

de la probabilidad para formalizar una regia de decision entre dos hipotesis complementarias; su objetivo

va

a ser aceptar o rechazar hipotesis cientificas, mediante un razonamiento inductivo de tipo

probabilistico.

Todos los contrastes de hipotesis tienen una estructura similar, y constan de las siguientes etapas:

1) Conocer, en la medida de lo posible, la distribucion de la poblacion.

2) Determinar las hipotesis de la prueba, que seran complementarias:

La hipotesis nula H

0

es la que se establece como verdadera y es la que se aceptara o rechazara. La

hipotesis nula en general establece que las diferencias entre los valores de los datos

se

deben a

causas puramente aleatorias. La hipotesis alternativa H

1

es la complementaria a la nula y par

tanto, se aceptara como verdadera cuando rechacemos la hipotesis nula. La hipotesis alternativa

par tanto, establece que las diferencias entre los valores observados NO se deben a causas

puramente aleatorias, sino que se de ben a la existencia de un factor con efecto.

3) Eleccion del nivel de significacion y el estadistico de prueba. El nivel de significacion a. nos

marca el error maximo del denominado tipo I que estamos dispuestos a admitir. Defme el

porcentaje de la poblacion que elegimos considerar no normal. Si elegimos a.=0,05, estamos

diciendo que aceptamos que un 5 de la poblacion lo vamos a considerar extraiio.

Si

la prueba es

de dos colas, consideraremos normal el 95 central y despreciaremos los 2,5 de los elementos

mas extremos. Si la prueba

es

de una cola, despreciaremos

el

5 mas extrema, tal y como

se

ve

en la figura

11.

La eleccion ·del nivel

de

significacion tiene importantes consecuencias. Si

elegimos a.=0,05, y rechazamos la hipotesis nula, tenemos un 5 de probabilidad de

equivocarnos. Si elegimos a.=0,01 y rechazamos la hipotesis nula, solo tenemos un

1%

de

probabilidad de equivocarnos, pero esta aumentando el riesgo de cometer un error

complementario (error que denominamos tipo II). Luego lo vemos con mas detaile.

El estadistico de prueba ( el tipo de test) es

el

que nos permitira dividir la distribucion muestral en

dos regiones complementarias, la de aceptacion de H

0

y, la de rechazo de Ho y aceptacion de H

1

(denominada region critica).

4) Obtencion de las regiones de aceptacion y rechazo de la hipotesis nula H

0

cuyos valores limites

los determinaremos en las tablas correspondientes segtin el estadistico que hayamos elegido. La

region de rechazo

es

la zona de la distribucion de la muestra cuya probabilidad es menor o igual

al nivel de significacion a..



38

V Ferreira ·

prueba bilateral prueba unilateral

Figura 11

Con esta regia de decision nos podemos encontrar con las siguientes situaciones:

Decidimos

H

verdadera

H

1

verdadera

AceptarHo

decision correcta

Error de tipo T

P error tipo

II =

Rechazar Hoy

Error de tipo I

decision correcta

aceptar H

1

P error tipo I) = a.

a.

:;=Riesgo,

1- = Potencia del test

5) Calculo del estadistico de contraste. Que es el que nos va a permitir aceptar la hipotesis nula, si el

estadistico de contraste se encuentra en la region de aceptacion, o rechazarla, si se encuentra en la

region de rechazo.

6 Conclusiones.

En esta seccion presentaremos los contrates mas usados, dando un enfasis especial a los controles de

exactitud y precision de los resultados y metodos analiticos. Analicemos con ayuda del ejemplo

presentado en el problema 11 la estructura basica de los tests, siguiendo los puntas presentados

anteriormente.

11°.- Sabemos que un matraz aforado de

2

mL tipo B tiene una tolerancia que podemos asimilar a

Ia

desviaci6n de

Ia

poblaci6n) de 0 03 mL. Deseamos saber si el matraz se ha descalibrado

por

su uso.

Para ello

lo

aforamos con agua densidad 1,0000 g/mL) y determinamos supeso: 20,0610

g. ;

Cucil

es

Ia

probabilidad de que el matraz se haya descalibrado?

La forma de trabajar es la siguiente:

En primer Iugar consideramos si la poblacion se distribuye de forma normal o no. No existe

ningUn motivo para que la poblacion no se distribuya de forma normal y asumimos que asi lo hace. en

otros casas mas complejos es preciso aplicar algtin test para verificar la suposicion de normalidad. AI

fmal del presente capitulo veremos algtin tipo de test para verificarlo)

En segundo Iugar, formulamos la hipotesis nula,

lfo.

Esta hipotesis establece que todas las

diferencias son atribuibles a errores de naturaleza aleatoria. En nuestro caso la hipotesis nula es que el

matraz no esta descalibrado, y por tanto la diferencia entre el valor medido 20,0610 g) y el esperado

20,0000) es aleatoria,

ya

que ambos puntas pertenecen ala misma distribucion. De forma simultanea se



tema

:

ntroauccwn a

a

, utm mema

:J:

plantea la hipotesis altemativa, que es que esos dos valores pertenecen a distribuciones distintas, el

segundo a una distribucion de centro conocido e igual a 20,0000, y el primero a una distribucion con

centro diferente.

En tercer Iugar se debe elegir el test estadistico y el nivel de significacion. Puesto que conocemos

la distribucion de la poblacion

J..L=20,0000;

a=0 03

mL),

escogeremos un test z.

En cuanto al nivel de significacion, comunmente se toma el nivel del 95%. Esto quiere decir que

si la probabilidad de que el valor medido pertenezca a la distribucion de referenda es inferior al 5%

(a=0,05), rechazaremos la hipotesis nula. Dicho de otra forma, vamos a considerar tan solo el 95% de los

individuos centrales de la poblacion, y vamos a despreciar como poco normales o poco probables el 5%

de los individuos situados en los extremos, segun se mostro en esquema en la figura 11.

El cuarto paso es determinar las regiones de aceptacion y rechazo de la hipotesis nula. En nuestro

caso, y puesto que hemos decidido realizar un test

z,

lo

que tenemos que determinar es que valores de z

son los que delirnitan el 95% de elementos centrales de la poblacion de los dos sectores (colas) que

consideramos marginales. En nuestro caso z=1,96.

El quinto paso es el calculo del estadistico

de

contraste, esto es, el valor experimental de z. En el

caso que nos ocupa,

lo

que tenemos que calcular es cual es la distancia normalizada en terminos del error

mediante la formula [3].

=X

J

=

0,0610

=

2 03

J 0,03 '

Esto es, nuestro valor se encuentra separado 2,03

a

del valor central y queda por tanto fuera de la

zona de aceptacion, que quedaba confinada para valores de z inferiores a 1 96. En la tabla de la

distribucion z se aprecia que tan solo un 2x0,0212=4,24% de puntas de la poblacion estan separados

tanto (o mas) del valor central. Dicho de otra forma, la probabilidad de que de una poblacion con centro

20,0000 y

a

0,03 extraigamos un valor 20,0610 es inferior al 5%. Par tanto rechazamos la hipotesis nula

y concluirnos que el matraz esta descalibrado. La probabilidad de equivocamos al decir esto es inferior al

5% (lo que se denomina error a o error de tipo que es el error de rechazar una hipotesis nula cierta).

4.2. Errores tipo

I

y tipo II

Habitualmente nos limitamos a fijar el nivel de significacion

a

por lo que podemos no ser

demasiado conscientes de las irnplicacjones reales

que

tiene dicha eleccion, pero veamos que es lo que

ocurre cuando cambiamos deliberadamente el nivel de significacion a. Puesto que defmirnos a como el

error de tipo que estamos dispuestos a asumir, podriamos pensar que trabajaremos mas seguros si

hacemos que a sea mas pequefio. Hagainos a por ejemplo 0,01 en Iugar de 0,05. AI tamar dicha decision,

desde luego que sera mucho menos probable que rechacemos una hipotesis nula cierta, pero estamos

perdiendo precision. Esto se puede ver facilmente con ayuda del ejemplo mostrado en el epigrafe

anterior. Si en el caso anterior a=0,01, entonces el z que delimita las zonas de aceptacion y rechazo ya no

es 1,96, sino que es 2,575. El estadistico de contraste (el z experimental) sigue siendo el mismo, 2,03,

pero en esta ocasion cae dentro de la zona de aceptaci6n de la hipotesis nula. Por tanto, al cambiar el

valor de a estariamos aceptando que nuestro matraz no esta descalibrado.

Lo que ocurre es que en al hacer mas pequefio el riesgo alfa, hacemos mas alto su riesgo

complementario, que se denomina beta, y que es aceptar como cierta una hipotesis nula falsa,

lo

que se

denomina error de tipo II. Ambos riesgos estan ligados y su defmicion exacta escapa del alcance de estos

apuntes.

Tambien podemos especular con lo que ocurriria si decidimos hacer mas grande el error alfa, por

ejemplo 0,1. En ese caso rechazaremos la hipotesis nula mucho mas facilmente, par

lo

que sera muy poco



40

V Ferreira ·

probable que aceptemos una hipotesis nula falsa (error tipo II o error

j3 ,

pero sera mucho mas facil que

rechacemos una hipotesis nula cierta (error tipo o error a .

4.3. Comparacion de una media con un valor conocido mediante el test t

Ademas del test z, que se aplicara siempre que conozcamos la distribucion de partida (siempre

que conozcamos la precision o tolerancia de los metodos o instrumentos analiticos), se emplean otros

tests basados en Ia distribucion t que se aplicaran siempre que la precision o tolerancia tengan que

estimarse en el propio experimento mediante la realizacion de medidas repetidas. Estos tests se

denominan test t.

El problema de comparar medias con valores conocidos es bastante frecuente en quumca

analitica tanto en Ia deteccion de errores sistematicos como en Ia comprobacion de Ia pureza de lotes. Por

ejemplo, hemos comprado un lote de mineral de pureza 67 y queremos comprobarlo tomando una serie

de muestras y analizandolas. Otro ejemplo, hemos puesto en marcha en nuestro laboratorio un metodo

analitico para determinar azufre en carbon y queremos verificar su exactitud mediante el analisis de una

muestra certificada con contenido 1,07 . ·

Para responder a ambas cuestiones necesitamos conocer los intervalos de confianza de los

resultados obtenidos, por lo que sera preciso realizar determinaciones repetidas (de muestras distintas en

el primer caso, de Ia misma muestra en el segundo) para estimar las variabilidades aleatorias (de muestreo

en el primer caso, de analisis en el segundo). Partiendo

por

tanto de un set de n resultados de media X y

de desviacion estandar s,

El

intervalo de confianza viene dado por:

-

x=p±t J;z

y podemos considerar que el valor conocido difiere del valor medido si Ia longitud del intervalo ±ts/..Jn es

inferior a Ia diferencia entre ambos valores. Esto es, si

no

hay posibilidad de que ambos valores esten

en

el mismo intervalo.

En

notacion matematica:

Despejando t

se

tiene:

La

t que aparece a la derecha de la desigualdad es la que se encuentra

en

las tablas al nivel de

probabilidad escogido y con los grados de libertad con que se conoce s. Por tanto, lo fulico que hay que

hacer es verificar si la desigualdad se cumple (se rechaza Ia hipotesis nula y queda probado que hay

diferencias significativas) o no nose rechaza la hipotesis nula).

En la practica, al termino izquierdo de la desigualdad se le denomina t experimental, y a Ia t de Ia

derecha (la tabulada) t critico.

[21]



.

rema

:

muoouccwn a

a .., um :m

Y el test se reduce a que si se verifica que te tc , entonces se rechaza la hipotesis nula y se

acepta la altemativa (hay diferencias).

Te hago notar que lo que has demostrado es que la probabilidad de que las diferencias observadas

sean debidas a causas aleatorias y no a diferencias reales, es inferior a la considerada como nivel de

confianza adecuado (habitualmente el 5%). Otra observacion importante, es que t, como ya comentamos

en su momento, no es nada mas que una medida de la diferencia entre dos parametros (en este caso una

media y un valor conocido) normalizada por el error o imprecision (en este caso s/raiz(n)).

Para aclarar la mecanica resolvamos el ejemplo 21:

En el ami/isis de Ia muestra de referencia, el analista obtuvo un resultado media de

26

,07 ppm, con una

desviaci6n estimdar de 0,46. El valor certificado (conocido) es 25,3 ppm.

El

ctilculo de t experimental

aplicando /a formula anterior, da un resultado de:

t

= l u xi Fn = (26

o7-

25 3

fi

= 4 42

e s ' ' 0,46 '

El valor de t que aparece en las tab/as para el 95 de confianza y 6 grados de libertad es 2 45,

inferior

al

calculado experimentalmente. Esto quiere decir que la probabilidad de que las diferencias

entre el valor conocido y e l determinado sean debidas a errores aleatorios son inferiores a/ 5 . Por

tanto existe una gran probabilidad

>

95 ) de que sean debidos a errores sistemtiticos.

Si se conoce la distribucion de partida, se puede emplear el test z.

28.- Para verificar

si el

matraz aludido anteriormente estti descalibrado, se realizaron replicas de la

medicion, de

forma

que los pesos obtenidos fueron: 20,0610; 20, 0589; y

20

,0623. Aplica el test z

para

verificar la posible descalibraci6n. Aplica tambien el test

t.

Comenta los resultados obtenidos mediante

ambos tests.

4.4. Comparaci6n de dos medias

Este caso es muy frecuente en todos los procesos de toma de decisiones, y particularmente en el

control de los resultados analiticos. Primero porque en la mayor parte de las ocasiones no es posible

disponer de muestras certificadas -estandares- y lo que hacemos es comparar el metodo de uso o nuevo

con un metodo oficial , y segundo porque muy a menudo en un experimento tratamos de estudiar el

efecto que provoca un cambio en algun parametro. En ambas situaciones disponemos de dos conjuntos de

datos (ambos afectados por una imprecision) y tenemos que averiguar si son diferentes o no. El

tratamiento de los datos debe ser distinto seglin si

se

puede considerar que las desviaciones standares -s

de los dos conjuntos de datos son similares o no.

a Son similares:

Se determina una s conjunta a traves de la siguiente expresion:

s= (nt-1) sy+(n2-l)

n1+n2-2

[22]

y se determina la t experimental como anteriormente a traves de la expresion:

te CXt xv

sv

i

+ £ [23]



42

V Ferreira ·

29.- Para la determinacion del grado alcoh6lico se utiliza un metoda basado en la rejlexi6n de

ultrasonidos. Este metoda no es oficial y debe ser calibrado peri6dicamente utilizando el metoda de

picnometria. Para la calibraci6n se analiza un vino 6 veces

par

ambas tecnicas. Los resultados fueron:

Metoda instrumental: 12,21; 12,23; 12,19; 12,26; 12,20; 12,29

Picn6metro: 12,31; 12,27; 12,23; 12,29; 12,32; 12,34

;_Debe volver a calibrarse el instrumento? Nota: Se conoce que las precisiones de ambos metodos son

practicamente iguales.

29bis.- Deduce la expresi6n para el test t anterior basandote en la

forma

en la que se pro

pagan

los

errores.

b) Las varianzas no son similares Nota: La similaridad en este caso se debe evaluar mediante un test

estadistico que veremos posteriormente)

n este caso no es valido realizar una estimaci6n conjunta de la varianza, y la t experimental debe

calcularse de forma directa aunque solo aproximada) a traves de la ecuaci6n:

y el nfunero de grados de libertad puede estimarse con la ecuaci6n:

st

1 = nt nz _

2

g {st

2

nt

ll2

nt 1

nz

1

[25]

30.- La tabla siguiente expresa la concentraci6n de albumina en giL en el suero sanguineo de 8 hombres

y 8 mujeres adultos sanos. ;_Difieren ambas medias?

Hombres 37 39 37 42 39 45

39

42

Mujeres

44 40 39 45 47 47 43

41

31.- La siguiente tabla proporciona la concentraci6n de tiol mM) en sangre de dos grupos de

voluntarios,

el

primer grupo es normal y el segundo sufre artritis reumatoide. ;_Difieren

significativamente ambos grupos en su contenido de tiol?

Normal 1.84

1.92 1.94 1.92 1.85 1.91

2 07

Reumatico 2.81 4.06 3.62 3.27

3.27

3 76

4.5. Prueba t

p r

parejas

A menudo ocurre que interesa comparar los resultados obtenidos por dos metodos analiticos

distintos muestra a muestra. Esto es, no se analiza una muestra repetidas veces con dos metodos, sino que

se analizan varias muestras una vez por cada metodo,

ya

sea porque hay poca cantidad de muestra o

porque interesa estudiar un rango de concentraciones amplio, o porque se desea hacer el estudio a lo largo

del tiempo para eliminar factores ambientales y puntuales. Por ejemplo, si se ha desarrollado un metodo

nuevo para analizar los az\lcares presentes en productos agricolas y se desea contrastar su exactitud con la



(JU M CA

A NAL CA

AV ANLAUA

ema

:

n roauccwn a

a

., m mema

del metoda clasico habitualmente utilizado. Puesto que las muestras analiticas pueden ser tremendamente

diferentes, (maiz, cocos, peras, remolacha, algarrobas .. ), nos interesa que el contraste se realice no sobre

el analisis repetido de un tipo de muestra (por ejemplo maiz), sino que abarque un amplio rango de

muestras. Cogemos entonces muestras de todos estos materiales y cada una de elias se analiza una vez

con cada uno de los metodos.

La estrategia a seguir consiste en hacer

el

test t sobre las diferencias entre los resultados

proporcionados por los metodos para cada muestra. Si los metodos conducen a respuestas

estadisticamente comparables, la media de las diferencias no debe diferir significativamente de cero.

Entonces es cero y aplicamos la comparacion de una media con

un

valor conocido.

32.- asiguiente tabla proporciona

Ia

cantidad en mg/mL de clorhidrato de efedrina encontrada en

preparaciones farmaceuticas de Ephedrine Elixir B.P., por dos metodos diferentes: espectroscopia uv de

derivadas y un metoda ojical. Ia cantidad nominal era de 3 mg/mL). Pruebe si los resultados obtenidos

por

ambos metodos difieren significativamente:

Muestra Numero

Metoda de derivadas

Metoda oficial

2.964 2.913

2

3.030 3.000

3 2.994

3.024

4.6.- Pruebas

de

1 y 2 colas

Hasta ahora hemos considerado en el estudio de los tests de significacion, que

la

diferencia entre

dos medias podria tener Iugar en cualquier direccion. Lo mismo daba cual fuera mayor,

ya

que lo unico

que nos interesaba verificar era si existian diferencias significativas entre ambas o no. Sin embargo en

numerosos experimentos sabemos de antemano que es posible que una de elias sea mayor que la otra, y

esto

(y

solo esto) es lo que queremos probar. Entonces nos interesa considerar el area de solo una de las

"colas" de la distribucion normal. Esto es, el 5% de los elementos de la poblacion que consideramos no

normales" son aquelios elementos que tienen el valor mayor (o menor) del parametro en cuestion.

32bis.- Si el factor peso se distribuye de forma normal en una cadena de producci6n de tornillos, con

una media 0.1500 g y con desviaci6n estimdar 0.0070 g, determina cual sera el rango de tamanos que

consideraremos normales para establecer una prueba

de

una cola a=0.05). Tras realizar una

reparaci6n en

Ia

cadena

de

producci6n, se sospecha que se producen tornillos mayores. Un tornillo

tornado al azar peso 0.1616 g 1,Conjirma esta medici6n dicha sospecha?

Es conveniente comprender bien estos conceptos para no cometer errores al emplear las tablas.

Muchas de las tablas mas habitualmente empleadas proporcionan los valores de t correspondientes

directamente a la suma de las dos colas. Esto es, cuando tomamos la t del 95%, es la que corresponde a

dos areas de cola del 2,5% por cada uno de los ados de la distribucion. Debemos escoger la

correspondiente a una P doble. Si solo nos interesa una cola, el valor tabulado que hemos de tomar es el

del 90% (dos colas del 5% de area). El tomar una cola o dos colas depende de

la

pregunta que nos

hacemos antes del experimento. Si la pregunta es ,SOn diferentes .. ?, entonces dos colas; si la pregunta es

(,es este valor mayor (o menor) que este otro .. ), entonces una cola.

33.- Algunos alcoholes alilicos pueden determinarse par formaci6n de

un

derivado coloreado con Ia

vainillina. Se desea estudiar

si

el aumento de Ia temperatura de reacci6n ejerce una mejora sabre el



44 V Ferreira ·

rendimiento de esta. Para ella, una misma muestrafue procesada a temperatura ambiente y a 60°C y se

midi6

Ia

Absorbancia del complejo formado a 608 nm Los datos obtenidos se muestran a continuaci6n:

25°C

0,209 0,212

0,223 0,215 0,

217

6 °C 0,232 0,219 0,224

0,220 0,21 7

1

Cual seria el resultado si nuestro interes hubiera sido determinar si

Ia

temperatura altera en cualquier

sentido) el rendimiento de la reacci6n?

4.7.- ltest F para

a

comparacion de desviaciones estandar

Sabemos ya que una caracteristica que debe ser conocida en todo sistema de medida es su

precision

al igual que

en

general, toda poblacion debe

ser

conocida no solo

por su

valor central sino

por

su dispersion de valores. Hasta ahara hemos empleado solo los valores centrales para comparar sets de

datos, pero

una estrategia muy util, y necesaria en muchas ocasiones, consiste en comparar las

dispersiones que existen entre dos (o mas sets de valores).

Un

ejemplo, se esta estudiando el pelaje de

dos poblaciones de animales, una de las cuales ha permanecido aislada por muchas generaciones mientras

que la otra

ha

sufrido numerosos procesos de mestizaje. Si demosttaramos que

la

poblacion mestiza posee

una

dispersion mayor

en

el atributo estudiado (pelaje: tipo de pelo, color, grosor . .), podriamos postular

la

presencia en esta poblacion de alelos de

un

gen que no estan presentes en

la

otra. Otro ejemplo, si alguien

nos propane un nuevo metoda de analisis ( o de muestreo) nos interesara determinar no solo si su

exactitud es comparable a la del metoda tradicional, sino tambien saber si su precision es mejor, similar o

pear.

Esta estrategia es muy util en el disefio de experimentos y en Ia toma de decisiones, como

veremos posteriormente

en

el epigrafe correspondiente

al

Analisis de Ia V arianza.

De

momenta nos

vamos a centrar

en

Ia comparacion de dispersiones de dos poblaciones, en particular de las precisiones de

metodos analiticos. En concreto, supongamos que hemos analizado una misma muestra repetidas veces

por dos metodos distintos. En el primer metoda hemos obtenido un valor promedio XJ y una desviacion

estandar s

1

•

En

el segundo, x

2

y s

2

•

Para

comparar precisiones el test t no es adecuado, y se utiliza

un

test en el que se considera Ia

razon de las dos varianzas muestrales. A dicho cociente se le denomina F:

F ~

s

[27]

donde las varianzas se colocan de forma que el valor de F sea siempre mayor que 1.

Recuerda que las desviaciones estandar no son mas que estimaciones realizadas con pocas

muestras, del parametro de dispersi6n de

la

poblaci6n, cr. Si

no

existiera incertidumbre en la estimaci6n

de

a

a partir de s, y los metodos tuvieran Ia misma precision (la misma

cr

, el cociente F seria

exactamente 1. Si encontraramos, en este caso hipotetico, un cociente distinto de 1

>

1

por

convenio)

seria sin Iugar a dudas, sefial inequivoca de que las precisiones son distintas. Pero desafortunadamente,

existe

una

incertidumbre en Ia estimaci6n de cr a partir de s. Como consecuencia de lo cual aunque el

cociente no sea 1 no podemos decir que sean significativamente distintas. Ahara bien, no es lo mismo que

dicho cociente F sea mucho mayor que 1 que solo un poco mayor que 1. Si el cociente fuera mucho

mayor, seria casi seguro que si que son distintas las precisiones. Como siempre, es posible determinar

cuanto mayor que 1 tiene que

ser

el cociente anterior

para

decidir si son distintas asumiendo una cierta

probabilidad de equivocarse. Este valor estadistico de F esta tabulado, y se trabaja con el de forma

parecida a como lo haciamos con Ia distribucion t. Por supuesto dicho valor sera tanto mayor cuanto

peores sean nuestras estimaciones ( cuantos menos grados de libertad), y cuanto mayor nivel de confianza

se requiera. El cociente F es tambien una distribuci6n de probabilidades derivada de

la

normal. Como las

distribuciones z y t, se encuentra

en

tablas estadisticas (una de elias en el anexo a estos apuntes), de forma



ema

:

n roouccwn a

a

., mema

tJ

que se puede conocer el valor F critico para un experimento deterrninado. El F critico es el valor del

cociente por encima del cual solo existe una probabilidad dada pequefia de aparici6n de dicho valor por

causas aleatorias.

Habitualmente se trabaja con un nivel de confianza del 95 (p<0,05), y de nuevo se aplica el

concepto de 1 o 2 colas.

La

estrategia a seguir en estos problemas es:

a) Deterrninar las medias y las desviaciones estandar.

b) Calcular el cociente F (recordar que F siempre

>1)

c) Buscar en la tabla el valor de F que se corresponde con los grados de libertad empleados en las

estimaciones de s

(numerador) y s

2

(denominador).

d) Si dicho valor F de Ia tabla es mayor que el F calculado, las diferencias observadas entre las

dos varianzas pueden ser aleatorias (no se rechaza la hip6tesis nula), si es menor, las diferencias son con

un 95 de probabilidad (o con el nivel de confianza empleado), debidas a causas reales no aleatorias

(rechazamos la hip6tesis nula).

34.- Se propane un nuevo metoda p r a determinacion de Pb. Se obtuvieron los siguientes resultados

para una muestra de aguas residuales que fue analizada 6 veces p r cada uno de los metodos

considerados, el estcmdar y el propuesto:

Media ppb)

s ppb)

518 9,3 Metodo estcmdar

521 4,2 Metodo Propuesto

t,Es a precision del metodo propuesto significativamente mejor que

a

del metodo estandar?

35.- Prueba con los datos del problema 33

si

a temperatura causa variaciones significativas en a

precision del metodo.

4.8.- La prueba Q de Dixon para

a

eliminacion de datos erroneos errores crasos)

A veces aparecen datos discordantes. En ocasiones son debidos a un error humano, (un error

accidental de pipeteo, o de trascripci6n), y pueden ser facilmente descartados (resulta obvio), pero

despues de eliminar los resultados obviamente estaban mal, alin pueden quedar resultados an6malos, y

muy distintos de lo esperado. El incluir estos resultados o no es una cuesti6n a menudo muy importante,

ya que los valores mas extremos ejercep. una influencia muy importante sobre la media.

La

cuesti6n que

se plantea es si dichos resultados aparentemente an6malos pueden ser debidos a un error craso y deben

ser por tanto rechazados o no.

La

respuesta a esta pregunta

ha

implicado el disefio de varios tests

estadisticos para resolverla. Uno de los mas sencillos (aunque no precisamente el mejor) es el test de la Q

de Dixon. Dicho test esta basado

en

el calculo de un parametro

Q

a partir de los datos experimentales, y

posteriorrnente este valor se compara con uno tabulado:

Q

=

(Valor sospechoso-Valor mas cercano )/ (Valor mas grande- Valor mas pequefio) [28]

De nuevo los valores Q estan tabulados para una P = 0.05, y si se supera el valor tabulado

( critico) podemos rechazar el valor an6malo con una probabilidad del 95 de no cometer un error.

36.- La siguiente lista de valores se obtuvo a/ medir el contenido de Zn de unas muestras determinadas.

59,2; 60,3; 59,8; 58,6; 56,3;

Pruebe si el valor anomalo 56,3 puede ser descartado.



6

V Ferreira ·

1

Y

sial

repetir las medidas encuentra los siguientes datos? 59,8; 60,5; 58,9; 59,5?

Otros ejercicios.

37.- En una cata de productos alimenticios 9 catadores estan valorando de 0 (estimulo nulo) a 5

(estimulo maximo) la caracteristica ''frutal de un alimento y comparandola con la del mismo alimento

al que se le ha aplicado un cierto tratamiento que deberia revertir en una mayor caracteristicafrutal.

Catador

I 2 3 4 5 6 7 8 9

Producto base

I.5 0.5 2

0

2.5 0.5

2.5

0.5

I

Producto tratado 2.5

2.5

3 3

2.5 3 I.5

2.5 2

1,Han

aumentado de forma significativa las caracteristicas ''frutales de dicho alimento?

38.- Se comparo un nuevo metoda espectroscopico de absorcidn atomica de llama

para

determinar

antimonio en la atmosfera con el metoda colorimetrico recomendado. Para muestras de atmosfera

urbana se obtuvieron los siguientes resultados:

N° Muestra Metoda propuesto Metoda estandar

I

22,2 25,0

2 I9,2

I9

,5

3

I5,7 I6 6

4

20,4 2I 3

5

I9,6 20,7

6

I5,7 I6,8

1,Dijieren significativamente los resultados obtenidos

por

los dos metodos?

39

.- Los siguientes datos proporcionan la recuperacion de Bromuro (ppm) adicionado a muestras

vegetales medido mediante un metoda cromatografico. La cantidad aiiadida a cada vegetal fue la misma:

Tomate

777

790 759 790 7

70

758 764

Pepino 782

773 778 765 789

797 782

a Prueba si la recuperacion en los vegetales tiene varianzas que difieran significativamente.

b

Prueba

silas

tasas de recuperacion medias difieren significativamente.

40.- En un proceso de concentracion por evaporacion con un disolvente se comparan dos sistemas de

rejlujo. Se midiola recuperacion de ana/ito a lo largo del proceso:

Columna de Vigreux: 59; 63; 58; 65; 62; 60; 6I

Evaporacion con Nitrogeno: 58; 67; 52; 6I; 57; 53; 63

1 Difieren los procesos en variabilidad y en recuperacion de forma significativa?

4I.-

Verifique de los datos expuestos a continuacion si el data 2,07 es un valor anomalo: I ,84; I ,92;

I,94; I ,85; I ,9I; 2,07

4.9. Tests para verificar el tipo de distribucion de un set de datos

En algunas ocasiones resulta importante conocer si un set de datos se aparta de forma notable de

Ia distribuci6n normal. Si

se

apartan de

Ia

distribuci6n normal

es

posible que

no

podamos aplicar



tema : ntro ucc n a

a

m ometna

+I

directamente algful test estadistico, y que los resultados deban ser transformados (por ejemplo trabajar

con sus logaritrnos).

En

otras ocasiones,

el

averiguar que una serie de datos no esta normalmente

distribuida constituye una evidencia de que debe haber algun factor no aleatorio incidiendo sobre el

sistema, por lo que este tipo de test nos permitiria confrrmar la incidencia de esos factores.

