compuestos de isoxazol como inhibidores de las proteínas de choque térmico

ES 2

393

483

T3

11 2 393 483

OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

19

Número de publicación:

T312

Número de solicitud europea:96 04709273 .9

Fecha de publicación de la solicitud:97 04.01.2006

Fecha de presentación: 09.02.200496

97 Número de publicación de la solicitud: 1611112

51 Int. CI.:

C07D 261/08 (2006.01)

C07D 413/04 (2006.01)

C07D 413/10 (2006.01)

C07D 417/04 (2006.01)

C07D 261/10 (2006.01)

C07D 495/04 (2006.01)

A61P 35/00 (2006.01)

30 Prioridad:

11.02.2003 GB 030310521.03.2003 GB 030656013.06.2003 GB 0313751

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

21.12.2012

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

21.12.2012

73 Titular/es:

VERNALIS (R&D) LIMITED (33.3%)100 Berkshire Place, Wharfedale Road, WinnershBerkshire RG41 5RD , GB;CANCER RESEARCH TECHNOLOGY LIMITED(33.3%) yTHE INSTITUTE OF CANCER RESEARCH (33.3%)

72 Inventor/es:

DRYSDALE, MARTIN, JAMES;DYMOCK, BRIAN, WILLIAM;FINCH, HARRY;WEBB, PAUL;MCDONALD, EDWARD;JAMES, KAREN E.;CHEUNG, KWAI M. yMATHEWS, THOMAS P.

74 Agente/Representante:

DE ELZABURU MÁRQUEZ, Alberto

Compuestos de isoxazol como inhibidores de las proteínas de choque térmico Título:54

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).

DESCRIPCiÓN

Compuestos de isoxazol como inhibidores de las proteínas de choque térmico

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Esta invención se refiere a isoxazoles sustituidos que tienen actividad inhibitoria de HSP90, al uso de tales compuestos en medicina, en relación con las enfermedades que son sensibles a la inhibición de la actividad de

5 HSP90, tales como cánceres, ya las composiciones farmacéuticas que contienen tales compuestos.

Antecedentes de la invención

Las chape ron as moleculares mantienen el plegamiento y la conformación adecuadas de las proteínas, y son cruciales en la regulación del equilibrio entre la síntesis y la degradación de proteínas. Se ha demostrado que son importantes en la regulación de muchas funciones celulares importantes, tales como la proliferación y la apoptosis

10 celular (Jolly y Morimoto, 2000; Smith et al., 1998; Smith, 2001).

Proteínas de Choque Térmico (HSPs)

La exposición de las células a varias agresiones ambientales, que incluyen el choque térmico, alcoholes, metales pesados y agresión oxidativa, da como resultado la acumulación celular de varias chaperonas, conocidas habitualmente como proteínas de choque térmico (HSPs). La inducción de HSPs protege a la célula de la lesión por

15 agresión inicial, potencia la recuperación y conduce al mantenimiento de un estado tolerante a la agresión. Se ha hecho evidente, sin embargo, que ciertas HSPs pueden desempeñar también un papel de chaperona molecular importante en condiciones normales, sin agresiones regulando, el plegamiento, degradación, localización y función correctas de una lista creciente de proteínas celulares importantes.

Existen varias familias multigénicas de HSPs, con productos génicos individuales que varían en la expresión, función 20 y localización celular. Se clasifican según el peso molecular, p.ej., HSP70, HSP90, y HSP27.

Se pueden adquirir diversas enfermedades en seres humanos como resultado del plegamiento erróneo de proteínas (revisado en Tytell et al., 2001; Smith et al., 1998). Por lo tanto, el desarrollo de terapias que alteren la maquinaria de las chaperonas moleculares puede resultar beneficioso. En ciertas afecciones (p.ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedades por priones y enfermedad de Huntington), las proteínas plegadas erróneamente pueden provocar una

25 agregación de proteínas, lo que da como resultado trastornos neurodegenerativos. Además, las proteínas plegadas erróneamente pueden dar como resultado la pérdida de la función de la proteína de tipo natural, lo que conduce a funciones moleculares y fisiológicas desreguladas en la célula.

Las HSPs también se han implicado en el cáncer. Por ejemplo, existen pruebas de la expresión diferencial de las HSPs que se puede relacionar con el estadio de la progresión tumoral (Martin et aL, 2000; Conroy et aL, 1996;

30 Kawanishi et al., 1999; Jameel et al., 1992; Hoang et al., 2000; Lebeau et al., 1991). Como resultado de la implicación de HSP90 en diversas rutas oncogénicas críticas y el descubrimiento de que ciertos productos naturales con actividad anticancerosa están seleccionando como objetivo esta chaperona molecular, se ha desarrollado el nuevo concepto fascinante de que la inhibición de la función de HSP puede ser útil en el tratamiento del cáncer. El primer inhibidor de chaperona molecular se está sometiendo actualmente a ensayos clínicos.

HSP90 constituye alrededor del 1-2% de la proteína celular total, y está presente normalmente en la célula en forma de un dímero en asociación con una de varias proteínas (véase, p.ej., Pratt, 1997). Es esencial para la viabilidad de la célula, y exhibe una función de chaperona doble (Young et aL, 2001). Desempeña un papel clave en la respuesta a la agresión celular interaccionando con muchas proteínas después de que su conformación nativa se haya

40 alterado por diversas agresiones ambientales, tales como choque térmico, lo que asegura el plegamiento adecuado de la proteína e impide la agregación inespecífica (Smith et aL, 1998). Además, los resultados recientes sugieren que HSP90 puede desempeñar también un papel en la amortiguación de los efectos de una mutación, probablemente corrigiendo el plegamiento inadecuado de las proteínas mutantes (Rutherford y Lindquist, 1998). Sin embargo, HSP90 tiene también un papel regulador importante. En condiciones fisiológicas normales, junto con su

45 homólogo del retículo endoplásmico GRP94, HSP90 desempeña un papel de mantenimiento en la célula, manteniendo la estabilidad conformacional y la maduración de varias proteínas cliente claves. Estas se pueden subdividir en tres grupos: (a) receptores de hormonas esteroides, (b) SerfThr o tirosina quinasas (p.ej., ERBB2, RAF-1, CDK4, y LCK), y (c) una colección de proteinas aparentemente no relacionadas, p.ej., p53 mutante y la subunidad catalítica de la telomerasa hTERT. Todas estas proteínas desempeñan papeles reguladores claves en muchos

50 procesos fisiológicos y bioquímicos en la célula. Se están identificando continuamente nuevas proteínas cliente de HSP90.

La familia de HSP90 muy conservada en seres humanos consiste en cuatro genes, concretamente las isoformas HSP90a y HSP90~ citosólicas (Hickey et al., 1989), GRP94 en el reticulo endoplásmico (Argon et al., 1999) y HSP75fTRAP1 en la matriz mitocondrial (Felts et al., 2000). Se cree que todos los miembros de la familia tienen un

55 modo de acción similar, pero se unen a proteínas cliente diferentes dependiendo de su localización dentro de la célula. Por ejemplo, se sabe que ERBB2 es una proteina cliente especifica de GRP94 (Argo n et al., 1999) y se ha

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demostrado que el receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 (TNFR1) Y RB son clientes de TRAP1 (Song et al., 1995; Chen et al., 1996).

HSP90 participa en una serie de interacciones complejas con una diversidad de proteínas cliente y proteínas reguladoras (Smith, 2001). Aunque los detalles moleculares concretos todavía se tienen que dilucidar, los estudios

5 bioquimicos y de cristalografia de rayos X (Prodromou et al., 1997; Stebbins et al., 1997) llevados a cabo a lo largo de los últimos años han proporcionado percepciones cada vez más detalladas sobre la función de chaperona de HSP90.

Tras la controversia anterior sobre este tema, ahora está claro que HSP90 es una chaperona molecular dependiente de ATP (Prodromou et al, 1997), y la dimerización de los dominios de unión a los nucleótidos es esencial para la

10 hidrólisis de ATP, que a su vez es esencial para la función de chaperona (Prodromou et al, 2000a). La unión del ATP da como resultado la formación de una estructura dimérica toroidal en la que los dominios N-terminales pasan a estar en contacto más cercano entre sí, lo que da como resultado un cambio conformacional conocido como el "mecanismo de abrazadera" (Prodromou y Pearl, 2000b).

Inhibidores Conocidos de HSP90

15 La primera clase de inhibidores de HSP90 en ser descubierta fue la clase de benzoquinona ansamicina, que incluye los compuestos herbimicina A y geldanamicina. Se demostró que invertían el fenotipo maligno de los fibroblastos transformados por el oncogén v-Src (Uehara et aL, 1985), y posteriormente exhibían una actividad antitumoral potente en modelos animales tanto in vi/ro (Schulte et al., 1998) como in vivo (Supko et al., 1995).

Los estudios de inmunoprecipitación y de matriz de afinidad han demostrado que el mecanismo principal de acción 20 de geldanamicina implica la unión a HSP90 (Whitesell et al., 1994; Schulte y Neckers, 1998). Además, los estudios

cristalográficos de rayos X han demostrado que la geldanamicina compite en el sitio de unión de ATP e inhibe la actividad intrinseca de ATPasa de HSP90 (Prodromou et al., 1997; Panaretou et al., 1998). Esto a su vez impide la formación de complejos de HSP90 multiméricos maduros capaces de actuar como chaperonas en las proteínas cliente. Como resultado, las proteínas cliente son seleccionadas para la degradación por medio de la ruta ubiquitina-

25 proteosoma. 17-Alilamino, 17-desmetoxigeldanamicina (17AAG) mantiene la propiedad de inhibición de HSP90 que da como resultado la disminución de las proteínas cliente y la actividad antitumoral en cultivo celular y en modelos de xenoinjerto (Schulte et al, 1998; Kelland et al, 1999), pero tiene una hepatotoxicidad significativamente más baja que geldanamicina (Page et al, 1997). 17 AAG se está estudiando actualmente en ensayos clínicos de fase 1.

Radicicol es un antibiótico macrocíclico que se ha demostrado que invierte el fenotipo maligno de los fibroblastos 30 transformados con v-Src y v-Ha-Ras (Kvvon et al, 1992; Zhao et al, 1995). Se ha demostrado que degrada varias

proteínas de señalización como consecuencia de la inhibición de HSP90 (Schulte et aL, 1998). Los datos cristalográficos de rayos X confirmaron que radicicol también se une al dominio N-terminal de HSP90 e inhibe la actividad intrínseca de ATPasa (Roe et aL, 1998). Radicicol carece de actividad antitumoral in vivo debido a la naturaleza química inestable del compuesto.

35 Se sabe que los antibióticos de cumarina se unen a la ADN girasa bacteriana en un sitio de unión de ATP homólogo al de HSP90. Se ha demostrado que la cumarina novobiocina se une al extremo carboxilo de HSP90, es decir, a un sitio diferente del ocupado por las benzoquinonas ansamicina y radicicol, que se unen en el extremo N-terminal (Marcu et al., 2000b). No obstante, esto todavia dio como resultado la inhibición de la función de HSP90 y la degradación de varias proteínas de señalización sometidas a la acción de chaperona de HSP90 (Marcu et aL,

40 2000a). Geldanamicina no se puede unir a HSP90 después de novobiocina; esto sugiere que debe existir cierta interacción entre los dominios N- y C-terminales, y es coherente con la visión de que ambos sitios son im¡x>rtantes para las propiedades de chaperona de HSP90.

Se ha demostrado que un inhibidor de HSP90 basado en purina, PU3, da como resultado la degradación de las moléculas de señalización, que incluyen ERBB2, y provoca la detención del ciclo celular y la diferenciación hasta

45 células de cáncer de mama (Chiosis et al., 2001).

HSP90 como Objetivo Terapéutico

Debido a su implicación en la regulación de varias rutas de señalización que son de crucial importancia en el control del fenotipo de un tumor, y el descubrimiento de que ciertos productos naturales bioactivos ejercen su efecto por medio de la actividad de HSP90, la chaperona molecular HSP90 se está estudiando actualmente como un objetivo

50 nuevo para el desarrollo de fármacos anticancerosos (Neckers et aL, 1999).

El mecanismo de acción predominante de geldanamicina, 17AAG, y radicicol implica la unión a HSP90 en el sitio de unión de ATP localizado en el dominio N-terminal de la proteína, que conduce a la inhibición de la actividad ATPasa intrinseca de HSP90 (véase, p.ej., Prodromou et al., 1997; Stebbins et al., 1997; Panaretou et al., 1998).

La inhibición de la actividad ATPasa de HSP90 impide la adquisición de co-chaperonas y estimula la formación de 55 un tipo de heterocomplejo de HSP90 a partir del cual estas proteínas cliente se seleccionan como objetivo para la

degradación por medio de la ruta ubiquitina-proteosoma (véase, p.ej., Neckers et al., 1999; Kelland et al., 1999).

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El tratamiento con inhibidores de HSP90 conduce a la degradación selectiva de proteínas importantes implicadas en la proliferación celular, la regulación del ciclo celular y la apoptosis, procesos que son de vital importancia en el cáncer.