Una primera posibilidad es, por supuesto, una inspeccion de la curva (tabla) de frecuencias de los

datos, que nos revelara si los datos se distribuyen de una forma uniforme en tomo a una media, o si por el

contrario, la distribucion muestra conjuntos de datos separados entre si. Esta apreciacion visual puede

materializarse en dos parametros cuantitativos utiles para evaluar si la distribucion es significativamente

diferente de la normal. Estos parametros son dos caracteristicas de toda distribucion poblacional (al igual

que la media y la desviacion estandar), pero estan relacionados con la forma de la distribucion.

El primero de estos parametros se denomina coeficiente de asimetria, h y mide la simetria de la

poblacion. Para cualquier atributo de una poblacion que se distribuya de forma simetrica, el coeficiente

de asimetria es 0, y su intervalo de confianza es

±

t raiz(6/n).

En

la distribucion gaussiana este parametro

es obviamente

0.

En las distribuciones con cola hacia la derecha, este parametro es mayor que

0,

y si la

cola es hacia la izquierda, menor que cero. Matematicamente esta relacionado con la tercera derivada

de la funcion de distribucion.

El segundo parametro esta relacionado con la cuarta derivada de la funcion de distribucion y se

denomina curtosis muestral.

La

curtosis mide la altura o grado de achaparramiento de una

distribucion. Poblaciones de datos con la misma media, desviacion estandar y coeficiente de asimetria se

pueden diferenciar en su curtosis. Una funcion de distribucion normal tiene una curtosis 3, las funciones

mas bajas, como la distribucion uniforme, tienen curtosis inferiores a 3, y las funciones de distribucion

mas altas (que concentran mas puntas en tomo a

la

media para una misma S) tienen curtosis superiores

a 3.

En

la practica, los programas estadisticos suelen trabajar con el coeficiente de curtosis muestral,

a

2

=curtosis-3, de manera que la gaussiana tenga su a

2

=0. El intervalo de confianza de este parametro es

±

t raiz(24/n)

Hay otras estrategias estadisticas de gran importancia para verificar si los datos de una poblacion

se distribuyen de acuerdo con una cierta distribuci6n de referencia (no solo con la normal). Estos tests

tienen una gran importancia en la formulaci6n y contraste de hipotesis y estan basados en el estudio de

las frecuencias acurnuladas. El objetivo basico es comparar las frecuencias acurnuladas observadas con

las esperadas en la distribucion de referencia, por ejemplo una distribucion normal. Los dos tests que

presentaremos son el de la chi cuadrado

X

2

y el test de Kolmogorov-Smimov. El primero esta basado

en

la distribucion chi-cuadrado que es una distribuci6n muy importante derivada de la normal y que se

emplea fundamentalmente en aquellas investigaciones en las que se mide la frecuencia con la que ocurre

un

cierto hecho (por ejemplo en investigaciones medicas). Desafortunadamente solo puede emplearse

cuando el ntimero de datos en el set es relativamente grande (habitualmente n>50). El test de

Kolmogorov-Smirnov es un test no parametrico (que no presupone que los datos se deban distribuir

normalmente) que puede emplearse en cualquier caso y que esta bas ado en

el

calculo de probabilidades.

Para aplicar el test de la chi cuadrado, segmentamos el set de datos en j intervalos consecutivos y

calculamos el ntimero de observaciones dentro

de

cada intervalo (frecuencia

Yi ·

A continuaci6n,

calculamos el

ntimero de observaciones esperadas por intervalo, t; Este ntimero de observaciones

esperadas por intervalo sera el correspondiente

al

que daria una distribucion normal (si

es

esta la

distribucion que queremos comprobar) y

lo

podemos obtener a partir de la tabla de Ia distribucion

z.

Posteriormente, calculamos el parametro

x

2

mediante la expresi6n:

x

=

_ _

J

[29]

Y comparamos este valor de chi cuadrado con la correspondiente distribucion con j-1 grados de

libertad. Una tabla chi cuadrado se encuentra

en

el

anexo. El ejemplo siguiente muestra Ia forma de

operar.



48

V Ferreira·

42.- En el ami/isis de 50 vinos se han obtenido los siguientes valores de grado alcoholico. Se quiere

saber si podemos considerar que el grado alcoholico

de

un vino se distribuye de forma normal.

Muestra Grado Muestra Grado Muestra

grado

1 12,0 18 13,2

35

12,6

2 11,0 19

14,0

36

13,0

3 11,3

20

12,4 37 14,1

4 11,5 21 12,1

38

11,2

5 12,1 22 11,9

39

11,5

6 10,8

23

14,2 40 11,7

7 13,1 24 12,9 41 11,5

8 13,2 25 12,0 42 13,4

9

12,0 26 12,1

43 13,0

10

12,5 27

12,5 44 12,6

11

14,0

28

11,2 45 12,8

12 11,3 29 12,4 46 12,9

13

11,2

30

12,7

47 14,2

14

10,8 31 13,8

48

12,3

15 12,6 32 13,2

49

12,7

16

12,7

33

12,3

50 12,4

7 13,5 34 12,3

Lo primero que debemos hacer es ordenar los datos, y determinar el maximo, el minima, la

media y la desviacion estandar. El minima es 10,8, el maximo14,

2,

la media es 12,5 y la desviacion

0,9.

Ahara debemos determinar el numero de intervalos y su extension en que vamos a dividir a la poblacion.

Cuando el numero de elementos es muy grande n> 400) se suelen hacer 20 grupos. Cuando es mas

pequeno se calcula

Ia

extension de los intervalos dividiendo el rango

par Ia

raiz del numero de datos. En

nuestro caso (14,2-1

0,8/raiz 50)=0,48::::{),5,

y dividiremos

Ia

poblacion en los siguientes interval

as:

Intervala Free Intervala Free Intervalo

.free

10,5 a 11,0 2 12,0 a 12,5 12 13,5 a 14,0 2

11,0 a 11,5 6 12,5 a 13,0 11

14,0a

14,5 5

11,5 a 12,0

5

13,0 a 13,5 14,5 a 15,0

0

Lo siguiente es contrastar esta distribucion con

Ia

normal, para lo que debemos conocer cual

seria Ia frecuencia esperada en cada uno de los intervalas en una distribucion normal cuyo centro fuera

12,5 y su desviacion

0,9.

Esto

esfacil

de hacer,

ya

que lo unico que debemos hacer

es

convertir los datos

de cada intervalo en coordenadas

z.

Por ejemplo, el intervalo 10,5 a 11,0, se corresponde con el

intervala - 2,20 a -1,67 en coordenadas

z.

La probabilidad de este intervalo es 4, 75-1,39=3,36 . Como

tenemos 50 elementos, lafrecuencia esperada sera 1,

7

En

Ia

tabla siguiente se muestran estos calculos:

Izda int cha int Prob izq Prob. dcha free. Esp. fobservada cocientes chi

10 5

11 0 0 013 0 048 1 7

2

0 0

11 0 11 5 0 048 0 133 4 3 6 0 7

11 5 12 0 0 133 0 289 7 8 5 1 0

12 0 12 5

0 289 0 500

10 5 12 0 2

12 5 13 0 0 500 0 711 10 5 0 0

13 0 13 5 0 711 0 867 7 8 7 0 1

13 5 14 0 0 867 0 952 4 3 2 1 2

14 0

14 5 0 952 0 987 1 7

5

6 2

14 5 15 0

0 987 0 997

0 5 0 0 5

x2=

9 94

Como el valor critico de

;

para

7

grados de libertad es 14, 1, no puede decirse que la

distribuci6n no sea normal. Todos estos calculos se pueden realizar facilmente en una hoja de calculo o

directamente en un programa estadistico.



ema

ntro uccwn

a a ., u m merna

43.- Un jefe de producci6n de

una

empresa quimica desea comprobar si la riqueza de una materia prima

que le suministra un tercero se distribuye de forma normal con una media 72,5 y

una

desviaci6n 2,5.

Para ella ha recopi lado los am:ilisis de los lotes de materia prima recibidos durante los dos ultimos anos.

Los

resultados, ya ordenados

par

recuencias son los siguientes:

Riqueza

No de casas

Menos de 70

8

Entre

70y

71 12

Entre 71 y 72

14

Entre 72 y 73

16

Entre 73 y 74

19

Entre 74 y 75

14

Entre 75 y 76

9

Mas de 76

1

Total 93

La distribuci6n chi tambien la podemos emplear para ver si nuestros datos se ajustan a cualquier

otra distribuci6n. Esto es muy util para determinar si sobre conjuntos de datos agrupados por frecuencias

hay factores que inciden de forma significativa.

44.- Se

ha

realizado un seguimiento del numero de averias observadas en un

ana

en cada 100

cromat6grafos de distintas marcas. Los resultados han sido 24, 17, 11 y 9 para las marcas A, B,

C

y D.

;,Puede asumirse que unas marcas

son

mas robustas

que

otras, o dichas frecuencias corresponden

al

azar?

Si

las averias ocurrieran

par azar

, esperariamos que

fueran

iguales

para cada fabric

ante y

podriamos

suponer que

el numero de averias observada al ana sigue una distribuci6n

normal

con Ia misma

media

en todos los casas y una cier ta desviaci61}. Una estimaci6n de dicha media es el promedio de averias par

fabricante: (24+ 17+ 11 +9)/4=61/4=15,25

Como

en este

caso

nuestra hip6tesis nula es que el numero de roturas

par

fabricante y

ana

es el mismo

para todos los

fabric

antes, la frecuencia esperada es 15,25.

Ahara

se construye la tabla

chi

como anteriormente

Fabricante Free. Observada

Free. Esperada

Cocientes chi

A

24

15,25 5,020

B

17

15,25 0,201

c 11

15,25 1,184

D 9 15,25 2,561

~

8,966

Como

el valor critico e ~

para

3

grados

de libertad es 7,81,

queda

demostrado que

las

averias no

han

ocurrido puramente par azar, y

par

tanto hay que concluir que las averias dependen del fabricante.

45.- Una industria tiene 5 tanques de reacci6n para la preparaci6n de un

mismo producto

, y

se

desea

saber

si

los tanques funcionan de forma similar.

Para

ella se ha medido el numero de veces que ha sido

necesario interrumpir la operaci6n de

cada

tanque a lo largo de 2 anos de trabajo (10 veces el tanque

1

15

el 2, 8

el

3

19 el

4 y

22 el

5). Determina

si

hay evidencias de que unos tanques funcionan

pear

que

otros.

Por ultimo veremos la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se trata de una prueba sencilla en la que

lo que se comparan son las curvas de frecuencia acumulada entre la distribuci6n esperada que puede ser

la normal, o puede ser otra distinta) y la distribuci6n esperada. Ellistado

e

datos se ordena de menor a

mayor y se calcula para cada data su frecuencia relativa acumulada frecuencia observada). A

continuaci6n, se calcula la distancia z de cada data y la frecuencia relativa acumulada correspondiente a

dicho z frecuencia esperada). Finalmente se computa la diferencia entre los valores de frecuencia

observada y esperada. La diferencia maxima se compara con el valor critico que se muestra en las tablas.



50

V Ferreira ·

Veamos su aplicaci6n con un ejemplo.

45bis.- nuna industria de sintesis un cierto producto se fabrica por lotes. Se ha medido Ia

riqueza de los ultimos 10 lotes y se

de

sea saber si Ia variable riqueza sigue una distribuci6n normal. Los

datos han sido:

10,5 14,9 9,8 9,6 9,3 10,2 8,8

9 1

15,3 13,8

(media= 11,13 desviaci6n=2,51)

La

hip6tesis nula es que

Ia

distribuci6n es normal con media 11,13

y

cr=2,51. Los datos se ordenan

y

se

presentan como en

Ia

tabla mostrada a continuaci6n

Datos

ordenados

8,8

9,1

9,3

9,6

9,8

10,2

10,5

13,8

14,9

15,3

Frecuencia Frecuencia

acumulada acumulada

observada

z esperada

10,0 -0,93 17,7

20,0 -0,81 21,0

30,0 -0,73 23,4

40,0 -0,61

27,2

50,0 -0,53 29,9

60,0 -0,37 35,6

70,0

-0,25 40,1

80,0

1,06

85,6

90,0 1,50

93

,3

100,0

1,66

95,1

Diferencia maxima=29 9

Diferencia critica=24,1 (a.=0,05)

diferencias

7,73

0,99

-6,64

-12,8

-20,1

-24,4

-29,9

5,56

3,29

-4,88

Por tanto, se rechaza Ia hip6tesis nula

46.- Estudia los valores de absorbancia

del

ejemplo 4 pagina 21), y aplicando Ia

prueba

de

Kolmogorov-Smirnov, determina

si

se

distribuyen de

forma

normal.

Distribuci n e referencia

A

H

I L

0,11

dm x

1

~ / ---.....

f.?.

........

........

~ n . . ,

.......

Distribuci n experimental

n

-2 -1 ,5

-1

-0,5 0 0,5

1

1,5 2

coordenada z

47.- Aplica el test de Kolmogorov-Smirnov para verificar silos

2

primeros datos de contenido en grado

alcoh6lico

del

ejercicio

42

se distribuyen de

forma

normal.



Tema 2. Descomposici6n de Varianzas y aplicaciones

analiticas

1 Concepto

y

utilidad

El analisis de la varianza ANOVA)

es

una poderosa tecnica estadistica utilizada para

separar y estimar las distintas fuentes de variacion que acruan sobre un cierto conjunto de

datos y determinar cuales de ellas ejercen un efecto suficiente como para influenciar el

conjunto de datos por encima del error aleatoric o experimental achacable a todo proceso de

medicion. La forma de trabajar del ANOVA es una forma un tanto peculiar y diferente

ala

que hemos visto hasta ahora, pero hay varias razones por las que interesa conocer bien sus

fundamentos.

• n primer lugar porque la forma e pensar ANOVA esta ligada

ala

forma en la

que han de conducirse las experimentaciones, cualquier experimentacion, lo cual

es de necesario conocimiento para cualquier quimico o cientifico experimental. La

contribucion mas importante del ANOVA y del analisis factorial es que cualquier

diseiio experimental debe permitir una adecuada evaluacion del error experimental

o aleatoric.

• En segundo lugar porque el ANOV A nos va a proporcionar una herramienta para

realizar comparaciones mucho mas complicadas que las que nos permiten los tests

estudiados en el capitulo anterior. Los tests z o t que vimos en el capitulo anterior

solo pueden emplearse para comparar un par de resultados, ahora podremos

comparar toda una serie.

• n tercer lugar, porque el ANOVA y su manera de plantear un problema forman

parte de un gran ntimero e tecnicas y tests estadisticos empleados para establecer

modelos acerca del comportamiento de la realidad. Muchos de estos modelos los

necesitaras en tu desarrollo profesional, cualquiera que sea tu especialidad, y

necesitas estas familiarizado con su estructura y forma e uso.

• En cuarto lugar, porque el ANOVA nos va a permitir conseguir llevar a cabo

alguna de las tareas mas importantes para alguien que trabaja con metodos de

analisis:

lade

separar las fuentes

e

incertidumbre que intervienen en la formacion

de incertidumbre del resultado final. En particular nos permitira distinguir la

incertidumbre debida a la medicion de la debida al muestreo, y nos permitira

diseiiar como

hade

realizarse el muestreo, o como hay que mejorar la medicion

para ajustar la incertidumbre a una requerida.

2. Fuentes e variacion

En cualquier conjunto de datos que podamos considerar resultados replicados de

varias muestras analiticas distintas, el conjunto de los resultados del comportamiento de un

reactor durante un tiempo, los datos de contenido en cierto componente de un grupo de

personas, ... ), nos encontraremos con que no todos los datos son iguales, sino que habra una

serie de diferencias entre ellos. Dicho de otra forma, en todos los casos existe una dispersion

del parametro e interes en el conjunto de la poblacion y,

si

se cumplen los presupuestos de



54 V. Ferreira

normalidad, dicha dispersion se podria medir a traves

de

la desviacion estandar de todos los

elementos del grupo. Podemos imaginar esa dispersion como el resultado aditivo

de

la

presencia

de

las distintas fuentes

de

variacion que acruan sabre dicho grupo

de

datos.

Tomemos como ejemplo el conjunto de pares de datos obtenido del seguimiento de un

reactor industrial durante varios dias y en varios puntas del reactor (los datos indican

rendimiento

en ):

dia 1 dia 1 dia 2 dia 2 dia 3

dia 3

replica 1

replica 2

replica 1 replica 2

replica 1 replica 2

punta A

26 27 32 32 28 27

punta B

30 29 35 36 33 32

punta C 27 27 29

30

28

28

La variabilidad de dicho conjunto de 18 datos es debida a las siguientes fuentes de

variac

on:

1.

la que hay entre replicas, que es la variabilidad analitica. Esta fuente de variacion

se denomina error experimental o error aleatorio, o simplemente error.

2. la heterogeneidad existente entre las distintas partes del reactor (variabilidad

muestral). A esta fuente de variacion

la

podemos denominar factor espacio o

muestral.

3. la variabilidad del estado de reactor en el tiempo (que es el data que nos interesa).

A esta fuente de variacion la denominaremos factor tiempo.

Par tanto, podemos afirmar que la variabilidad total observada en el conjunto

de 18

datos es debida a la suma de las contribuciones de estas tres fuentes de variacion . Como

ya

sabemos como se propagan o combinan errores aleatorios o variabilidades, sabemos que la

varianza

total=

suma de varianzas analitica, muestral,

de

factor.

La obtencion de la variabilidad del reactor en el tiempo no se puede hacer

de

forma

directa (cogiendo las medias de los 6 resultados de cada dia),

ya

que las variaciones entre

dichas medias tambien seran debidas en parte a las variabilidades analitica y muestral. Pues

bien, el ANOVA, nos permitira ser capaces

de

obtener las distintas fuentes

de

variacion,

de

compararlas entre si, y

de

determinar si dichas fuentes de variacion tienen una repercusion

real y significativa en el sistema en estudio.

En general, las fuentes

de

variacion encontradas en un conjunto de datos son:

• La debida a los errores aleatorios en la medicion (SIEMPRE EXISTEN)

• La originada par otros factores aleatorios (variabilidad espacial, variabilidad

temporal. ..

.

• La originada par la presencia de uno o varios factores de efecto fijo o controlado

(temperatura, tiempo, almacenamiento .. ), cualquier factor que podamos modificar

y que es objeto de estudio.



3.-

escomposicion de las distintas fuentes de variacion del ejemplo del reactor

Las 3 fuentes de variacion que

actUan

sobre el reactor pueden ordenarse segtin su

facilidad para ser aisladas. La variacion analitica (precision) es la que mas facilmente se

puede aislar, ya que basta realizar una serie de medidas repetidas de una rnisma muestra para

deterrninarla. La segunda de ellas es

la

causada por la heterogeneidad del reactor. No es

posible conocerla si antes no hemos deterrninado la analitica,

ya

que para medir la

heterogeneidad hemos de tomar muestras

de

distintas partes del reactor y analizarlas, por lo

que los datos en los que nos basamos llevan incluida la incertidumbre derivada de la

imprecision analitica. Finalmente, la variabilidad temporal del reactor es

lamas

compleja en

el sentido de que para poder deterrninarla hemos de conocer previamente las otras dos, ya que

inevitablemente para comparar la composicion del reactor en dias distintos hemos de tener en

cuenta la heterogeneidad muestral y la imprecision analitica.

Este hecho es el que motiva el diseiio experimental aplicado en este caso. Se hacen

replicas analiticas de cada una de las muestras extraidas del reactor para poder deterrninar

previamente la variabilidad analitica, y cada dia se toman 3 muestras del reactor para poder

medir la heterogeneidad muestral. A este disefio experimental se le denornina FACTO RIAL.

En este caso de dos factores (factor espacio y factor tiempo).

Veamos como se deterrninan las distintas variabilidades.

a)

Aislarniento de la variabilidad analitica

De cada una de las 9 muestras

3

par dia) extraidas del reactor se han realizado dos

analisis.

Par

tanto, en ausencia de errores sistematicos o crasos, las diferencias que existan

entre cada par de replicas han de deberse entera y exclusivamente a la imprecision del metoda

analitico. Esto es, cada una de las 9 desviaciones estandar calculadas a partir de las 9 parejas

de replicas analiticas rnide el rnismo parametro: la imprecision analitica. Por tanto, la mejor

estimacion de

la

variabilidad analitica la obtendremos si ponderamos esos 9 valores.

Sustituyamos cada pareja de datos por una media y calculamos su desviacion estandar, con lo

que la tabla de datos original queda de la siguiente manera:

Dia 1*

Dia2 Dia3

Punta A

26,5 (0,707)

32,0 (0,000) 27,5 (0,707)

Punta B

29,5 (0,707) 35,5 (0,707)

32,5 (0,707)

Punta C

27,0 (0,000) 29,5 (0,707) 28,0 (0,000)

Entre parentesis se dan los valores de desviaci6n estandar.

Y ahora agrupemos las 9 desviaciones estandar como

ya

sabemos:

Este dato estima la variabilidad analitica con 9 grades de libertad.

b) Aislarniento de la variabilidad muestral

Para deterrninar la variabilidad muestral hemos de comparar las medias obtenidas para

cada una de las tres muestras extraidas cada dia. Sin embargo, hemos de ser conscientes,

de



56

V. Ferreira

que estas medias (por ejemplo 26.5; 29,5

y

27,0, para el primer dia), no difieren solo por

representar la composicion de tres muestras extraidas de distintas partes del reactor, sino

tambien como consecuencia de la imprecision analitica en su determinacion. Para verlo claro

piensa

en

que hubieras cogido una Unica muestra

y

la hubieras analizado tres pares de veces.

Las tres medias no tendrian porque ser iguales, y de hecho el teorema central del limite nos

dice que la desviacion estandar de esas tres medias sera

la

de la poblacion original dividida

por la raiz del nllinero de elementos que componen esa media. Esto es, si la composicion no

variara espacialmente dentro del reactor (la variabilidad muestral es cero), la varianza de las

medias seria = ?{ . or otra parte, sabemos que el intervale de confianza de cada una

de las medias viene dado por

la

expresion,

donde f l se refiere al valor cierto de composicion de la muestra analizada. Por el contrario, si

la

variabilidad analitica fuera cero, las medias obtenidas

en

el analisis replicado (las replicas

serian iguales en este caso) serian justamente el valor cierto de composicion de cada una de

las muestras extraidas. n ese caso, esta claro que la varianza de estas tres medias seria la

varianza muestral, s nd

=

s?n o .

n

el caso general en que ni

la

variabilidad analitica

sea

cero

(que nunca lo es), ni la muestral sea nula, la desviacion estandar que obtenemos de las tres

medias (26,5; 29,5 y 27,0), sera una estimacion de la variabilidad muestral aumentada en la

analitica corregida por dos.

En concreto:

2

2 2

Sa

s -

md mto 2

Ahora bien, esta observacion se repetira en los tres trios de medias que tenemos (un

trio por dia), por lo que la mejor estimacion de la desviacion de las medias (y por tanto de la

muestral) sera la combinacion de las tres. Vamos a hallarlas, reduciendo la tabla anterior a

tres medias y tres desviaciones estandar:

Las de las medias ponderadas es:

Smd

=

1,607

2

3,014

2

2,754

2

=

2 53

3

Con 2 x 3=6 grados de libertad

Por tanto:

2

2

=

2

- Sa = 2 53

2

-

0

•

333

= 6 234 > = 2 49

S mto S md 2 2 S mto



Cuya estimaci6n tiene tambien 6 grados de libertad.

Para calcular la variabilidad debida

al

factor tiempo, y al igual que hicimos antes,

podemos ahora escribir el intervale

de

confianza de cada una de las tres medias de la tabla

anterior:

2

tz

a

- md - -

mto

2

x_ t . f j - x _ t J3

Esto es, las tres medias de esta tabla son diferentes entre

s

por dos razones, una

porque corresponden a distintos dias (variabilidad temporal que quiero determinar), y otra

porque cada una viene afectada

de

una incertidumbre combinada

de

la muestral y la analitica.

(El mismo razonamiento de antes valdria: imagina que las tres medias procedieran

de

3

grupos

de

3 muestras analizadas por duplicado que hubieran sido sacadas en el mismo

instante)

La desviaci6n estandar de estas tres medias esta por tanto relacionada

de

la siguiente

manera con las tres fuentes de variaci6n:

2 2

2

=

2 Smto Sa: : :> 2

=

3

45

> =

86

Smd Stemp 3 6 Stemp Stemp

Moraleja: Todo disefio experimental tiene que permitir separar las fuentes de

variaci6n aleatoria

de

las que pueda producir el factor a estudio. Mediante un disefio

experimental adecuado, y si los presupuestos de normalidad se cumplen, el ANOV A nos

permitira aislar las distintas fuentes de variaci6n que acttlan sobre el conjunto de datos.

El disefio de experimentos debe tener en cuenta la existencia de todas las fuentes de

variaci6n que existen en un determinado sistema y tratar

de

obtener una estimaci6n de su

magnitud mediante el uso adecuado

de

replicas. A cada fuente de variaci6n que acrua sobre el

sistema se le denomina FACTOR.

AI

conjunto de variaciones aleatorias (que son las de

medici6n mas otras variabilidades ambientales) se le denomina habitualmente ERROR. Los

factores pueden ser de efecto fijo (que son los factores que habitualmente queremos estudiar,

por ejemplo el efecto

de

la temperatura o del pH en una reacci6n quimica, o el efecto

de

un

tipo

de

abonado

en

el rendimiento de una plantaci6n), o aleatorios, que son tipicamente los

relacionados con la heterogeneidad muestral y el muestreo (en terminos tanto de espacio

como

de

tiempo). El nfunero de valores

de

un factor que consideramos se denominan

NIVELES de dicho factor. Por ejemplo, si para evaluar el efecto

de

la temperatura

realizamos mediciones a tres temperaturas diferentes, el factor temperatura decimos que tiene

tres niveles. Para evaluar el efecto de un factor hace falta, como minimo, dos niveles.

AI

tipo de disefio experimental derivado del reconocirniento de la existencia de

factores y de la necesidad de aislar la influencia de los factores jerarquicamente inferiores, se

le denomina disefio factorial. El ejemplo con el que hemos comenzado el capitulo es un

disefio factorial complete de dos factores (espacio y tiempo ), ya que el tercer factor (error

experimental o aleatoric) no se cuenta porque siempre existe. Los factores espacio y tiempo



58 V. Ferreira

tienen tres niveles. El nillnero total de experimentos es 3 puntos de muestreo) x 3 dias) x 2

replicas muestra) 18.

A continuacion vamos a exponer en detalle la forma en que el ANOVA trabaja en un

caso mas sencillo, aquel en el que solo hay un factor a estudio.

4. ANOVA e un factor de efecto fijo o controlado:

Supongamos que estamos disefiando un metodo analitico y decidimos estudiar el

efecto de una de las variables que tenemos bajo control, por ejemplo el pH. El interes de este

control viene determinado por la necesidad de determinar:

1.- .Con que exactitud y precision debo regular el pH para obtener una precision y

exactitud analitica adecuadas?

2.-

i Si

el pH ejerce un efecto significativo sobre la sefial analitica,

curu

es el valor

optimo de pH?.

Para contestar estas cuestiones he de tener en cuenta que cualquier medicion que haga

dependera no solo del pH factor controlado), sino tambien

de

la variabilidad analitica. Para

tener una idea real de la importancia del factor, debere ser capaz de computar el valor de la

variabilidad analitica. Para ello, planteo el experimento de la siguiente manera: voy a medir la

sefial analitica a 4 pHs distintos 3,20; 3,25; 3,30; y 3,35), realizando a cada pH 4 medidas.

Para evitar efectos indeseados en los resultados de mi tabla he de tomar una

precaucion muy importante, que es ALEATORIZAR el experimento. Esto quiere decir que

no voy a realizar las medidas siguiendo un orden cronologico ordenado, sino que lo hare de

forma aleatoria. Supongamos que puedo realizar 4 medidas por dia.

Si

realizara cada dia las

medidas correspondientes a un pH, mis resultados podrian venir afectados por un efecto

desconocido casual o aleatorio) del dia. Por ejemplo,

sil s

medidas a pH 3,20 las realizo el

lunes y ellaboratorio no esta bien termostatizado, podria ocurrir que las medidas de ese dia se

hubieran realizado a una temperatura inferior a las de los otros dias. Si la temperatura

ejerciera un efecto importante sobre la medida,

el

efecto de la temperatura se sumaria

al

del

pH, conduciendome a unas conclusiones erroneas. Este efecto podria atenuarse si cada dia

realizo medidas a todos los pHs. Si sigo un orden estricto empezando por

el

pH mas bajo),

resultara que todas las medidas a pH 3,20 se han realizado l misma hora, y antes que todas

las demas. Esto es arriesgado. De nuevo podria ocurrir que alglin factor no contemplado en el

disefio del experimento tiene efecto, complicandome la vida y haciendome llegar de nuevo a

conclusiones erroneas. Por ejemplo, si el pHmetro no lo recalibro de forma continua y solo lo

hago al comienzo de la jomada como se realiza en muchos laboratorios), podria haber un

sesgo constante en las medidas

de

los otros pHs.

Para conseguir una aleatorizacion real, y puesto que las replicas son independientes,

debo realizar medidas a los 4 pHs cada dia y decidir

de

alguna forma realmente aleatoria

el

orden en que se analizaran las muestras. En concreto, podria coger la baraja espafiola y

asignar las espadas al pH 3,20, bastos al 3,25, copas al 3,30 y oros al 3,35 , y decidir el orden

en que se realiza el analisis sacando las cartas. Obtenemos los datos de la tabla siguiente

unidades relativas). En superindice se muestra

el

orden en que se realizaron las medidas cada

dia.



pH Rep 1

Rep

Rep3

Rep4

lunes) martes)

miercoles)

jueves)

3,20

8

8j

9

2

3

8 7

1

19e

3,25 8 8

1

19,0

4

8 7

2

8

6

3

3,30 8 6

2

8 5

2

8

4

4

8 7

4

3,35

8

8 0

1

8 1

3

7

9

1

Sobre este conjunto de 16 datos existen dos posibles fuentes de variaci6n

La

debida al

pH

cuya existencia he de comprobar)

La debida al error aleatoric de la medida que seguro que existe)

Otras fuentes no contempladas en el modelo que al haber aleatorizado el

experimento es de esperar se cancelen y queden incluidas dentro de los errores

aleatorios).

Nota: l haber aleatorizado, la variabilidad analitica

ya

no se refiere solo a la imprecision del metodo de

medida, sino que tambien incluye la variabilidad asociada a la variacion aleatoria de parametros ambientales que

puedan afectar al resultado de la medicion.

Este diseiio de experimentos es un diseiio Factorial complete aleatorizado en el que

consideramos 4 niveles del factor y 4 replicas. El nfunero total de ensayos es 4 pHs) x 4

replicas a cada pH)

=

16.

El Amilisis de

la

Varianza comienza el proceso de resoluci6n del problema

formulando la hip6tesis nula siguiente:

Todas las variaciones que aparecen en Ia tabla se deben solo a los errores a/eatorios

esto es: el pH ejerce una influencia NULA sabre e/ sistema).

A partir de este memento, el ANOVA

va

a seguir un proceso de descomposici6n de

varianzas similar al que

ya

realizamos anteriormente. En primer lugar calcularemos

la

varianza analitica ponderando las cuatro varianzas de los cuatro grupos de replicas uno

por

pH).

En

segundo lugar calcularemos la varianza de las cuatro medias de los cuatro grupos.

Esa varianza, de acuerdo con lo

que

expusimos anteriormente, deberia descomponerse de la

siguiente manera:

2

2 2 Sa

s +-

m

pH 4

Ahora bien, si la hip6tesis nula es cierta, entonces

SpH

es cero y la expresi6n anterior

se convertiria en:

2

2 Sa

Smd 4

Por tanto, si

la

hip6tesis nula es cierta,

la

varianza de las medias multiplica

da

por 4)

deber ser equivalente o sea no significativamente diferente) de la varianza analitica. Para

comprobar este extreme tan solo tendremos que aplicar un test F. Si el test F nos indicara que



60 V. Ferreira

existen diferencias significativas entre ambas varianzas, esto quiere decir que la hipotesis

nula no puede ser cierta. Entonces y solo entonces podremos decir que hemos demostrado

que el pH ejerce una influencia significativa sobre

la

sefial analitica.

Una

vez demostrado

esto, se puede aplicar el test t para comparar entre las distintas medias.

Vamos a realizar el proceso paso a paso.

a) Estimacion de Ia

varianza

dentro de los grupos (determinacion de Sao, en general, de

S

0

.

En

este camino voy a tratar de calcular la variabilidad hipotetica total del sistema

midiendo exclusivamente las variabilidades aleatorias que en nuestro ejemplo en particular

estan relacionadas tan solo con

la

imprecision analitica. Calculo la varianza para cada

conjunto de cuatro medidas replicadas:

pH

media s

s2

3,20

18,95 0,238

0,0567

3,25

18,77

0,171 0,0292

3,30 18,55 0,129 0,0167

3,35

18,05 0,129 0,0167

Calculo ahora la media ponderada de todas estas varianzas, que es la mejor estimacion

de la variabilidad analitica, y si

la

hipotesis nula fuera cierta, seria tambien una buena

estimacion de

la

varianza de

la

poblacion original.

Esta estimacion tiene h (n-1) grados de libertad, siendo h el nillnero de grupos y n el

2 = S ~ = 0,0567 + 0,0292 + 0,0167 + 0,0167 =0 0298

a h 4

nillnero de elementos dentro de cada grupo. En este caso esta estimacion de

la

varianza

analitica tiene 12 grados de libertad.

b Calculo de Ia

varianza

entre grupos (Determinacion de Ia

varianza

de las medias y de

Ia

varianza

del factor). Las medias de los cuatro grupos son distintas entre si

por

dos

razones, en primer lugar porque se trata de medidas a distinto pH, y en segundo lugar porque

cada media representa al valor verdadero de

la

sefial a un

pH

determinado con una

incertidumbre asociada que es ± t sa "Vn (de acuerdo con el teorema central del limite). Por

esta razon, la varianza de las medias tendria que ser

s d

=

s H ~ a =

0,152

Teniendo esta estimacion h-1= 3 grados de libertad. Ahora bien, bajo la hipotesis nula Sp es

cero, por lo que si la hipotesis nula es cierta: s;d =

s;

y

4

2

Sa 0,152 X 4 = 0,609

A este valor 0,609 se le denomina

varianza entre

grupos.

c) Comparacion de ambas varianzas. Basta con aplicar el test F para demostrar que la

varianza entre grupos es mayor que la varianza dentro de grupos:



=

0

•

609

= 20 44

3

2

0 0298

El valor critico encontrado

en

las tablas de F

para

una cola

ya

que solo nos interesa

comprobar si

la

varianza entre grupos es mayor que lade dentro de grupos) es 3,49.

Por tanto la varianza entre grupos es significativamente mayor que la varianza entre

grupos y eso quiere decir que la hipotesis nula es falsa, esto es; que el factor controlado p

ejerce una influencia significativa y real sobre el sistema.

En

concreto sabemos que la variabilidad asociada al

pH

es:

2

2 = 2

_Sa=0152-0,0298=0144

Sp Smd

4 4

d Calculo de las diferencias minimas significativas

Una vez (y solo

una

vez) que se ha demostrado que existe

una

influencia significativa

del factor,

es

posible aplicar el test t para determinar que medias de grupos difieren entre si:

donde s es

la

variabilidad aleatoria calculada dentro de grupos. En el caso frecuente de que

n

=n2:

Puesto que

el

termino s (2/n)

0

•

5

es el mismo

para

todos los casos, y puesto que

la

tc es

la misma tambien

para

todas las medias,

en

Iugar de calcular

el

t experimental para cada par

de medias, lo que se hace es calcular la minima diferencia que tiene que haber entre las

medias para que pueda ser considerada significativa. En

la

ecuacion anterior el numerador se

convierte en D, y sustituimos

:e:

por el tc encontrado en las tablas con h (n-1) grados de

libertad):

D

= sV

h(n-1)

En nuestro caso:

=

X

2,18

=

0,27

Ahora podemos construir

una

tabla de doble entrada para calcular todas las diferencias

entre las medias, marcando

con

un asterisco las que sobrepasan D:



6

V Ferreira

pH 3,2 3,25

3,3 3,35

pH

medias 18,95 18,775 18,55 18,05

3,2 18,95

0

3,25 18,775 -0,175

0

3,3 18,55 -0,4 -0,225

0

3,35 18,05 -0,9 -0,725 -0,5 0

Puede verse que de las cuatro medias de que disponemos, tan solo las diferencias entre

las medias correspondientes a las parejas de pHs 3,20 y 3,25 y 3,25 y 3,30 no superan la

Minima Diferencia Significativa, pero que entre 3,30 y 3,35 ya hay una diferencia

significativa y si la diferencia de pH es superior a 0,05 siempre hay diferencias. Por tanto no

solo hemos demostrado que el pH ejerce un efecto significative, sino que debe ser controlado

con una precision superior a las cinco centesimas para evitar que afecte de forma negativa a

la precision del metodo. En cuanto a cual es el pH optimo, si el objetivo es obtener una sefial

maxima, el pH mejor de los ensayados es el inferior.

5.- La tabla del Amilisis de Ia Varianza

El Analisis de la varianza se desarrollo en la primera mitad del siglo pasado de la

mano de Fisher. En esa epoca nose podia disponer de mas herramientas de calculo que de las

reglas de calculo y de las tablas de logaritrnos, por lo que es comprensible que se dedicara un

gran esfuerzo a la simplificacion de los calculos. Ese esfuerzo se concretaba en estrategias

operativas que yen formas de trabajar que han perdurado hasta hoy. En particular se evitaba

el trabajo con desviaciones estandar (para no tener que extraer la raiz) y aun con varianzas, y

se trabajaba con lo que se denomina cuadrados, tal y como se muestra a continuacion:

El numerador se denomina

suma de cuadrados.

s-

/L x; x ) ~

- l[ ------------

A la varianza se le denomina

cuadrado medio

La forma de operar la podemos ilustrar con el ejemplo que acabamos de ver acerca del

efecto del pH. La tabla de datos queda de la siguiente forma:

pH Rep 1

Rep Rep3 Rep4

medias

3,2 18,8

19,2 18,7

19 1

18,95

3,25 18,8 19

18,7 18,6

18,775

3,3 18,6 18,5 18,4 18,7 18,55

3,35 18,2 18 18 1 17,9 18,05

media global 18,58125

a) La variabilidad dentro de grupos se calcula restando

la

media de grupo a cada una

de las 4 replicas del grupo correspondiente:

pH Rep 1 Rep 2 Rep3 Rep4

3,2

-0

15 0,25 -0,25 0,15



3 25

3 3

3 35

0 025

0 05

0 15

0 225

-0 05

-0 05

-0 075

-0 15

0 05

-0 175

0 15

-0 15

Al elevar al cuadrado cada una de estas diferencias se obtienen los correspondientes

cuadrados, y la suma de todos los cuadrados es lo que denominamos la suma de cuadrados

dentro de grupos:

pH Rep 1

Rep

Rep 3

Rep4

sumas

3 2 0 0225 0 0625 0 0625 0 0225 0 17

3 25 0 000625 0 050625 0 005625

0 030625 0 0875

3 3 0 0025 0 0025 0 0225

0 0225 0 05

3 35 0 0225 0 0025

0 0025 0 0225 0 05

Suma global 0 3575

Esta suma de cuadrados dentro de grupos tiene 12 grades de libertad. Al dividirla por

este dato obtenemos la varianza, que en la nomenclatura ANOVA se denomina cuadrado

medio:

Cuadrado medio dentro grupos es 0,3575/12=0,02979

b a variabilidad entre grupos la calculamos sustituyendo cada dato por la diferencia

que hay entre su media de grupo y la media global:

pH Rep 1 Rep 2

3 2 0 36875 0 36875

3 25 0 19375 0 19375

3 3 -0 03125 -0 03125

3 35 -0 53125 -0 53125

Rep3

0 36875

0 19375

-0 03125

-0 53125

Rep4

0 36875

0 19375

-0 03125

-0 53125

Al elevarlos al cuadrado y sumarlos obtenemos los correspondientes cuadrados y

suma de cuadrados:

pH Rep 1

Rep

Rep 3

Rep4

cuadrados

3 2 0 13598 0 13598

0 13598 0 13598 0 54391

3 25 0 03754 0 03754 0 03754 0 03754 0 15016

3 3 0 00098 0 00098 0 00098

0 00098 0 00391

3 35 0 28223 0 28223 0 28223 0 28223

1 12891

1 82688

Esta suma de cuadrados entre grupos tiene 3 grados de libertad. Como anteriormente,

al

dividir la suma de cuadrados por los grados de libertad obtenemos el cuadrado medio entre

grupos:

Cuadrado medio entre grupos = 1 82688/3=0,60896

Dato que coincide con la varianza entre grupos anteriormente calculada.

El cociente F coincide con el cociente entre el cuadrado medic entre grupos por el

cuadrado medic dentro de grupos:

F=0,60896/0,02979=20,4405, con 3 y

2

grados de libertad.

Todos estes resultados se ordenan

en

una tabla como la siguiente que es la tradicional

tabla de analisis de la varianza, yes

la que nos proporcionara cualquier programa estadistico.



64

V. Ferreira

Fuente de variaci6n

Grados de

Sumade Cuadrado Medio F

Libertad

Cuadrados

Entre grupos

3 1,82688

0,60896 20,4405

Dentro grupos error)

2

0,3575 0,02979 P=0,0001

TOTAL

5

2,18438

La fila encabezada por TOTAL, es Uri calculo de la variabilidad total del sistema.

Como es facil de comprender, esta variabilidad es simplemente la suma de los cuadrados de

las diferencias entre cada uno de los 16 datos individuales

y l

media global,

y

se calcula tal

y

como se explic6 anteriormente. Primero calculamos las correspondientes diferencias:

p Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4

3 2 0 21875 0 61875 0 11875 0 51875

3 25 0 21875 0 41875 0 11875 0 01875

3 3 0 01875 -0 08125 -0 18125 0 11875

3 35 -0 38125 -0 58125 -0 48125 -0 68125

Y luego los cuadrados

y

sus sumas:

p Rep 1

Rep Rep3 Rep4

cuadrados

3 2 0 04785 0 38285

0 01410

0 26910 0 71391

3 25 0 04785 0 17535 0 01410 0 00035 0 23766

3 3 0 00035 0 00660 0 03285 0 01410 0 05391

3 35 0 14535

0 33785

0 23160 0 46410

1 17891

2 18438

6. l modelo subyacente al ANOVA

Siguiendo en detalle lo que hemos hecho al aplicar la estrategia clasica, se pone de

relieve que basicamente lo que hemos hecho ha sido descomponer el conjunto de datos

originales en una media global, una contribuci6n debida al pH

y

un error o residual. Por

ejemplo, el primero de los datos replica 1

de

pH 3,20)

lo

hemos descompuesto de la

siguiente forma:

18,8 = 18,581+0,3687-0,15

18,581 es la media global, 0,3687 es la contribuci6n o efecto del pH 3,20

y

-0,15 es el

residual, que no es mas que la diferencia de ese dato con respecto

l

media de grupo. La

suma 18,581 +0,3687=18,95 es el valor estimado por el ANOVA para una medida realizada a

pH 3,20. Los estimados se denotan por y

Esto puede generalizarse para los 6 datos del ejemplo:

De forma que el dato yij que corresponde al dato

n°

j del tratamiento pH) i, puede

considerarse como la media global, mas la contribuci6n del tratamiento pH) i

correspondiente, mas su termino de error o residual. En terminos matriciales:



[

18 8

18,8

18,6

18,2

0 bien,

19,2 18,7

19,0 18 7

18 5 18 4

18,0

18 1

[

0,219

0,219

0,019

-0,381

19

,11 [18,58

18 6

18 58

18 7 18 58

17,9 18 58

0,619

0 119

0,419 0,119

-0 081 -0,181

-0 581 -0,481

18 58 18 58

18 58 18 58

18 58 18 58

18 58 18 58

18 58

1

r

0 37

0 37 0 37

0 3

7

1

r-0,15

0 25 -0,25

0,225

07

5

-0 05 -0,15

18 58 0 19

0 19 0 19

0 19 0,025

18,58 -0 03 -0 03 -0 03

-0 03

0 05

18 58 ,53 -0 53 -0 53

-0 53

0 15

-0 05 0 05

0,519

1

r 0 37

0,019 0 19

0 119 -0 03

- 0 681 - 0 53

0 37 0 37

0 19

0 19

-

0 03

-0 03

-0 53 -0 53

0 3

7

1

r-Q,l5 0 25 -0,25 0 15

1

0 19 0,025 0 225 075 175

- 0,03 0,

05

- 0 05 - 0 15 0 15

-0 53

0 15

-0 05 0 05 -0,15

0 15 1

-0,175

0 15

-0,15

Donde la primera de las matrices ahora contiene los diferencias entre cada dato con la

media general. Al elevar al cuadrado cada uno de los elementos de las matrices y hacer

la

suma, obtenemos las correspondientes sumas de cuadrados, que cumplen

la

igualdad:

2,1843

=

1,827 0,357

lo que se corresponde con los mismos datos contenidos

en

la tabla ANOVA.

El modele ANOVA,

por

tanto es

un

modele aditivo simple, que nos permite

descomponer cualquier conjunto de datos en

la

contribucion de los distintos factores que

sobre ellos inciden y en

un

termino residual. Desde el punto de vista aritmetico,

la

descomposicion anterior se puede aplicar a cualquier conjunto de datos, pero esto no quiere

decir que

la

aproximacion ANOVA sea valida.

En

principio, esta aproximacion es valida en

l

caso en que los datos de poblacion original procedan de 4 subsets de distinta media y la

misma desviacion tipica. En ese caso, el modele ANOVA permite reducir el conjunto de

datos inicial a la aportacion de cada tratamiento por lo que de ser cierto, podriamos prescindir

tanto de los residues como de los datos originales y concentrar nuestra atencion en el efecto

de los tratamientos.

En

la practica, seria imprudente realizar esta simplificacion sin mas

comprobaciones,

ya

que los datos pueden venir afectados de fuentes de error no contempladas

en el experimento y que de conocerse harian variar de forma notable las conclusiones

extraidas sobre ellos, tal y como ya discutimos al hablar de la aleatorizacion.

Muchos de los efectos supyacentes que pueden afectar a la interpretacion real de los

resultados, pueden hacerse patentes al estudiar los residuales. Por ejemplo, si el tercer dia se

hubiera estropeado el pHmetro o

e

sistema de medida, los residuales obtenidos ese dia

podrian ser particularmente altos. Observa que esto solo lo podrias verificar caso de haber

aleatorizado completamente el experimento. En particular es precise estudiar:

La distribucion de los residues deberia ser

una

distribucion

aproximadamente normal con centro

en

cero

La

relacion entre la magnitud del residue y

la

magnitud de la respuesta

que se estudia representando los residues frente a los valores estimados

por

el modele

La

distribucion con el tiempo de los residues



66

V. Ferreira

Cualquier otra representaci6n de los residuos frente a una variable que

se

considere pueda ser interesante temperatura de laboratorio, analista, dia

de

la semana .. )

Histograma de los residuos:

Histograma residues

menor/igual- entre .{),15 entre .{),05 entre 0,05 mayor a o,15

0,15 .{),

05

0,05 0,15

lue

El histograma nos indica que en este caso, los residuos no parecen distribuirse

de

forma normal,

ya

que los residuos mas grandes son mas frecuentes. De hecho

10

de los

residuos tienen una magnitud superior a 0,149. Podemos aplicar alguna de las pruebas citadas

en el capitulo anterior para verificar la normalidad. La curtosis muestral que a la vista del

histograma es el parametro que puede desviarse de la normal), arroja un valor de -1,18,

claramente por debajo del 0 esperado, lo que muestra que la distribuci6n es mas chata que la

normal. Sin embargo, el intervalo de confianza de este parametro raiz 24/n)) es 1,23, por

lo

que no podemos afirmar que la distribuci6n se aparta de la normal de forma concluyente. De

la

rnisma forma, la maxima diferencia entre las curvas de frecuencia acumulada observada y

la

normal te6rica 0,147-hazlo como ejercicio-) es bastante inferior al valor requerido para el

test de Komogovov-Srnimov 0,213).

La representaci6n

de

los residuos frente a los estimados se puede apreciar en la figura

siguiente:

realdualea va eaUmadoa

0,3

.

•

,2

.

•

.

0

1

. .

.

1

•

18,1 18,2 18,3 18,4

18,5 •

18,8 18,7 18,8 18,9

.

),1

.

• •

),2

.

. ),3

La figura tampoco muestra un comportarniento que podamos calificar de anormal,

aunque nos indica que los residuos tienden a hacerse mas grandes cuando los estimados son

may ores. De hecho, 6 de los valores residuales may ores de 0,14 corresponden a las medidas

realizadas a pHs 3,2 y 3,25, que son los que proporcionan seiiales mas altas. Ademas, los

Unicos

residuales que superan el valor 0,2 corresponden a estas medidas. Dicho de otra forma,

la distribuci6n no normal de los residuos parece deberse fundamentalmente al hecho de que

los residuos correspondientes a los estirnados mas altos son mas altos. La forma de la grafica

es tipica, ya que

se

puede apreciar que aparece una tipica forma de embudo con la abertura



colocada

en

el lado derecho y sugiere que a mayor magnitud, mayor desviacion. Desde el

punto de vista analitico esto quiere decir que aunque la

mayor sefial se obtiene a un pH 3,20,

esta sefial es mas imprecisa. Sin embargo, todo esto se queda

en

observaciones, ya que las

diferencias entre las desviaciones a

pH

3,2 y 3,35 no son significativas, tal y como indica el

correspondiente cociente F:

Siendo el valor critico 9,27. Por lo que no tenemos pruebas de que dicha observacion

no sea debida a causas puramente aleatorias. Sin embargo, hemos obtenido

una

interesante

informacion que podriamos contrastar disefiando nuevas experiencias por ejemplo,

estudiando con mayor detalle lo que le ocurre a

la

precision analitica a dos

pHs

distintos), lo

que enriquece el proceso experimental.

reslduos

v

dlo

0,3

.

0,2

.

.

.

0,1

. .

•

0,5

1

1,5

a

2,5 3 3,5

4 5

•

. . .

•

.

La representacion de los residues frente al dia de la semana se muestra a continuacion:

En

esta representacion se puede apreciar que no hay un efecto importante del dia que

podamos achacar a causas no aleatorias. Para comprobar si el factor dia ejerce

un

efecto

significative

en la

magnitud de los residues, podemos realizar un ANOVA de un factor sobre

los residues. La tabla de ANOVA correspondiente se muestra a continuacion y de nuevo

confirma que el efecto no es significative.

Origen de las Suma de Grados de Promedio de

variaciones cuadrados libertad los

Entre grupos

Dentro de los

grupos

Total

0 081875

0 275625

0 3575

cuadrados

3 0 027291667 1 188208617

2 0 02296875

15

Probabilidad Valor critico

para

0 355507716 3 490299605

Como ejercicio haz la representacion frente al orden

en

que se hizo

la

medicion)

7.- Factor

e

efecto aleatorio teoria del muestreo

El factor de efecto aleatoric mas importante con el que se

ha

de enfrentar el quimico

es el derivado del muestreo. Noes posible analizar un estanque para deterrninar su contenido

en material organico, pero este debe ser conocido.

No

podemos analizar todas las pastillas

fabricadas

por

una industria farmaceutica, pero la cantidad de principia activo debe ser

conocida.

Lo

que hacemos entonces es tomar muestra que es Ia primera etapa del metodo



68

V. Ferreira

analitico ), esto es, tomamos una pequefia fracci6n de la poblaci6n el estanque, o el lote de

pastillas constituyen l poblaci6n). A partir de esta muestra tomada estimaremos las

propiedades de l poblaci6n original. Por supuesto que esta muestra debe ser aleatoria, esto es

todos los individuos de l poblaci6n cada una de las pastillas, o cada una de las unidades de

volumen del estanque) tienen que tener la rnisma probabilidad de ser elegidos.

Para evitar ambiguedades en ellenguaje, a cada una de las fracciones de muestra la

llamaremos incremento de muestra, y al grupo de las fracciones muestra bruta. Como los

materiales el estanque, las pastillas), no son homogeneos, deberemos tomar varios

incrementos de muestra elegidos al azar. Estos incrementos, bien por

separado, bien despues

de mezclarse, senin analizados y el resultado del analisis sera la media aritmetica obtenida en

cuantos analisis se hayan realizado. Este resultado ira afectado de dos fuentes de

incertidumbre, l analitica y

l

muestral. Por consiguiente, para estimar la incertidumbre

global del resultado y por tanto para disefiar el proceso analitico 6ptimo mas adecuado, sera

preciso conocer ambas dos fuentes de variaci6n. El ANOVA puede utilizarse con el fm de

separar ambas fuentes de variaci6n.

Vamos

ver

su aplicaci6n con el siguiente ejemplo:

Deseamos deterrninar el contenido

en

principio activo de un lote de medicamento

formado por 1.000.000 de tabletas. Se tomaron para ello 10 tabletas elegidas al azar, y sobre

cada una de elias se realizaron 3 medidas del principio activo por una tecnica cromatografica.

Tableta

e

medicion

a

medicion

3a

medicion

1 2.92

2.98 2.97

2

3.02 3.06 3.00

3 3.10 3.01 3.08

4 2.87 2.91

2.83

5 2.82 2.85

2.84

6 3.11 3.14

3.08

7

3.14

3.16 3.18

8 3.09 3.07

3.13

9 3.19 3.14 3.19

10 2.82

2.80 2.78

Estimacion de

Ia

varianza dentro de los grupos replicas analiticas)

Esta varianza es debida tan solo, a los efectos aleatorios que acruan sobre l medida, y

no a los del muestreo. La calculamos como l media de las varianzas de cada una de las

1 2

=10

L xij-xJ

=

0,95 ·10 3

triadas de datos:

con 20 grados de libertad.

Estimacion de

Ia

varianza entre los incrementos de muestra.



Esta varianza es debida tanto a los efectos aleatorios que actuan sobre la medida como

a la variabilidad existente entre los incrementos de muestra y que es consecuencia del

proceso de producci6n industrial, son diferencias reales). La calculamos como la varianza

entre las medias de las triadas de datos con 9 grados de libertad):

Como

ya

sabemos, esta varianza de las medias es debida

l

variabilidad muestral

2

md =

0,0184

real que bajo la hip6tesis nula es despreciable) aumentada en la variabilidad analitica

corregida por el nlimero de replicas de cada media:

Ahora bien, si la hip6tesis nula es cierta,

La varianza entre grupos es por tanto,

2 2

Seg = md X

3

=

0,0552

Para comprobar estadisticamente que las variaciones originadas por el muestreo no

son despreciables, basta con aplicar el test F a estas las varianzas entre grupos y dentro de

grupos:

=

0,0552

=

5

8

0 95 ·10-

3

,

,

Siendo el F critico para 9, 20; 2,393, por lo que queda demostrado que la

heterogeneidad muestral ejerce un efecto significative.

Descomposicion de a varianza total

De nuevo se tiene:

2

2 2 s 2

-3

d

=s

___ _

> s =

0 0184-0 95

·10 = 0,0181

m mto 3 mto

Errores en el muestreo estrategia de muestreo

Una vez que hemos deterrninado la varianza asociada al muestreo, junto con la

varianza analitica, podremos optimizar el esquema de muestreo mas analisis que mejor se

adapte a nuestras necesidades. Esto supone elegir cual es el esquema de muestreo mas

adecuado, deterrninar cuantos incrementos de muestra se extraeran del sistema y cuantas

veces se analizaran bien por separado, bien la mezcla bruta).



70

V. Ferreira

r

esquema de muestreo: Como se indic6 en el ejemplo anterior:

Se

toman h incrementos

de muestra y cada incremento se analiza n veces. En esta estrategia se obtiene una media final

promedio

de l sh

medias

den

replicas. La varianza de la media de las medias es:

y el intervale de confianza de dicha media resultado final es

2

2 2

San

S

s -

md

mto

n

Donde

test

calculado con los grados de libertad con que se conoce la varianza de muestreo.

2 2

J l = X± S md = X± S

mto

San

Jii

h nh

En la practica, sin embargo, en lugar de emplear t emplearemos la distribuci6n z , ya que en

las operaciones en las que se estudia la variabilidad de un rimestreo se suele disponer

de

un

nillnero

de

grados de libertad lo sufientemente grandes como para que t y z sean

practicamente coincidentes.

° esquema de muestreo: Se toman h incrementos de muestra y antes

de

analizarse se

mezclan. De la mezcla se realizan n medidas. En este caso el resultado final es la media de las

n replicas analiticas realizadas sobre la muestra bruta o compuesta. El intervale de confianza

del resultado finales en este caso:

Donde igualmente t esta calculado con los grados de libertad con que se conoce l varianza

de muestreo.

Problemas:

2 2

J l = X±

S mto

San

h n

1.- Sabemos a

partir

de experiencias previas que

Ia

varianza debida al muestreo es 10 y

Ia

debida al

metoda analitico 4.(en unidades arbitrarias). Calcula

Ia

varianza de

Ia

media

para

los siguientes

esquemas de muestreo:

a) Se taman 5 incrementos de muestra, se mezclan y se realiza un ana/isis p or duplicado.

b Se taman 3 incrementos de muestra y se analiza cada una por duplicado.

c) Se taman 2 incrementos de muestra y se analizan

por

triplicado.

2.- Se desean conocer las varianzas de medici6n y muestrales del contenido de Nitr6geno Aminico de

un campo de soja. Para determinarlas se tomaron 5 muestras aleatorias de 10 g de soja , y se analiza

cada muestra por triplicado. Se obtuvieron los siguientes valores:

...... ....

.

... ~ ...... ..........

r

d i ~ i 6 ~

f

i ~ i ~ · · · · . .........

3

; . l

r·

· · _ · · _ · : · : · : · : - - · : ·

· · : · : · : · : ~ · : : : · : · : · c : : · : · : · : · : · · · : · : : : : : r § i : :.T·· ··· · : · : · : · : · : · : · : : · · : · : · : c : · ~ : ~ · : · : · : · : : : : :

~

: ; c : ~ ~ ~ : : ~ = : J

............ 13

........

...

J J.1,7

. ··i_····-······ .1. - - - - · · · - - - - - 1

9 l . .

}_Q,} .......................

................

n l _1,2 .. .

. ?,

?

........... J

u

.z J



Determina la variabilidad achacable al muestreo y la causada por el metoda analitico.

Comenta los resultados y propon que estrategia de muestreo es la mas adecuada

para

mejorar los

intervalas de confianza de la media. ;,Merece la pena invertir tiempo y dinero

en

mejorar la precision

del ana/isis?

3.- En la puesta a punta de un proceso cromatografico se desea conocer con que exactitud y precision

se debe controlar la temperatura. Para ella se monitorizan los tiempos de retencion de los analitos a

distintas temperaturas, realizandose esta medida

por

triplicado. Aplicando el metoda de la minima

diferencia significativa determina que oscilacion minima de temperatura causa diferencias

significativas en los tiempos de retencion. Haz un estudio de los residuos.

[ : : : :

f ~ ~ P i . ~ q f . ~ i . q

___ _

1

a me_licion 2°

e d i c i 6

; · - ~ ~ ~ - - ~ ~ ~ i i i ~

~ j ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1

~ ? . _Q_Q __________________ __ _____ 5 } 2 __ _,;, .......... . ~ § ,,.....

• · · ~ ? . ~ . . 9 . . L i

5,39

1

5,38

~ L

J

.. ................. . .9.

5,

3

§ 5,

3 9 - - - - - - - - - - - ~ } 2 ___________

L .

.

.

?. .U................

- ~ - - - - - - - - - - - _________________ 1 2 . __ ___

____ ;_

................

. . ~ 9 . . ......................

;

55,20 i 5,39 f 5,41

;

5,40

;

------------·----·5

---

5

---

,

-

2---5

---·---------------·-r--------_

5. ._,-_4

_

2

-_------- i.·

-------5 4-0-------------T----- ............5

.........

1.......................

. . . - - - - - - - - - _______ ..:;, ...........................

55,

3

o

·

..........

1 . 2

i

5,

4 2

1

_________

}

..

1

.

L

...______

j

55,35

1 . . ? . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . 5,45 _______?..r1.1. _______

_j

4.- Los siguientes resultados muestran el porcentaje del agua intersticial total recuperada al

centrifugar muestras de piedras areniscas tomadas de diferentes profundidades.

Profundidad

m)

Agua recuperada 0/o)

7

33.3 33.3 35.7 38.1 31.0 33.3

8

43.6 45.2 47.7 45.4 43.8 46.5

16

23 72.5 70 .4 65.2 66.7 77.6 69.8

Demuestre que el porcentaje de agua recuperada difiere significativamente de diferentes

profundidades. Uti/ice el metoda de la menor diferencia significativa.

5.- Resuelve aplicando el ANOVA ·el problema 33 del tema

1.

Haz un estudio completo de los

residuos.