Se ha demostrado que la inhibición de la función de HSP90 provoca la degradación selectiva de proteínas de 5 señalización importantes implicadas en la proliferación celular, la regulación del ciclo celular y la apoptosis, procesos

que son de vital importancia y que normalmente están desregulados en el cáncer (véase, p.ej., Hostein et al., 2001). Un fundamento atractivo para el desarrollo de fármacos contra este objetivo para el uso en la clínica es que al disminuir simultáneamente las proteínas asociadas al fenotipo transformado, se puede obtener un efecto antitumoral potente y conseguir una ventaja terapéutica contra el cáncer respecto de las células normales. Se cree que estos

10 eventos posteriores a la inhibición de HSP90 son responsables de la actividad antitumoral de los inhibidores de HSP90 en cultivo celular yen modelos de animales (véase, p.ej., Schulte et al., 1998; Kelland et al., 1999).

Descripción breve de la invención

La presente invención se refiere al uso de una clase de compuestos de isoxazol sustituidos como inhibidores de HSP90, por ejemplo para la inhibición de la proliferación de células cancerosas. La invención también incluye

15 compuestos de isoxazol nuevos per se, y composiciones farmacéuticas que los contienen.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, se proporciona un compuesto de fórmula (A) o (B) o una sal, N-óxido, hidrato o solvato del mismo:

20 en la que

R1 es un grupo de fórmula (lB)

(A)

R

Q-(Alk2),_(Z),-(Alkl)~ OH

en la que en cualquier combinación compatible

R representa uno o más sustituyentes opcionales,

(B)

(lB)

25 Alk1 Y Alk2 son radicales alquileno C1-C6 o alquenileno C2-C6 diva lentes sustituidos opcionalmente,

p, r y s son independientemente O ó 1 ,

Z es -0-, -S-, -(C=O)-, -(C=S)-, -S02-, -C(=O)O-, -C(=O)NRA-, -C(=S)NRA-, -S02NRA-, -NRAC(=O)-, -NRAS02- o _NRA_ en las que RA es hidrógeno o alquilo C1-C6, y

Q es hidrógeno o un radical carbocíclico o heterocíclico sustituido opcionalmente;

30 R2 es (i) un grupo de fórmula (lA):


Ar1 es un radical arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, y

Alk\ Alk2, p, r, s, Z, RA y Q son como se definen en relación con R1;

35 (ii) un radical carboxamida; o

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(jii) un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático en el que un carbono del anillo está sustituido opcionalmente, y/o un nitrógeno del anillo está sustituido opcionalmente con un grupo de fórmula -(Alk 1)P_(Z)r (Alk2)s-Q en la que Q, Alk 1, Alk2

, Z, p, r y s son como se definieron anteriormente en relación con el grupo (lA); y

5 R3 es un grupo carboxilo, carboxamida o éster de carboxilo,

la expresión "sustituido opcionalmente" significa sustituido con hasta cuatro sustituyentes compatibles, y cada uno de los cuales se selecciona independientemente de alquilo (C 1-C6), alcoxi (C 1-C6), hidroxi, hidroxialquilo (C 1-C6),

mercapto, mercaptoalquilo (C,-C6), alquiltio (C ,-C6), halógeno (que incluye Iluoro, bromo y cloro), trilluorometilo, trilluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, lenilo, -COOH, -COORA

, -coR', -S02RA, -CONH 2, -S02NH 2, -CONHRA, -10 S02NHRA, _CONRARB, _S02NRARB, -NH2, _NHRA

, _NRARB, -OCONH2, -OCONHRA, _OCONRARB, -NHCORA, -

NHCOORA, _NRBCOORA, -NHS0 20RA, -NRBS020H, _NRBS020RA, -NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHRB, -

NRACONHRB, _NHCONRARB, o _NRACONRARB en las que RA y RB son independientemente un grupo alquilo (C , -C6),

y

el término "carboxamida" significa un grupo de fórmula -CONH 2 o un grupo metilaminocarbonilo, etilaminocarbonilo o 15 isopropilamino carbonilo, o un grupo de lórmula -CONRB(Alk)cRA en la que

Alk es un radical alquileno, alquenileno o alquinileno divalente sustituido opcionalmente,

nesOó1,

RB es hidrógeno o un grupo alquilo C 1-C6 o alquenilo C2-C6,

RA es hidroxi o carbocíclico o heterociclilo sustituido opcionalmente,

20 o RA y RB junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo N-heterocíclico que puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados de O, S Y N, Y que pueden estar sustituidos opcionalmente en uno o más átomos de C o N del anillo.

Tal como se usa en la presente memoria:

la expresión "grupo carboxilo" se refiere a un grupo de fórmula -COOH; y

25 la expresión "grupo éster de carboxilo" se refiere a un grupo de fórmula -COOR, en la que R es un radical realmente o teóricamente derivado del compuesto de hidroxilo ROH.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "alquilo (Ca-Cb)", en la que a y b son números enteros, se refiere a un radical alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono. Así, cuando a es 1 y b es 6, por ejemplo, el término incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-

30 pentilo y n-hexilo.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "radical alquileno (Ca-Cb) divalente", en la que a y b son números enteros, se refiere a una cadena de hidrocarburo saturado que tiene de a a b átomos de carbono y dos valencias libres.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "alquenilo (Ca-Cb)", en la que a y b son números enteros, se 35 refiere a un radical alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono y que contiene al

menos un enlace doble de configuración E o Z, que incluye, por ejemplo, etenilo y alilo.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "radical alquenileno (Ca-Cb) divalente", en la que a y b son números enteros, se refiere a una cadena de hidrocarburo que tiene de a a b átomos de carbono, al menos un enlace doble, y dos valencias libres.

40 Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "alquinilo (Ca-C4)", en la que a y b son números enteros, se refiere a un radical alquinilo de cadena lineal o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono y que contiene al menos un enlace triple, que incluye, por ejemplo, etinilo y prop-2-inilo.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "radical alquinileno (Ca-Cb) divalente", en la que a y b son números enteros, se refiere a un radical alquinilo de cadena lineal o ramificada que tiene de a a b átomos de

45 carbono y que contiene al menos un enlace triple, y dos valencias libres.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cicloalquilo" se refiere a un radical carbocíclico saturado que tiene 3-8 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cicloalquenilo" se refiere a un radical carbocíclico que tiene 3-8 50 átomos de carbono que contiene al menos un enlace doble, e incluye, por ejemplo, ciclopentenilo, ciclohexenilo,

5

cicloheptenilo y ciclooctenilo.

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Tal como se usa en la presente memoria, el término "arilo" se refiere a un radical aromático carbocíclico mono-, bi- o tri-cíclico. Los ejemplos ilustrativos de tales radicales son fenilo, bifenilo y naftilo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "carbocíclico" se refiere a un radical cíclico cuyos átomos del 5 anillo son todos carbono, e incluye los radicales arilo monocíclico, cicloalquilo y cicloalquenilo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático mono-, bi- o tricíclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N Y O. Los ejemplos ilustrativos de tales radicales son tienilo, benzotienilo, fu rilo, benzofurilo, pirrolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, bencisotiazolilo, pirazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, bencisoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, benzotriazolilo,

10 tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indolilo e indazolilo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término sin calificar "heterociclilo" o "heterocíclico" incluye "heteroarilo" tal como se definió anteriormente, y en particular significa un radical no aromático mono-, bi- o tri-cíclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N Y O, Y grupos que consisten en un radical no aromático monocíclico que contiene uno o más de tales heteroátomos que está unido de manera covalente a otro radical o a un

15 radical carbocíclico monocíclico. Los ejemplos ilustrativos de tales radicales son los grupos pirrolilo, furanilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo, morfolinilo, benzofuranilo, piranilo, isoxazolilo, bencimidazolilo, metilendioxifenilo, etilendioxifenilo, maleimido y succinimido.

A menos que se especifique de otra manera en el contexto en el que se da, el término "sustituido", tal como se aplica 20 a cualquier resto de la presente memoria, significa sustituido con hasta cuatro sustituyentes compatibles, cada uno

de los cuales puede ser independientemente, por ejemplo, alquilo (C,-C6), alcoxi (C ,-C6), hidroxi, hidroxialquilo (C ,-C6), mercapto, mercaptoalquilo (C,-C6), alquiltio (C,-C6), halógeno (que incluye Iluoro, bromo y cloro), trilluorometilo, trilluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN)" oxo, lenilo, - COOH, _COORA, _CORA, -S02RA, -CONH2 , -S02NH2, -CONHRA, -S02NHRA, _CONRARB, -S02NR RB, -NH2, _NHRA, _NRARB, -OCONH2, -OCONHRA, _OCONRARB, -NHCORA, -

25 NHCOORA, _NRBCOORA, -NHS020RA, -NRBS020H, _NRBS020RA, -NHCONH2, -NRACONH 2. -NHCONHRB, -NRACONHRB, _NHCONRARB, o _NRACONRARB en las que RA y RB son independientemente un grupo alquilo (C , -C6). Un "sustituyente opcional" puede ser uno de los grupos sustituyentes anteriores. De los sustituyentes anteriores, alquilo (C1-C6), halógeno, trifluorometilo, trifluorometoxi, trifluorometilsulfonilo, y fenilo son los que se consideran más habitualmente como lipófilos. Otros sustituyentes enumerados que contienen grupos alquilo pueden ser lipófilos

30 dependiendo de los grupos alquilo particulares presentes.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "sal" incluye las sales de adición de bases, de adición de ácidos y las sales cuaternarias. Los compuestos de la invención que son ácidos pueden formar sales, que incluyen las sales farmacéuticamente o veterinariamente aceptables, con bases tales como hidróxidos de metales alcalinos, p.ej. hidróxidos de sodio y potasio; hidróxidos de metales alcalinotérreos, p.ej. hidróxidos de calcio, bario y magnesio; con

35 bases orgánicas, p.ej. N-metil-D-glucamina, colina tris(hidroximetil)aminometano, L-arginina, L-lisina, N-etil piperidina, dibencilamina y similares. Los compuestos (1) que son básicos pueden formar sales, que incluyen las sales farmacéuticamente o veterinariamente aceptables, con ácidos inorgánicos, p.ej. con haluros de hidrógeno tales como ácidos clorhídrico o bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico y similares, y con ácidos orgánicos, p.ej. con ácidos acético, tartárico, succínico, fumárico, maleico, málico, salicílico, cítrico, metanosulfónico,

40 p-toluenosulfónico, benzoico, bencenosulfónico, glutámico, láctico, y mandélico, y similares.

El término "Iipófilo", tal como se usa en la presente memoria en relación con un sustituyente, significa que tiene una constante de hidrofobicidad (TI) positiva para el sustituyente. (Un valor positivo para TI indica que el sustituyente es más lipófilo que el hidrógeno, mientras un valor negativo indica que es menos lipófilo, es decir, más hidrófilo, que el hidrógeno).

45 Algunos compuestos de la invención contienen uno o más centros quirales reales o potenciales debido a la presencia de átomos de carbono asimétricos. La presencia de varios átomos de carbono asimétricos da lugar a varios diaestereoisómeros con estereoquímica R o S en cada centro quiral. La invención incluye tales diaestereoisómeros y las mezclas de los mismos.

Un aspecto de la invención incluye los compuestos de fórmula (A) o (8) anteriores y las sales, N-óxidos, hidratos o 50 solvatos de los mismos, y profármacos de los mismos, excepto los tres compuestos siguientes (X), (Y) Y (Z) que

están disponibles comercialmente:

6

HO

(X) (Y)

F

(Z)

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Sujeta a esas exclusiones, la invención incluye en particular aquellos en los que los sustituyentes R1, R2 Y R3 son como se discute y se especifica en las siguientes secciones tituladas "El radical R1", "El radical R2", y "El radical R3". Otro aspecto incluye el uso de tales compuestos para el tratamiento de enfermedades sensibles a la inhibición de la

5 actividad de HSP90.

El radical R1

El grupo R1 tiene la fórmula (lB)

R

Q-(Alk2)s-(Z),-(Alkl)~ OH

(lB)

en la que Alk \ Alk2, p, r, s, Z y Q son como se definieron anteriormente en relación con R1, Y R representa uno o 10 más sustituyentes opcionales. En tales estructuras, se prefiere además que el átomo de carbono del anillo

adyacente al grupo hidroxilo éste sin sustituir. En la discusión posterior de R1 que sigue, se aplica esta preferencia además de cualquier otra posibilidad mencionada.