6. El departamento de control de residuos

y

medioambiente de una gran empresa qufmica

tiene que determinar cual es

Ia

cantidad vertidapar ana de un cierto contaminante. Para ella

monitoriza el ejluyente a lo largo de varios meses, realizando controles una serie de dfas

aleatoriamente distribuidos) en cuatro distintos puntas de toma de muestra. Los resultados

se muestran a continuaci6n:

Dia

Punta Punta

Punta C

Punta D

1

2,2

3,5 2,7 1,9

2

3,6 2 2,4 3,3

3

4,9

4,1

5,4 5,2

4 4,3 5,1

3,6 5



72

V Ferreira

5

1,7

3,3

2,5 2,9

6

4,5

6,3

4,7 4

7

3,8

3,2

2,3 2,9

8

3,3

2,8

4,2

4,1

9 5,7 5

4,2

5,1

10

5,3

4,2

4,7

3,9

Determina

a) ;,Cuantos puntas de muestreo se deberiancolocar para determinar la composici6n diaria

con un

10

de precision (a=0,05)?;

b)

Manteniendo el numero

de

puntas de muestreo inicial

4),

;,cuantos dias del afio debe monitorizar el efluyente

para

conocer la composici6n media

anual del vertido con una precision de ±0,5 (95 ) ?; c) como b pero con el numero de puntas

de muestreo determinados en a).



Tema 3. Calibraci6n de Metodos Analiticos

1. Funciones de calibracion

Una gran parte de los analisis que se realizan en la actualidad emplean tecnicas instrumentales

tales como la espectroscopia de absorci6n ultravioleta-visible, absorci6n y emisi6n at6mica o

cromatografia de gases y

de

liquidos.

En

todas estas tecnicas, la muestra es sometida a un cierto

estimulo energetico y se mide la respuesta a dicho estimulo absorci6n de luz, emisi6n de luz,

diferencia de potencial, corriente electrica, cambio en el indice de refracci6n .. ). Dicha medici6n se

realiza mediante un dispositivo capaz de convertir dicha forma de energia en una sefial electrica que

puede ser procesada de forma digital. Por tanto, podemos decir que las tecnicas instrumentales

generan una sefial electr6nica que esta relacionada con la concentraci6n o masa de analito presente en

la muestra. La relaci6n existente entre la sefial y la concentraci6n o masa puede ser muy variable. En

algunos casos, como en la Absorci6n Molecular, disponemos de una expresi6n te6rica la ecuaci6n de

Beer) que nos relaciona ambos parametros. En otros casos, como en la mayor parte de los detectores

que se emplean en cromatografia de gases, no hay una teoria que proporcione una ecuaci6n

relacionando concentraci6n y sefial. No importa. Por la forma en la que se realiza el trabajo, lo mas

practico es realizar un calibrado del instrumento introduciendo disoluciones de concentraci6n

conocida, realizando su medici6n, y posteriormente generando una ecuaci6n empirica que relacione la

sefial con la concentraci6n. Incluso en el caso de la absorci6n molecular, en el que la ecuaci6n

es

conocida nadie suele ir a la biblioteca a buscar el coeficiente

de

absorci6n molar del analito en

cuesti6n, para aplicar la ecuaci6n

de

Beer y determinar la concentraci6n. Esto no es practico y no

funcionaria por la cantidad de parametros adicionales que no conocemos. Esta ecuaci6n empirica que

relaciona la sefial medida con la concentraci6n

es

fundamental en el analisis instrumental y la

podemos denominar

funcion de calibracion.

Para determinarla, lo mas frecuente es preparar una serie tipicamente entre 3 y 6) de

disoluciones de calibrado de estructura matricial disolvente, reactivos) lo mas parecida a la de las

muestras. Las disoluciones tendran concentraciones distintas y deberan cubrir todo el intervalo de

concentraciones que nos interese calibrar esto es, las muestras a analizar deberan tener

concentraciones comprendidas entre el calibrado mas diluido y el mas concentrado .

La

funci6n de

calibraci6n en la inmensa mayor parte de los casos es una linea recta.

En

primer lugar, porque en la

mayor parte de las tecnicas analiticas mas importantes la relaci6n entre la concentraci6n y la sefial

es

lineal en un cierto intervalo de concentraciones). En segundo lugar porque el procesado matematico

de funciones mas complejas es mas complicado y lleva asociada una mayor imprecision. En tercer

lugar, porque aunque la relaci6n sefiallconcentraci6n no sea lineal, probablemente podemos buscar un

intervalo pequefio en el que dicha funci6n pueda aproximarse por una linea recta. Si esto ultimo no es

posible o practico, se pueden emplear otras funciones de calibrado pero su tratamiento esta fuera del

alcance del presente curso

. - ---------------------------------------

0,6

0,5

senal medida en

Ia

muestra

0 1

concentraci6n determinada

~ ~ ~

~ ~ ~

0

5

10 15 20 25 30 5

concentrac 6n mg l)

Figura :

Tipica

recta de calibrado



74

V Ferreira

Alternativamente, puede que una pequefia transformacion de la sefial o de la concentracion

nos proporcione la relacion lineal adecuada. Este es el caso de la Absorcion de luz, en el que la sefial

realmente medida no es la Absorbancia, sino la Transmitancia.

La

relacion entre la Transmitancia y la

concentracion es de tipo exponencial. El logaritmo cambiado de signa) de la transmitancia es la

Absorbancia, que guarda una relacion lineal con la concentracion. Los datos obtenidos en el analisis

de las muestras de calibrado se representan frente a la concentracion tal y como se indica en la figura

1. La

concentracion se coloca en el eje de abcisas, y la sefial en el de ordenadas.

Ese conjunto de datos se debe ajustar a una recta de ecuacion

y=

bo b

1

x para disponer de una

ecuaci6n que relacione la sefial con la concentraci6n. Cuando se analiza una muestra de concentracion

desconocida, lo que se hace es interpolar el resultado de Ia medicion esto es, Ia sefial pura o

transformada matematicamente) en dicha recta tal y como se muestra en

Ia

figura 1.

En este epigrafe vamos abordar de una forma elemental las siguientes cuestiones:

1.- ,Como podemos verificar si los datos obtenidos en el analisis de las disoluciones de

calibrado realmente se pueden ajustar a una recta?

2.- ,Como se construye la recta? ,que incertidumbre tenemos en su conocimiento?

3.- ,Cuai es Ia imprecision asociada a

Ia

determinacion de Ia concentracion de un analito en

una muestra empleando Ia recta de calibrado?

4.- ,Como se debe disefiar el proceso de calibracion y analisis para que la incertidumbre sea

minima.

5.- ,Que mas informacion relacionada con el metoda de analisis nos aporta la funcion de

calibracion?

2. Linealidad de a funcion de calibracion

Para averiguar si la relacion entre la sefial y la concentracion responde a una recta, lo mejor es

construir la figura correspondiente representando los pares de puntas sefial/concentracion obtenidos en

el analisis de las disoluciones de calibrado tal y como se hizo en la figura 1. Pero ademas, hay un

parametro estadistico que nos permite evaluar el grado de correlacion lineal entre dos variables. Este

parametro es el coeficiente de correlacion momento-producto o coeficiente de correlacion de Pearson.

Su expresion es la siguiente:

~ ] x ; - x) Y;- .Y ]

r ;

~ L x ; -x)2) L Y;

-.Y 2 ,

[1]

donde Xi e Yi corresponden a la concentracion/sefial del punta de calibracion i, y x e , son los

promedios de las Xi e Yi, respectivamente. El punta definido

par

las coordenadas

x

se denomina

centroide de la regresion.

Si dos variables estan muy correlacionadas esto es, si realmente y=cte x), su coeficiente de

correlacion es 1.

Si estan anticorrelacionadas y=-cte x) este coeficiente es -1, tal y como puedes

comprobar sin mas que sustituir en la ecuacion 1 cada valor de y

par

su correspondiente cte x. Si no

tienen ninglin tipo de correlacion, r es 0.

Tomemos los siguientes pares de datos: a) 1 ,2); 2, 4); 3, 6); 4, 8) y b) 1,6); 2, 2); 3, 8);

4, 4). La representacion de ambas series se puede vera continuacion:

r no es mas que un parametro estadistico empleado para medir la significatividad de la

9

9

R = 1+

8

•

7

6

•

6

.

5

R -

0

•

4

•

3

•

2

•

1

0 0

0

4

0

1

2

3 4

5



correlacion entre dos variables. Para un geologo, la existencia de un coeficiente de correlacion r=O

,S

puede ser indicia de una importante correlacion entre dos variables. En quimica analitica, para

considerar poder emplear funciones lineales de calibracion satisfactorias, r debe ser mayor de 0,99, y a

veces incluso de 0,998. En cualquier caso,

es

conveniente siempre trazar la gratica porque incluso tras

coeficientes muy altos muy cercanos a 1) pueden esconderse tendencias no lineales importantes que,

sin embargo, son facilmente detectadas par supervision visual.

Se puede determinar Ia significatividad de una correlacion empleando el siguiente estadistico

t:

i

Jn-

t ~

a relacion entre la sefial y la concentraci6n no es lineal mas que en un cierto intervalo. El

interval a en el que la relacion se mantiene, se denomina rango lineal del metodo o del instrumento).

Obviamente, este intervalo es un parametro de calidad importante de los metodos y de los

instrumentos de analisis y debe ser conocido. Hay instrumentos de analisis para los que la relacion

lineal se mantiene a lo largo de varios ordenes de magnitud. Par ejemplo, el detector de ionizacion a Ia

llama FID) comunmente empleado en los cromatografos de gases mantiene una respuesta lineal

durante mas de 7 ordenes de magnitud desde 10 picogramos basta

0 1

mg). Sin embargo, el detector

de indice de refraccion empleado en HPLC raramente mantiene Ia linealidad a lo largo de mas de un

arden de magnitud. El que la respuesta generada par un instrumento o detector sea lineal no garantiza

que el metoda lo sea. Par ejemplo, aun empleando un FID como detector, el intervalo lineal de

calibrado puede ser muy reducido si el metoda de analisis esta basado en

Ia

inyeccion de los vapores

del espacio

de

cabeza en equilibria sabre un solido o un liquido.

I. - Estudia el comportamiento lineal de los siguientes pares de datos obtenidos en el ami/isis de un

mismo set de disoluciones de calibrado por distintos metodos de ana/isis y determina en todos los

casos:

a Ia validez del ajuste lineal, el intervalo de calibraci6n lineal y el coeficiente de correlaci6n-

b Caso de que el ajuste lineal no sea posible, determina si se trata de la inexistencia de

correlaci6n entre la senal y la concentraci6n, o a

la

existencia de un tipo de relaci6n

diferente a la lineal.

concentraci6n

OI

O

I5

0 2

0 26

0,3I

0,39

0,

45

0,

5I

0,57

Senali

I

I ,5

2, I

2 5

3,2

3 8

4, I

4,3

4,3

La recta de regresion

ey

sobre x

Sena/2

0 6

I 7

I ,4

2 5

3 8

3 6

4 I

5,3

5

7

Sena/3

I

I 6

2 I

2 8

3,5

4 9

5 8

7

9

Sena/4

2

4

3

I

5

8

4

2

4

Existen diversas formas de generar una recta que represente de Ia mejor manera posible una

serie de pares de valores. a mas comtin emplea el denominado metoda de los minimos cuadrados.

Se

denomina asi porque lo que hace es buscar aquella recta, de todas las posibles, para Ia que la suma de

los cuadrados de los residuos el residua es

Ia

diferencia entre el valor observado de

Yi

y el estimado,

Y; para todos los pares de datos Xi,Yi) sea minima. No nos vamos a entretener en su deduccion

matematica y presentaremos directamente las expresiones que nos permiten calcularlos:



76

V

Ferreit a

pendiente

[ ]

ordenada en el origen

[3]

Conocidos ambos panimetros, para determinar la concentraci6n de una muestra desconocida,

no hemos mas que sustituir el valor de sefial obtenido en la medicion de la misma, y

0

, en la ecuaci6n

de la recta y despejar el valor de la concentracion,

XQ:

Yo bo

x

= [4]

bl

Esta es la denominada recta de regresion de y sobre x. Y aunque parezca extrafio, no es la

misma recta que se obtendria si representaramos Ia

c o n c e n t r ~ i o n

en ordenadas y Ia sefial en abcisas.

a

razon por la que esto es asi, es que

la

recta de regresion de y sobre x supone que la abcisa la

concentracion) se conoce de forma perfecta, sin imprecision,

y

que

la

imprecision esta asociada a la

medida, o sea a Ia sefial. Este supuesto se adapta bastante bien a Ia realidad de Ia medici6n

en

quimica,

ya que las disoluciones de Ia recta de calibrado se pueden preparar con mucha mayor precision de la

que la mayor parte de las tecnicas instrumentales de analisis proporcionan. Si representaramos Ia

concentracion

en

ordenadas y Ia sefial

en

las abcisas, estariamos bajo el supuesto opuesto, esto es,

estariamos considerando que el error mayor tiene Iugar en Ia estimacion de Ia concentracion de las

disoluciones de calibrado y que el de medicion es despreciable. Este supuesto no se corresponde con

Ia realidad.

Tanto Ia pendiente como la ordenada en el origen llevan asociadas una incertidumbre. Estas

incertidumbres se pueden computar en forma de varianza) como sigue:

primero se calcula

la

varianza media de los residuales,

L Y ; -

2

s

= __ __;

n-2

[5]

donde los

Y

son los valores estimados y n el nillnero de pares de puntos de l a recta de calibrado. Este

parametro es parecido a la varianza de una poblacion, con las siguientes variaciones: a) en Iugar de la

diferencia frente a la media, se computa frente al valor estimado; b) el numero de grados de libertad de

una regresion lineal son n-2 y no n-1, como es el caso en el calculo de una varianza muestral. Esto es

debido a que

en una

regresion se necesitan dos parametres pendiente y ordenada

en

el origen) para

definir el conjunto de datos.

A continuacion se calculan las varianzas asociadas tanto a Ia ordenada en el origen como a la

pendiente,

s ; ; ; = : :

o '( -)2

nL J X; x

[6]

[7]

Finalmente, Ia incertidumbre en Ia determinacion de

un

valor de concentracion por

interpolacion de la sefial obtenida en Ia medicion en Ia correspondiente recta de calibrado viene dada

por Ia siguiente formula:

sY

s

b

I

[8]



donde m es el mimero de mediciones replicadas que se han realizado de la muestra problema, Yo la

seiial media obtenida en el analisis de la muestra, y n el nfunero de puntos en la recta.

Al

determinar

una

concentraci6n por

interpolaci6n en

la recta, su intervale de confianza viene definido

por

tanto por:

1.1.=

Xo

± n 2So

Donde Xo es el

valor

de

concentraci6n obtenido

por interpolaci6n en la

recta,

So es el

valor

de

desviaci6n obtenido

con la

ecuaci6n [8], y t es el estadistico con n-2 grados de libertad. Una

representaci6n de los

intervalos

de confianza

obtenidos con la

recta construida

con

los

datos

de la sefial 1 del problema 1

se muestra

a continuaci6n.

4. - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - -- - - - - -- - .

/

. ..-

3 5

, . L _ ..

Y o 1····················· · ···· ·············································· ·································· · ··· ··························

- ~

v(.--r

, . ~ / ~

2,5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -; / ; - ~ : . _ _ _ , . ' - ~

- + - -

--f-. - : - - - - - - - - - - -1

/ .. ..--

r - - - - - - - - - - - - - - - ~

~ ~

- - - - + - - - ~ - + - - - - - - - ~

. ..r _ / ,..

......"'

/

_ .. ..

1,5 - - - - - - - - - -/ ~ _ _ _ , . . 4 - _ , . . , . : . - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - l

/ .. ..--

/ /

/

interwlo de conftenza

, - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - t = : : : : ; = = : ; r - - - - - - - ~

+ - - - ~ - - - - . - - - - - - - - - ~ - - - - - -

- - ' - ~ T ~ - - ' - - - - - - - - - - - 1

0 0,

05

0,1 0,15 0

,2

0,

25

0,3

Xo

0,35 0,4 0,45

Concentracl6n

2.- Con los datos del problema I que se ajustan a una recta construye Ia correspondiente recta de

regresi6n calcula los intervalos de confianza tanto

de Ia

pendiente como de

Ia


y determina Ia concentraci6n con sus correspondientes intervalos de confianza de una disoluci6n

cuya senal

p r Ia

tecnica I fue de 3 I5.

Una simple inspeccion visual de la ecuacion [8] y de la figura anterior nos permite extraer las

siguientes conclusiones acerca de la precision en toda medicion que emplee una recta de calibrado:

1.- Cuantas mas replicas de la muestra, mejor. Aunque a partir de 3 datos la mejora es

residual.

2.- El nfunero de puntos

en

la regresion juega un doble efecto en la incertidumbre de

una

concentracion interpolada. Por una parte afecta directamente a la imprecision S

0

,

y por otra

parte afecta a los grados de libertad con que conocemos t. Es conveniente que n sea por tanto

no inferior a 6.

3.-

La

cercania de la muestra al centroide de la regresion es muy importante.

La

maxima

precision se da en el centro.

efe to n puntas en regresi6n

0,2 -r-----------------

---------------

L

0,18 ---------,..........._: - - - - - - - - - - - - - - - - - -.--/

- 7 ' - - - - - - l

0

6

+-----------' --:

----::--------:=::::-----

-

0,14

.J-------------======:::::::::.-------------1

0,12 r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~

0,1 r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~

0,08 r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~

006 --------: , -----------------------:=------l

------------------

0,04

= = =

: : i ~ ~ i i m i i i i M m ; j ~ ~ = j

,02

0,5

1,5 2,5

S o ~ a l

3,5 4,5

- - - n = 3

-

---

n=4

n•5

- t--n=6

-n=e

-r\ '10

· - - ~ - - n=20



78

V

Ferreira

Efecto

de

m (n=6)

0,04

0,035

0,03

m=1

0,025

- - - -m=2

m=3

0,02

M m=5

0,015

m=10

0 01

·· · ·· m=2

0,005

0,5 1,5 2,5 3,5 4,5

Seftal

Algunos de esos efectos se visualizan en las figuras anteriores.

3.- Para investigar Ia posible existencia de efectos de Ia matriz en un metoda de ana/isis se han

realizado sendas rectas de calibraci6n en dos medias matriciales diferentes . Comprueba

si

hay

evidencias significativas de dicho problema aplicando el test t a las correspondientes pendientes y

ordenadas en el origen.

Concentraci6n Matriz I Matriz 2

10

8 7 13 2

15

10 6 15 3

20 12 6

17 5

25 14 4 19 5

30 16 5 21 7

35 18 6 23 7

4. El modelo subyacente a a regresion

4.1 Recta de Regresi6n

y

ANOVA

Desde el punto de vista estadistico, Ia recta de regresion esta muy relacionada con el analisis

de Ia varianza, porque como el, Ia recta de regresion es un modelo aditivo simple que nos permite

simplificar y predecir el comportamiento de un sistema natural. Como vimos en los epigrafes

anteriores el ANOVA nos permite separar las fuentes de variacion que intervienen en un sistema, de

forma que Ia variabilidad total se considera Ia suma de Ia variabilidad deb da al factor o a los

factores) mas Ia debida al error experimental. En el caso de Ia regresion ocurre algo muy similar.

La

variabilidad del conjunto original de datos se descompone en Ia explicable por el modelo lineal Ia

recta de regresion) yen Ia debida al error que es Ia varianza contenida en los residuales). Esto es, los

residuales son

Ia

parte de variacion del sistema original que no es explicada por Ia recta y constituye el

error aleatorio.

El modelo de regresion establece que un resultado dado,

Yi

se

puede descomponer

de Ia

siguiente manera:

yi=bo +

b1xi

+error= valor estimado

+valor

residual, Y = y +

£ ;

donde Y;=

b

+

h

1

X ; ,

o en notacion matricial:

Y

=

XB

+

R

=

Y

+ R donde

Y

contiene los datos de seiial originates es un vector columna),

B es

Ia

matriz horizontal que contiene los parametros de

Ia

regresion boy

bl),

X es la matriz que

contiene los datos de concentracion.,

Yes

un vector columna que contiene los valores estimados, y R

es otro vector columna que contiene los residuales.



[

Y1]

[1 x1]

[ 1] [Y1] [ 1]

· · · = 1 · · ·

0

b

1

]

+ · · ·

=

· .·

·

+ · · ·

Yn 1 xn &n Yn &n

La variabilidad del conjunto de datos Y original, se computa como la

suma

de los cuadrados

de las diferencias de cada

i

frente ala media j i como de costumbre. La variabilidad retenida

por

el

modelo puede calcularse mediante

la

suma de los cuadrados de las diferencias de los valores

estimados frente al valor

j i

, y frnalmente

la

variabilidad no explicada por el modelo y englobada en el

termino error, se calcula como

la

suma de los cuadrados de los residuales.

En

terminos matriciales,

esto deriva de la igualdad anterior restando a ambos miembros j i :

Por lo que de forma exactamente igual que en el caso NOVA, se han de cumplir las

siguientes igualdades entre las correspondientes sumas de cuadrados:

Y; - ji

2

= Y;- ji

2

£

Y entre los correspondientes grados de libertad:

n-1=1 n-2

El

primer termino de los cuadrados se corresponde con

la suma

de cuadrados denominada

Total,

el

segundo es la suma de cuadrados

de la

Regresi6n, y

el

tercero el Residuo o Error.

De manera analoga al NOVA, en la regresi6n lineal tambien se formula una hip6tesis nula.

Esta hip6tesis es que la relaci6n observada entre los pares de datos xi.

Yi

es puramente aleatoria, no

existiendo efecto del factor concentraci6n en

la

magnitud de la sefial medida.

Para

aceptar o rechazar

dicha hip6tesis se calcula una F entre el cuadrado medio residual y el cuadrado medio

de

regresi6n y

los datos se ordenan como en la tabla de

NOV

A tradicional.

3.-

La

tabla de ANOVA obtenida para

Ia

regresion de

Ia

senal sabre

Ia

concentracion con los siete

primeros pares de datos del problema 1 se muestra a continuacion: [los datos son los siguientes:

0,1;

1),

0,15; 1,5), 0,2; 2,1), (0,2

6;

2,5), 0,31; 3,2), 0,39; 3,8), 0,45; 4,1)]

Sumade Gl

Media

F

fS ig.

ruadrados

'(::uadriztica

Regresion 7,983

1

7,983

409,472

000

Residual

9,747E-02 5

1,949E-02

Total 8,080 6

a Variables predictoras: Constante), CONCENTRACION

b Variable dependiente: SENAL

explica como se ha obtenido esta tabla y deduce las formulas para su cizlculo.

4.2. Descomposici6n

e

los residuales de

a

regresi6n

Hay dos posibles razones por la que los residuales pueden ser altos, y merece

la

pena saber

diferenciar entre ambas.

En

primer Iugar los residuales podrian ser altos si el metodo es impreciso,

aunque la linealidad sea muy buena.

En

segundo Iugar el metodo podria ser muy preciso pero ser poco

lineal. La unica forma posible de averiguar cual de estas dos causas es

la

responsable, o al menos de

saber

en

que proporci6n contribuyen ambas al tamafio de los residuales, es realizando h analisis

replicados de los n calibrados, de forma que para cada punto de concentraci6n xi, dispongamos de h

sefiales Yij· Los cuadrados asignados entonces a los residuales pueden descomponerse en imprecision

suma de los cuadrados

de

las diferencias de cada una de las replicas frente a su correspondiente valor



80

V Ferreira

media) yen falta de ajuste (suma de los cuadrados de las diferencias entre Ia media de las replicas y el

valor estimado

.

Esto es:

ij

ij

4.- Considera los datos obtenidos en

el

ami/isis repetido

de

disoluciones de calibrado por dos

tecnicas distintas:

Calibrado

Tecnica 1 Tecnica 2

10

mg/L

0 28

0 32

10

m14 L

0 36

0

33

20mg/L

0 46

0 51

20

mg/L

0 57 0 53

30 mg/L 0 69 0 65

30 mgll

0 75 0 65

Realiza en

ambos casas

los calculos

de

las ecuaciones de Ia recta y

del

coejiciente

de

regresi6n.

Cage

los residuales y calcula las contribuciones de

Ia

imprecision y de Ia falta de ajuste. Haz un

diagn6stico

acerca de

ambas

tecnicas y

prop6n

Ia

mejor

soluci6n.

4.3. Diagn6stico del modelo mediante el estudio de los residuales

Ademas de separar las fuentes de error en los residuales, su estudio puede resultar muy util

para realizar un diagnostico de Ia regresion. La regresion lineal tal y como

Ia

hemos vista, esta

asentada en una serie de presupuestos. Alguno de elias ya lo conocemos (el error en X es

despreciable), pero hay otro que no hemos enunciado

de

forma explicita (aunque se desprende de

lo

anterior). Este presupuesto es que los residuales

se

deben distribuir de forma absolutamente aleatoria,

y por tanto,

Ia

representacion de los mismos, bien frente al tiempo, bien frente al eje X, no debe

revelar Ia existencia de ningtin patron o modelo. Las siguientes figuras ilustran las distintas

situaciones.

0

0 0 0

..

0

0

0

0

0

-

0

-

r

0

0

r

0

;::l

;::l

;::l

0

0

0

0

-

Cll

Cll

Q

Cll

Q

Q

tiempo

1 <

concentraci6n

1 <

1 <

La primera de las figuras denota que el residual va aumentado conforme fuimos analizando las

muestras de calibrado (que deberian haberse introducido siguiendo un arden aleatorio. Esto nos esta

indicando que

Ia

precision de nuestro metoda vario a

lo

largo del tiempo, y que las ultimas medidas

que hicimos eran mucho mas imprecisas que las primeras. Esto puede ser un indicia de que algtin

instrumento dejo de funcionar

de

forma correcta en un cierto momenta (por ejemplo un medidor de

pH, una sonda de temperatura ...).

La segunda de las figuras denota un comportamiento totalmente normal. No se observa ningtin

patron. Es

lo que

deberiamos esperar tanto en

Ia

representacion residuaVconcentracion como

residuaVtiempo.

a

tercera de las figuras nos ilustra un efecto parecido al que observamos en

Ia

primera. Aparece una forma de embudo caracteristica que nos indica claramente que

Ia

imprecision

aumenta con Ia concentracion. Este efecto es frecuente en analisis instrumental, ya que en muchas

ocasiones el error absoluto no se mantiene constante al cambiar Ia concentracion, mientras que si que

lo hace el error relativo. En este frecuente caso Ia recta de regresion tal y como Ia hemos calculado no

es

adecuada y debe calcularse una recta

de

regresion que de mas peso a los datos mas precisos. A este

tipo de rectas se les denomina rectas de regresion ponderadas.



5. Rectas de regresion ponderadas

Si la desviacion relativa permanece constante,

y la

absoluta aumenta de forma proporcional a la

concentracion, se puede introducir la siguiente ponderacion donde

ro

es la ponderacion que

introduciremos al punto i de la recta

de

calibrado):

1

{ i [9]

X

Esta ponderacion no puede aplicarse de forma directa, logicamente, en el caso de que una de las

concentraciones sea cero.

Otra ponderacion posible es corregir cada punto de la recta de regresion por su imprecision, medida

como varianza:

1

{ i

=

sy

[1 0]

Ahora se calculan los nuevos centroides de la regresion:

L{J ;Y;

[11]

[12]

y

a continuacion los nuevos parametros de la regresion:

[13]

[14]

Ejemplo. Tras un estudio previa de residuales, un laboratorio analitico ha determinado que

Ia

varianza de Ia senal aumenta de forma proporcional a Ia concentraci6n,

por

lo que ha decidido

construir una recta de calibrado ponderada. Para obtener los correspondientes factores de

ponderaci6n h decidido determinar /a.senal cinco veces a cada concentraci6n. Se da

Ia

senal media

y Ia desviaci6n estimdar a cada valor de concentraci6n:

X

0 1

10

20

30

40

50

y

4

21,2

44,6

61,8

78

105,2

Si

0,71

0,84

0,89

1,64

2,24

3,03

Lo primero es calcular los factores de ponderacion aplicando la formula 10

y

las nuevas coordenadas

del centroide mediante la

11 y

12,

Wi

1,984

1,417

1,262

w x/L wi

0,037

2,652

4,725

w y/L wi

1,485

5,623

10,537



82

0,372

0,199

0,109

2,087

1,492

1,019

4,300

2,909

2,144

X V y V

L.=5,343 L.=12,013 L.=26,999

V erreira

A continuacion se determina la pendiente y la ordenada en el origen como es habitual pero empleando

las formulas 14 y 15, en las que los productos cruzados y la suma de cuadrados de x estan ponderadas:

Xi-Xw Yi-Yw w(xi-Xw)

2

w(xi-Xc}(Yi-Yw)

-11,913 -22,999 281,54 543,53

-2,013 -5,799 5,74 16,55

7,987 17,601 80,53 177,47

17,987 34,801 120,29 232,73

27,987 51,001 156,10 284,47

37,987 78,201 157,17 323,56

L.=801,38 L.=1578 31

Par

lo que la pendiente de la recta ponderada es 1,969 y la ordenada en el origen 3,339. Esta recta es

bastante parecida a la que obtendriamos empleando la regresion normal y=2,818+1,985 x) pero al

estar su centroide mas cercano al origen proporciona menos error en la zona inferior de x.

La otra ponderacion posible es la 1/x. En ella, los factores de ponderacion y las coordenadas del

centroide son:

Wi

Wi X/ i.Wi wi y/L.wi

10

0,0978

3,9107

0 1 0,0978 0,2073

0,05 0,0978

0,2180

0,0333 0,0978

0,2014

0,025 0,0978 0,1906

0,02 0,0978 0,2057

X V

Y V

L.=10,228 L.=0,5866

L.=4,9337

Y realizando los calculos correspondientes, se obtiene la recta de calibrado de ecuacton

y=3,792+1,946 x, parecida a las anteriores pero cuyo centroide se sima todavia mas cerca del origen.

La

comparacion de los residuos obtenidos par las tres tecnicas se muestra en la figura siguiente.

5

4

3

'

u

'

1

• regresi6n normal

1;

:::1

tl

0

• ponderaci6n 1/s2

·u;

c;n

il

1nn

f

-1

0

" ponderaci6n

1 x

-2

r

l

-3

-4

"

-5

estimados

Como puede apreciarse, no hay excesiva diferencia en el tamafio de los residuales, tan solo se observa

que el punta primero el residual mas pequefio corresponde a las rectas ponderadas y que en el punta

mas alto ocurre lo contrario.



nlo

que si que hay una diferencia radical es en la forma de los intervalos de confianza de los valores

detetminados en una recta o en otra. n la recta ponderada, la varianza de los residuales y las

incertidumbres en el calculo de la ordenada en el origen y en la pendiente se obtienen mediante las

formulas siguientes:

Finalmente, los intervalos de confianza de una concentraci6n determinada par interpolaci6n

son:

sy

s

I

[18]

n 2

[19]

ws es el factor de ponderaci6n empleado en la sefial de la muestra)

La representaci6n de los intervalos de confianza se muestra en la figura siguiente.

-10 10 20

3 40 5 6 7



84 V.

Ferreira

6. Calibracion por adicion estandar

6.1. Efecto matriz

Las rectas de calibrado, en particular sus pendientes, son la mejor herramienta de que

disponemos para verificar si un metoda de amilisis o una tecnica instrumental viene afectada por lo

que denominamos efectos de la matriz. Baja esta denominacion nos referimos a un conjunto mas o

menos complejo de efectos causados

par

diferencias en la estructura matricial de las muestras y de las

disoluciones de calibrado que tienen como consecuencia la alteracion de la relacion existente entre la

sefial

y

la concentraci6n. Por ejemplo, en la determinacion de hierro en plasma sanguineo par

Espectroscopia de Absorcion Atomica puede ocurrir que a igualdad de concentracion de hierro, no

den la misma respuesta una disolucion sintetica (conteniendo agua, hierro patron

y

un tampon) que

una muestra real (que contiene proteinas, grasas, distintos acomplejantes . . . Esta diferencia de

comportamientos entre las disoluciones de calibrado, par fuerza sinteticas, y las muestras reales es

fuente

de un

gran nfunero de errores que deben ser detectados y corregidos. Para detectarlos lo mejor

es comparar las rectas obtenidas en el analisis de disoluciones sinteticas y las obtenidas en el analisis

de muestras reales a las que hemos afiadido cantidades conocidas de analito. Si no hubiera efectos de

la matriz, las rectas obtenidas en ambos casas deberian tener la misma pendiente. Para comparar

ambas pendientes, basta con aplicar un test t sabre ambos datos empleando las desviaciones de las

pendientes tal

y

como se calcularon en e1 epigrafe 3.

6.- Para verificar si un metoda de

am

i /isis de THT (tetrahidrotiofeno) en aguas residuales

pr

esenta

efectos de

Ia

matriz se han analizado una serie de disoluciones de calibrado obtenidas disolviendo

distintas cantidades de THT en agua y una serie

de

disoluciones de agua residual a las que se les ha

anadido cantidades crecientes de T T Campara ambas rectas y determina si se puede afirmar si el

metoda esta fibre de efectos de

Ia

matriz o

no.

calibrados

Concentraci6n (mg/L)

Senal

M. tr d des as

opa as

Concentraci6n anadida

(mg/L)

senal

0

0,067

1 2

3 4 5

0,081

0,094

0,109 0,124

0,136

El estudio de regresi6n de ambos sets de pares de datos nos proporciona los siguientes resultados:

pendiente recta normal

Ordenada recta normal

pendiente recta adici n

Ordenada recta adici n

0,01454 desviaci n 1

0,00156

0,01397

desviaci n

2

0,0669

0,000173

0,000201

Como las desviaciones

de

sendas pendientes son muy parecidas, cociente F=1,35

p

=0,37)

pod

emos

hallar una desviaci6n conjunta ponderando cada una

por

sus grados de libertad:

Desviaci6n conjunta= 0, 000186

y

ahara no enemas mas que aplicar el test t correspondiente:

t

0 01454-0,01397 4

33

0 0 0 0 1 8 6 ~

par

lo que Ia diferencia entre ambas pendientes

es

significativa con una probabilidad 0,0019 y par

tanto hemos demostrado

Ia

existencia de efectos

de

Ia matriz.



Caso de que ambas pendientes sean significativamente diferentes, no es posible realizar el

calibrado de la muestra con la recta construida mediante el analisis

de

disoluciones sinteticas,

ya

que

estariamos introduciendo un error sistematico con signo defmido), y de magnitud desconocida, ya

que lo mas probable es que la relaci6n sefial/concentraci6n no solo sea diferente entre estandares y

muestras, sino que lo sera tambien entre muestras distintas con estructuras matriciales diferentes. Ante

este problema se pueden intentar distintas estrategias, bien dirigidas a la mejora de la sefial, bien

dirigidas a emplear otro tipo de calibraci6n. Para mejorar la sefial se puede intentar lo siguiente:

a) diluir la muestra con lo que podriamos conseguir que el efecto causado por los

componentes de la matriz distintos del disolvente, disminuya en intensidad

b) introducir alglin paso de limpieza para elirninar de forma total o parcial las

sustancias causantes del problema.

c) Introducir un paso de aislamiento, de forma que el analito se transfiera a una fase

diferente, aislandolo del resto de componentes de la matriz

d) Introducir un estandar intemo que se comporte de forma similar al analito.

AI

hacer esto, la sefial con la que trabajaremos no sera la sefial directa, sino la sefial

relativa a la de estandar intemo. Si ambas moleculas se comportan de manera

parecida frente a los componentes de la matriz, el problema podria estar resuelto.

e)

Si

es posible, se puede realizar la recta de calibrado en una matriz identica a lade

la muestra

Si ninguna de estas estrategias funciona o si complica excesivamente el procedirniento

de

analisis, puede optarse por emplear una recta de calibrado especifica para cada muestra, mediante el

metodo de la adici6n estandar.

6.2.

l

metodo de

a

adicion esttindar

Si no es posible realizar un calibrado con disoluciones sinteticas, debe realizarse el calibrado

por adici6n estandar. Como explicamos anteriormente, de lo que se trata es de afiadir cantidades

crecientes y conocidas de analito sobre la muestra,

de

forma que conozcamos en una matriz identica a

la de la muestra cual es la sefial asociada a una cierta concentraci6n de analito esto es, cual es la

sensibilidad o pendiente de la recta de regresi6n).

La ecuaci6n de la recta de adici6n estandar y

=

b

0

b

1

x esta representada en la figura inferior.

Puede apreciarse que la sefial de la muestra es justamente la ordenada en el origen si el experirnento

esta bien disefiado, la ordenada en el origen de la recta es una estirnaci6n de la sefial de la muestra

mejor que la obtenida en la medici6n directa).

r--------------------------------------------.

iii

•C

C

II

concentraci6n

en a muestra

adicion estandar

2

-0,05

concentracion aliadida

4

6

La concentraci6n se calcula entonces dividiendo la sefial estirnada para la muestra esto es,

I

a

ordenada

en

el origen de la recta), por la sensibilidad o sea, por la pendiente).

Puedes comprobar que en el caso del problema anterior Ia concentraci6n de Ia muestra es:

C=ordenada/Pendiente=O 066910 01397=4 79 mg/L

i por l contrario dicha concentraci6n se hubiera deterrninado interpolando Ia sefial de

Ia

muestra

en Ia recta de calibrado construida con disoluciones sinteticas

l

resultado obtenido hubiera sido

4 50mg/L.



86

V

Ferreira

Desde el punto de vista matematico, esta concentraci6n no se

ha

determinado por

interpolaci6n en la recta de calibrado, sino por extrapolaci6n de la misma, tal y como se muestra en la

figura construida con los datos del problema 6). Por esta raz6n nose pueden aplicar de forma directa

la ecuaci6n [8] para el calculo de la imprecision. En su lugar se debe aplicar la siguiente formula.

s 1

2

s ~ - y [17]

0

b

n

b

2

~ x i

2

de donde se deduce que la precision crece cuantos mas puntos introducimos y cuanto mayor intervalo

de x cubrimos.

Puedes comprobar que para el caso anterior,

la

imprecision es 0,107 mg/L.

l metodo de la adici6n estandar tal y como lo hemos explicado es particularmente sensible al

problema enunciado al introducir las rectas ponderadas una incertidumbre de la sefial creciendo con

la concentraci6n), ya que es fundamental asegurar que los residuales de la medida correspondiente a la

muestra en la correspondiente recta de calibrado son pequefios. Si se tiene la precauci6n de que la

cantidad de muestra adicionada no sea excesivamente grande,

~ s t

es poco probable que ocurra. Si por

el contrario se detecta dicho problema sera preciso que la recta de adici6n estandar sea una recta

ponderada. n dicho caso, el error estandar del resultado extrapolado se puede estimar mediante la

siguiente ecuaci6n:

sY

s

0

b

1

1

2

m

[18]

En cualquiera de los casos, los intervalos de confianza de la respuesta vienen defmidos por la

expresi6n:

X

0

± 1:n 2So

7.- Rectas de calibrado como parametros de calidad y diagnostico de metodos de analisis

La recta de calibraci6n contiene informacion muy importante con respecto a la calidad de un

metodo de analisis.

La

pendiente esta relacionada con la sensibilidad, aunque para poder hacer

comparaciones es preciso detallar un gran mimero de condiciones. Su estudio ademas nos puede servir

para diagnosticar cambios en la sefial al cambiar la matriz lo que denominamos efectos de la matriz)

tal y como vimos anteriormente. La ordenada

en

el origen esta relacionada con el limite de detecci6n

del metodo.

7.1- Limite de deteccion de

un

metodo que emplea calibracion lineal

Como ya comentamos anteriormente, si se cumplen los requisitos que hacen posible la

aplicaci6n del metodo de los minimos cuadrados para construir una recta de calibrado, la ordenada en

el origen de la recta de calibrado constituye

una

muy buena estimaci6n del valor de la sefial del blanco

y ademas la varianza de los residuales constituye una muy razonable estimaci6n siempre que se

cumpla el presupuesto de varianza independiente de la concentraci6n) de la varianza del blanco.

Una

defmici6n aceptable de limite de detecci6n es la siguiente:

Es la concentraci6n de analito que proporciona una sefial igual a la de

la


aumentada en 3 veces su desviaci6n estandar. Esto es, la concentraci6n para la que la sefial es b

0

+3Sb

0

,

donde Sbo se calcula como se indica en el epigrafe 5.3.

7.

Determina el limite de detecci6n del metoda presentado en el problema

5

Emplea ambas rectas

ponderada y normal) y discute los resultados.

7 2.- Otros usos de las rectas de regresion

Las rectas de regresi6n tambien pueden emplearse para comparar dos metodos de analisis.

n

particular, si tenemos

un

metoda de

referenda

frente al que queremos comprobar un nuevo metodo de



analisis, podriamos analizar un conjunto de muestras al menos 8) por ambos metodos y estudiar la

regresi6n existente entre los datos obtenidos por el metodo nuevo y los obtenidos por el metodo de

referenda. Como el modelo de regresi6n que hemos estudiado parte del supuesto de que no hay error

en x, el metodo de mayor precision habitualmente el de referenda)

es

el que debe colocarse en este

eje. i ambos metodos fundonan de forma satisfactoria, deberemos obtener una recta de pendiente 1 y

ordenada en el origen cero. Desviaciones de la pendiente indicarian una inadecuada calibrad6n en uno

de los casos. Desviadones de la ordenada en el origen indicarian una interferencia o una mala

correcci6n del fondo. Para realizar la comparaci6n con criterio estadistico, se debe aplicar el test t para

comparar un valor con un valor conoddo.

8.- Se esta comparando

un

nuevo metoda para Ia determinacion de

Plomo

en

piensos

frente a un

metoda de referencia. Para ella, se analizaron 10 muestras distintas por ambos metodos. Empleando

Ia recta de regresion entre ambos set de datos, comprueba si

el

nuevo metoda proporciona resultados

comparables

a/ de

referencia no olvides que

el

metoda de referencia debe ir en

el

eje de abcisas).

muestra

Metoda

Referencia

Nuevo Metoda

1

0 16

0 19

2

0,35

0 36

3

0,59

0,63

0,05

0,05

5

0,23

0 27

6

0,98

1,01

7 8

0 73 0 056

0,81 0,055

9

0,43

0,44

10

0 17

0,21

La recta de regresi6n tambien puede emplearse para verificar si una distribuci6n de

datos se ajusta a la normalidad. Esta utilidad esta basada en el hecho de que la curva

de

frecuencia acumulada de la distribuci6n normal, que es una sigmoide, cuando la frecuencia se

representa en escala logaritrnica, pasa a convertirse en una linea recta. Por lo tanto,

si

representamos el logaritmo de la frecuencia acumulada frente al valor absolute o

transformado en z), debemos obtener una recta, coeficiente de regresi6n lineal alto y un

estudio de los residuales no nos debera mostrar indicios de comportarnientos no lineales).

9.- Calcula Ia concentracion de Ia muestra de abono utilizada en Ia adicion estandar del problema

10. Campara

el

resultado obtenido con

el

que se obtiene por interpolacion del data de ana/isis de Ia

muestra en Ia recta de calibrado obtenida mediante el ana/isis de disoluciones de calibrado

sinteticas.

11.- Se esta estudiando

el

papel del pH sabre

una

senal analitica de Pb. Los resultados se tienen en Ia

tabla

siguiente. Exam na Ia posible existencia de una relacion lineal entre

el pH

y Ia senal generada.

Considera

en

Iugar de pH Ia concentracion de H+, y averigua si Ia relacion puede

ser

lineal.

pH

1 2 3 4

3.20 18.8 19,2

18 7

19,1

3 25

18,8 19,0 18 7 18 6

3 30 18 6

18,5 18 4

18 7

3 35 18,2 18,0

18,1 17,9

12.- Estudia Ia

posibilidad

de que Ia variacion de tiempos de retencion con Ia Temperatura que

se

ha

estudiado

tenga unaforma

lineal.

Encuentra en ese caso Ia ecuacion de Ia recta correspondiente, los errores de Ia pendiente y Ia

ordenada en

el

origen, y predice cual sera

el

tiempo de retencion

si

Ia temperatura del sistema es de

55. 50°C.

1

Cual sera

el

intervala de confianza de esta prevision?

L ~ . : ~ ~ ~ ~ t ~ ~ l i ~ . ~ . ~ i _ q ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ] ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ i i ~ ¥ _ q ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ r = ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ i 2 ~ 4 I ; J ~ ~ ~ ~ - ~ : : . I ~ ~ : : : ~ ~ ~ ~ i i . ~ ~ i £ ~ ~ ~ : : ~ ~ : : : : : : l

~

..

_ _ }.}8

~ } _ z _ _____J

5

_§

_________

:

_

_________

l ~ . Q L ____________j

________________ L_

l } § ___

...

_ J _

l ? l _ ________________

55 10 5 38 5 39 5 39

-------------------;--------------------------------------Y-------------·-·-------·;;..--------------··-··-----------··--- e

__________ ~ _ }

_____________

j_______ __ _ } 9 _

_______

L L ' f Q __l

_ _ _

__

_ _

39 _ ;



V.

Ferreirp

13.- Los siguientes resultados muestran el porcentaje del agua intersticial total recuperada

al

centrifugar muestras de piedras areniscas tomadas de diferentes profundidades.

Agua

recuperada 1/o)

Profundidad m)

33.3 33.3

35.7 38.1 31.0 33.3

8

43.6 45.2 47.7 45.4 43.8

46

.5

16

73.2 68.7 73.6 70.9

72.5 74.5

23

72.5 70.4 65.2 66.7 77.6 69.8

Investiga si la dependencia existente entre la profundidad y la cantidad de agua intersticial es lineal.

que rango de profundidades podrias hacer la suposici6n de que la relaci6n es lineal, y con que

error?.

14.- La respuesta de un ensayo colorimetrico

para

glucosa GLU) se contro/6 con la ayuda de

soluciones estimdard de glucosa. Determina el coeficiente de correlaci6n a partir de los siguientes

datos y comenta los resultados.

Concentraci6n de GLU,

mM

Absorbancia

0 2 4 6 8 1

0.002 0.150 0.294 0.434 0.570 0.704

15.- Se obtuvieron los siguiente resultados cuando se analizaron una serie de soluciones estimdar de

plata

por espectrometria de absorci6n at6mica de llama:

Concentraci6n ng/mL

Absorbancia

0 5 1 15 2 25 30

0.003 0.127 0.251 0.390 0.498 0.625 0. 763

Determina la pendiente y la ordenada en el origen de la grajica de calibraci6n, junto con sus limites

de confianza.

Estima los limites de confianza

para

las concentraciones de

plata

en una muestra que proporciona

una absorbancia de 0.308, 0.314, 0.347 y 0,312 en cuatro ana/isis separados.

Estima ellimite de detecci6n del ana/isis.

16.- El contenido de oro de una muestra de agua de mar concentrada se determin6 por

espectrometria de absorci6n at6mica mediante el metoda de las adiciones estandar. Los resultados

obtenidos fueron los siguientes:

Oro aiiadido, ng por mL

de muestra concentrada

Absorbancia

0 10 20 30

4 5

60 70

0.257 0.314 0.364 0.413 0.468 0.528 0.574 0.635

Estima la concentraci6n de

Au

en agua de mar, y determina sus limites de confianza.



Tema 4. VALIDACION Y CONTROL E

C UD D

EN QUiMICA

ANALiTICA

Contenido:

Introduccion, Validacion de metodos de ami/isis. Concepto. Validacion de Ia exactitud y

trazabilidad. Vision general

de Ia

Validacion

de

metodos de ami/isis. Ensayos

de

control y

puesta en marcha. Una vision general del concepto de Calidad en transparencias);

Normalizacion en transparencias); Trabajo en entornos regulados BPL en transparencias);

Acreditacion de laboratorios

en

transparencias)

1 Introducci6n

La Quimica Analitica siempre se ha preocupado por la calidad de sus resultados, y

desde hace mas de 100 afios ha incorporado elementos estadisticos para seguir y controlar

dicha calidad. La mayor parte de dichos elementos han sido expuestos en los capitulos

anteriores y puede decirse, por tanto, que forman parte del tronco esencial de la quimica

analitica. Sin embargo, la palabra calidad y mas concretamente el trio de palabras control de

calidad hoy tienen unas acepciones que van mucho mas alla de las fronteras de nuestra

ciencia y que nos afectan de una forma rotunda.

Para empezar se habla de sistemas de calidad o incluso de sistema de calidad total,

refiriendose a que las acciones de una determinada empresa o laboratorio se encuentran

sometidas a una serie de protocolos y normas de planificaci6n, ejecuci6n y documentaci6n

verificadas por una empresa o instituci6n neutral o estatal, seglln el caso. Este tipo de

empresas para poder asegurar la integridad de su propio sistema, acaban relacionandose con

proveedores que tambien estan integrados en un sistema de calidad similar. En este sentido, el

resultado mas visible de estar integrado en un sistema de calidad es recibir una certificaci6n

de un organismo oficial, tipo certificado ISO 9000 o similar. Los laboratories analiticos por

supuesto no se sustraen a ese mismo sistema, en principia voluntario.

Pero es que ademas, algunos laboratories suministran datos de importancia vital

(seguridad alimentaria, medioambiental, de farmacos, cosmeticos, juguetes

..

), por lo que van

a tener unas exigencias de calidad todavia mas estrictas, constituidas por lo que denominamos

las Buenas Practicas de Laboratorio (BLP s o GLPs). Estas normativas son de obligado

cumplimiento para dichos laboratories, pero se han convertido en un estandar de referenda al

que voluntariamente se someten otros laboratories.

Por tanto en este capitulo hemos de hablar de calidad,

de

su concepto, de los sistemas

de calidad y de su aplicaci6n particular a los laboratories analiticos. Antes sin embargo,

habremos de tratar de los parametres de calidad mas importantes del producto de un

laboratorio analitico, que no son otros que la exactitud e incertidumbre de los resultados.

Dichos parametres de calidad dependen en primera instancia de la calidad del metodo de

analisis y en segundo lugar de como se pone en marcha este en un laboratorio en concreto.

Estas dos cuestiones seran tratadas en cierta profundidad en el epigrafe validaci6n de metodos

analiticos presentado a continuaci6n.



92

V erreira

2. V ALIDACION

DE METODOS DE

ANALISIS.

ON EPTO

2.1. Concepto

La validacion de un metodo de amilisis es el proceso seguido para confirmar que todas

las etapas del proceso analitico empleado para un analisis dado son adecuadas para su

finalidad y que el metodo en su conjunto proporciona unos resultados de las caracteristicas de

calidad adecuadas ( exactitud, precision, tiempo, coste).

La validacion (o revalidacion) del metodo debe realizarse

1. Tras su desarrollo y antes de su empleo en analisis de rutina. Esta es la

validacion completa. Se realizara primeramente en un laboratorio, pero si el

metodo ha de ser de aplicacion general, esta validacion habra de ser realizada

en varios laboratories diferentes.

2. Siempre que se modifiquen las condiciones operatorias o se ponga el metodo

en un laboratorio distinto. Esta es una validacion parcial, pero que en algunos

casos puede tener mucha complicacion.

3. Al ponerlo en marcha tras un tiempo de reposo. Se trata de una validacion

minima, basada en un chequeo de idoneidad.

4.

Durante su uso normal. Mediante las correspondientes operaciones de control.

5.

Siempre que el control indique que el metodo esta proporcionando resultados

defectuosos (fuera del rango previamente definido como aceptable . En este

caso es preciso localizar el problema, solucionarlo y pasar al punto 3.

Logicamente la extension del trabajo de validacion depende en gran medida del caso

en que nos encontremos. El trabajo mas importante hay que hacerlo en el momento en que el

metodo acaba de ser desarrollado y es por hi por donde comenzaremos. Tal vez

no

te

enfrentes con la tarea de validar completamente un metodo novedoso nunca, pero aprender

como se hace, por que y que consideraciones es preciso hacer, es una escuela interesantisima

de quimica analitica que pondra a prueba tu sentido comful y tus conocimientos de

quimiometria y de quimica analitica. Ademas te sorprenderia ver la dificultad que a veces va

asociada a la puesta en marcha de un metodo de analisis no muy bien conocido y

el

esfuerzo

de

validacion que hay que desarrollar.

En esta primera parte nos vamos a cefiir exclusivamente a metodos de analisis

cuantitativo normales , esto es, metodos cuyo objetivo es la determinacion de analitos en

cantidades no traza. En un epigrafe posterior generalizaremos el problema de la validacion a

otros tipos de metodo.

2.2. La validacion de

un

metodo recien desarrollado

En este epigrafe no discutiremos acerca de como se desarrolla y optimiza un metodo

de analisis, sino que nos situaremos en el momento en que la optimizacion del mismo ya va

llegando a su final. Tendremos, por tanto, un protocolo mas o menos optimizado que nos

permitira generar una sefial de analito en uno o varios tipos de muestra. A partir de aqui h de

comenzar lo que denominamos el trabajo

de

validacion, cuya mision en este caso

es:

1.

determinar como ha de realizarse la calibracion,

2. determinar la calidad de los resultados surninistrados por el metodo (precision y

exactitud),



3. fijar el tipo de ensayos de control que debenm realizarse durante su

funcionamiento para garantizar que

se

mantiene la calidad

Las tres cuestiones anteriores, particularmente las dos primeras, no pueden resolverse

de forma cronologica ya que una depende de otra. Otra cosa que es preceptivo recordar en

este punta, es que la precision y exactitud, deben ser coherentes con los requisitos de la

informacion requerida, tal y como expusimos al comienzo del primer capitulo. Finalmente,

otra puntualizacion que debe realizarse es que no hay lineas predefinidas y comfunnente

acordadas acerca de como debe realizarse este proceso, por lo que lo expuesto a continuacion

es fruto de mi experiencia y reflexion personal, y sin duda viene afectado del sesgo

caracteristico de quien ha trabajado mucho mas en el campo del analisis cuantitativo

organico.

3.- VALIDACIONDE

L EX CTITUD

Y

TR Z BILID D

DEL METODO

La exactitud de un metoda es la propiedad analitica mas importante y preciada. Sin embargo,

su determinacion y medida es dificil y esta sometida a controversia, por cuanto en su

definicion interviene un concepto casi filosofico como es

el

valor verdadero de concentracion

de analito en una muestra. En los casas en los que se dispone de estandares certificados de

referenda o CRM Certified Reference Material), el termino concentracion verdadera es

sustituido por el

de

concentracion aceptada como verdadera , pero si no disponemos de un

CRM, la definicion de la exactitud por si no nos es de gran ayuda para determinar si nuestro

metoda es exacto.

Resulta mucho mas util emplear un concepto denominado trazabilidad, que es

bastante mas intuitivo y pragmatico. a trazabilidad es una propiedad de las medidas y de los

metodos. Diremos que una medida tiene trazabilidad si somas capaces de forma inequivoca

de relacionar dicha medida con la masa de analito patron. En la practica esto quiere decir que

podemos garantizar que la sefial final medida es:

a) de todo el analito presente en la alicuota de muestra procesada o de una

fraccion de proporcionalidad perfectamente conocida del mismo

b) solo del analito y no de cualquier otra especie interferente

c) proporcional a la concentracion de analito

d) que la constante o uncion de proporcionalidad entre sefial y concentracion

son perfectamente conocidas

Balanza

calibrada

Alicuota

muestra

pesada

Muestra

preparada

Alicuota

medida

t

iiioo

. . . _

--? i l l i i i i

. . . _

c:::ms

· .

Masa .........

. . .

Analito

patron

Seiial

Figura : Trazabi idad de un resultado



94

V Ferreira

Lo que en general hay que hacer para poder demostrar que un metodo garantiza la

trazabilidad de los resultados se resume en

la

figura

2

Discutamos cada paso de los

mostrados en dicho organigrama.

3.1. Evaluacion de a precision

•

Curiosamente, lo primero que se debe hacer para determinar la trazabilidad (y

exactitud) del metodo es determinar

si

nuestro metodo recien optimizado es suficientemente

precise. Si no hay una evaluacion de la precision no dispondremos de criterios para

determinar si el resultado es trazable. Si la precision no es suficientemente satisfactoria, el

metodo tiene que ser re-optimizado o desechado ya que la precision de la medida es un

requisite irrenunciable cualquier proceso de medicion.

El estudio lo podemos dividir en dos partes, evaluacion inicial y formal. En la

evaluacion inicial podemos comenzar estudiando el analisis replicado de muestras sinteticas a

una concentracion intermedia. Si los resultados son satisfactorios pasaremos a la evaluacion

f o r m ~ l

si son insatisfactorios es precise re-optimizar o cambiar el metodo.

·;::: >

no 1-------_.

Estudio recuperaci6n


proporcionales i

\ . (efectos de matriz y otros) ,.-·

00

..

0000000

- 0000MOOOO -OOOOOOOOOOO

OM-000000000000000

0

00000

0000

0-000-00

0 0000000000000

00000

00 0 0000000000 0000000

00 0000-0 0 00 0000 0000-00

M

00 00oOo-ooO_o___ , , _ _ _ _000

-•

0

0 0 0 000

...

Figura : Verificaci6n de a trazabilidad de un metoda

En este ultimo caso pueden estudiarse por separado las distintas etapas del metodo

para aislar aquella con mayor efecto en la imprecision, o puede considerarse si es el caso , el

uso de alglin tipo de estandar interne que corrija la imprecision .. por desgracia las posibles

fuentes de irreproducibilidad son muchas y en ocasiones son muy dificiles de detectar.



Si la reproducibilidad con disoluciones sinteticas es suficiente, pasaremos a una

determinacion mas completa

de

la precision

del

metoda. Como todo parametro que ha de

validarse, habra de tenerse en cuenta la regla de oro de la validacion:

vali dar to

do

el metoda

Validar todo el rango de concentraciones

Validar todo el rango de matrices (muestras)

La precision se habra de determinar a distintas concentraciones de analito y en tantos

tipos de muestra (matrices) como sea necesario. En el caso de la precision, su estudio alcanza

diversos niveles

segU.n el esfuerzo experimental y el nllinero de var1aoles consideradas. El

nivel mas bajo es la repetitividad, que es la precision que se obtiene realizando las replicas en

un rnismo dia y con las

m1smas

condiciones operatonas.

hl

mvel siguiente es el de l

reproducibilidaa mtermedla, en el que las replicas se realizan en dias diferentes y empleando

01stmtas condiciones operatorias, pero dentro del.mismo laboratono. P' ara determinar el nivel

mas alto

e

precision, es precisa la mtervenci6n de distintos laboratorios. En ese caso la

denorninamos reproducibilidad propiamente dicha. Obviamente en los estudios iniciales nos

quedaremos con la reproducibilidad intermedia, a la que denominaremos sencillamente

reproducibilidad.

3.2.- Linealidad y rango dinamico del metodo

Una vez que tengamos la garantia

de

que el nietodo genera sefiales al menos

repetitivas, el siguiente paso es considerar la relaci6rt existente entre la sefial y la

concentracion, que en la mayor parte de los casos sera lineal. Al'igual que hicimos en el caso

de la precision, iremos de mayor a menor complejidad. Lo primero es estudiar la linealidad y

rango lineal con disoluciones sinteticas conteniendo los patrones ae analito en concentracion

conoc1da.

S1

la relac1on no- fuera neal, seria preciso considerar una transformacion

matemat1ca de la sefial (que puede ser desde la extraccion de logaritmos, una raiz cuadrada o

la introduccion de

algU.n

estandar intemo

.

Una vez conseguida una relacion Sefial/Concentracion satisfactoria, es preciso fijar el

rango dinarnico del metoda y estudiar la linealidad en muestras reales. Esto se consigue

mediante la tecnica de la adicion estandar, pero esta tecnica solo

se

puede realizar sobre

disoluciones, por

lo

que los pasos previos realizados sobre solidos no quedaran validados en

este momenta.

3.3.- Determinacion de a exactitud como ausencia de errores sistematicos)

Si tenemos un metoda que nos proporciona sefiales precisas a varias concentraciones

y en las matrices de interes, y es ademas lineal, tenemos.ya mucho ganado. Lo que nos queda

por demostrar ahora es que la sefial es solo de analito y no de alguna especie interferente, y

que la relacion sefial/concentracion (funcion de calibracion) es conocida e independiente de la

muestra en particular que se vaya a analizar. Dicho de otra forma, lo que nos queda es

averiguar que el metoda puesto en marcha esta exento de errores sistematicos.

La forma mas directa de verificar la presencia potencial de algU.n error sistematico es

mediante el uso de muestras certificadas. Si la aplicacion del metoda a una muestra

certificada proporciona un resultado que difiere significativamente del valor certificado,

podemos concluir la existencia

de algU.n

error sistematico.

Si

el resultado del analisis del

CRM no difiere significativamente del valor certificado, la presencia de algU.n error



96

V

Ferreira

sistematico es mas improbable. Para poder concluir de forma taxativa que no hay errores

sistematicos, seria conveniente el analizar distintos CRM conteniendo el analito a distinta

concentradon en tantos tipos de muestra como se quieran analizar con el metodo. En caso de

problemas, los datos de analisis de varios CRMs nos proporcionarian una informacion clave

para el diagnostico de la situacion. En la practica pocas veces se toma esta precaucion.