En las estructuras más simples con las que está relacionada la invención, cada p, r y s puede ser O, y Q puede ser hidrógeno, de forma que R1 es arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente. En tales casos, R1 puede ser, por

15 ejemplo, fenilo sustituido opcionalmente, preferiblemente 2-hidroxifenilo que puede estar sustituido adicionalmente, por ejemplo con uno o más de hidroxi, metilo, etilo, metoxi, etoxi, cloro, o bromo. Los preferidos actualmente son los compuestos en los que R1 es 2,4-dihidroxifenilo, sustituido en la posición 5 con un sustituyente lipófilo pequeño, por ejemplo que tiene un volumen molecular igualo menor del de terc-butilo, tal como metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo, cloro, o bromo, en especial etilo, isopropilo, o cloro. En tales compuestos de 2,4-dihidroxi fenilo

20 sustituidos en la posición 5 de la invención, los grupos hidroxilo se pueden proteger mediante grupos que se escinden en el organismo para liberar los grupos hidroxilo. Los grupos de tipo profármaco conocidos de este tipo que se escinden hasta hidroxilos incluyen grupos alquilcarboniloxi tales como metilcarboniloxi, y grupos alquilaminocarboniloxi tales como dialquilamino- o isopropilamino-carboniloxi.

En otras estructuras simples con las que la invención está relacionada, p, r y s pueden ser de nuevo O, y Q puede 25 ser un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido opcionalmente, por ejemplo un anillo fenilo o piridilo. En tales

casos, Q es un sustituyente directo en el anillo Ar 1 sustituido opcionalmente.

En estructuras más complejas con las que la invención está relacionada, uno o más de p, r y s pueden ser 1, Y Q puede ser hidrógeno o un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido opcionalmente. Por ejemplo, p y/o s pueden ser 1 y r puede ser O, de forma que Q está unido a Ar1 mediante un radical alquileno o alquenileno, por ejemplo un

30 radical alquileno C1-C3, que está sustituido opcionalmente. En otros casos, cada p, r, y s puede ser 1, en cuyo caso Q está unido a Ar 1 mediante un radical alquileno o alquenileno que está interrumpido por el radical Z que contiene el heteroátomo. En otros casos, p y s pueden ser O y r puede ser 1, en cuyo caso Q está unido a Ar1 por medio del radical Z que contiene el heteroátomo.

Los ejemplos específicos de grupos R1 de los tipos anteriores están presentes en los compuestos de los Ejemplos 35 de la presente memoria.

El radical R2

Cuando R2 es de tipo (i), es decir, un grupo de fórmula (lA), los ejemplos incluyen fenilo, 2-, 3-, o 4-piridilo, 2- o 3-furanilo, 2- o 3-tienilo, y tiazolilo en los que los sustituyentes opcionales incluyen cualquiera de los enumerados anteriormente en la definición de "sustituido", por ejemplo metoxi, etoxi, metilendioxi, etilendioxi, fluoro, cloro, bromo,

7

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y trifluorometilo. Por ejemplo, R2 puede ser fenilo sustituido en la posición 4 con alcoxi C1-C6 tal como metoxi o etoxi, o con fluoro, cloro, bromo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, o piperidinilo.

Los sustituyentes R2 preferidos actualmente incluyen los que tienen la estructura parcial:

5 en la que el grupo ami no sustituido _NR10R11 es un grupo solubilizante. Se conocen muchos grupos solubilizantes en la química médica. Los ejemplos incluyen morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropilamino, dietilamino, ciclohexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, dióxido de tiomorfolinilo, 4-hidroxietilpiperidinilo, y 4-hidroxipiperidinilo.

La solicitud de patente internacional pendiente junto con la presente nO PCT/GB2003/005275 describe compuestos 10 de pirazol inhibidores de HSP90 análogos a los isoxazoles con los que está relacionada esta invención, y se cree

que se unen al objetivo de HSP90 de una forma análoga. Esos compuestos de pirazol tienen un grupo carboxamida en la posición correspondiente a R2 de los isoxazoles presentes. Por lo tanto, cuando R2 en los isoxazoles presentes es un radical carboxamida del tipo (ii) anterior, los ejemplos incluyen aquellos presentes en los compuestos de pirazol del documento PCT/GB2003/005275, por ejemplo carboxamidas de fórmula -CONRB(Alk)nRA en la que

15 Alk es un radical alquileno, alquenileno o alquinileno divalente, por ejemplo un radical -CHr, -CH2CHr, -CH2CH2CH2-, -CH2CH=CH-, o -CH2CCCH2-, y el radical Alk puede estar sustituido opcionalmente,

nesOó1,

RB es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C6, por ejemplo metilo, etilo, n- o iso-propilo, o alilo,

RA es hidroxi o carbocíclico sustituido opcionalmente, por ejemplo hidroxi y/o fenilo sustituido con cloro y 3,4 20 metilendioxifenilo; o heterociclilo, por ejemplo piridilo, fu rilo, tienilo, N-piperazinilo, o N-morfolinilo, cualquiera de

cuyos anillos heterocíclicos pueden estar sustituidos,

o RA y RB junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo N-heterocíclico que puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados de O, S Y N, Y que pueden estar sustituidos opcionalmente en uno o más átomos de C o N del anillo, y los ejemplos de tales anillos N-heterocíclicos

25 incluyen morfolino, piperidinilo, piperazinilo y N-fenilpiperazinilo.

30

El radical R3

R3 es un grupo carboxilo, carboxamida o éster de carboxilo.

Un subgrupo particular de los compuestos con los que está relacionada esta invención consiste en los de fórmula (ID), y los regioisómeros de fórmula B de los mismos, y sus sales, solvatos e hidratos, y profármacos de los mismos:

HO

(ID)

en la que cada R representa independientemente un sustituyente opcional y R3 representa un grupo carboxamida.

Un subgrupo preferido de los compuestos con los que está relacionada esta invención consiste en los de fórmula (lE), y los regioisómeros de fórmula B de los mismos, y sus sales, solvatos e hidratos, y profármacos de los mismos:

8

HO

(lE)

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en la que R3 representa un grupo carboxamida (tal como etilaminocarbonilo CH3CH2NHC(=O)-, o isopropilaminocarbonilo (CH3)2CHNHC(=O)-); Rg representa _CH2NR10R11

0 _NR10R11 en las que el grupo ami no sustituido _NR10R11 es un grupo solubilizante, (tal como morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino,

5 isopropilamino, dietilamino, ciclohexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, Nmetilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, dióxido de tiomorfolinilo, 4-hidroxietilpiperidinilo, y 4-hidroxipiperidinilo); y Rs representa un sustituyente opcional, en especial un grupo lipófilo pequeño (tal como etilo, isopropilo, bromo, o cloro).

Los compuestos específicos con los que está relacionada la invención incluyen los de los Ejemplos, en particular los 10 siguientes, y sus sales, N-óxidos, hidratos y solvatos, y profármacos de los mismos:

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-piperidin-1-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

15 Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-etilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-[4-(isopropilamino-metil)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-ciclohexilaminometil-fenil)-5-(2,4-dihidroxi-5-isopropilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-[4-(terc-butilamino-metil)-fenil]-5-(2,4-dihidroxi-5-isopropilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-{4-[(2-metoxi-etilamino)-metil]-fenil}-isoxazol-3-carboxílico

20 Isopropilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Isopropi lamida de ácido 5-(2,4-di hidroxi -5-isopropil-feni 1)-4-[4-( 4-meti l-piperazin-1-i Imeti I)-feni 1]-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-piperidin-1-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

25 Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-piperidin-1-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-dietilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 3-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-5-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(4,6-dihidroxi-2'-metil-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxílico

30 Etilamida de ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(4'-fluoro-4,6-dihidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(4,6-dihidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2'-fluoro-4,6-dihidroxi-bifenil-3-il)-4-(4-pirrolidin-1-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(4,6-dihidroxi-bifenil-3-il)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

9

Isopropi lamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-feni 1)-4-( 4-pi peridi n-1-i Imeti I-feni 1)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(5-etil-2,4-dihidroxi -fenil)-4-[ 4-( 4-meti I-pi perazin-1-ilmeti 1)-fenil]-isoxazol-3-carbox ílico

Etilamida de ácido 5-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

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5 Etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-dietilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico


Los compuestos con los que está relacionada la invención se pueden preparar mediante métodos de la bibliografía, tales como los de los Ejemplos preparativos de la presente memoria, y métodos análogos a los mismos.

10 Por ejemplo, algunos compuestos de fórmula (lA) se pueden preparar mediante la reacción de hidroxilamina y un compuesto de fórmula (111)

(111)

en la que el anillo A corresponde al grupo R1 de los compuestos (lA) y R2 Y R3 son como se definieron en relación con la fórmula (1). Los compuestos preparados de esta manera se pueden modificar químicamente después para

15 introducir los sustituyentes deseados, para producir otros compuestos de fórmula (A). Por ejemplo, cuando R1 es un anillo fenilo, que opcionalmente ya porta sustituyentes, la introducción de un sustituyente de bromo posibilitará a menudo la introducción de otros sustituyentes en el sitio del bromo mediante acoplamiento sp2.

20

En otra ruta hacia ciertos compuestos de fórmula (A), el anillo isoxazol se forma mediante la reacción de un compuesto (IV) con hidroxilamina

R1 R1 1¡íy 3 (IV)

O OH

en la que R'1 y R'3 son miembros de las clases de sustituyentes R1 y R3 definidos anteriormente, para producir el isoxazol M

R1 1

h--R1 N 3

(V)

seguido por la introducción del sustituyente adicional R2 (por ejemplo mediante bromación o yodación del carbono 25 del anillo en M y acoplamiento sp2, y/o modificación de los sustituyentes R \ R \ Y R2 resultantes del isoxazol.

Además, ciertos regioisómeros del isoxazol (B) se pueden preparar a partir de los isoxazoles (A) mediante reacción con trifluoruro de boro-trimetiloxonio, y de nuevo los compuestos preparados de esta manera se pueden modificar químicamente después para introducir los sustituyentes deseados, para producir otros compuestos de fórmula (lA).

Se entenderá que durante las síntesis anteriores, puede ser deseable proteger los grupos reactivos, tales como 30 hidroxilos, y desprotegerlos más tarde. Se describen detalles sintéticos adicionales en los ejemplos de la presente

memoria.

Los compuestos de la invención son inhibidores de HSP90 y, así, son útiles en el tratamiento de enfermedades que son sensibles a la inhibición de la actividad de HSP90, tales como el cáncer; enfermedades virales tales como Hepatitis C (HCV) (Waxman, 2002); Inmunodepresión, tal como en el transplante (Bijlmakers, 2000 y Yorgin, 2000);

35 Enfermedades auto-inflamatorias (Bucci, 2000) tales como Artritis reumatoide, Asma, EM, Diabetes Tipo 1, Lupus,

10

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Psoriasis y Enfermedad Inflamatoria Intestinal; Fibrosis quística (Fuller, 2000); Enfermedades relacionadas con la angiogénesis (Hur, 2002 y Kurebayashi, 2001): retinopatía diabética, hemangiomas, psoriasis, endometriosis y angiogénesis tumoral. Además, un inhibidor de Hsp90 de la invención puede proteger a las células normales de la toxicidad inducida por la quimioterapia y puede ser útil en enfermedades en las que la incapacidad de experimentar

5 la apoptosis es un factor subyacente. Tal inhibidor de Hsp90 puede ser útil también en enfermedades en las que podría ser beneficiosa la inducción de una respuesta de proteínas de agresión celular o choque térmico, por ejemplo, la protección de la hipoxia-Iesión isquémica debida a la elevación de Hsp70 en el corazón (Hutter, 1996 y Trost, 1998) y cerebro (Plumier, 1997 y Rajder, 2000). Un inhibidor de Hsp90 también podria ser útil en enfermedades en las que el plegamiento erróneo o la agregación de las proteínas es un factor causal importante, por ejemplo,

10 encefalopatia espongiforme ovina/CJD, enfermedad de Huntingdon y enfermedad de Alzheimer (Sittler, 2001; Trazelt, 1995 y Winklhofer, 2001).

Por lo tanto, la invención también proporciona:

(i) un método de tratamiento de enfermedades o afecciones sensibles a la inhibición de la actividad de HSP90 en mamíferos, en particular seres humanos, y el método comprende administrar al mamífero una cantidad de un

15 compuesto de fórmula (A) o (B) como se definió anteriormente, o una sal, hidrato o solvato del mismo, eficaz para inhibir dicha actividad de HSP90; y

(ii) un compuesto de fórmula (A) o (B) como se definió anteriormente, o una sal, hidrato o solvato del mismo, para el uso en medicina humana o veterinaria, en particular en el tratamiento de enfermedades o afecciones sensibles a la inhibición de la actividad de HSP90;

20 (iii) una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (A) o (B) como se definió y especificó anteriormente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En particular, la invención incluye una disolución o suspensión de tal compuesto en un vehículo fisiológicamente aceptable, estéril, por ejemplo solución salina acuosa.

Se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de 25 factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud

general, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la vía de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y el mecanismo causal y la gravedad de la enfermedad particular que se somete a terapia. En general, una dosis adecuada para las formulaciones administrables de manera oral estará normalmente en el intervalo de 0,1 a 3000 mg una vez, dos veces o tres veces al día, o la cantidad diaria equivalente administrada

30 mediante infusión u otras vías. Sin embargo, los niveles de dosis y la frecuencia de dosificación óptimas se determinarán en ensayos clínicos, como es convencional en la técnica.

Los compuestos que conciernen a la invención se pueden preparar para la administración mediante cualquier vía coherente con sus propiedades farmacocinéticas. Las composiciones administrables oralmente pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pastillas, preparaciones líquidas o en gel, tales como soluciones

35 o suspensiones orales, tópicas, o parenterales estériles. Los comprimidos y las cápsulas para administración oral pueden estar en una forma farmacéutica de dosis unitaria, y pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, o polivinilpirrolidona; rellenos, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o glicina; lubricantes para producción de comprimidos, por ejemplo estearato magnésico, talco, polietilen glicol o sílice; disgregantes, por ejemplo almidón de

40 patata, o agentes humectantes aceptables, tales como lauril sulfato sódico. Los comprimidos se pueden revestir según métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos, o se pueden presentar en forma de un producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, por

45 ejemplo sorbitol, jarabe, metil celulosa, jarabe de glucosa, gelatina, grasas hidrogenadas comestibles; agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitán, o goma arábiga; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos tales como glicerina, propilen glicol, o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico, y, si se desea, agentes aromatizantes o colorantes.

50 Para la aplicación tópica en la piel, el fármaco se puede preparar en una crema, loción o pomada. Las formulaciones en crema o pomada que se pueden usar para el fármaco son formulaciones convencionales muy conocidas en la técnica, por ejemplo como se describe en libros de texto habituales de farmacia, tales como la Farmacopea Británica.

El ingrediente activo se puede administrar también de manera parenteral en un medio estéril. Dependiendo del 55 vehículo y de la concentración usada, el fármaco se puede suspender o disolver en el vehículo. De manera

ventajosa, se pueden disolver en el vehículo adyuvantes tales como un anestésico local, conservantes y agentes de tamponamiento.

11

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Los compuestos de la invención son útiles también en ensayos in vitro dependientes de la inhibición de la actividad de HSP90, por ejemplo en el cribado en busca de clases alternativas de inhibidores de HSP90 en los que el compuesto de ensayo compite con o desplaza un compuesto de esta invención. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención incluye un método para inhibir la actividad de HSP90, que comprende poner en contacto, in vitro, una

5 enzima HSP90 y un compuesto de fórmula (A) o (B) como se definió y especificó anteriormente.

Los ejemplos siguientes ilustran la preparación y actividades de los compuestos específicos de la invención.

Ejemplos 1-4

Esquema 1: Preparación de intermedio de bromo y arilación posterior

o HO~OH

I

d?~lo

-~ ~ I"'=::

HO .ó OH

"' O

--_~ HO

OH

"' O

I

-C6?0

O ~ I ~

I "'=:: I HO .ó O

----<.~ BnO

OBn

I

.. BnO dPO Ph

Ph "'=:: ~ I • HO

I I HO .ó O

OH

"' O

"' O

10 Ejemplo 1

4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol

15

20

Etapa 1

1-( 2,4-Di h id roxi -fe n i 1)-2-( 4-metoxi -fe n i 1) -etan ona

I

d?o o .;rl

'<::: :::,..

HO 1 ¿ OH

Se calentó resorcinol (4,4 g, 40 mmol) y ácido 4-metoxifenilacético (6,6 g, 40 mmol) en trifluoruro de boro - eterato (25 mi, 0,2 mol), bajo una atmósfera de nitrógeno, a 90 oC durante -90 mins. para proporcionar una disolución roja pálida. La disolución se dejó enfriar y se vertió en acetato sódico acuoso (200 mi, 10%) Y la mezcla se agitó para proporcionar un precipitado amarillo pálido. El sólido se extrajo mediante filtración y se lavó con agua (200 mi). El sólido se resuspendió en acetato de etilo (250 mi) y se lavó con agua (200 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró, hasta un semi-sólido amarillo. La trituración con éter dietílico (100 mi) proporcionó la 1-(2,4-dihidroxi-fenil)-2-(4-metoxi-fenil)-etanona en forma de un sólido naranja pálido, se secó a vacío, (2,2 g).

12

Tiempo de retención en LC 2,39 minutos [M+Hf 259,2 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

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R.M.N. (DMSO-d6) 7,95 (d J 8,9 Hz ArH) 7,2 (d J 8,7 Hz 2ArH) 6,9 (d J 8,7 Hz 2ArH) 6,4 (d J 9,9 ArH) 6,25 (s ArH) 4,2 (s 2CH2) 3,75 (s 30CH3)

Etapa 2

5 7-Hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-cromen-4-ona

I

dP~ o ~I

I '-':: I HO ¿ o

Se añadió anhídrido acético (3 mi, 30 mmol) a una suspensión de carbonato potásico (4,0 g, 29 mmol) y 1-(2,4-dihidroxi-fenil)-2-(4-metoxifenil)-etanona (1,95 g, 7,5 mmol) en DMF (10 mi), y la suspensión resultante se calentó a 115 oC durante -90 mins. La mezcla se dejó enfriar y se vertió en agua (200 mi), para proporcionar un precipitado

10 blanquecino. El sólido se extrajo mediante filtración y se lavó con agua (100 mi) y éter dietílico (2x40 mi) para proporcionar 7 -hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-cromen-4-ona en forma de un polvo blanquecino, y se secó a vacío (1,65 g)

Tiempo de retención en LC 2,26 minutos [M+H( 283,2 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

R.M.N. (DMSO-d6) 7,8 (d J 8,7 Hz ArH) 7,2 (d J 8,8 Hz 2ArH) 7,0 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,9 (d J 8,7 ArH) 6,8 (s ArH) 3,8 15 (s 30CH3) 2,2 (s 3CH3)

Etapa 3

4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol

Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (0,35 g, 5 mmol) a una suspensión de 7 -hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-20 cromen-4-ona (0,14 g, 0,5 mmol) en piridina (3 mi) y la mezcla se calentó a reflujo durante -4 hrs. La disolución se

dejó enfriar y se vertió en agua (50 mi) y se extrajo con éter dietílico (50 mi). Los extractos se lavaron con agua (3x 50 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (30 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar una goma de color marrón pálido.

El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, de sílice, mediante elución con acetato de etilo/ 25 hexano (1 :2), para proporcionar una goma incolora. La trituración con hexano proporcionó 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-

metil-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol en forma de un polvo blanco, secado vacío, (0,087 g)


R.M.N. (DMSO-d6) 7,1 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,85 (d J 8,6 Hz ArH) 6,8 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,25 (s ArH) 6,15 (d J 8,6 Hz ArH) 3,65 (s 30CH3) 2,15 (s 3CH3)

30 Ejemplo 2

4-Bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol

HO

"o

Se añadió tri bromuro de benciltrimetilamonio (3,95 g, 10 mmol) en porciones a una suspensión enfriada en hielo de 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metilisoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol (Ejemplo 1) (2,95 g, 10 mmol) en diclorometano (50 mi), y

13

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la mezcla se agitó durante -60 mins, a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo (300 mi) y la mezcla se lavó con agua (3x200 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar un sólido marrón pálido. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, de sílice, eluyendo con acetato de etilo / hexano (1 :2), para proporcionar 4-bromo-6-[4-(4-

5 metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol en forma de un sólido blanco, secado a vacío, (3,42 g)


R.M.N. (Acetona-d6) 7,35 (s ArH) 7,2 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,9 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,65 (s ArH) 3,8 (s 30CH3) 2,25 (s 3CH3)

Ejemplo 3

10 5-[ 4-(4-Metoxi-fen il)-3-metil-isoxazol-5-il]-bifen il-2,4-d iol

HO

Etapa 1

5-(2,4-Bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metilisoxazol

"-O

15 Se añadió una suspensión en bromuro de bencilo (0,36 mi, 3 mmol) de 4-bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metilisoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol (Ejemplo 2) (0,55 g, 1,5 mmol) y carbonato de cesio (0,85 g, 2,6 mmol) en DMF (5 mi), y la mezcla se agitó durante -18 hrs, a temperatura ambiente. Se añadió agua (100 mi) y la mezcla se extrajo con éter dietílico (2x30 mi). Los extractos combinados se lavaron con agua (4x75 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar una

20 goma de color marrón pálido. La trituración con hexano proporcionó 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxifenil)-3-metil-isoxazol en forma de un sólido blanquecino, secado a vacío, (0,5 g).


R.M.N. (Cloroformo-d) 7,55 (s ArH) 7,35-7,25 (m 5ArH) 7,2 (m 3ArH) 6,95 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,85 (m 2ArH) 6,7 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,35 (s ArH) 4,95 (s 2CH2) 4,6 (s 2CH2) 3,75 (s 30CH3) 2,25 (s 3CH3)

25 Etapa 2

5-(4,6-Bis-benciloxi-bifenil-3-il)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metilisoxazol

Se añadió fosfato potásico (0,1 g, 0,5 mmol) a una disolución de 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxifenil)-3-metil-isoxazol (0,14 g, 0,25 mmol) y ácido fenil borónico (0,095 g, 0,75 mmol) en 1 ,4-dioxano (4 mi) bajo una

30 atmósfera de nitrógeno. Se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio(O) (cat.) y la suspensión se calentó, 80 oC durante -18 hrs. La suspensión se dejó enfriar y se añadió acetato de etilo (25 mi). La mezcla se lavó con agua (3x25 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (25 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar una goma de color marrón pálido. La trituración con hexano proporcionó 5-(4,6-bisbenciloxibifenil-3-il)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol en forma de un sólido blanquecino, secado a vacío.

14

Tiempo de retención en LC 3,08 minutos [M+Ht 554,4 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

E04709273 16-11-2012

R.M.N. (Cloroformo-d) 7,4 (m 2ArH) 7,35 (s ArH) 7,3-7,1 (m 11ArH) 6,95 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,9 (m 2ArH) 6,7 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,45 (s ArH) 4,9 (s 2CH2) 4,7 (s 2CH2) 3,75 (s 30CH3) 2,25 (s 3CH3)

Etapa 3

5 7-Hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-6-fenil-cromen-4-ona

I O

Se añadió formiato de amonio (3,2 g, 50 mmol) a una disolución de 5-(4,6-bis-benciloxi-bifenil-3-il)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol (1,4 g, 2,5 mmol) en metanol (20 ml)/acetato de etilo (10 mi) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió paladio sobre carbono (10%) (cat.) y la suspensión se calentó a 60 oC durante -18 hrs. La suspensión se

10 dejó enfriar y se añadió acetato de etilo (150 mi), y la suspensión se filtró. El filtrado se lavó con agua (3x100 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar una goma de color marrón pálido. La trituración con metanol proporcionó 7-hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-6-fenil-cromen-4-ona en forma de un sólido blanquecino, secado a vacío.


15 R.M.N. (DMSO-d6) 7,9 (s ArH) 7,5-7,3 (m 5ArH) 7,25 (d J 8,8 Hz 2ArH) 7,1 (s ArH) 7,05 (d J 8,8 Hz 2ArH) 3,85 (s 30CH3) 2,2 (s 3CH3)

Etapa 4

5-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-bifenil-2,4-diol

HO

20 Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (75 mg, 1,08 mmol) a una suspensión de 7-hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-6-fenil-cromen-4-ona (105 mg, 0,29 mmol) en piridina (2 mi), y la mezcla se calentó a reflujo durante -6 hrs., para proporcionar una disolución amarilla pálida. La disolución se dejó enfriar y se añadió agua (20 mi). La mezcla se extrajo con éter dietílico (2x10 mi). Los extractos combinados se lavaron con agua (2x20 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (10 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró. El

25 producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice, eluyendo con acetato de etilo/hexano (1 :1), para proporcionar el compuesto del título en forma de un polvo blanquecino (80 mg)


R.M.N. (Acetona-d6) 7,5-7,3 (m 5ArH) 7,2 (d J 8,8 Hz 2ArH) 7,0 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,9 (d J 8,6 Hz ArH) 6,35 (s ArH) 6,1 (d J 8,7 Hz ArH) 3,85 (s 30CH3) 2,25(s 3CH3)

30 Ejemplo 4

4-Cloro-6-[4-(4-metoxi-fen i 1)-3-metil-isoxazol-5-il] -benceno-1 ,3-d iol

HO

" O

Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (0,7 g, 10 mmol) a una suspensión de 6-cloro-7-hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-cromen-4-ona [preparada de manera análoga al Ejemplo 1, Etapa 2] (0,32 g, 1,0 mmol) en piridina (4 mi), y la

35 mezcla se calentó a reflujo durante -6 hrs., para proporcionar una disolución amarilla pálida. La disolución se dejó

15

E04709273 16-11-2012

enfriar y se añadió agua (20 mi). La mezcla se extrajo con éter dietílico (2x10 mi). Los extractos combinados se lavaron con agua (2x20 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (10 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice, eluyendo con acetato de etilo/hexano (1: 1), para proporcionar 4-cloro-6-[ 4-( 4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-

5 benceno-1 ,3-diol en forma de un polvo blanquecino (0,103 g)


R.M.N. (Acetona-d6) 7,2 (d J 8,8 Hz 2ArH) 7,15 (s ArH) 6,9 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,6 (s ArH) 3,85 (s 30CH3) 2,25 (s 3CH3)

Los compuestos de los Ejemplos 1-4 tuvieron una CI50 para HSP90 en el intervalo A cuando se analizaron en el 10 ensayo de ATPasa con Verde Malaquita descrito más adelante. En las tablas siguientes, la columna final

proporciona el resultado basándose en el mismo ensayo para el compuesto en cuestión, excepto en el caso del Ejemplo 12b, en el que la actividad indicada es la que se mide en el ensayo de polarización de fluorescencia descrito más adelante.