Desafortunadamente, hay muchos problemas analiticos para los que no hay CRM

disponibles, particularmente dentro del mundo del analisis organico. En este caso podriamos

hacer uso de un metodo de referenda distinto del que esta bajo validacion. Para ello seria

necesario disponer de un metodo y validado y adecuado para el analisis del analito bajo

estudio en las muestras de interes. Caso de que dicho metodo existiera, se analizarian varias

muestras cubriendo el rango de concentraciones y de tipos matrices) por ambos metodos.

Finalmente, se aplicaria cualquier test estadistico de los que

y

hemos visto en los capitulos

anteriores para verificar que los datos generados por ambos metodos no difieren.

De nuevo de forma desafortunada, nos

encontraremos con que en pocas ocasiones

disponemos de ese otro metodo de referenda

mue

hacer entonces?

Entonces debemos realizar un estudio sistematico que nos permita verificar la

trazabilidad de los resultados proporcionados por nuestro metodo. Para ello hemos de cubrir

tres objetivos: a) verificar la

l .O

existenda de interferendas aditivas; b) verificar la

recuperacion en

fos

procesos de tratamiento de muestra; y c) verificar la no existencia de

i n t e r r e r e n c ~ s

proporcwnales tl.mdamentalmente deefectos de la matriz).

3.4. Estudio de interferencias aditivas

Una interferenda aditiva esta causada por la presencia en una o varias muestras de

alguna sustanda que produce una sefial que confundimos con la del analito. La

presencialausencia de interferencias aditivas esta ligada l complejidad de la muestra y l

selectividad de la tecnica de analisis. Las interferencias aditivas nos van a producir un error

sistematico por exceso y por lo general variable en las distintas muestras.

En muestras simples, en las que los interferentes potenciales son conocidos, se puede

verificar su existencia mediante el estudio de muestras sinteticas. Este estudio consiste en

preparar lo que se denomina un blanco de muestra, que es una muestra similar a la real pero

carente de analito:

Ejemplo 1.- Determinacion de o en un metal o aleacion por EAA. Los interferentes

potenciales son el resto de metales presentes o potencialmente presentes en la

aleacion. Estudiar sefzal de Mo en disoluciones sinteticas conteniendo los otros

me ales.

Ejemplo 2.- Determinacion de un principia activo en un farmaco

por

HPLC.

Interferentes potenciales: Otros principios activos presentes en el farmaco

y

excipientes. Estudiar sefzal del analito en ausencia de ana/ito y presencia de

excipientes otros principios activos

Este tipo de ensayo solo se puede realizar en aquellos casos en los que la composicion

de la muestra es conocida y podemos disponer de sus componentes.

En muestras complejas en las que los interferentes potenciales son en su mayor parte

desconocidos e indeterminacies solo puede verificarse empleando una tecnica de analisis que

proporcione una seiial multidimensional caracteristica del analito. Veamos varios ejemplos.



Ejemplo

1

Se quiere determinar un compuesto aromatico (etilbenceno)

par

cromatografia de gases con detecci6n FID. El cromatograma de las muestras

conteniendo el ana/ito no muestra evidencia de coeluci6n de otras sustancias con el

ana/ito (los picas de ana/ito se ven gaussianos). Para confirmar la no presencia de

interferentes, se inyectan varias muestras en una columna similar pero conectada a

un espectr6metro de masas. El estudio del espectro

de

masas a lo largo del pica

confirma la no presencia de ninguna sustancia coeluyente en ninguna de las

muestras. Se confirma lo que denominamos la pureza del pica .

Ejemplo 2.- Se quiere determinar una vitamina par formaci on de un complejo

coloreado con un reactivo organico. Para verificar que la sefial espectrofotometrica

(descontada la Absorbancia del blanco) es enteramente debida al ana/ito, se

comparan los espectros de absorci6n uv-vis (220-900 nm) de distintas muestras con

los espectros obtenidos de patrones. En todos los casas, las bandas de absorci6n en

la zona del maximo mostraron una identidad espectral completa.

3.5.- studiode a recuperacion de analito

Los estudios de recuperacion, entendida como rendirniento en los oroceso _s_

de

tratarniento de muestra, tienen como objetivo determinar que proporcion de analito se pierde

en las etapas prev1as a la medicion. Esta perdida puede ser una fuente de importante error

sistematico y tambien aleatorio) en aquellos metodos en los que el tratarniento de muestra

deberia idealmente conseguir transferir todo el analito a la fase finalmente analizable en el

instrumento lo que los analiticos denorninamos transferir cuantitativamente).

Hay muchos metodos de analisis en los que estos estudios no tienen la rnisma

importancia, puesto que dicha transferencia cuantitativa no se pretende, generalmente porque

se piensa que se puede reproducir con calibrados la transferencia parcial de analitos. Uno de

los casos mas caracteristicos es el estudio de volatiles mediante tecnicas del espacio de

cabeza estatico.

En cualquiera de los casos es conveniente realizar este tipo de estudios es rni opinion

personal). El porcentaje de analito finalmente transferido a la alicuota de medida no solo

puede indicar la existencia de perdidas de analito en algtin paso del analisis, sino que nos

proporciona una indicacion de la robustez del metodo.

La forma de llevar a cabo este estudio es mediante un experimento estandar de

recuperacion. n estos experimentos se adicionan masas conocidas de analito a distintas

muestras y se analizan siguiendo l metodo a estudio tanto las

muestras

como las muestras

adicionadas. l incremento de sefial obtenido entre cada muestra dopada y su original sin

dopar se compara con la seiial que produce en el instrumento una masa similar de analito.

Ejemplo.- Se estan comparando dos metodos para la determinacion de etilbenceno

en

agua par GC-FID. El primer metoda emplea una extracci6n del ana/ito en un sorbente y

su posterior termodesorci6n directa automatica en el sistema GC-FID; el segundo

metoda es un metoda de espacio de cabeza, en

el

que 10 mL de agua se colocan en un

vial de 20 mL, se termostatizan a 50°C y se introduce en el cromat6grafo un volumen del

gas 1 mL) en equilibria con el agua dentro del vial. Para el calculo de la recuperaci6n

se tom6 una muestra de agua y se fortific6 con dos niveles de etilbenceno 1 0 y 90

ng/

mL),

analizandose

par

ambos metodos las muestras fortificadas y el agua original.

Par otra parte se prepararon dos disoluciones estandar en pentano del ana/ito 1 00 y 900

ng

/jiL). Puesto que en ambos metodos se procesan 10 mL de agua, la cantidad de ana/ito

presente en las alicuotas de ensayo es 100 y 900 ng. a sefial correspondiente a estas



9

V

Ferreira

masas se calcu/6 inyectando 1 j L de las disoluciones de pentano directamente en el

cromat6grafo. Los resultados mostraron que a masa transferida en el primer metoda es

e/84±2 y n el segundo tan solo el 6,2±0,

7 .

Comentarios al ejemplo. El experimento

ha

puesto

de

relieve la perdida de un 16% de analito

en el primero de los metodos.

La

recuperaci6n es bastante alta, independiente de la

concentraci6n y previsiblemente constante muestra a muestra ( esto se habra de demostrar

posteriormente). Por tanto, seria posible en este metodo realizar una calibraci6n por

estandar

extemo y realizar posteriormente la correcci6n por el 16% perdido. En el segundo de los

casos tenemos un metodo con una transferencia muy baja de analito. Esto nos alerta acerca de

varias cuestiones.

n

primer lugar

no

es posible realizar la calibraci6n con un estandar

extemo y hacer la correcci6n correspondiente al 93,8% perdido. Esto seria un disparate que

llevaria asociada una enorme incertidumbre. En segundo lugar nos indica que este metodo va

a ser probablemente muy dependiente de pequefias variaciones ambientales y/o operatorias,

esto es, va a ser muy poco robusto. En este caso parece mas recomendable realizar una

calibraci6n por estandar intemo (tomando como estandar un is6mero del etilbenceno) a partir

de

muestras de agua conteniendo cantidades conocidas de .etilbenceno.

3.6.- studio de interferencias proporcionales

Las interferencias proporcionales hacen que la misma cantidad

de

analito produzca

una sefial analitica diferente en funci6n de la muestra analizada. n los metodos

instrumentales esto puede ser causado por una larga serie de problemas, mas o menos

caracteristicos de las distintas tecnicas y metodos.

A modo de ejemplo podemos citar los siguientes:

En Espectroscopia de Absorci6n At6mica a la llama todo aquello que afecta a la

viscosidad

de

la disoluci6n que es aspirada a traves del venturi de entrada va a provocar

una variaci6n de sensibilidad. Si estamos analizando muestras de viscosidad diferente

entre elias y con los patrones tendremos graves problemas cuantitativos.

En cromatografia

de

gases capilar realizando la inyecci6n en split, cualquier cambio de

composici6n que afecte a como

se

evapora el extracto inyectado en el cromat6grafo,

puede producir cambios en la proporci6n de analito que realmente entra

en

la columna.

Por tanto, si estamos analizando extractos sucios conteniendo alta cantidad de material

no volatil, las condiciones de vaporizaci6n de los mismos seran muy diferentes de las de

los calibrados.

En cualquier metodo en el que realicemos una extracci6n o proceso de separaci6n no

cuantitativos, pequefios cambios en las caracteristicas de la muestra (pH, contenido de

organicos, constante dielectrica, fuerza i6nica, viscosidad, presencia de acomplejantes... ),

o

de

las condiciones ambientales (pH, material empleado, operador ... ), pueden llevar

asociadas cambios en la cantidad de analito recuperado.

Como puede apreciarse, el origen del problema son las diferencias de contenido en

componentes diferentes al analito que puedan tener las muestras a analizar. Se trata de

componentes desconocidos y a menudo inespecificos, por

lo

que los englobamos dentro del

concepto de matriz y al efecto lo denominamos efecto matriz. Los efectos matriz son la

distorsi6n mas grave que puede afectar a nuestro conocimiento de la relaci6n

Sefial/Concentraci6n. Su efecto en la calidad

de

los resultados puede ser doble. Por un lado se

trata de un error sistematico,

ya

que las mayores diferencias de comportarniento se daran

habitualmente entre las disoluciones de calibrado (que no contendran en absoluto los

componentes que generan el efecto matriz) y las muestras (que contendran cantidades



variables de los componentes que causan el efecto matriz). Por otra lado es una fuente

importante de incertidumbre, ya que aunque seamos conscientes de su existencia y realicemos

el calibrado en una matriz promedio , seguini habiendo pequefias variaciones en la relacion

SI

en funcion de la composicion particular de cada muestra.

Otra observacion que puede hacerse acerca

de

la naturaleza

de

los efectos de la

matriz, es que dada su naturaleza, todos aquellos metodos en los que no hay transferencia

cuantitativa de analito en algful paso del analisis son mucho mas sensibles a su existencia.

Si

reconsideramos los ejemplos expuestos en la determinacion del etilbenceno, es facil

pronosticar cual de los dos metodos es mas susceptible de sufrirlos. Un efecto matriz en un

analisis de agua puede estar causado por la cantidad de materia orgamca generica que

contenga el agua y que facilite la disolucion del etilbenceno. Es poco probable que dicho

efecto matriz afecte a la retencion del analito en el sorbente del primer metodo, pero es casi

seguro que dicho efecto matriz afectara a la proporcion de etilbenceno en el vapor que esta en

equilibria con el agua. Como ademas la cantidad que se esta transfiriendo es muy pequefia,

cualquier pequefio cambio tendra un efecto dramatico desde el punto de vista porcentual. Una

disminucion en

1

de la cantidad total transferida causara un error por defecto de mas del

15%. La constatacion de este hecho es la razon por la que el estudio de recuperacion tiene

importancia.

Para detectar los experimentos de la matriz se pueden hacer varias experiencias:

a)

Mediante un experimento de recuperacion de sefial

b) Mediante un experimento de adicion estandar

a) Mediante un experimento de recuperaci6n de sefial parecido al expuesto en el calculo

de

la recuperacion. Como en aquella ocasion, se escogeran un cierto nfunero de

muestras (intentando cubrir el rango de tipos de muestras a analizar), se fortificaran

con uno o preferiblemente dos niveles de analito (intentando cubrir el rango de

concentraciones a analizar) y se analizaran tanto las muestras originales como sus

alicuotas fortificadas siguiendo el metodo. En esta ocasion, sin embargo, el

tratamiento de los datos es muy diferente.

Nose

compararan las sefiales obtenidas con

las que producirian masas conocidas y equivalentes en la alicuota de medida, como se

hizo anteriormente, sino que el incremento de sefial asociado a la fortificacion se

transformara en concentracion al dividirlo por la pendiente

de

la recta de calibrado

construida con estandares. La comparacion de las masas obtenidas siguiendo este

proceso y las realmente afiadidas, nos dara una estimacion de la intensidad de los

efectos matriz. La diferencia ·entre la masa afiadida estimada y la real se expresa como

porcentaje y se denomina recuperacion. Veremos luego un ejemplo.

b) Mediante un experimento de adici6n estandar. Realizaremos una adicion estandar

completa y compararemos la pendiente obtenida en la recta de adicion con la de la

recta de calibrado tal y como se expuso en el tema correspondiente a la calibracion (lo

que equivale a demostrar que la concentraci6n determinada por interpolacion y

extrapolacion no difieren). Este es el primer paso, porque si encontramos que existen

efectos de la matriz, el siguiente es estudiar

si

estos efectos son de una intensidad

suficiente, no solo para diferenciar la S/C entre muestras y calibrados

lo

que ya se ha

demostrado, sino para que muestras diferentes generen diferentes relaciones S/C.

Ejemplo. Seis muestras e grasa han sido dopadas con cantidades conocidas de un

aldehido E-2-nonenal). Las muestras dopadas y las originales sin dopar se han

analizado siguiendo el metoda propuesto.

a

recta de calibrado del metoda, obtenida



100

V

Ferreir(l

mediante el ancilisis

de

extractos sinteticos es Sefia/=0, 00390+0,1983C, donde

C

esta

expresada en ng/mL y Ia sefial en unidades

de

area relativa a/ estandar inferno. Las

sefiales obtenidas en los ana/isis son las siguientes:

Muestr Seiial Seiial Concentraci6n

a

muestra dopado adicionada

1

1,07

47

3,8909 14,0

2 1,5506

4,2289 13,2

3

0,2419

3,2368 15,4

4 3,8509 6,0993

11

,9

5

9,1157 11,8036

13 7

6

1,8481 5,1109

16,2

Determina si hay evidencias

de

efectos de

Ia

matriz.

Para resolver este problema,

lo

que vamos a hacer es determinar las concentraciones

de muestra y dopado, restarlas y compararlas con

Ia

concentraci6n adicionada real.

recuperaci6n

Cmuestra

Cdoe.ado

Cadicionada

Creal

Di&rencia

5,3999 19,6016

14,201 7 14,0 0,20

101,4

7 7998 21,3061 13,5063 13,2 0,31

102,3

1,2002

16

,3031

15,1029 15,4 -0,30

98,1

19

,3999

30

7383

11,3384 11,9 -0,

56

95,3

45,9496 59,5043

13,5547

13,7

-0,15

98

,9

9,3001

25

, 7539 16,4539 16,2 0,25

101,6

Un simple test

por

parejas comparando las concentraciones adicionadas, real y

determinada, da los siguiente resultados: media diferencias=-0,04; desviaci6n

diferencias=0,35; t=0,28; v=5;resultado no significativo.

Observa que

da

lo mismo restar las concentraciones que restar las sefiales y dividirlas por la pendiente. Otra

observaci6n fundamental es que el termino recuperaci6n en este caso tiene un significado netamente diferente

del expuesto en el punto 3.5. Ahi se referia a la recuperaci6n de analito en los procesos de tratamiento de

muestra aqui se refiere a la capacidad de nuestro sistema

de

medida para interpretar adecuadamente la sefial en

distintos tipos de muestra. Una recuperaci6n alta en este caso no indica que no haya perdidas fisicas de analito

durante el tratamiento de muestra indica que si las hay estan adecuadamente corregidas por el sistema de

calibraci6n escogido.

a

denominaci6n recuperaci6n es claramente equivoca y es preciso especificar claramente

a que nos referimos.

Es posible que con los pasos anteriores ya hayamos conseguido verificar que el

metodo proporciona resultados con trazabilidad. Pero tambien lo es que no como

consecuencia de la aparici6n de alglin problema ligado bien

ala

existencia de interferencias

a la existencia de perdidas importantes o a la existencia de efectos de la matriz. a soluci6n

de estos problemas queda fuera del alcance del presente texto y nos hemos de limitar a

formular

alglin tipo de pautas o recomendaciones de caracter muy general.

La existencia de interferencias requiere la re-optimizaci6n del metodo a fm de incluir

alguna etapa de aislamiento o enmascaramiento que mejore la selectividad de la seiial.

Dependiendo del caso esto puede ser muy complicado y poco practico por lo que puede ser

recomendable incluso el cambio de estrategia de detecci6n.

La existencia de perdidas en las etapas de aislamiento no tiene porque ser un problema

en tanto y en cuanto sea un factor previsto tal y como se explic6. Lo que sera preciso por



supuesto, es que la calibraci6n tenga en cuenta este hecho. Como ya dijimos, el problema

asociado a una baja recuperaci6n es la escasa robustez del metoda tanto a cambios en

condiciones ambientales como a cambios de composici6n matricial.

La existenda de efectos de la matriz puede ser superada con un esfuerzo en la

calibraci6n del

metoda. En los casas de tecnicas multicomponente muchos problemas de

precision, de recuperaci6n y de efectos de la matriz pueden ser resueltos con un estandar

interne que se comporte

de

una forma similar

al

analito. Esto explica porque algunos analisis

particularmente dificiles requieren el uso de estandares internes que son la rnisma molecula

marcada isot6picamente con C

3

o con deuterio (tecnica de calibraci6n conocida como

diluci6n isot6pica). Finalmente, y en el caso de que no exista o no

se

pueda emplear dicho

estandar interne, la existencia de efectos de la matriz tiene una soluci6n quimiometrica, que

es emplear el metoda de adici6n estandar como estrategia de calibraci6n. Esta elecci6n

obligada implica multiplicar el esfuerzo analitico por factores entre 4 y 6, lo que no siempre

es viable.

3.7. Consideraciones fmales

Todas las indicaciones anteriores son utiles para el caso de que la exactitud del

metoda no pueda verificarse mediante el empleo de CRMs o de alglin metoda de referenda.

Como se indica, esta situaci6n se dara con frecuencia en el campo

el

analisis organico. De

hecho en este campo, fuera de las moleculas

de

pestiddas y contaminantes mas comunes y

peligrosos, no es

facil encontrar CRMs, ni metodos de referenda. En el campo del analisis

elemental, por el contrario, el nlimero y tipo de CRMs es bastante amplio, por lo que deben

ser la primera opci6n a considerar. En este campo tambien se dispone de bastantes mas

metodos de referenda.

En todo el proceso de validaci6n mostrado es precise el uso extensive de muestras

dopadas o fortificadas. Esta es la

Unica

soluci6n que tenemos para poder abordar el problema

de la existencia de errores sistematicos tal y como hemos vista, pero no debemos olvidar que

la preparaci6n de este tipo de muestras puede ser

mas complicada de lo que parece.

En primer lugar sera muy dificil, salvo en alglin producto industrial, el preparar

muestras dopadas s6lidas iguales a las muestras reales. En todo el trabajo con s6lidos las

etapas previas a la puesta en disoluci6n (ya sea mediante ataques, extracciones, lixiviaciones,

sublimaciones,...) no podran ser estudiadas mediante estas estrategias.

a

Unica soluci6n que

puede haber en estos casas es el uso de tecnicas de extracciones sucesivas, pero su

comentario y tratarniento es demasiado complejo para el presente capitulo.

En segundo lugar, incluso aunque la adici6n de analito se realice sabre una matriz

liquida, no tenemos la garantia de que el analito afiadido establezca el rnismo tipo de

asociaciones que el analito native. Por ejemplo, en muchos fluidos naturales (suero

sanguineo, savias vegetales, zumos, orina .. ) las moleculas organic as y por supuesto los

elementos metalicos y no metalicos, se encuentran formando distintas asociaciones complejas

no bien conocidas. Algunas de estas asociaciones responden a equilibrios rapidos, pero otras

se han formado al cabo del tiempo, por lo que

no

tenemos garantia de que podamos conseguir

una igualdad total de comportarniento entre el analito native y el afiadido.

A pesar de estas lirnitaciones no tenemos muchas mas alternativas que las aqui

expuestas.

4. Vision general de a validacion de metodos de amilisis

4.1. Parametros a validar segun el metodo



1 2

V erreira

Como hemos visto, los panimetros mas importantes en la evaluacion de la calidad de

un metodo de analisis son la exactitud y la precision. Como la discusion anterior nos ha

mostrado, la exactitud esta relacionada, ademas de con la precision, con una serie de

propiedades secundarias de los metodos de analisis como son:

;;>

La linealidad y el rango lineal

;;> La selectividad ( o especificidad) de la sefial

;;> La existencia de efectos de la matriz

;;> Los limites de deteccion y de cuantificacion

;;>

La inercia del metodo (solidez y robustez)

No todos estos parametres deben ser evaluados en un proceso de validacion complete,

ya que en funcion del objetivo del metodo unos son

mas importantes que otros. La tabla

siguiente muestra que parametres deben validarse en funcion de los objetivos del analisis o

ensayo.

Parametro de calidad Cualitativo Cuantitativo Analisis

de

Parametres

trazas

fisico-quimicos

Exactitud

X X

X

Precision

X X X

Linealidad X

X X

Especificidad/selectivida

X X X

d

Limite de deteccion X

X

Limite de cuantificacion

X

Inercia (robustez)

X X

Fiabilidad X

Definiciones:

a Parametros

e

interes para metodos cuantitativos y semicuantitativos

Exactitud: A menudo se emplea la palabra veracidad, que se define como el grado de

acuerdo entre el valor medido (media de varias replicas) y el valor de referenda

aceptado. Se mide mediante el empleo de materiales de referenda, de blancos de

matriz fortificados, mediante el empleo de metodos de referenda, o mediante ensayos

inter aboratorio.

Precision: Se mide mediante la desviacion estandar relativa, o mediante el parametro

ISO, P, que es 2,83 veces la desviaci6n estandar. Como se apunto anteriormente, se

distinguen tres categorias: la repetibilidad, la reproducibilidad intermedia o la

reproducibilidad

Linealidad:

Se mide mediante la regresion lineal obtenida en el analisis

(preferentemente replicado) de

5

o mas) estandares de calibrado cubriendo entre el

80 y el 120 del rango de concentraciones que se espera que se encuentren las



_

_

muestras. El rango lineal, es el intervalo de concentraciones en el que la relaci6n entre

la sefial y la concentraci6n se mantiene lineal.

Especificidad/selectividad. No

hay una forma comUnm.ente aceptada de medirlo, y su

medici6n depende del contexto. Un metodo especifico se refiere a que proporciona

sefial para un linico analito. Un metodo selectivo proporciona sefiales diferenciables

para distintos analitos. Un inmunoensayo es el prototipo de metodo especifico. Un

metodo cromatognifico de metodo selectivo.

Limite detecci6n:

Se define como

la

concentraci6n o masa que produce una sefial

igual ala de

la

ordenada en el origen aumentada

en

3 veces

su

desviaci6n estandar.

Limite cuantificaci6n: De forma analoga se defme como

la

concentraci6n o masa que

produce una sefial igual a la de la ordenada en el origen aumentada

en

10 veces su

desviaci6n estandar.

Inercia: La inercia hace referencia a la resistencia que presenta un metodo analitico a

proporcionar valores inexactos cuando se modifica ligeramente el valor operacional

de las condiciones experimentales. Se diferencia entre robustez robustness), referido

a modificaci6n de valores experimentales intrinsecos al proceso, T, pH,

concentraci6n de reactivos auxiliares .. ) y solidez ruggedness), que se refiere a la

modificaci6n de condiciones operacionales extrinsecas lote de producto de partida,

equipo instrumental, operador. ).

b Parametros especificos para metodos cualitativos de analisis

Fiabilidad: Es un parametro exclusivo de los metodos de an<Hisis cualitativo, y se

define como el porcentaje de aciertos de los ensayos realizados

en

alicuotas de la

misma muestra al identificar un analito. Se diferencia entre la relaci6n de falsos

positivos y relaci6n de falsos negativos.

La relaci6n de falsos positivos se define como

la

fracci6n porcentual de falsos

positivos sobre el total de negativos conocidos, esto es,

la

frecuencia con la que un

resultado negativo es err6neamente confundido con uno positivo error alfa).

La

relaci6n de falsos negativos

se define como la fracci6n porcentual de falsos

negativos sobre el total de positivos conocidos, esto es,

la

frecuencia con

la

que una

muestra conteniendo el analito es err6neamente clasificada como ausente. error beta)

4.2.- Tipos de validaci6n

a) Validaci6n intema o intralaboratorio. En ella interviene un linico laboratorio, sea el

que ha desarrollado el metodo, sea un laboratorio que quiere poner

en

marcha un metodo

desarrollado por otro laboratorio. Seglin el grado de conocimiento del metodo a poner en

marcha,

la

validaci6n puede ser:

Prospectiva: realizando un estudio completo de las caracteristicas analiticas del metodo

antes de su puesta en marcha y generalmente tras

su

desarrollo

Chequeos de validaci6n: una serie de pruebas de validaci6n menos completa que las

anteriores, y cuya finalidad es verificar que las caracteristicas documentadas

previamente validadas) del metodo se cumplen. Este tipo de chequeos se realizan

para poner en marcha en ellaboratorio un metodo de analisis originalmente propuesto

por otro laboratorio o instituci6n y del que

ya

existen datos de validaci6n.



104 V

erreira

Chequeo

de

idoneidad: que son un conjunto de pruebas sencillas que se realizan

de

forma

rutinaria antes o durante cada serie o lote de anruisis

Validacion retrospectiva: El proceso de validacion no es un proceso finito limitado en el

tiempo, sino que es un proceso continuo en el que se van incorporando cada vez mas

datos que aumentan el conocimiento que tenemos tanto del metodo de analisis como

del funcionamiento de dicho metodo en nuestro laboratorio. Un ejemplo, si en un

metodo de anruisis decidimos que una prueba de idoneidad consiste en la inyeccion

(en un HPLC) de una disolucion patron diaria, tras varios afios de trabajo

dispondremos de un conocimiento muy grande del comportamiento de dicha

disolucion patron. Sabremos cual es el tiempo de retencion esperado de cada uno de

los analitos, su desviacion estandar y

el

limite a partir del cual consideraremos que la

columna debe ser cambiada o regenerada. Forman parte tanto de la validacion

retrospectiva como de los chequeos

de

idoneidad

el

uso

de

graficos en los que se

representa la evolucion de ciertos parametros

der

analisis (por ejemplo,

el

tiempo de

retencion, o el factor de asimetria de un pico). Estos graficos se denominan graficos

de

control que seran introducidos posteriormente .

b) V alidacion extema o interlaboratorio. Es un proceso de validacion complejo

acometido por varios laboratorios que realizan los mismos tipos de anruisis empleando los

mismos y en ocasiones distintos) metodos.

El

proceso suele ir coordinado por una autoridad

extema encargada de suministrar muestras similares a todos los componentes y de realizar el

estudio estadistico de los resultados. El resultado de estos ensayos sirve para medir

importantes parametros de los metodos de anruisis (como la exactitud y la precision) de forma

independiente de un Unico laboratorio de analisis.

4.3.-

tapas

en Ia validacion de

un

metodo

En el apartado 3 seguimos una serie

de

pautas para validar una parte fundamental de

un metodo de anruisis cuantitativo, pero no debemos olvidar que la validacion es un proceso

complejo que parte de las necesidades de un cliente potencial, y que acaba con la elaboracion

detallada de un documento normalizado de trabajo denominado Protocolo Normalizado de

Trabajo (PNT o SOP, Standard Operating Procedure) en el que se

hade

documentar todo el

trabajo

de

validacion y

de

control del metodo en cuestion.

La tabla siguiente muestra un esquema general ideal de las etapas seguidas en la

validacion completa de un metodo de anruisis generico.

tapas preliminares

1.- Iden tif icadon del problema 1Necesidades del cliente

2.- Seleccion del metodo Entre los

ya

desarrollados

3.- Desarrollo

de

un nuevo metodo pptimizacion

tapas

de validacion

4.- Precision

4.1 Repetibilidad

IDentro del dia

4.2 Precision intermedia Entre dias (analistas instrumentos)

4.3 Reproducibi lidad Entre laboratorios

5.- Linealidad y rango lineal

iBondad del ajuste

6.- Exactitud: veracidad

iMuestras

de referenda, muestras fortificadas, metodos de

referenda

7.- Limites de deteccion/cuantificacion IEstudio de blancos, determinacion de la sefiallruido

8.- Especificidad/selectividad IEstudio de interferencias

9.- Recuperacion

IMuestras fortificadas



10.- Jnercia

iffit1uencia de pequefias variaciones en las condiciones operatorias

11.- Jncertidumbre

~ l c u l o en cada una de las etapas

12.- Control de calidad piseiio de los tests a realizar para el

control del metodo

( obligatoriamente blancos, muestras fortificadas ..)

13.- Idoneidad del sistema

~ s t b l e c i m i e n t o de criterios de aceptaci6n de los datos obtenidos en

fase rutina (graficos de control)

Etapas adicionales

14.- Documentaci6n del metodo Escribir todo el trabajo experimental y de validaci6n

15.- Descripci6n de todas las etapas

Preparar los Protocolos Normalizados de Trabajo (PNTs)

16.- Autorizaci6n para el uso del metodo

17.- Revision del metodo Actualizaci6n de los PNTs

5.- ENSAYOS DE CONTROL Y

PUEST EN

M RCH

Durante el proceso de validacion se han de disefiar cuales son los ensayos o pruebas

mas adecuados para realizar el control de calidad de

un

metodo. El control de calidad

realizado por el propio laboratorio agrupa todos los ensayos realizados para supervisar que el

metodo validado mantiene dentro de unos rangos especificados sus caracteristicas de calidad.

Esto incluye una serie de operaciones que deben quedar perfectamente descritas en los

Protocolos Normalizados de Trabajo, como son como deben encenderse los instrumentos, si

se realiza alglin test para verificar su correcto funcionarniento -pruebas de idoneidad del

sistema-, y ademas y fundamentalmente, la introduccion de una serie de muestras de control

dentro de la rutina analitica.