Los Ejemplos 5-16 se prepararon mediante el uso de la reacción descrita para los Ejemplos 1-4. Otros detalles de la 15 preparación de los Ejemplos 6 y 7 son análogos a los de los Ejemplos 86 y 87.

Ejemplo Estructura MH+

5* 326

6 330

7 296

8 349

16

CI50 de Hsp90

B

B

B

B

HO

9

HO

10

11

12 HO

o 12a

O

12b** O

O

12c§ HO

F

0-

q í' S

ot-f'J ~

17

286

303

342

375

367

323

351

A

A

A

B

A

A***

A

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HO F

* También disponible comercialmente de Interbioscreen

§ disponible comercialmente de Enamine

343 A

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** preparado a partir de intermedio protegido de bromo resorcinol con cianuro de cobre (1) en dimetilformamida 5 a 150 oC

*** Ensayo de Polarización de Fluorescencia: ~'= <10 uM; 'B' = >10 uM

Ejemplo 14

4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-6-fenetil-benceno-1 ,3-diol

HO

10 Se preparó a partir del acoplamiento con ácido estirilborónico del compuesto de bromo isoxazol del Ejemplo 2 Etapa 1, como se describió anteriormente, seguido de reducción y tratamiento con hidroxilamina, de manera análoga al Ejemplo 3.

Tiempo de retención en Le 2,56 minutos [M+Hf 402 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

Ejemplo 15

15 4-[ 4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-2,6-bis-( 4-metilpiperazi n-1-ilmetil)-benceno-1 ,3-diol

Esquema 2: Reacción de Mannich

18

E04709273 16-11-2012

Se añadió N-metilpiperazina (0,125 mi, 1,1 mmol) a una suspensión de 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]benceno-1,3-diol (0,15 g, 0,5 mmol) y paraformaldehído (0,040 g) en 1,4-dioxano (4 mi), y la mezcla se calentó a reflujo durante -18 hrs., para proporcionar una disolución de color amarillo parduzco. La disolución se dejó enfriar y se añadió acetato de etilo (25 mi). La mezcla se lavó con agua (3x25 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro

5 sódico (25 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró hasta una goma de color marrón pálido. La trituración con hexano proporcionó 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-2,6-bis-(4-metilpiperazin-1-ilmetil)-benceno-1 ,3-diol (0,121 g) en forma de un polvo marrón pálido.


R.M.N. (Acetona-d6) 7,2 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,95 (s ArH) 6,8 (d J 8,8 Hz 2ArH) 3,85 (s 30CH3) 3,75 (s 2CH2) 3,65 (s 10 2CH2) 2,9-2,0 (s ancho 16 CH2) 2,3 (s 3CH3) 2,25 (s 3CH:,) 2,2 (s 3CH3)

15

Ejemplo 16

Éster metílico de ácido 2,4-dihidroxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzoico

I

HO~O O 0-- ~ ~ ~ /¡ -

HO -O ....:

'N

Esquema 3: Formación del éster

I I

BnOMEb

B

' f ~O-__ • BnORf~ O f ~O- __ • HO~Ob O f ~ 0-

BnO -O, ....: BnO - HO-

N O ....: O ....: 'N 'N

Etapa 1

Se añadió n-butil-litio (100 ¡JI) a una disolución de 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metilisoxazol (154 mg, 0,28 mmol) en tetrahidrofurano (2,5 mi) bajo una atmósfera de nitrógeno a -78 oC. La disolución se agitó a -70 oC durante 30 minutos para proporcionar una disolución naranja. El ión se neutralizó con cloroformiato de

20 metilo (100 ¡JI, 3 eq) y se dejó calentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La disolución se diluyó con cloruro amónico acuoso saturado (5 mi). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 mi). Los extractos combinados se lavaron con agua (2x5 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (5 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró. El producto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice, eluyendo con acetato de etilo en hexano (gradiente del 20% al 60% de acetato de etilo) para proporcionar

25 éster metílico de ácido 2,4-bis-benciloxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzoico (72 mg).


R.M.N. (DMSO-d6) 7,8 (s ArH) 7,55 (d J 7,1 Hz 2ArH) 7,4 (t J 6,2 Hz 2ArH) 7,35 (d J 6,1 Hz ArH) 7,3 (m 3ArH) 7,1 (m 4ArH) 7,0 (s ArH) 6,9 (d 8,8 Hz 2ArH) 5,3 (s 2CH2) 5,1 (s 2CM) 3,78 (s OCH3) 3,76 (s OCH:,) 2,28 (s CH3)

Etapa 2

30 Se añadió formiato de amonio (172 mg, 20 eq) a una disolución de éster metílico de ácido 2,4-bis-benciloxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzoico (72 mg, 0,13 mmol) en metanol (2 ml)/acetato de etilo (1 mi) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió un 10% de paladio sobre carbono (cat.) y la suspensión se calentó a 60 oC durante la noche. La disolución se dejó enfriar. Se añadió acetato de etilo (5 mi), la disolución se lavó con agua (2x5 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (5 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y

35 se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice, eluyendo con acetato de etilo en hexano (gradiente del 25% al 45% de acetato de etilo) para proporcionar éster metílico de ácido 2,4-dihidroxi-5-[4-( 4-metoxifeni 1)-3-meti l-isoxazol-5-i I]-benzoico (7, O mg).


19

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R.M.N. (CDCi3) ó = 10,85 (s ArOH) 7,52 (s ArOH) 7,12 (d J 8 Hz 2ArH) 6,98 (s ArH) 6,91 (d J 8 Hz 2ArH) 6,45 (s ArH) 3,78 (s 3 OCH3) 3,71 (s 3 OCH3) 2,21 (s 3 CH3).

Los compuestos de los Ejemplos 14-16 tuvieron una CI50 de HSP90 en los intervalos 'A', 'B' Y 'B', respectivamente, cuando se ensayaron en el ensayo de ATPasa con Verde Malaquita descrito más adelante.

5 De forma similar, los Ejemplos 17-20 se prepararon tratando con N-formil piperidina, tioisocianato de fenilo, isocianato de 2-metoxifenilo y benzaldehído, respectivamente. La reacción de desprotección final se llevó a cabo con tricloruro de boro como se describe para el ejemplo 23 (última reacción del Esquema 5). El Ejemplo 21 fue un subproducto de la Etapa 1, Ejemplo 16. Las actividades indicadas son las obtenidas en el ensayo de Verde Malaquita descrito más adelante.

10

Ejemplo Estructura

17 HO

OH

0"""'-

18 HO

OH

Q 0--O HN O

19 HO

OH

OMe

20

20

MH+

326

433

447

418

CI50 de Hsp90

B

B

A

A

OMe

21 HO

Ejemplo 22

4-Bencil-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol

5 Esquema 4: Síntesis de bencil resorcinol

o

~ HO~OHV

354

Éster etílico éster 2-benzoil-5-etoxicarboniloxi-fenílico de ácido carbónico

A

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Se añadió trietilamina (10 mi, 72,2 mmol) a una disolución de 2,4-dihidroxibenzofenona (1) (5,4 g,23,3 mmol) en THF 10 (50 mi), y la disolución se enfrió a O oC. Se añadió cloroformiato de etilo (6,9 mi, 72,2 mmol) lentamente, y la

suspensión se agitó durante -30 mins a O oC, y durante -3 hrs a temperatura ambiente. Se añadió agua (150 mi) y la mezcla se extrajo con éter dietílico (150 mi). Los extractos se lavaron con agua (2x 150 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (100 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar 4-bencil-benceno-1 ,3-diol en forma de una goma verde pálida, solidificada en reposo, (8,2 g).

15 Tiempo de retención en LC 2,73 minutos [M+Hf 359,2 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

Ó (Cloroformo-d) 7,7 (m 2ArH) 7,5 (m 2ArH) 7,35 (m 2ArH) 7,15 (m 2ArH) 4,25 (q J 7,1 Hz 2CH2) 4,05 (q J 7,1 Hz 2 CM) 1,35 (t J 7,1 Hz 3CH3) 1,15 (t J 7,1 Hz 3 CM)

4-bencil-benceno-1,3-diol

20 Se añadió una disolución de borohidruro sódico (1,85 g, 49 mmol) en agua (30 mi) a una disolución enfriada con hielo de éster etílico éster 2-benzoil-5-etoxicarboniloxi-fenílico de ácido carbónico (3,6 g, 10 mmol) en THF (30 mi). La mezcla se agitó durante -60 mins. a O oC, y durante -60 hrs. a temperatura ambiente, para proporcionar una suspensión roja pálida. Se añadió agua (150 mi) y la mezcla se extrajo con éter dietílico (150 mi). Los extractos se lavaron con agua (2x 100 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mi). La disolución se secó sobre

25 sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar una goma de color amarillo pálido. La goma se

21

E04709273 16-11-2012

resuspendió en hidróxido sódico acuoso (20 mi, 10%), Y la disolución se calentó a reflujo durante -60 mins. La disolución se dejó enfriar y se acidificó con ácido clorhídrico (5 mi, 37%). La mezcla se extrajo con éter dietílico (50 mi). Los extractos se lavaron con agua (3x 40 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (30 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró para proporcionar 4-bencilbenceno-1 ,3-diol en

5 forma de una goma roja oscura, (2,1 g).

Tiempo de retención en LC 2,28 minutos [M+Hf sin ión (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

Ó (Cloroformo-d) 7,2 (m 3ArH) 7,1 (m 2ArH) 6,85 (d J 8,1 Hz ArH) 6,3 (d J 8,1 Hz ArH) 6,2 (s ArH) 3,85 (s 2CM)

El 4-bencil-benceno-1,3-diol se usó como material de partida en una síntesis del Esquema 1 para proporcionar el Ejemplo 23.

10 Ejemplo 23

Ácido 3-{2,4-dihidroxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico

HO

Esquema 5: Reacción de Heck y desprotección con tri cloruro de boro

BnO

15 Etapa 1

"O

--_;o BnO ___ o HO

HO O O-

Éster terc-butílico de ácido 3-{2,4-bis-benciloxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico

Se añadió diisopropiletilamina (1 mi, 5,7 mmol) a una suspensión de 5-(2,4-Bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxifenil)-3-metil-isoxazol (0,56 g, 1,0 mmol) en acrilato de terc-butilo (1 mi, 6,8 mmol) y 1-butanol (8 mi) bajo una

20 atmósfera de nitrógeno. Se añadió diclorobis(tri-o-tolilfosfina)paladio (11) (cat.) y la suspensión se calentó, 140 oC durante -18 hrs., para proporcionar una disolución amarilla/verde. La disolución se dejó enfriar y se concentró hasta una goma amarilla/verde. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice, eluyendo con acetato de etilo/ hexano (1 :9), para proporcionar éster terc-butílico de ácido 3-{2,4-bis-benciloxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico en forma de una goma amarilla/verde (315 mg). Se recuperó material de partida

25 (170 mg).


R.M.N. (Cloroformo-d) 7,85 (d J 16,1 Hz CH) 7,6 (s ArH) 7,4-7,25 (m 8ArH) 7,05 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,9 (m 2ArH) 6,8 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,5 (s ArH) 6,35 (d J 16,1 Hz CH) 5,05 (s 2CH2) 4,75 (s 2CM) 3,75 (s 30CM) 2,25 (s 3CM) 1,5 (s 9CCH3)

30 Etapa 2

Ácido 3-{2,4-dihidroxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico

22

HO

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Se añadió lentamente una disolución de tricloruro de boro (2 mi, 1,0 M en diclorometano) a una disolución de éster terc-butílico de ácido 3-{2,4-bis-benciloxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico (50 mg, 0,09 mmol) en diclorometano (1 mi), a -78 oC (hielo seco/ acetona) bajo una atmósfera de nitrógeno. La disolución resultante se

5 agitó durante -1 hr a -78 oC, y durante - 90 mins. a temperatura ambiente. La disolución se enfrió a -78 oC y se añadió agua (2 mi), y la mezcla se agitó durante -30 mins a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo (30 mi) y la disolución se lavó con agua (2x5 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (10 mi). La disolución se secó sobre sulfato magnésico anhidro y se concentró hasta una goma amarilla pálida. La trituración con hexano proporcionó un sólido amarillo, el sólido se retiró mediante filtración y se lavó con hexano, se secó a vacío, para

10 proporcionar ácido 3-{2,4-dihidroxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico (10 mg) en forma de un polvo amarillo.