5.1.- Pruebas de idoneidad del sistema

Ironicamente se puede decir que uno de los problemas

mas grandes que nos

encontramos

en

el analisis instrumental, es que los instrumentos siempre proporcionan un

resultado, esten funcionando bien o esten funcionando mal. Esto es, un instrumento analitico

puede estar funcionando de manera defectuosa mucho antes de que los sistemas de

autocontrol del instrumento nos alerten de ello. Esta observacion debe ser tenida muy en

cuenta por todos los que trabajen con frecuencia en un laboratorio instrumental, a fin de que

incorporen como una obligacion inexcusable

la

realizacion de una serie de pruebas,

adicionales a los distintos chequeos que el propio instrumento realiza, antes del comienzo de

cualquier tanda de analisis, no antes de la medicion, sino antes si quiera de la pesada de las

muestras. Proseguir con el analisis de forma deliberada o inadvertida

en

un instrumento que

no esta funcionando de forma correcta es uno de los errores mas graves que se pueden

cometer

en

un laboratorio. En el mejor de los casos se perdera todo el tiempo empleado

en

el

analisis, pero con mucha frecuencia se pueden perder muestras linicas, se puede dafiar el

instrumento, o se puede generar informacion erronea.

El tipo de test dependera obviamente del instrumento y del analisis que estemos

realizando, siendo siempre mucho mas exigentes los requisitos de un analisis de trazas. Hay

instrumentos cuya estabilizacion y verificacion puede llevar mas de un dia (un sistema GC

MS para analisis de trazas), hay otros cuya estabilizacion y verificacion es practicamente

inmediata. En los sistemas mas exigentes se ha de llevar mucho cuidado y ser muy rigurosos,

pues cualquier error en la puesta

en

marcha puede facilmente demorar el trabajo dos o tres

dias. En mi experiencia con instrumentos "dificiles" es conveniente disefiar dos tipos de

pruebas de idoneidad. Una primera dirigida a la evaluacion del sistema de medida y una

segunda dirigida a su capacidad especifica para llevar a cabo el analisis

en

cuestion.

El ensayo para

la evaluacion de sistema debera cumplir una serie de requisitos:



106

Sencillez y facilidad de preparaci6n

Estabilidad en composici6n

Trazabilidad

Rapido de

ej

ecutar

V.

Ferreira

Capaz de evaluar los parametros mas importantes y criticos del instrumento y

del metodo de

ana Iisis

Ejemplo. La cromatografia HPL en fase normal es una de las tecnicas cuya puesta

en

marcha y estabilizaci6n es mas dificil con una alta dependencia de las condiciones

ambientales y operatorias.

Para la evaluaci6n del sistema decidimos preparar una

disoluci6n facil de preparar de analizar. La disoluci6n contenia vainillina ~ f e n i l e t n o l y

acetato

de

feniletilo en concentraci6n prefijada. Estos tres componentes son estables faciles

de

preparar

de

separar de detectar. Su analisis en condiciones prefijadas nos permitia

evaluar en poco mas de 15 minutos:

a

La

selectividad de la columna

b

La eficiencia de la columna y sistema cromatografico

c La posible existencia de problemas de quimisorci6n

c La sensibilidad del detector y el correcto funcionamiento general del sistema

Esta prueba fue incorporada independientemente del analisis que se fuera a hacer a

continuaci6n como una veri.ficaci6n de

que el sistema funciona correctamente. Despues de

obtener un resultado satisfactorio pero solo entonces se introducia la segunda prueba

especifica

para

el metoda de ana/isis que se fuera a realizar.

5.2. Muestras operaciones de control

El control de un metodo se realiza mediante el analisis por todo o parte del metodo de

una serie de muestras de control.

a

naturaleza de estas muestras depende del caso particular

en que nos encontremos, pero suelen incluir:

Ana.Iisis de disoluciones estandar. Una disoluci6n conteniendo los analitos en un

disolvente apropiado. Esta disoluci6n se empleara habitualmente como parte

de

las

pruebas de idoneidad del sistema anteriormente comentadas. Puede ser interesante

realizar un segundo analisis de esta disoluci6n

al

acabar el lote de muestras para

analizar y antes de apagar el instrumento de medida. De esta forma, dispondremos

de una valiosa informacion acerca del estado real de nuestro sistema.

Analisis de blancos. Un analisis realizado aplicando el procedimiento analitico

completo, pero sin incluir la muestra. Este tipo de ana Iisis son particularmente

importantes en el analisis

de

trazas, y sobre todo en aquellos casos en los que se

conoce la facilidad del sistema para sufrir

algU n

tipo de contaminaci6n. En

realidad podemos distinguir distintos tipos de blancos . El mas completo pero

que no siempre

se

puede conseguir seria una muestra exenta de analito. El

segundo nivel es el blanco de sistema, en el que el procedimiento analitico se

aplica por completo pero sin incluir muestra. Hablaremos con

mas detalle en el

tema del analisis de trazas.

Analisis de muestras reales empleadas como referenda. Una muestra estable

seleccionada por ellaboratorio o un grupo de laboratorios y cuyas propiedades han

sido establecidas de antemano. De nuevo estas condiciones no pueden ser siempre



conseguidas, pero si es posible se trata

e l

forma mas eficaz de controlar la

calidad de un metodo de amilisis. En algunos casos (muestras clinicas) hay

muestras de este tipo suministradas por empresas. Se trata de materiales cuya

exactitud conocida es inferior a la

e

un CRM, pero que resultan adecuados para

el control

Analisis de muestras sinteticas empleadas como referencia. Una mezcla e

analitos en un medio similar a la matriz, y cuya estabilidad y propiedades

analiticas se han establecido

e

antemano.

Analisis de CRMs. Este tipo de muestras es muy caro, por lo que su uso esta

limitado a la validaci6n y no al control. Sera precise acudir a su uso cada vez que

sea necesario verificar la exactitud del sistema.

Habitualmente se debe introducir una muestra e control por cada serie de analisis, y

el esfuerzo asignado al control no debe superar

el

20 del total.

Ejemplo.

Se ha desarrollado en un cierto laboratorio un nuevo metoda

para Ia

determinacion

del principia activo de un farmaco por HPLC con detecci6n uv-vis. l metoda incluye Ia

trituraci6n del preparado y su disgregaci6n en una disoluci6n agualmetanol a/ 50 . Esta

disoluci6n es .filtrada y se inyecta en el HPLC. El protocola

de

control de calidad del metoda

incluye las siguientes operaciones:

a) (Test de adecuaci6n del sistema) Antes

de

la inyecci6n de muestras en

el HPLC, se inyectara una disoluci6n conteniendo 10,0

mg

/L del principia activo en

metana/. El cromatograma debera mostrar un pico a 12,3 : :

0,

5 min y dar un area de

125000:1:4500 mV, empleando condiciones estandarizadas de trabajo en el HPLC.

b) Cada lote de ami/isis (que comprende 20 muestras) incluira un blanco

preparado con el agualmetanol empleado en la extracci6n, y una muestra

de

referenda.

l

blanco no debera mostrar

ningU.n

pico al tiempo

de

retenci6n del

ana/ito. La muestra de referenda se prepar6 tomando un lote de 1000 pastillas,

triturandolas y homogeneizando el polvo triturado. Seguidamente este polvo

homogeneo se analiza en dias sucesivos, encontrandose que su concentraci6n es

8,2:1:

0,2 mg/L. Por consiguiente, sabemos que el 95 de los resultados de Ia muestra de

referenda estaran en el intervala

8,

2 : :

0,

4

mg

/

L.

5.3.- epresentacion de los datosde control

Los resultados obtenidos en los ensayos de control de calidad se suelen representar en

un diagrama de control. En nuestro ejemplo anterior tendriamos 3 diagramas de control, uno

correspondiente al tiempo e retenci6n de la disoluci6n estandar, otro a su area, y otro

procedente e la concentraci6n e la muestra e referencia. Estos diagramas de control

se

construyen tal y como se indica en la figura:



108

Area +3S

Linea e acci n superior

13175 ·

Area

+2S

Linea e alerta superior

129500 ·······························································*···*············································· .........................

*

* *

25000·5-- - - - - - - - - - - - - -*- . . . . . - - - -A-r_ea_m_edia

esperada

12050

11825

: J ~ . ~ 9 . : .l : alerta inferior

Area

-2S

Linea e acci n inferior

Area

-3S

V

Ferreira

El diagrama de control resulta de ayuda para detectar la existencia de tendencias o

derivas en el comportamiento de un metodo o de cualquier proceso), ademas de establecer

una forma efectiva

de

determinar cuando el sistema esta dejando de funcionar como se

espera.

Si

un resultado aparece fuera de la linea de alerta, puede ser una cuesti6n aleatoria,

pero si

l siguiente esta tambien fuera de esta linea, debe aceptarse que l metodo esta fuera

de

control. Igualmente, si un resultado cae fuera de Ia linea de acci6n, sabemos que es casi

seguro que l metodo esta fuera de control. De manera analoga, y puesto que en un metodo de

analisis las variaciones se supone que son aleatorias, la presencia consecutiva de un nillnero

grande

de

puntos en la misma region por encima o por debajo de la media), puede ser

indicativa de una falta de control.

Los Protocolos Normalizados de Trabajo deben especificar las acciones a tomar en el

caso

de

que el metodo caiga fuera

de

control. Estas acciones pueden ser muy variadas, y

pueden implicar desde una sencilla operaci6n de mantenimiento mas o menos rutinario

limpieza de un detector, sustituci6n de un fungible...), hasta requerir la revalidaci6n del

proceso

de

analisis.



Referencias recomendadas:

a Basica general

Estadistica y Quimiometria para Quimica Analitica, 4 Ed. J.C. Miller y J.N. Miller, Pearson

Education, Madrid, 2002

Quimiometria. G. Ramis, C. Garcia. Ed. Sintesis, Madrid 2001

Chemometrics. Matthias Otto. Wiley-VCH, Weinheim, alemania. 1999

b Avanzada

b I .- De Control de Calidad y quimiometria en

Qui

mica Analitica general

Quality Control in Analytical Chemistry. Kateman, G. Buydens, Wiley Interscience. New

York 1993. Una de las obras mas completas y pragmaticas cubriendo todos los aspectos

teoricos y practicos relativos a Ia quimiometria y el control de calidad

Chemometrics. Data Analisis for the laboratory and chemical plant. R.G. Brereton. Wiley

New

Cork, 2003

Handbook of Chemometrics and Qualimetrics.Vol 20 A : D.L. Massart, B. Vandeginste, L.

Buydens, S. DeJong P. Lewi J. Smeyers-Verbeke. (1997) Vol20

B:

B. Vandeginste, D.L.

Massart, L. Buydens, S. DeJong P. Lewi J. Smeyers-Verbeke. (1998) Elsevier. El texto de

referenda mas complete y serio de quimiometria.

b .- Acerca de los rudimentos de las distribuciones de probabilidad y su aplicaci6n en el diseno de

experimentos ANOVA y otras tecnicas):

Estadistica para Investigadores. Box, G.E.; Hunter,

W.G

.; Hunter

J. S.

Ed. Reverte, Madrid

1989. Todo un clasico

Disefio y analisis de Experimentos. D. Montgomery, Iberoamerica. Mexico 1991. Otro clasico

b3.- Acerca de la calidad y su aplicaci6n allaboratorio analitico

Garantia de Calidad

en

los laboratorios analiticos. R. Compafio, A. Rios. Ed. Sintesis, Madrid,

2002

La

calidad en los laboratorios analiticos. M. Valcarcel, A Rios. Ed. Reverte, Madrid 1992

Principios de Quimica Analitica. M. Valcarcel. Ed. Springer Iberica, Barcelona 1999

b4.- Manuales practicos de garantia de calidad en ellaboratorio

Laboratory Quality Assurance System. T.

A

Ratliff. Wiley Interscience.

New

Cork, 2003

A primer Good Laboratory Practice and current Good Manufacturing Practice for Analytical

Laboratories. L.Huber. Agilent Technologies. Germany 2003.

Guidelines for achieving quality in trace analysis. Ed.

Por

M.Sargent and G. Mackay, RSC

1995

b5.- Validaci6n de metodos analiticos

Validation and qualification in Analytical Laboratories. L. Huber. www.labcompliance.com

Development and validation of analytical methods. Ed. Por Riely, C.M.; Rosanske, T.W.;

Pergamon Press 1996. Dedicado particularmente al analisis farmaceutico.

Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. US Dep

.

of Health and Human

Services. www.fda.gov/cvm

b6.- Otros libros de interes

Estadistica aplicada a traves de Excel. C. Perez. Pearson Educacion, Madrid, 2002. Es un libra

practico acerca del manejo de Excel.

General Principles

of

Good Sampling Practice. Ed. N.T.Crosby y I Patel. RSC, 1995.

Contiene una serie de cuestiones practicas acerca del disefio e implantacion de un plan de

muestreo.

Manual de estadistica para quimicos. E.L. Bauer. Alhambra, 1974.

Un

autentico incunable de

estadistica para quimicos. Una

joy

ta

Information Theory in Analytical Chemistry. K.Eckschlager y D.Danzer. Wiley Interscience,

New York, 1994 Una obra para reflexionar acerca del significado de los procesos de medicion

en Quimica Analitica.



I

DEFINICIONES DE C LID D

I

D Propiedad o con unto de propiedades inherentes a

una

cosa que

permiten apreciarla como igual, mejor o peor que las restantes

de su especie Diccionario Real Academia)

D

Grado de

acuerdo

en

los valores de las

propiedades

de un

producto, proceso o servicio con las

deseadas

de cara a

la

satisfaccion de unas necesidades

ISO)

D Grado en que un conjunto de rasgos diferenciadores inherentes

a

un

proceso cumple con unas necesidades o expectativas

establecidas, generalmente implicitas u obligatorias. lo que

garantiza la calidad del producto o servicio) ISO 9000)

Evolucion historica del papel de a

C LID D

y

su

control

D

Etapa primitiva:

Se inspeccionan todas las unidades

producidas

D

Etapa chisica 1930-1970):

Se introduce el control

estadistico de la calidad y el control estadistico de procesos

D

Etapa moderna 70s-80s):

Aseguramiento de la calidad.

Enfasis en la prevenci6n. Se estudia la totalidad del sistema

D Etapa

contemporanea:

Gesti6n de la calidad como

un

factor

estrategico. Aparici6n del concepto de calidad total



volucion historica del papel de a C LID D y su control

Objettvo

Metodos epartamentos

Filosofia

Detectar

Estandares de

La calidad se

Primitiva

defectos nonnas

Inspeccion

comprueba

uniformidad

inspecciones

Uniformidad

Tecnicas

La calidad se

Control

optima estadisticas

Produccion controla de

forma optima

Prevenir Programas

y

Departamento de

Aseguramiento

desviaciones sistemas de calidad/ Todos

La calidad se

estudiando el

aseguramiento los

produce

sistema de a calidad

departamentos

Competitividad/

Planificacion

satisfaccion

Estrategica.

Gerencia/todos

La calidad se

Gestion optima los miembros de

necesidades

Movilizacion

Ia organizacion

gestiona

cliente

organizacion

3

Jerarquia

de

terminos y actividades basicas

de

a

garantia

de a calidad

calidad

GARANTIA DE

L

CALIDAD

4

112



amino bacia sistema

e

a alidad

liil

A quiere comprar un producto a

a

empresa B

liil A se pone de acuerdo con B acerca de las caracteristicas que ha

de tener el producto y el precio que se pagara

liil A se pone de acuerdo con B en quien y como mide dichas

caracteristicas un laboratorio acreditado)

liil A exige a B que le garantice a calidad del producto a lo largo

del tiempo

liil B hace un estudio documentado de su proceso de produccion,

disena un sistema de control y le encarga a supervision a un

auditor que le dara un diploma que satisfara a A

liil B se ve obligado a exigir lo mismo a sus propios proveedores

5

oncepto de caUdad total

Suministradores

mpresa

Clientes

o laboratorio)

Materias primas

Personal

Instalaciones

Producto o servicio

Instrumentos

Equipos

que satisface las

Maquinaria

Procesos

necesidades del cliente

Reactivos etc

Calidad externa

Calidad interna Calidad externa

gesti6n

de la

Calidad Total)

01

Beneficios intemos: Derivados de estructura clara, de funcionamiento 6ptimo

Beneficios extemos: Mejor servicio, mayor eficiencia, mayor control de riesgos

6

113



Nuevo enfoque

de

Ia calidad

ENFOQUE TRADICIONAL NUEVO ENFOQUE

Cumplir los estandares

Satisfacer las expectativas del

cliente

Cumplir el presupuesto Ai iadir valor

Detectar errores Prevenir errores

lnvertir dinero en calidad

Rentabilizar el dinero en forma de

competitividad

La

calidad requiere tiempo

La

calidad gestiona el tiempo de

forma optima

La

responsabilidad es de unos

La

responsabilidad es de todos

pocos

Elementos basicos de

un

sistema de Ia calidad

POLITICA DE LA CAUDAD

Objetivos y compromiso del organismo respecto a Ia calidad

Formulada

porIa

Direccion del organismo

Revision del

sistema de Ia calidad

PorIa Direccion

lnstalaciones y equipos

antemmiento

Verijicacion CalibraciOn

PROCESOS

Organizaci6n

FomJacion/Cualificacion

l : · · ~ ~ ~ ~ ~ :

Procedimientos

j

Instrucciones

j

\ ...........

~ . & i . . t r Q ~ __________ /

( ''AiiD1

Toilis

··--··

Internas l

t .......... J t ~ M

114

7

8



omponentes del sistema de

a

calidad

Garantia de calidad Quality Assurance)

Control de calidad Quality Control)

Evaluacion de a calidad Quality Assessment)

M NU L DE CALIDAD

Identidad dellaboratorio; Actividades; Recursos y organizacion; Objetivo

de calidad

Procedimientos generales Procedimientos e

Plan de Evaluaci6n de

UNE 66900/ISO 9000) instrucciones tecnicas BPLs Ia calidad

Documentaci6n,

auditorias intemas, - Procedimientos de analisis Auditorias intemas

Gesti6n de equipos de - Procedimientos de

Auditorias extemas

medida y ensayo,

calibraci6n Sistema de revision del

tratamiento de

- Procedimiento de control program a

reclamaciones de calidad

9

CONCEPTO DE NORMALIZACION

Actividad consistente

en la

elaboracion, difusion y aplicacion de normas

con

el

objeto de:

1. Adaptar los productos, procesos y servicios a sus respectivas fmalidades

2. Evitar las barreras tecnicas a las transacciones comerciales

3. Facilitar la cooperaci6n tecnol6gica entre organismos y paises

4. Proteger

la

salud de las personas y animales y preservar el medio

ambiente

CONCEPTO DE NORMAS

Documentos que contienen especificaciones tecnicas de aplicacion

voluntaria, que son elaborados

por

consenso entre las partes interesadas

fabricantes, administracion, consumidores, universidades y centros de

investigaci6n, asociaciones profesionales , son aprobados

por

un

organismo de normalizaci6n reconocido y estan a disposicion del publico

10

115



Ejemplos de productos

y

actividades objeto de normalizaci6n

.

Materiales vidrio, plastico, aleaciones)

. Productos aparatos de vidrio, tornillos, tarj etas de credito)

. Maquinas motores, electrodomesticos)

.

Metodos de toma de muestra

. Metodos de medida y ensayo

.

Terminologia relevante para

un

cierto campo

. Unidades del Sistema Intemacional de Unidades

. Sistemas de Gesti6n de la Calidad

.

Sistemas de Gesti6n Medioambiental

. Criterios generales de funcionamiento y evaluaci6n de los laboratorios

de ensayo

Organismos de N ormalizaci6n

FUNCION: Elaborar, revisar, aprobar difundir normas

OrganismosNacionales

AENOR Asociaci6n Espanola de Normalizaci6n Espana

Normas UNE

creada en 1986, tiene 130 comites tecnicos)

AFNOR Association Francaise de Normalisation Francia

ANSI American National Standards Institute USA

BSI British Standards Institution

U

DIN

Deutsches Instituts ft r Normung Alemania

NormasDIN

sec

Standards Council ofCanada Canada

Organismos Supranacionales

CEN Comite Europeo de Normalizaci6n Europa

NormasEN

integra los organismos de 19 paises)

ISO Organizaci6n Intemacional de Normalizaci6n

Normas ISO

integra a 130 paises, tiene 220 comites tecnicos)

ASTM American Society for Testing and Materials

USA

publica anualmente el ASTM standards)

12

116



Ejempltls de productos

y

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12

116



Certificaci6n/Acreditaci6n

Certificacion: Proceso en el que un organismo independiente, mediante unos

procedimientos de evaluacion y verificacion, declara formalmente que un producto un

proceso o

un

servicio, debidamente identificado, satisface unos requerimientos

perfectamente especificados a menudo regulados por norma; en este caso reconocimiento

de Ia conformidad a una norma)

Acreditacion: Procesos en el que un

organismo autorizado

, mediante unos procedimientos

de evaluacion y verificacion, reconoce formalmente que una entidad es competente para

realizar unas tareas perfectamente especificadas.

l,Quien certifica?

n

organismo empresa) acreditado p r esta tarea

Certijicaciones importantes: sistemas de calidad conforme a normas ISO 9000

Sistemas de gestion medioambiental conforme a normas ISO 14000

l,Quien acredita?

Un organismo autorizado por

el

gobierno) p r esta tarea

En

Espana: ENAC

3

Certificaci6n/Acreditaci6n

Certificaciones

• Productos

• Servicios

• Sistemas de la calidad ·

• Sistemas de gesti6n

medioambiental

• Personas

• Marcado CE segllil directivas

europeas

campo voluntario)

Acreditaciones

• Laboratorios de ensayo o calibraci6n

• Entidades de certificaci6n

• Entidades de inspecci6n

instalaciones electricas, instalaciones

frigorificas, lTVs, ... )

• Verificadores medioambientales

segllil criterios

UE

761/2001)

• Laboratorios de ensayo que realizan

estudios

en entomos regulados

por

Buenas Pnicticas de Laboratorio

campo ob/igatorio)

4

7



Normalizaci6n en Europa perspectiva hist6rica

• 1957: Tratado de Roma. Libre circulaci6n de personas y bienes

• 1970-80: Limitaciones reales

ala

libre circulaci6n mediante normas y

especificaciones internas

• 1985: Resoluci6n Consejo de Europa ''Nuevo enfoque . Mecanismos

de control sobre las normas de los paises. Cuerpo de normas europeas

(rango de directivas, restringido a seguridad, salud, medio ambiente .

Calidad de producto regulado

por

normas tecnicas se establece

en

campo voluntario

• 1989: Resoluci6n Consejo de Europa Enfoque global . Condiciones

reconocimiento reciproco de resultados de pruebas de conformidad.

Acreditaci6n organismos evaluadores de la

o ~ f o r m i d a d

Referenda

normativa:

EN

ISO 9000 yEN 45000

• 1993: Creaci6n de la marca de conformidad

CE

• 1995: (en Espana) Laboratorios oficiales de alimentos han

de

acreditarse por ENAC mediante UNE-EN ISO 17025

Sistemas genericos de gesti6n de

l

calidad

SERlE

ISO

9000

../ Son normas que proponen modelos genericos para la implantaci6n y

mantenimiento de sistemas de gesti6n de la calidad

cuyo objetivo es

asegurar que lproducto/servicio satisfara a lo largo del tiempo los requerimientos

preestablecidos)

../ Lanzadas en 1987, revisadas parcialmente en 1994 y totalmente

remozadas en 2000

../

No

defmen las caracteristicas de un producto/servicio

../ Hacen hincapie en los aspectos organizativos (con incidencia en las

caracteristicas del producto)

../ Mas de 400000 empresas/organismos certificados a fmales

del2

(equipos electricos/6pticos, ind. metahirgica, construcci6n, instrumental analitico .. )

SERlE QS 9000 y SERlE EAQF

../ Sistemas especificos de la industria del autom6vil

15

16

8



ISO 9000

• UNE-EN ISO 9000:2000 Sistemas de gesti6n de la calidad.

Fundamentos y Vocabulario

• UNE-EN ISO 9001:2000 Sistemas de gesti6n de la calidad. Requisitos

- Bloque 1: Responsabilidad de Ia direccion

- Bloque 2: Gestion de los recursos

- Bloque 3: Realizacion del producto enfasis en Ia definicion gestion

de los procesos, desde identificacion de requisitos del cliente basta

compras)

- Bloque 4: Medicion, analisis mejora evaluacion de Ia satisfaccion

del cliente, auditorias ...

•

UNE EN

ISO 9004:2000 Sistemas de gesti6n de la calidad. Directrices

para la mejora del desempefio

7

Trabajo en entomos regulados

Si un trabajo experimental se rea/iza en un entorno regulado deberia

ser posible

para

un inspector cuatro o cinco afios despues revisar los

archivos del trabajo y determinar facilmente quien como y

porque

se

realizo

e

trabajo de quien

era

a

responsabilidad que equipo se empleo

los resultados obtenidos que problemas se encontraron y como se

so/ucionaron

D.L. Weller. Anal Proc, 1998, 25: 199

Acreditaci6n

Sistemas regulados por las GLPs obligatorios)

• Sistemas regulados

por

las GMPs obligatorias)

• Sistemas regulados por la norma EN-IS0-17025 optativas*)

• Sistemas regulados por normas de certificaci6n normas ISO 9000) optativas)

*obligatoria para amilisis oficiales de alimentos

Certificaci6n

18

119



; Quien tiene que cumplir con las regulaciones

GLP/GMP?

• Originalmente disefiadas para estudios de to:xicidad pre-clinicos

• Son generalizables a todos los trabajos realizados con mediciones

analiticas.

OBLIGATORIOS PARA:

Estudios de seguridad no clinicos para el desarrollo de drogas humanas y

veterinarias), aditivos alimentarios, nuevos componentes cosmeticos,

suplementos nutricionales para ganado, productos biol6gicos

Desarrollo de pesticidas agricolas; Desarrollo de quimicos t6xicos; Control

de alimentos aditivos y drogas ); Amilisis y control de explosivos

O OBLIGATORIOS PARA:

Investigaci6n basica; Desarrollo de nuevos metodos de analisis; Ensayos

empleados para derivar las especificaciones de un producto comercial .

Documentos reguladores

• Regulaciones FDA: http://www.fda.gov

• Directivas europeas: http://dg3.eudra.org

• Guias ISOIIEC, guia 25: Requisitos generales para la competencia de

los laboratorios de calibraci6n y ensayo. 1990, 56, CH-1211 Geneve

20. Switzerland. Se puede adiquirir on line en http://www.iso.ch) Este

es el documento basico reconocido intemacionalmente para la

ACREDITACION de laboratorios. Norma ISOIIEC 17025

2

12



Historia de a calidad en ellaboratorio

Escandalo en los

laboratorios farmaceuticos

1908

1930

1931

1940

Contraste t

TestF

Diagramas de Shewhart

Sistemas de calidad industrial

(USA, 1974)

Nuevos panimetros de control de

la informacion analitica 1970 s

F ormaci6n de la Chemometrics

Redefinici6n Quimica Analitica

( obtenci6n de estrategias 6ptimas)

Evoluci6n de la quimica clinica

(Robotizaci6n y automatizaci6n)

Soci (1972)

Proteccion del consumidor medio ambiente. Hitos

historicos v re lllacion

2

l> Hasta 1974: Se asurne que los laboratorios fannaceuticos reportaban de forma

fiel y exacta los estudios realizados sobre farmacos

l> 1974. Varios escandalos (talidomida y otros). Datos inconsistentes, practicas

de laboratorio irregulares. Defectos en el disei io, conducci6n y docurnentaci6n

de los estudios (Hirsch, 1989)

l> 1976. Se emiten las regulaciones conocidas como GLP bajo el paraguas de

FDA

l>

1983.

La

EPA emite regulaciones similares para productos quimicos agricolas

e industriales

} >

Ambas directrices se incluyen en los protocolos mas generales GMP

} >

1983. La OCDE publica sus propias GLP

} >

1990. annonizaci6n de GLP europea

l>

90s, Establecirniento de acuerdos de reconocimiento bilaterales

2



Peculiaridades del trabajo dellaboratorio

•

La

medida numerica de

Ia

calidad es dificil, cara y basada en pocas medidas

• Altisima dependencia del factor humano

•

La

mayor parte del personal esta altamente cualificado

• Gran facilidad de cambio de un proceso de anlilisis a otro

PREMISAS

DAJO LAS

QUE

DESCANSAN LAS DUENAS

PRACTICAS DE

LADORA

TO

RIO

• Un analista es capaz de realizar sus medidas de control y de evaluarlas

• Todo trabajador de un laboratorio puede y desea mejorar Ia calidad de sus

resultados

• Se debe establecer un

sistema

que de

a

analista el derecho y el deber de cumplir

conayb

Requisitos para trabajar de acuerdo con LPs

• Nombrar

un

director de estudios para estudios toxicologicos) con

funciones

de

aprobar los PNTs y

de

hacerlos cumplir puede ser o no

el jefe de laboratorio)

• Disponer de

una

unidad de Aseguramiento de la Calidad Quality

Assurance Unit) intema e independiente, designada por la gerencia.

• Disponer de personal cualificado adecuadamente mediante un

programa de formacion

23

• Disponer de Procedimientos Normalizados de Trabajo SOPs o PNTs).

Cubren defmiciones, administracion, operacion tecnica, trabajo con los

equipos

y

metodos de analisis

• Controles

y

sustancias de referencia. Totalmente identificados

concentracion, pureza estabilidad, origen, identidad, concentracion,

condiciones de almacenamiento

y

fecha de caducidad)

4

122



La U nidad de seguramiento de Calidad

• Funci6n de control intemo,

p r

que instalaciones, personal, metodos, pn1cticas,

archivos, controles, PNTs, informes finales y archivos cumplen

con

lo pre-

establecido

en

GLPs

• Funci6n de correcci6n. Detecci6n y soluci6n de problemas

Actividades:

Mantener una copia del programa de estudios en marcha y de todos los

protocolos de los estudios de los que es responsable

Inspeccionar los estudios a intervalos adecuados, manteniendo informes

escritos adecuados de cada inspecci6n

Remitir periodicamente a la gerencia y al director del estudio informes del

estado de los estudios, problemas detectados y acciones correctoras

Determinar si las desviaciones observadas de los PNTs se realizaron

de

forma adecuada

Auditar el equipo de laboratorio y los informes del director

Los Procedimientos Normalizados de Trabajo

JPNTs oSOPs

25

Procedimientos escritos del programa de trabajo de laboratorio

Incluyen

• Operaciones de inspecci6n, limpieza, mantenimiento y calibraci6n

rutinaria de equipos

• Acciones que deben tomarse en caso de fallo

•

Metodos de analisis

• Defmici6n de los datos base

• Cualificaci6n del personal

•

Precauciones de higiene y seguridad

• Acceso autorizado a los equipos

•

Recepci6n, identificaci6n, almacenamiento, mezclado, muestreo de

muestras y sustancias de referenda

•

Documentaci6n, almacenamiento y recuperaci6n de datos

• Operaciones del personal de aseguramiento de la calidad

6

123

•



Los Procedimientos Normalizados de Trabajo

PNTs o SOPs)

Se almacenan

en el

laboratorio

itulo

Distribuido a/departamento

Nfunero

Revisados por

los operadores

Numero de revisi6n

Defmenc6mo

se trabaja

PNT

al que reemplaz

-- ---1

Pecha de entrada en vigor

. . ~ : ; ; l

bj<ti

Sello empresa

Escrito por:..............................