R.M.N. (Acetona-d6) 7,85 (d J 16,1 Hz CH) 7,5 (s ArH) 7,25 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,95 (d J 8,8 Hz 2ArH) 6,6 (s ArH) 6,35 (d J 16,1 Hz CH) 3,8 (s 30CH3) 2,25 (s 3CH3)

15 De forma similar, se preparó 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-6-estirilbenceno-1 ,3-diol (Ejemplo 24) mediante desprotección con tricloruro de boro de 5-(2,4-bis-benciloxi-5-estiril-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol (preparado a partir de acoplamiento con ácido estiril borónico del intermedio de bromo isoxazol, Ejemplo 3).


20 Los compuestos de los Ejemplos 22 - 24 tuvieron una CI50 de HSP90 en los intervalos 'A', 'B' Y 'C', respectivamente, cuando se ensayaron en el ensayo de ATPasa con Verde Malaquita descrito más adelante.

Esquema 6: Síntesis de 5-carboxamido isoxazoles

HO~ y OH

::~HO~ OH O

~ Bno~ ~~a~:i~~ Bno~ ~ ~C03 yy Na/EtOH ~OEt CH3CN OBn O OBn O OH

H2NOH.HCI

EtOH

CI CI

Bno~ EtNH2 Bno~ Br2 B o~CI I O • I o_n I ~ Br ¿; 9" /, EtOH I MeOH ¿; 9" /, AcOH ¿; O

OBn O-N OEt OBn O-N NHEt NaOAc OBn;~ NHEt

MeOC6H4B(OH)2 OMe

DMF/H20 CI

BnO BCI3 HO -NaHC03 CH2C~

CI2Pd(PPha)2 NHEt OH

23

Ejemplo 25

Etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxifenil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

OMe

HO

Etapa 1

5 1-( 5-Cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-etanona

HO~ lrY

OH O

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Se añadió ácido acético (17,5 mL) gota a gota a una suspensión de 4-clororesorcinol (42,5 g, 0,293 mmol) en trifluoruro de boro - eterato (200 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se calentó a 90 oC durante 3,5 horas y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se formó un sólido después de

10 aproximadamente 1 hora de enfriamiento. La mezcla se vertió en 700 mL de una disolución acuosa de acetato sódico del 10% p/v. Esta mezcla se agitó enérgicamente durante 2,5 horas. Se formó un sólido marrón claro que se filtró, se lavó con agua y se secó al aire durante la noche para proporcionar 1-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-etanona (31,6 g, 58%). LCMS: [M-Hf 185.

Etapa 2

15 1-(2,4-Bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-etanona

el.

Bno~

lrY OBn O

Se añadió bromuro de bencilo (30 mL) a una mezcla de 1-(5-cloro-2,4-dihidroxifenil)-etanona (20 g, 0,107 moles) y carbonato potásico (37 g, 2,5 equiv.) en acetonitrilo (350 mL). La mezcla se calentó a reflujo durante 6 horas, después se dejó enfriar y se agitó durante la noche. La mezcla se filtró y el sólido se lavó con diclorometano (3 x 100

20 mL). Los extractos orgánicos combinados se evaporaron a vacío para proporcionar un sólido amarillo pálido que se trituró con una mezcla de hexano (350 mL) / acetato de etilo (15 mL) y se filtró para proporcionar un sólido blanquecino, 1-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-etanona (35,4 g, 90%). 1 H RMN (400 MHz) coherente con la estructura.

Etapa 3

25 Éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico

o el

~o~ I o ~ ,.ó '-':: O~

~o o OH

Se añadió sodio metálico (1,35 g, 0,058 mol) en trozos pequeños a lo largo de un periodo de 20 minutos a etanol anhidro agitado bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó después durante otros 10 minutos hasta que todo el sodio hubo reaccionado para proporcionar una disolución homogénea. Se añadió 1-(2,4-bis-

30 benciloxi-5-clorofenil)-etanona (10,0 g, 0,027 mol) en porciones a lo largo de 2-3 minutos, y la suspensión resultante se agitó durante 5 minutos antes de la adición de oxalato de dietilo (6 mi, 0,043 mol), lo que proporcionó un

24

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precipitado amarillo más espeso. La mezcla de reacción se calentó a reflujo (lo que proporcionó una disolución marrón homogénea) durante 4 horas, después se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió ácido acético (6 mi). El sólido resultante que se formó se trituró, se filtró, se lavó con etanol y se secó para proporcionar un sólido amarillo (12,0 g, 95%). 1 H RMN (400 MHz, CDCb) ó 1,2 (t, 3H), 4,19 (q, 2H), 5,05 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 6,50 (s, 1 H),

5 7,22-7,41 (m, 10H), 7,97 (s, 1H).

Etapa 4

Éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-isoxazol-3-carboxílico

CI

o~

Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (0,89 g; 12,8 mmol) a una suspensión de éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-10 benciloxi-5-clorofenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico (5,00 g; 10,7 mmol) en etanol absoluto (100 mi). La mezcla de

reacción se calentó a reflujo durante cuatro horas y después se dejó enfriar a temperatura ambiente (durante este tiempo la mezcla sigue siendo heterogénea, pero adquiere un color amarillo más claro). La mezcla se filtró y el sólido filtrado se lavó con agua (2 x 20 mi), etanol (2 x 20 mi) y se secó a vacío a 45 oC. Esto proporciona éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido amarillo esponjoso, 4,49 g (91 %)

15 LCMS: [M+H( 466, 464 e7 CI; 35CI). 1 H RMN (400 MHz, CDCb) ó 1,42 (t, 3H), 4,42 (q, 2H), 5,13 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,35-7,43 (m, 10H), 8,00 (s, 1H).

Etapa 5

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-isoxazol-3-carboxílico

N~ H

20 Se añadió una disolución de etilamina en metanol (2,0 M; 40 mL; 80 mmol) a una suspensión agitada de éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-isoxazol-3-carboxílico (4,40 g; 9,51 mmol) en etanol absoluto (50 mi). La mezcla de reacción se calentó a 80 oC (temperatura del baño de aceite) durante cinco horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se dejó reposar durante la noche. Se formó un producto sólido incoloro y la mezcla de reacción se enfrió adicionalmente en un baño de agua helada, se filtró y se lavó con etanol frío (2 x 20

25 mi). El producto incoloro se secó a vacío para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)isoxazol-3-carboxílico 3,42 g (78%) LCMS: [M+H( 465, 463 e7 CI; 35CI). 1 H RMN (400 MHz, CDCb) ó 1,25 (t, 3H), 3,48 (m, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 6,59 (s, 1 H), 6,83 (t ancho, 1 H), 7,08 (s, 1 H), 7,30-7,41 (m, 10H), 7,97 (s, 1 H).

30

35

Etapa 6

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico

~ CI

~O~B I r O

0:: :~ ~~ Se añadió una disolución de bromo en ácido acético (0,6 M; 7,2 mL; 4,32 mmol) a una suspensión agitada de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-4-bromoisoxazol-3-carboxílico (2,00 g; 4,32 mmol) y acetato sódico (0,708 g, 8,64 mmol) en ácido acético (30 mi) a temperatura ambiente. La mezcla se calentó a 80 oC y se hizo homogénea en 5-10 minutos, para proporcionar una disolución roja oscura. Después de calentar durante 2,5 horas, la disolución fue de color amarillo. El análisis mediante CCF demostró que había presente material de partida y producto. Se añadieron otros 2,0 mi (1,2 mmol) de la disolución de bromo en ácido acético a lo largo de las dos

25

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horas siguientes. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y el ácido acético se eliminó a vacío para proporcionar un residuo sólido, que se repartió entre éter (200 mi) yagua (200 mi). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con agua (3 x 100 mi), disolución acuosa saturada de bicarbonato sódico (2 x100 mi) y disolución saturada de cloruro sódico (1 x 200 mi). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y los

5 disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un aceite amarillo que se purificó mediante cromatografía rápida con gel de sílice, eluyendo con un 1-20% de acetato de etilo en hexano. Esto proporcionó el producto en forma de un sólido incoloro, 1,2 g (52%) LCMS: [M+Hf 543, 541 (81 Sr; 79Sr). 1H RMN (400 MHz, CDCb) Ó 1,26 (t, 1H), 3,50 (m, 2H), 5,01 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 6,74 (t ancho, 1H), 2,28-7,41 (m, 10H), 7,53 (s, 1H).

10 Etapa 7

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

0--

N~ H

A una mezcla de ácido 4-metoxifenilborónico (0,178 g, 1,17 mmol) y etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (0,507 g, 0,94 mmol) se le añadió bicarbonato sódico (237 mg, 2,82 mmol)

15 seguido de DMF (5 mL) yagua (1,0 mL). La mezcla se desgasificó mediante evacuación e inyección de nitrógeno (tres veces), seguido de burbujeo de gas nitrógeno a través de la mezcla durante cinco minutos. Se añadió diclorobis(trifenilfosfina)paladio (11) (66 mg, 0,094 mmol) y la mezcla de reacción se calentó bajo una atmósfera de nitrógeno a 90 oc durante dos horas (la mezcla de reacción adquiere un color marrón oscuro). Se añadieron otros 10 mg de diclorobis(trifenilfosfina)paladio (11) y la mezcla de reacción se calentó a 90 oc durante 15 horas, y después se

20 dejó enfriar a temperatura ambiente. La mayoría de los disolventes se eliminaron a vacío y el residuo se repartió entre acetato de etilo (50 mL) yagua (50 mL). Esta mezcla se filtró a través de una almohadilla de celite para eliminar los residuos de paladio, y después se separaron las fases y la fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL), disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mL) y después se secó sobre sulfato sódico. La mezcla se filtró y los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un aceite amarillo (598 mg). El producto de la

25 reacción en bruto se purificó mediante adsorción en gel de sílice y después cromatografía rápida con gel de sílice (20 g 1ST) eluyendo con un gradiente de disolventes del 1 al 20 % de acetato de etilo en hexano. Esto proporciona etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofeni9-4-~4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido incoloro (0,223 g, 40%). LCMS: [M+Hf 571, 569 e CI; 5cl). 1 H RMN (400 MHz, CDCI3) Ó 1,21 (t, 3H), 3,44 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 4,73 (s, 2H), 6,45 (s, 1H), 6,65 (t, 1H), 6,80 (d, 2H), 7,14 a 7,44 (m, 8H), 6,95 (m 2H).

30 Etapa 8

Etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxifenil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

OMe

HO

A una disolución enfriada en un baño de hielo de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-4-(4-metoxifenil)-isoxazol-3-carboxílico (0,213 mg, 0,374 mmol) en diclorometano (5 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno se le

35 añadió una disolución 1,0 M de tricloruro de boro en diclorometano (1,12 mL; 1,12 mmol). La mezcla de reacción se agitó a O oc durante 15 minutos y después a temperatura ambiente durante 35 minutos. La mezcla de reacción se volvió a enfriar a O oc y se paró mediante la adición de una disolución acuosa saturada de bicarbonato sódico (5 mL). Después de agitar durante 5 minutos se eliminó el diclorometano a vacío y el residuo se repartió entre acetato de etilo (30 mL) yagua (30 mL). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con agua (30 mL), disolución

40 acuosa saturada de cloruro sódico (30 mL) y después se secó sobre sulfato sódico. La mezcla se filtró y los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un sólido incoloro espumoso que se purificó mediante adsorción en gel de sílice y después cromatografía rápida con gel de sílice (10 g 1ST) eluyendo con un 50 % de acetato de etilo en hexano. Esto proporciona etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxifeni~-4-(4-metoxi-fenil)isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido incoloro (0,097 g; 67%). LCMS: [M+Hf 391, 389 ( CI; 35cl). 1 H RMN

26

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(400 MHz, d6-DMSO) Ó 1,08 (t, 3H), 3,22 (m, 2H), 3,73 (s, 3H), 6,59 (s 1 H), 6,87 (d, 1 H), 7,13-7,17 (m, 3H), 8,88 (t ancho, 1 H), 10,09 (s, 1 H), 10,62 (s, 1 H).

El Ejemplo 25 tuvo una actividad 'A' en el Ensayo de Polarización de Fluorescencia, como se describe más adelante.

De forma similar, el Ejemplo 26 se preparó acoplando el éster de boronato de 4-piperazinofenilo protegido con Boc 5 como se mencionó anteriormente. Este éster de boronato se produjo a partir de 1-(4-bromofenil)piperazina mediante

protección con boc seguido de la formación del éster de boronato mediante acoplamiento catalizado por Pd con bis(tetrametilpinacolato)diboro. El Ejemplo 27 se produjo de forma similar. El Ejemplo 27a se produjo mediante la des protección de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-clorofenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico:

10

Ejemplo

26 o

27 o

HO

27a

* Ensayo de Polarización de Fluorescencia

Estructura

() N

NA...

N~ H

MH+

443

377

362

CI50 de Hsp90*

A

A

A

Esquema 7: Preparación del intermedio 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-yodo-3-metil-isoxazoI

27

Bno~ ~

OSn O

sodio el acetato ~ de etilo BnO ~ H2NOH.Hel ----~;a~ I ~

.,¿; ~ EtOH

OSn O OH

Bno~ __ ,_I_CI--;;a~ ~ACOH

OBn O-N agua

a a a Bno~~ I acoplamiento BnO~R Bel3 HO~

.,¿; • I -----.~~ I R ~ .,¿; ~ .,¿; ~

¡, /, ¡, OSn O-N OSn O-N OH O-N

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~ acoPla~ento NR'R" NR'R"

CI el BnO H BnO HO

~

aminación reductora

OSn OBn

Ejemplo 28

4-eloro-6-[3-metil-4-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxaz01-5-il]-benceno-1 ,3-diol

HO

5 Etapa 1

1-(2,4-Bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-hidroxi-but-2-en -1-ona:

A una disolución de cetona (15 g) en EtOAc (200 mi) se le añadió sodio metálico (3,0 g) en trozos pequeños. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 15 mins, y después se calentó a reflujo durante la noche. La reacción se paró con ácido acético, y se filtró el precipitado amarillo. Esto se trituró en hexanos para proporcionar

10 cristales amarillos brillantes. La RMN indicó que este era el producto deseado - principalmente en forma enol -pequeña traza en forma ceto.

Etapa 2

5-(2,4-Bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-metil-isoxazol:

La dicetona (4,0 g) se suspendió en un 80% de EtOH ac. Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (3,4 g) Y acetato 15 sódico (4,0 g), Y el pH se ajustó a 8/9 con NaOH 2 M. La disolución se sometió a reflujo durante 24 hrs (difícil de

monitorizar mediante eeF debido a valores de R¡ muy similares). Tras este tiempo se acidificó la disolución a pH 5 con Hel 1 M Y se vertió en agua. El precipitado blanco se filtró, se lavó con agua, y se trituró con hexano para proporcionar un sólido blanco.

Notas; El compuesto se puede lavar también con éter si es necesario para eliminar las trazas de impurezas, pero 20 normalmente no es necesario. La RMN indicó que este era el producto deseado.

Etapa 3

5-(2,4-Bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-yodo-3-metil-isoxazol:

Se colocó isoxazol (2 g) en una mezcla de ácido acético (24 mi) yagua (30 mi). Se añadió monocloruro de yodo (2 g en exceso) y la disolución se calentó a 80 °e durante 2-3 hrs. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió

25 un 10% de Na2S03 (sulfito sódico) en agua (50 mi). Se separó un sólido/aceite naranja viscoso de la mezcla y se lavó con agua. Después se disolvió en acetona y se filtró. La eliminación de la acetona a vacío proporcionó un aceite naranja pegajoso que se solidificó hasta un sólido naranja durante la noche. La RMN y LeMS indicaron que este era el producto deseado.

28

Etapa 4

3-[5-(2,4-Bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-benzaldehído

BnO CHO

1. OBn O-N

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Se disolvió 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-yodo-3-metil-isoxazoI (200 mg, 0,38 mmol), y ácido 3-formilbenceno 5 borónico (85 mg, 1,5 equiv.) en DMF (12 mi) antes de añadir una disolución de bicarbonato sódico 1 M (1,1 mi, 3,0

equiv) y Pd(Ph3P)2Cb (21 mg, 0,08 equiv.) con agitación. La mezcla de reacción se transfirió a tres tubos de microondas que se sellaron y las mezclas del interior se desgasificaron antes de irradiarlas mediante una potencia inicial de 200 Wa una temperatura de 150 oC durante 15 minutos en un aparato de microondas CEM. Después de enfriar, las mezclas de reacción se combinaron y se repartieron entre acetato de etilo (10 mi) yagua (10 mi). La capa

10 acuosa se separó y se extrajo de nuevo con acetato de etilo (10 mi). Las capas orgánicas se combinaron después, se lavaron con agua (2 x 20 mi), salmuera (20 mi), se secaron sobre Na2S04 antes de condensarlas a vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida con gel de sílice, eluyendo con un 25% de acetato de etilo en hexano.

LCMS tR = 9,06, MS miz 510,4 [M+Hf

Etapa 5

15 4-{3-[ 5-( 2 ,4-Bis-benci loxi -5-clo ro-fe n i 1) -3-metil-iso xazo 1-4-il] -benc i I}-morfo I i na

BnO

Se mezcló 3-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-benzaldehído (25 mg, 0,05 mmol) y morfolina (0,3 mi) con DCE (0,5 mi) en un tubo de microondas. Se añadió triacetoxiborohidruro sódico (15 mg. 1,4 equiv), el tubo se selló, y se introdujo una atmósfera de nitrógeno. Después de 1 hr se añadió más triacetoxiborohidruro sódico

20 (15 mg) y la reacción se dejó con agitación durante la noche. El análisis de CCF demostró que la reacción no había llegado a la finalización, por lo que se añadió una gota de ácido acético y la reacción se dejó de nuevo con agitación durante la noche, tras lo cual la reacción se paró con una disolución de NaHC03 1 M (7 mi) y se extrajo en EtOAc (5 mi). Esto se secó sobre MgS04 y el disolvente se eliminó a vacío para proporcionar 13 mg del producto bruto en forma de un polvo blanquecino que se llevó a la etapa de desprotección.

25 Etapa 6

4-Cloro-6-[3-metil-4-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-5-il]-benceno-1 ,3-diol

HO

Se desprotegió 4-{3-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-bencil}-morfolina como se mostró previamente y el producto bruto se purificó mediante CCF preparativa eluyendo con un 10% de Etanol en

30 diclorometano para proporcionar 0,6 mg (7% de rendimiento) del producto en forma de un polvo blanco.

LCMS tR = 5,46, MS miz 399,3 [M-Hr


Ejemplo 29

Amida de ácido 1-{3-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-bencil}-piperidin-4-carboxílico

29

BnO

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Se preparó mediante el uso de un procedimiento similar al de 4-cloro-6-[3-metil-4-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazo1-5-il]-benceno-1,3-diol, excepto que isonipecotamida sustituyó a la morfolina y se añadió inicialmente triacetoxiborohidruro sódico (3 equiv.) y ácido acético (1 gota). La reacción se completó tras 18 hrs, y el producto

5 bruto obtenido tras el procedimiento se llevó a la etapa de desprotección.

Amida de ácido 1-{3-[5-( 5-cloro-2,4-dih idroxi-fen il)-3-metil-isoxazol-4-il]-bencil}-piperidin-4-carboxílico

Se desprotegió amida de ácido 1-{3-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-bencil}-piperidin-4-carboxílico como se mostró previamente y el producto bruto se purificó mediante CCF preparativa eluyendo con un

10 10% de Etanol en diclorometano para proporcionar 0,7 mg (3% de rendimiento) del producto en forma de un polvo blanco.

15

20



Se preparó el ejemplo 30 de una forma similar:

Ejemplo

30


Ejemplo 31

Esquema 8:

Estructura

~O}-~ # _ N

o -o,~

el

MH+ CI50 de Hsp90

359 A*

CI

BnO~f" O- H ~ ---

OBn o.... # CONHEt N

Etapa 1

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico

30

BnO

CONHEt

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Se suspendió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (0,90 g, 1,94 mmol), Nyodosuccinimida (0,44 g, 1 equiv.) y nitrato de amonio y cerio (IV) (0,53 g, 0,5 equiv) en Acetonitrilo (55 mi) antes de calentar a reflujo (baño de aceite a 100 oC), cuando la mezcla se hizo homogénea. Después de 18 hrs la disolución

5 se enfrió y el disolvente se eliminó a vacío para proporcionar un aceite naranja espeso. Este se repartió entre DCM (25 mi) yagua (10 mi), la capa orgánica se retuvo y se lavó con salmuera (2 x 25 mi) antes de secarla sobre Na2S04. El DCM se eliminó a vacío para proporcionar 0,88 g (77% de rendimiento) del producto en forma de un polvo de color naranja/marrón claro.


10 Etapa 2

1-(3-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina

Se añadió 1 ,3-dibromobenceno (0,90 mi, 7,49 mmol), N-metilpiperazina (0,28 mi, 2,50 mmol) y tolueno anhidro (7 mi) mediante una jeringa a un matraz seco lleno de argón. La disolución se mezcló bien antes de suministrar BINAP (47

15 mg) y Pd2dba3 (23 mg), y el matraz se llenó de nuevo con argón y DBU (0,93 g, 2,5 equiv.) añadidos por medio de una jeringa. La mezcla de reacción se calentó a 60 oC antes de añadir terc-butóxido sódico recién pulverizado en una porción para comenzar la reacción. La reacción se dejó con agitación a 60 oC durante la noche, y los análisis de CCF parecieron mostrar que todavía había presente algo de piperazina, de manera que la reacción se calentó a 100 oC y se agitó durante otras 24 hrs, tras lo cual se repartió entre EtOAc (20 mi) yagua (20 mi). La capa acuosa se

20 extrajo de nuevo con EtOAc y las capas orgánicas combinadas se lavaron con disolución de HCI 1,6 M (2 x 10 mi). La disolución ácida que contenía el producto se basificó primero con un volumen similar de disolución de NaOH 1 M respecto de la disolución de ácido y después se añadió cuidadosamente bicarbonato sódico sólido para alcanzar un pH=8,5 antes de extraer de nuevo en EtOAc (2 x 15 mi), que se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 y se evaporó hasta sequedad para proporcionar 0,50 g (78% de rendimiento) del producto puro en forma de un aceite

25 amarillo.

LCMS tR = 4,55, MS miz 255,4/257,3 [M+Hf

Etapa 3

1-Meti 1-4-[3-( 4,4,5,5-tetrameti 1-[1 ,3 ,2]d i oxa borolan-2-i 1) -fe n i 1] -p i perazi na

30 A una disolución de PdCb (dppf).DCM (10 mg, 0,012 mmol) en tolueno anhidro (4 mi) en un tubo de microondas sellado lleno de argón se le añadió la 1-(3-Bromofenil)-4-metil-piperazina (100 mg, 0,39 mmol), EbN (0,11 mi, 2 equiv.), y 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (0,09 mi, 1,5 equiv). El tubo de microondas se vació y se volvió a llenar con argón antes de irradiarlo en un reactor de microondas CEM a 100 oC durante 1 hr mediante el uso de una potencia inicial de 200 W. La mezcla de reacción se repartió entre más tolueno (6 mi) yagua (10 mi), la capa

35 orgánica se separó, se lavó con agua (1 x 10 mi), se secó sobre MgS04 y después se evaporó a vacío para proporcionar un residuo púrpura/marrón que se usó para un acoplamiento de Suzuki sin purificación adicional.

31


Etapa 4

E04709273 16-11-2012

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-[3-(4-metil-piperazin-1-il)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

5 Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (38 mg, 0,07 mmol) y 1-Metil-4-[3-(4,4,5,5-tetrametil-[1 ,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]-piperazina (31 mg, 2 equiv.) se acoplaron mediante el uso del método de Suzuki descrito previamente para proporcionar 37 mg (83% de rendimiento) del producto bruto en forma de un aceite marrón que se llevó a la etapa de desprotección.

Etapa 5

10 Etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-[3-(4-metil-piperazin-1-il)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

HO

Se desprotegió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-[3-(4-metil-piperazin-1-il)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico de la manera mostrada previamente. El precipitado formado durante la reacción se separó, y se repartió entre EtOAc yagua. La capa acuosa se guardó, se basificó mediante el uso de bicarbonato sódico sólido y el

15 producto se extrajo mediante el uso de EtOAc (2 x 10 mi). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 mi), se secaron sobre MgS04 y se evaporaron a vacío para proporcionar 5,2 mg (20% de rendimiento) del producto en forma de un polvo de color marrón.


OH (d4-MeOH), 7,17 (1H, m, Ar-H), 7,09 (1H, s, Ar-H), 6,94 (1H, m, Ar-H), 6,80 (1H, m, Ar-H), 6,49 (1H, s, Ar-H), 3,13 20 (4H, t, NCH2CH2N-CH3), 2,69 (2H, q, CONHCH2CH3), 2,61 (4H, t, NCH2CH2N-CH3), 2,37 (3H, s, NCH2CH2N-CH3),

1,19 (3H, t, CONHCH2CH3).


Los Ejemplos 32 - 38 de la Tabla siguiente se prepararon de forma similar, pero con las siguientes variaciones:

1. Para el Ejemplo 36, el intermedio de dioxaborolano se preparó como sigue:

25 Esquema

Etapa 1

1-(4-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina

32

PdCI2(dppf) KOAc DMSO

E04709273 16-11-2012

1-(4-Bromo-fenil)-piperazina (1 g, 4,1 mmol) y carbonato potásico (1,8 g, 3 eq) en DMF (15 mi) se trataron con yoduro de metilo (250 ¡JI, 1,1 equivalentes), y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se paró con agua desionizada (10 mi), y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con

5 bicarbonato sódico para eliminar cualquier impureza dimetilada, se secó y el disolvente se eliminó para proporcionar 1-(4-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina con un 73% de rendimiento.