Firmas

probado por.. ........................

Revisado por ..........................

Pagina 1

de

X

---1--- N° paginas

27

Otras claves para funcionar bajo GLPs

Disoluciones

y

reactivos:

etiquetadas indicando identidad concentraci6n requisitos de almacenamiento

y fecha de caducidad. En caso de botellas indicar fecha apertura

Sustancias de referenda:

debe conocerse la concentraci6n pureza forma de control estabilidad

se deber etiquetar como anteriormente ademas deben estar sometidas a tests

de pureza identidad y concentraci6n

Datos brutos todo dato necesario para reconstruir el informe final)

cada estudio debe tener su propio cuademo de laboratorio. Las paginas

numeradas y escritura solo en tinta. Las correcciones sin tachones.

Los ficheros originates tambien deben guardarse con una etiquetaci6n

adecuada

Almacenamiento archivo

Datos brutos documentos PNTs protocolos informes fmales y muestras

deben ser almacenados durante tiempo suficiente. Se debe identificar a la

rnn ~ l l P < m ln<: ~ r r . h i v n < :

8

124



Otras claves para funcionar bajo GLPs

Personal

cada

seccion debe mantener un fichero actualizado con

la

descripcion de los

puestos

de

trabajo de los trabajadores a ella asignados, de su entrenamiento

experiencia, cursos de formacion, ..

deben incluirse los riesgos asociadas a cada trabajo

Equipos

deben

ser

del disefio capacidad apropiados para cumplir

con la

funcion

asignada, y deben estar en un lugar adecuado para asegurar su funcionamiento,

supervision, limpieza y mantenirniento. Debe pasar un

proceso de validacion.

onduccion de un estudio GLP

cada estudio debe tener

un

protocolo escrito antes de su comienzo. Cualquier

cambio justificado debeni estar documentado y autorizado

por

el director.

Las

muestras se identificaran adecuadamente, los datos se registraran directa y

nipidamente en tinta, cada

set

debe

ir

fechado firmado. Cualquier

correccion debe no oscurecer el original e

ir

tambien fmnada.

Validacion

Defmicion general

Evaluacion de procesos, productos o metodos de analisis para verificar que

cumplen los requisitos establecidos

Defmicion especifica para metodos de analisis

Proceso basado en estudios sistematicos de laboratorio mediante el que se

pone

de manifiesto

que

·

un

metodo analitico determinado posee

unas

caracteristicas de funcionamiento adecuadas a la aplicacion que se

le

quiere

dar

Que

debe validarse?

Los equipos, el software, los sistemas, los metodos los datos

validacion del equipo software: chequeo de acuerdo a las especificaciones

documentadas

validacion de metodos: determinacion de las caracteristicas analiticas del

metodo

sistema analitico instrumento, computador y metodo ,

test

de verificacion

datos: verificar

la

recepcion, archivado almacenamiento

de

los datos, para

garantizar su consistencia, integridad trazabilidad

personas. V erificar que tienen

la

formacion experiencia adecuada

estandares. V erificar pureza, identidad, concentracion estabilidad

2 :.1

30

125



Validaci n

L,Cuando?

Instrumentos: antes del uso en rutina, despues de reparaciones y a intervalos

de tiempo regulares

Ordenadores y software: durante la instalaci6n, antes y durante uso de rutina y

tras cada update ·

metodos de anlilisis: antes del uso en rutina, despues de cada cambio. Ademas

debe realizarse un test de verificaci6n antes y durante cada uso rutinario

L C6mo?

Elaboraci6n de un plan de validaci6n

Formaci6n de equipos de validaci6n para instrun1entos complejos identificar

los equipos que requieren validaci6n, establecer prioridades, revisar el plan,

establecer procedimientos para la validaci6n de sistemas informaticos)

Elaborarun inventario incluyendo el estado de cada sistema en cuanto a

validaci6n

Establecer las especificaciones requeridas para cada instrumento

comparandolas con las especificaciones del fabricante

Establecer los tests de eficiencia requeridos para medir

la

calidad de las

especificaciones

Establecer los sistemas de archivo requeridos

por

GLP

Cuando debe validarse un metodo

I

Inmediatamente tras su desarrollo

Validaci6n completa:

r = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ~ ~ ·

intra/aboratorio o inter/aboratorio)

Al cambiar alguna condici6n operatoria

o al poner en marcha un metodo

validado en otro laboratorio)

l

ponerlo en marcha tras un cierto

periodo

Validaci6n parcial:

chequeo de va/idaci6n)

Validaci6n minima:

chequeo de idoneidad)

Operaciones de control

~ ~

Identificaci6n problema y

Durante su uso normal

Si el control indica resultados

defectuosos

chequeo de validaci6n

31

32

126



Ejempltls de productos

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L:o.:ru;;:w'

t

A 5 T ~ ~ :\rne:icnn :-inl; tCL: - 1:..r T . u t : n ~ anti \ t . a · ~ r

USA

1pu

hl

1cD .tJ'lllfth a.:c.IL' to1 A ~ T M ~ ~ : ~ n r t r . r . . J ~ )

12

116



6Que validar?

Panimetro de calidad Cualitativo Cuantitativo

Anallsis ae

x ~ m ~ t r o s

trazas

fis1co-qu m1cos

c

Jrxactitud

-..

X

Precision

X

r Jmite

de

detecci6n

X

Linealidad

X

Especificidad/selectividad

;

X X

Limite de cuantificaci6n

]

Inercia robustez)

,;:

X

Incertidumbre

00

X

X

REGLAS DE ORO DE LA VALIDACION:

../ Validar el metodo completo

X X

X X

X

X X

X

X

X

X X

../ Validar todo el rango de concentraciones objeto de estudio

../ Validar el metodo en todas las matrices objeto de estudio

6Como verificar

la

exactitud de

un

metodo?

33

1. La exactitud requiere que no haya interferencias y que se conozca perfectamente

la relaci6n entre la Sefial y la Concentraci6n funcion de calibraci6n)

2. La presencia/ausencia de· nterferencias esta ligada ala complejidad de la

muestra y a la selectividad de la tecnica de analisis. En muestras simples se

puede verificar mediante el estudio de muestras sinteticas. En muestras

complejas s6lo puede verificarse:

1. Mediante muestras certificadas de identica

estructura

matricial

2.

Comparando

datos con los de un metodo libre de interferencias

3. Empleando

una

tecnica de analisis que proporcione una seiial multidimensional

caracterfstica del analito

3. La relaci6n Sefial-Concentraci6n se puede estudiar mediante el analisis de

muestras sinteticas calibrados), de muestras dopadas o adicionadas) o mediante

experimentos de adici6n estandar. Los efectos matriz son la distorsi6n mas grave

que puede afectar a nuestro conocimiento de la relaci6n SIC

4. Por otra parte, la exactitud se puede comprobar pero no diagnosticar) mediante

el analiSlS de muestras de referencia, 0 por comparaci6n con metodos de

exactitud verificada

34

127



razabilidad de un metodo o resultado

() a-d _@

Alicuota Muestra Alicuota

~ ~ ~

Resultado

muestra d d d

p e s t ~ p ~ _ o ; J ~

Balanza

calibrada

Q

Masa

--<::" ;:

Alicuota

Analito med1da

patron

-

-

o

Reoptimizaci6n

Cambio metodo

UsoS .I.

Estudio interferencias aditivas

Estudio recuperaci6n


L - - - - - - - - - 1

proporcionales

efectos de matriz y otros)

128

5

6



Evaluacion

de

la exactitud de un metodo

validacion)

o Estudiar la relaci6n entre concentraci6n sefl al

o Determinar el rango dinamico del metoda

o Determinar

la

presencia de interferencias

o Determinar

la

existencia de efectos de

la

matriz

o Seleccionar

la

funci6n

de

calibraci6n

o Evaluaci6n de la inercia robustez) y comportamiento a largo

plaza

o Determinacion de parametros que deben ser controlados

Exactitud: Presencia/ausencia de interferencias

Muestras simples interferentes potenciales conocidos)

-

studiar

Ia seftal en

~ u s e n c i

de analito con los potenciales interferentes

- Ejemplo 1: Determinaci6n

deMo

en un metal o aleaci6n

por

EAA. Los

7

interferentes potenciales son el resto de metales presentes en Ia aleaci6n.

studiar

seiial de Mo en disoluciones sinteticas conteniendo los otros metales.

- Ejemplo

:

Determinaci6n de un principia activo

en

un farmaco

por

HPLC.

Interferentes potenclales:

Otros

principios activos presentes en el farmaco y

excipientes.

studiar

seftal del analito en ausencia de analito y presencia de

excipientes y otros principios activos

Muestras complejas interferentes potenciales desconocidos)

- Ejemplo 1: Analisis de contaminantes. Empleamos muestras libres de

contaminantes

para

estudiar Ia seftal. Determinaci6n GC-ECD de pesticidas

organoclorados en agua

- Ejemplo

:

Determinaci6n GC-MS en modo scan) de Ia oxima de E)-2-

nonenal en harinas

- Ejemplo 3: Analisis de anabolizantes por inmunoensayo. Confirmaci6n por

HPLC-MS

2

- Ejemplo 4: Analisis de Hg

en

material vegetal. Confirmaci6n

por

analisis de

muestras certificadas

38

129



Muestra

preparada

Recuperaci6n

Muestra

Muestra

~

1

1

1

1

Disoluci6n

conteniendo

~

@

6

l

I

_Incren1ento

i l l ~

Recuperaci6n =

6

Recuperacion de etil benceno en SPE o SPME

lOmL

10

mL

agua

+

100 o 900

ng

39

r

1

1

1

Disoluci6n conteniendo

100 o 900

ng

Muestra

preparada

Recuperaci6n

=

6

Metodo SPE:

bajo nivel: 83

Alto nivel: 85

ncremento

i l l ~

Metodo SPME:

bajo nivel:

5

Alto nivel: 7

4

130



Exactitud: Efectos matriz

Tras determinar la relaci6n sei l.al/concentraci6n con calibrados sinteticos, y tras

determinar que no hay interferencias, debe comprobarse que la relaci6n

sei l.al/concentraci6n

no

cambia al cambiar de matriz. Posibilidades:

1 Comprobation que Ia pendiente de Ia recta de adicion no difiere de Ia de

calibrado con patrones sinteticos

o

equivale a demostrar que Ia

concentration determinada por interpolation extrapolation no difieren)

2 Mediante un experimento

estandar

de recuperation: Aditiones de masas

conotidas de analito a distintas muestras. Se analizan las muest ras las

muestras aditionadas. El incremento de area se interpola en Ia recta de

calibrado de patrones

para

determinar Ia masa adicionada. La relacion entre

Ia masa adicionada determinada Ia real se determina recuperati on. No debe

diferir de 100

3. Mediante un experimento de

recuperation

con muestras b lancas Oibres del

analito) aditionadas. Como antes, se analizan las muestras conteniendo

cantidades conocidas de analito. Las masas determinadas se comparan con las

aiiadidas determinando Ia recuperation

41

EFECTOS M TRIZ

Rel. S/C esperada en muestras

V ariabilidad entre muestras

Recta de calibrado

con estandares

Concentraci6n

42

3



Recuperaci n de Sefial

Muestra

1

1

Muestra preparada

Muestra

Ca

1

ncremento

sefial

Recta de calibrado

pasa por origen)

concentraci n

I

Recuperacion

=

CiCa

Recta de calibrado

4

Exactitud Efectos matriz mediante adici n

estandar

Datos obtenidos en

un

experimento de

adici6n estlindar y en una recta de calibrado

para verificar Ia presencia de efectos

de

Ia

matriz.

Pendiente recta calibrado: 2,3173±0,184

Pendiente recta adici6n: 2,3554±0,195

t=0,42, diferencia no significativa

Concentraci6n determinada por

interpolaci6n: 0.498±0,09

Concentraci6n determinada por

extrapolaci6n: 0,493±0,10

No difieren significativamente. El metodo

esta libre de efectos de Ia matriz

Creal o

afiadida

ng/mL)

0

0,1

0,3

0,6

0,9

1,2

Sefial Sefial

Calibrados

Adici6n

estandar

0

1,175

0,253 1,423

0,75 1,8

1,453 2,6

1,992 3,284

2,856

44

132



Exactitud. Efectos matriz mediante dopados

Seis muestras de grasa han sido dopadas con cantidades conocidas de un aldehido . Se

ha

determinado el contenido en este aldehido en las muestras dopadas sin dopar. Los

resultados son los siguientes:

Muestra C (muestra) C (dopada) Adicionado Adicionado

ng/mL ng/mL determinado real

1 5,4 19,4 12 14

2 7,8 20,8 14

3

3 1,2 16,2 13

5

4

19,4

30,4 14

5

46

59

12

3

6 9,3 25,3 15 16

Un simple test por parejas comparando las concentraciones adicionadas, real determinada, da

los siguiente resultados: media diferencias=0,33; desviaci6n diferencias=1,97; t=0,42; no

significativo

45

ateriales de referencia

Material o sustancia que tiene una o varias de sus propiedades suficientemente

bien establecidas como para calibrar un instrumento, validar un metodo o

asignar valores a un material.

Terminos relacionados: Material de Referencia Certijicado

Sustancia patron: Patron primario (99.98 ) o estdndar de trabajo

(>99 )

Requisitos: Homogeneidad, Estabilidad, Exactitud, Trazabilidad, Similitud

Uso: Son materiales caros de alta calidad no empleados de forma rutinaria en

control de calidad.

Organismos suministradores:

National Institute ofStandards and Technology NISI)

http://ts.nist.gov/srm

Community Bureau ofReference (BCR) http://www.irmm.jrc.be/

Laboratory of he Government Chemist (LGC) http://www.lgc.eo.uk/

Laboratoire National d Essais (LNE) http://www.lne.fr/

46

133



Evaluaci6n de Ia precision

Grado de concordancia entre los resultados de ensayos independientes obtenidos

en unas condiciones bien defmidas IUP

AC

1998, ISO 1994 .

Se mide mediante una desviacion estandar.

Se distinguen tres niveles de conocimiento:

- Repetibilidad: Obtenida mediante el analisis replicado de una o varias

muest ras a lo largo de una misma serie de medidas

- Reproducibilidad intermedia: Obtenida mediante el analisis replicado de una

o

varias

muestras a lo largo de distintos dias y/o distintos instrumentos y

operadores

- Reproducibilidad: Obtenida mediante el analisis replicado de

una

o varias

muestras por distintos laboratorios empleando el mismo metodo

Puesto que la precision de la medicion depende de la concentracion de analito,

debe realizarse el estudio a niveles de concentracion diferente si el rango de

estudio es alto). Esto tiene ademas repercusiones sobre la calibracion

Si se estudian ademas distintas matrices la precision debe determinarse en todas

ell as

47

Ejemplo. Validaci6n de un metodo

por

comparaci6n con otro

referenda

Determinacion deN en piensos. Metodo de referencia: Kjeldahl; Metodo a prueba: Dumas

modificado

Muestra Dumas Kjeldahl

t

Diferencia

n=5) n=3)

Maiz

7,55 ±0,25

7,28±0,09 1,81 0,27

Cebada

10 ,54±0,06 10,63±0,08

1,92 -0, 9

Guisantes 18 ,20±0,30

17,89±0,10 1,69 0,

31

Semilla girasol 25,95±0,47 26,04±0,11 0,32 -0,09

Harina soja 38 ,88±0,45 38,73±0,44

0,41 0,04

Harina carne 51,83±0,59 51 ,83±0,25

0,02 0,15

Harina pescado 71 ,

55

±0,52 71,48±0,21 0,02

0

Pienso delicias 27,09±0,20 27,05±0,06 0,34 0,07

• Exactitud: La prueba t no muestra diferencias. La prueba t por parejas tampoco t=1,54). La

regresion de los resultados de ambos metodos da como pendiente 0,9986±0,007 y como

ordenada en el origen 0,126±0,25

• Precision: La varianza ponderada para el metodo dumas es 0,155; para Kjeldahl 0,0425. El

cociente F

3

,63) es significativo con p<0,05 48

34



Puesta en funcionamiento de

un

metodo de analisis

Una vez optimizado validado,

la

puesta en marcha debe incluir:

Un sistema de verificaci6n de Ia idoneidad del sistema

Un sistema de control de Ia calidad de los resultados

Un sistema de archivo de resultados de control, que sirva para su evaluaci6n y

mejora continua

Chequeos de idoneidad

Son pruebas sencillas que permiten asegurar que el sistema en su conjunto reactivos,

instrumentos, operadores) estan listos para trabajar de forma adecuada. Sin no

proporcionan resultado positivo NO

se

puede proceder al anal isis

- Dependen del tipo de metodo y de los puntos criticos que se hayan o se vayan detectando)

- Son pruehas que se realizan ANTES del anlilisis

- Suelen consistir

en

el analisis en condiciones identicas a las de las muestras,

de

muestras

sinteticas de facil preparaci on y trazabilid ad

-

Su

objetivo mas frecuente es verificar el comportamiento del sistema instrumental , y son

mas importan tes y costosos cuanto mas complejo e inestable es este GC, HPLC).

En

ocasiones pueden incluir estudio de pureza

de

reactivos, de actividad enzimatica

- Ejemplos: Inyeccion en GC de una disolucion sintetica de concentracion conocida

para

evalua r tiempos de retencion, anchura de picos y seftal

- Analisis de un patron

de

concentracion conocida en EAA

49

Puesta en funcionamiento de un metodo de analisis

Pruebas de control de calidad de los resultados

Son un conjunto de pruebas que se realizan de manera simultanea o en el mismo lote) al

analisis de las muestras. Su fmalidad es demostrar que durante ese lote de analisis o en esa

muestra en particular el metodo de analisis funcion6 correctamente . Su evaluaci6n es por

tanto, a posteriori. Si Ia prueba no

es

satisfactoria, el resultado del analisis debe descartarse

- Como anteriormente, el tipo y naturaleza de pruebas depende del caso particular y

de los pasos que

se

hayan identificado se vayan identificando) como problematicos

- En las tecnicas de analisis multicomponente se pueden real izar las pruebas de

manera

simultanea

al

analisis de Ia muestra

- Son pruebas que se realizan AL MISMO TIEMPO que el analisis de las muestras

- Posibles pruebas son:

• El analisis de muestras sinteticas calibrados)

• El analisis de muestras adicionadas

• El analisis de muestras de referencia intema o externa)

• El analisis de blancos

• La inclusion de compuestos de control estandares o surrogados)

s

135



Seguimiento hist6rico de los panimetros de

control

dia2ramas de

Shewhart

e

escogen los parametros de control mas adecuados, se miden a lo largo de un cierto

periodo, y se determina su media y su desviaci6n. Con esos datos se construyen los

diagramas

de

control, tal y como se muestra a continuaci6n

AICa 3S

1317SO

129SOO

125000

12 SOO

118250

rea -3S

Area lS

inea de

occ1cin

pcnor

°de lote

136

51



Tabla : Area de la cola

l

derecha de

un cierto valor z en la distribuci6n

normal estandar.

z 0 00

0 01 0 02 0 03

0 0

0,5000 0,4960 0,4920 0,4880

0 1 0,4602 0,4562 0,4522

0,4483

0 2 0,4207 0,4168 0,4129

0,4090

0 3

0,3821 0,3783 0,3745 0,3707

0 4

0,3446 0,3409 0,3372 0,3336

0 5 0,3085 0,3050

0,3015

0.29a1

0 6

0,2743 0,2709

0,2676 0,2643

0 7

0,2420 0,2389 0,2358 0,2327

0 8

0,2119 0,2090 0,2061 0,2033

0 9

0,1841 0,1814 0,1788 0,1762

1 0

0,1587 0,1562 0,1539 0,1515

1 1

0,1357 0,1335

0,1314 0,1292

1 2 0,1151 0,1131 0,1112 0,1093

1 3 0,0968 0,0951

0,0934 0,0918

1 4 0,0808 0,0793 0,0778 0,0764

1 5

0,0668 0,0655 0,0643 0,0630

1 6 0,0548 0,0537 0,0526

0,0516

1 7 0,0446 0,0436 0,0427 0,0418

1 8 0,0359 0,0351 0,0344

0,0336

1 9

0,0287 0,0281 0,0274 0,0268

2 0

0,0228 0,0222 0,0217 0,0212

2 1 0,0179 0,0174 0,0170 0,0166

2 2 0,0139 0,0136 0,0132 0,0129

2 3 0,0107 0,0104

0,0102

0,0099

2 4

0,0082 0,0080

0,0078 0,0075

2 5 0,0062 0,0060 0,0059 0,0057

2 6 0,0047 0,0045 0,0044 0,0043

2 7 0,0035 0,0034 0,0033 0,0032

2 8 0,0026 0,0025 0,0024 0,0023

2 9

0,0019 0,0018 0,0018

0,0017

3 0

0,0013

0,0013 0,0013 0,0012

3 1

0,0010

0,0009

0,0009 0,0009

3 2 0,0007 0,0007 0,0006 0,0006

3 3 0,0005 0,0005 0,0005 0,0004

3 4 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003

3 5 0,0002 0,0002

0,0002 0,0002

3 6 0,0002

0,0002 0,0001 0,0001

3 7 0,0001

0,0001 0,0001 0,0001

3 8 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

3 9

0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 09

0,4840 0,4801 0,4761 0,4721 0,4681 0,4641

0,4443

0,4404

0,4364 0,4325

0,4286 0,4247

0,4052

0,4013

0,3974 0,3936 0,3897 0,3859

0,3669 0,3632 0,3594 0,3557 0,3520 0,3483

0,3300 0,3264 0,3228 0,3192 0,3156 0,3121

0,2946 0,2912 0,2877 0,2843 0,2810 0,2776

0,2611 0,2578 0,2546 0,2514 0,2483 0,2451

0,2296 0,2266 0,2236 0,2206 0,2177 0,2148

0,2005 0,1977 0,1949 0,1922 0,1894 0,1867

0,1736 0,1711 0,1685 0,1660 0,1635 0,1611

0,1492 0,1469 0,1446 0,1423 0,1401 0,1379

0,1271 0,1251 0,1230 0,1210 0,1190 0,1170

0,1075

0,1056 0,1038 0,1020 0,1003 0,0985

0,0901

0,0885 0,0869 0,0853 0,0838 0,0823

0,0749 0,0735 0,0721 0,0708 0,0694 0,0681

0,0618 0,0606 0,0594 0,0582 0,0571 0,0559

o

0,0495 0,0485 0,0475 0,0465 0,0455

0,0409 0,0401 0,0392 0,0384 0,0375 0,0367

0,0329

0,0322 0,0314 0,0307 0,0301 0,0294

0,0262 0,0256 0,0250 0,0244 0,0239 0,0233

0,0207 0,0202 0,0197 0,0192 0,0188 0,0183

0,0162 0,0158 0,0154 0,0150 0,0146 0,0143

0,0125 0,0122

0,0119

0,0116 0,0113 0,0110

0,0096

0,0094

0,0091

0,0089

0,0087

0,0084

0,0073 0,0071 0,0069 0,0068 0,0066 0,0064

0,0055

0,0054

0,0052

0,0051 0,0049 0,0048

0,0041 0,0040 0,0039 0,0038 0,0037 0,0036

0,0031 0,0030 0,0029 0,0028 0,0027 0,0026

0,0023 0,0022 0,0021 0,0021 0,0020 0,0019

0,0016 0,0016 0,0015

0,0015 0,0014

0,0014

0,0012 0,0011 0,0011 0,0011 0,0010

0,0010

0,0008 0,0008

0,0008

0,0008 0,0007 0,0007

0,0006 0,0006 0,0006 0,0005 0,0005 0,0005

0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0003

0,0003 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003 0,0002

0,0002

.0,0002

0,0002 0,0002 0,0002 0,0002

0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

0,0000 0,0000 0,0000

0,0000 0,0000 0,0000



V Ferreira

Tabla 2: Distribuci6n t de Student de dos

colas Valores de t que dejan fuera del

intervalo central

un

cierto porcentaj e de

elementos de l poblaci6n

dos colas

rados lib 0,25

0 1

1 2,41 6,31

2 1,60 2,92

3

1,42 2,35

4 1,34 2,13

5

1,30 2,02

6

1,27 1,94

7 1,25

1,89

8 1,24

1,86

9 1,23 1,83

10

1,22 1,81

15 1,20

1,75

20

1,18

1,72

30

1,17 1,70

50 1,16 1,68

Tabla 3: Distribuci6n t de Student de

una cola Valores de t que dejan a su

derecha un cierto porcentaje de

elementos de l poblaci6n

una cola

rados lib 0,25 0 1

1 1,00 3,08

2 0,82 1,89

3

0,76 1,64

4 0,74 1,53

5 0,73 1,48

6

0,72 1,44

7 0,71 1,41

8

0,71 1,40

9 0,70

1,38

10 0,70 1,37

15 0,69 1,34

20 0,69 1,33

30 0,68 1,

31

50

0,68 1,30

0,05

12,71

4,30

3,18

2,78

2,57

2,45

2,36

2,31

2,26

2,23

2,13

2,09

2,04

2,01

0,05

6,31

2,92

2,35

2,13

2,02

1,94

1,89

1,86

1,83

1,81

1,75

1,72

1,70

1,68

.138

0,025

0,01 0,001

25,45 63,66 636,62

6,21 9,92 31,60

4,18 5,84

12,92

3,50

4,60 8,61

3,16

4,03 6,87

2,97 3,71 5,96

2,84 3,50 5,41

2,75 3,36 5,04

2,69 3,25 4 78

2,63 3,17 4,59

2,49 2,95 4 07

2,42 2,85 3,

85

2,36

2,75

3,

65

2,31 2,68 3,50

0,025

0,01 0,001

12,71 31,82 318,31

4,30 6,96 22,33

3,18

4,54 10,21

2,78 3,75 7,17

2,57

3,36 5,89

2,45 3,14 5,21

2,36

3,00 4,79

2,31 2,90 4,50

2,26 2,82 4,30

2,23 2,76 4,14

2,13 2,60 3,73

2,09 2,53 3,55

2,04 2,46 3,39

2,01 2,40 3,26



Grados

Tabla 4. Distribuci6n F de 1 cola. Valores de F que dejan a su derecha u 5 de los

elementos de la poblaci6n

rados libertad numerador

1 2 3 4 5

6

7 8 9

10 12

15 20 25 50

Iibertad 1 161,4 199,5 215,7 224,6 230,2 234,0 236,8 238,9 240,5 241,9 243,9 245,9 248,0 249,3 251,8

denomi

2 18 51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40

19 41

19,43 19,45 19,46 19,48

nador 3 110,13 9,552 9,277 9,117 9,013

8 941

8,887 8,845 8,812 8,786 8,745 8,703 8,660 8,634 8 581

4 7,709 6,944 6 591 6,388 6,256 6,163 6,094

6 041

5,999 5,964 5,912 5,858 5,803 5,769 5,699

5 16,608 5,786 5,409 5,192 5,050 4,950 4,876 4,818 4,772 4,735 4,678 4,619 4,558

4 521

4.444

6 5,987 5,143 4,757 4,534 4,387 4,284 4,207 4,147 4,099 4,060 4,000 3,938 3,874 3,835 3,754

15 591 4,737 4,347 4,120 3,972 3,866 3,787 3,726 3,677 3,637 3 ,575 3 511 3,445 3,404 3,319

8 5,318 4,459 4,066 3,838 3,687 3 581 3,500 3,438 3,388 3,347 3,284 3,218 3,150 3,108 3,020

9 15,117 4,256 3,863 3,633 3,482 3,374 3,293 3,230 3,179 3,137 3,073 3,006 2,936 2,893 2,803

10 4,965 4,103 3,708 3,478 3,326 3,217 3,135 3,072 3,020 2,978 2,913 2,845 2,774 2,730 2,637

11 14,844 3,982 3,587 3,357 3,204 3,095 3,012 2,948 2,896 2,854 2,788 2,719 2,646

2 601

2,507

12 4,747 3,885 3,490 3,259 3,106 2,996 2,913 2,849 2,796 2,753 2,687 2,617 2,544 2,498 2 401

13 14,667 3,806 3 411 3,179 3,025 2,915 2,832 2,767 2,714 2 671 2,604 2,533 2,459 2,412 2,314

14 4,600 3,739 3,344 3,112 2,958 2,848 2,764 2,699 2,646 2,602 2,534 2,463 2,388 2 341 2 241

15 14,543 3,682 3,287 3,056

2 901

2,790 2,707

2 641

2,588 2,544 2,475 2,403 2,328 2,280 2,178

16 4,494 3,634 3,239 3,007 2,852 2 741 2,657 2,591 2,538 2,494 2,425 2,352 2,276 2,227 2,124

17 14,451 3,592 3,197 2,965 2,810 2,699 2,614 2,548 2,494 2,450 2 381 2,308 2,230

2 181

2,077

18 4,414 3,555 3,160 2,928 2,773 2 661 2,577 2,510 2,456 2,412 2,342 2,269 2 191 2 141 2,035

19 14,381 3,522 3,127 2,895 2,740 2,628 2,544 2,477 2,423 2,378 2,308 2,234 2,155 2,106 1,999

20

4 351

3,493 3,098 2,866

2 711

2,599 2,514 2,447 2,393 2,348 2,278 2,203 2,124 2,074 1,966

25 14,242 3,385 2 991 2,759 2,603 2,490 2,405 2,337 2,282 2,236 2,165 2,089 2,007 1,955 1,842

50 4,034 3,183 2,790 2,557 2,400 2,286 2,199 2,130 2,073 2,026 1,952

1 871

1,784 1,727 1,599

Tabla 5. Distribuci6n F de 2 colas. Valores de F que dejan a

su

derecha

u

2,5 de los

elementos de la poblaci6n, dejando fuera un 5 en total.

rados libertad numerador

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 15 20 25 50

Grados

1 647 8 799,5 864,2 899,6 921,8 937 1 948 2 956

7

963,3 968,6 976,7 984,9 993 1 998 1 1008 1

conceptos basicos de quimiometria y control de calidad en quimica analitica

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