10

15

Tiempo de retención en LC 2,21 minutos [M+Hf 256 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins).

Etapa 2

1-Metil-4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1 ,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]-piperazina

1-(4-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina (750 mg, 3 mmol) en DMSO (15 mi) con bis(pinacolato)diborano (1,1 g, 1,5 equivalentes) y acetato potásico (900 mg, 3 equivalentes). La suspensión se desgasificó antes del tratamiento con PdCb(dppf) (cat.), y se agitó a 80 oC. Se añadió más bis(pinacolato)diborano (1 eq) después de 3 horas, y se agitó durante otras 2 horas. La suspensión se repartió entre acetato de etilo yagua. La purificación mediante cromatografía en columna con un gradiente del 0-8% de metanol en diclorometano proporcionó 1-Metil-4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1 ,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]-piperazina con un 62% de rendimiento.


2. Para los ejemplos 37 y 38, se usó un intermedio de ácido borónico en vez de un dioxaborolano, y el primero se preparó como sigue:

20 Ácido 4-[(2-metilsulfonil)-etilaminometil]-fenil borónico (intermedio para el Ejemplo 37)

QNH2.HCI

1"::::

h-

HO .... S'OH

H

QN~~:

O O ,,,:::: ó

HO",S'OH

Se trató hidrocloruro de ácido 4-aminometil fenil borónico (560 mg, 3 mmol) en etanol (5 mi) con metil vinil sulfona (260 ¡JI, 1 equivalente) y trietil amina (1,2 mi, 3 equivalentes). La disolución se agitó a 100 oC durante 2 hrs. El etanol se eliminó a vacío, se repartió en agua y butanol para proporcionar ácido 4-[(2-metilsulfonil)-etilaminometil]-fenil

25 borónico con un 94% de rendimiento.


Ácido 4-[N-metil S,S-dioxo-tiomorfolino]-fenil borónico (Intermedio para el Ejemplo 38)

33

QNH2.Hel

I~ h-

HO,B'OH

~s~ '1 \'

00

o rs~o

QNJ

I~ h-

HO,B'OH

E04709273 16-11-2012

Se trató hidrocloruro de ácido 4-aminometil fenil borónico (456 mg, 2,4 mmol) en etanol (8 mi) con vinil sulfona (244 ¡JI, 1 equivalente) y trietilamina (2 equivalentes), y la disolución se agitó a 100 oC durante 3 hrs. El etanol se eliminó a vacío, y se repartió en agua y butanol para proporcionar el producto con un 88% de rendimiento.

5 Tiempo de retención en LC 1,65 minutos [M+Hf 270 (Tiempo de funcionamiento 8 mins).

Ejemplo Estructura

HO

32

33

O

el

HO

34

el

35

o

N\ H

34

MH+ CI50 de Hsp90*

409 411

410 412

360 362

409 411

A

A

A

A

el 36 HO

OH

37

38

Ejemplo 39

Esquema 9:

CI

BnO

5 Etapa 1

I

(J N

NH

\

BnO BH3.THF

457 459

494 496

506 508

CI

A

A

A

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(3-cloro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

E04709273 16-11-2012

Se acoplaron etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (60 mg, 0,11 mmol), y ácido 3-clorobenceno borónico (23 mg, 1,3 equiv.) mediante el uso del método de Suzuki descrito

10 previamente para proporcionar 35 mg (55% de rendimiento) del producto bruto en forma de un polvo marrón que se

35

llevó a la siguiente etapa.

Etapa 2

[5-(2,4-Bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(3-cloro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-etil-amina

BnO

E04709273 16-11-2012

5 A una disolución de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(3-cloro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (36 mg, 0,06 mmol) en THF anhidro bajo argón se le añadió complejo Borano-THF 1 M (1 mi) y la disolución se sometió a reflujo durante la noche. Después de enfriar, la disolución se vertió en una columna Isolute® SPE Flash SCX-2 5 g que se eluyó rápidamente con metanol (2 x 20 mi). El producto deseado se recuperó después eluyendo con una mezcla de un 10% de amoniaco en metanol (2 x 10 mi), que se evaporó a vacío para proporcionar 23 mg (65% de

10 rendimiento) de un polvo amarillo claro.

LCMS (LCT) tR = 8,18, MS miz 558,8 [M+Hf


El Ejemplo 40 se preparó de forma similar:

Ejemplo

40

15 * Ensayo de Polarización de Fluorescencia

Ejemplo 41

Esquema 10:

Etapa 1

Estructura

el

°

MH+ CI50 de Hsp90

0-

375 A

377

o

20 Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

36

N/"""\ '-.JO

o

E04709273 16-11-2012

Se combinó etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico (preparada como en el Ejemplo 31) (2 g, 3,4 mmol), ácido 4-formilborónico (0,612 g, 4,08 mmol), NaHC03 (10,2 mi, disolución ac. 1 M, 10,2 mmol), PdCI2(PPh3)2 (119 mg, 0,17 mmol) y DMF (50 mi). La mezcla se desgasificó después haciendo burbujear N2

5 en ella durante 5 minutos antes de calentarla a 80 oC durante 1 hora. La mezcla se evaporó después a vacío y se repartió entre EtOAc (3 x 50 mi) yagua (50 mi). Las capas orgánicas combinadas y secadas (Na2S04) se evaporaron a vacío para proporcionar un aceite bruto. Este se disolvió en EtOAc y se hizo pasar a través de un tapón de Si02, que se lavó con EtOAc. El filtrado se evaporó a vacío y el aceite resultante se trituró con EbO para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1,577 g,

10 82%) en forma de un sólido de color pálido, LC/MS: RT = 2,908 mino 567,3 (MH+).

Etapa 2

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

o

Se añadió ácido acético (0,37 mi, 6,44 mmol) gota a gota a una mezcla de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-15 cloro-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (730 mg, 1,29 mmol), morfolina (0,225 mi, 2,58 mmol), tamices

moleculares en polvo de 3 A (730 mg) y MeOH (21 mi). Esto se dejó con agitación durante la noche bajo N2. La mezcla se evaporó después a vacío y el producto bruto resultante se repartió entre CH2Cb (3 x 40 mi) y disolución sat. de NaHC03 (40 mi). Las capas orgánicas combinadas y secadas (Na2S04) se evaporaron a vacío para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

20 en bruto (810 mg) en forma de un sólido amarillo, LC/MS: RT = 2,365 mino 638,4 (MH+).

Etapa 3


Se añadió 8Cb (disol. 1 M en CH2Cb, 3,87 mi, 3,87 mmol) gota a gota a una disolución de la etilamida de ácido 5-25 (2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico bruta (810 mg, - 1,29 mmol) en

CH2Cb (30 mi) a O oC. Después se dejó que la reacción alcanzase la TA. Después se añadió lentamente NaHC03 acuoso saturado (40 mi) y la mezcla resultante se concentró a vacío. Esto se repartió después entre EtOAc (3 x 50 mi) yagua (50 mi). Las capas orgánicas combinadas y secadas (Na2S04) se evaporaron a vacío. La cromatografía rápida mediante elución con CH2Cb - 10% de MeOH / 1 % de NH3 / CH2Cb proporcionó la etilamida de ácido 5-(5-

30 cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (380 mg, 64% a lo largo de 2 etapas) en forma de una espuma amarilla, LC/MS: RT = 1,751 mino 458,2 (MH+).


37

E04709273 16-11-2012

En la Tabla siguiente, los Ejemplos 42-64 se prepararon mediante métodos análogos a los del Ejemplo 41, mediante el uso del aldehído o la cetona adecuada.

Ejemplo Estructura

42

HO

43

HO

44

HO

45

38

~\

() N

NH

\ (o N)

NH

\

MH+

472

474

458

460

472

474

458

CI50 de Hsp90*

A

A

A

A

39

E04709273 16-11-2012

HO

52

HO

53

O

54

55 HO

OH

56 HO

OH

N0

O

NJ--OH

N0

o

NH

\.

Nr:)

40

N\ H

456 A

458

472 A

474

442 A

452 A**

450 A**

E04709273 16-11-2012

57 HO

OH

58

CI

59

60

CI

61

~\

f ~ ~JJ ~ !.

O

/ N \

~J O

I N

~ OH

O

t~ f ~

N~

O

41

465

479

481

416

418

446

448

471

473

A**

A

A

A

A

E04709273 16-11-2012

5

62

o

o}-

CI f<) ~ N 63

o

64

o


** preparado a partir de material de partida de etil resorcinol

499

501

517

519

476

478

A

A

A

Los compuestos adicionales 41 a-s se prepararon mediante métodos análogos a los del Ejemplo 41 :

Ejemplo Estructura MH+ CI50 de Hsp90*

H

N~

41a 468 A

O

42

E04709273 16-11-2012

41b HO

OH

41c

O

F

41e HO

41f HO

OH

41g HO

OH

41h

O

43

NH

\ NO

N~ H

N~ H

NO

438

442

395

474

476

428

A**

A

A

A

A

A

E04709273 16-11-2012

HO

41i

HO

41j

HO 41k

HO

41m

41n

NH

\

NH

\ (0)

N

~ NH

~\

ro N~

~\

44

470

472

502

458

389

A

A

A

A

A***

E04709273 16-11-2012

5

41p

41q

41 r

41s


** preparado a partir de material de partida de etil resorcinol

*** preparado mediante la reducción del intermedio de aldehído

**** preparado mediante la alquilación del intermedio de fenal

***** preparado a partir del naftil aldehído

Ejemplo 65

Esquema de Reacción:

45

471

475

507

472

A

A****

A*****

A

E04709273 16-11-2012

H0"ll1

yY OH O

Bno"ll1

yY OBn O

MeCN

NBS

DMF

Bno~ ~

OBn O

Br

(COOEt)2 Bno~o - ___ o ,

NaOEt ¿; O~

EtOH OBn O O

HONH2

EtOH

Bno~: I¿; O

7 /,

OBn O-N O~

Bno~: ',.ó O

7 /,

OBn O-N NHEt

Etapa 1

1-(2,4-Bis-benciloxi-fenil)-etanona

~ B(OH)2

DMF / H20

NaHC03

CI2Pd(PPh3)2

NBS/CAN

MeCN !1

•

1. BCI3 ! CH2CI2 O oC -7 rt .

2. HCI! Et:p ! EtOH

Bno'll1

yY OBn °

NaHC03

CI2Pd(PPh3h

E04709273 16-11-2012

5 Se disolvieron 35 9 de 2,4-dihidroxiacetofenona (0,230 mol, 1 eq) en 500 mi de acetonitrilo. Se añadieron 79,5 9 de carbonato potásico (0,575 mol, 2,5 eq) y 86,6 9 de bromuro de bencilo (0,506 mol, 2,2 eq). La mezcla se sometió a reflujo durante 64 horas, se enfrió y el acetonitrilo se eliminó a presión reducida. El residuo se separó entre agua y acetato de etilo. El residuo fue principalmente resorcinol mono-bencilado.

El producto bruto (43 g) se disolvió después en 250 mi de DMF. Se añadió carbonato potásico (29 g, 0,210 mol, 1,2 10 eq) y 25 mi de bromuro de bencilo (0,210 mol, 1,2 eq), y la mezcla se agitó durante la noche. El disolvente se eliminó

a presión reducida y el residuo se separó entre acetato de etilo yagua. Tras la eliminación del disolvente, el residuo se trituró con hexano para eliminar el exceso de bromuro de bencilo.

LC-MS [M+Hr = 333

46

Rendimiento: 51,2 9 (67%)

Etapa 2

1-(2,4-Bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-etanona

Bno~ W

OSn O

E04709273 16-11-2012

5 Se disolvieron 51,2 9 de 1-(2,4-bis-benciloxi-fenil)-etanona (0,154 mol, 1 eq) en 250 mi de DMF. Se añadieron gota a gota 27,42 9 de N-bromosuccinimida (0,154 mol, 1 eq) en 100 mi de DMF. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en 700 mi de agua y el precipitado se filtró. La torta de filtración se lavó con agua y el sólido incoloro se recristalizó a partir de 370 mi de acetonitrilo.

LC-MS [M+Hr = 411 Y 413

10 Rendimiento: 58,15 9 (92%)

Etapa 3

Éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-2,4-dioxo-butírico

Sr

SnO

OSn O O

Se disolvieron 9,75 9 de sodio (0,424 mol, 3 eq) en 500 mi de etanol absoluto (1,5 horas). Se añadieron 58 9 de 1-15 (2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-etanona (0,141 mol, 1 eq) y 30,98 9 de oxalato de dietilo (0,212 mol, 1,5 eq), y la

mezcla se sometió a reflujo durante 2 horas. Después de enfriar, la mezcla se vertió en 220 mi de HCI acuoso 2 N Y el producto se extrajo en 700 mi de diclorometano. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo amarillo se trituró con 150 mi de éter dietílico.


20 1H RMN (400 MHz, CDCI3) Ó 1,27 (t, 3H), 4,27 (q, 2H), 5,13 (d, 2H), 6,54 (s, 1H), 7,37 (m, 10H), 8,17 (s, 1H).

Etapa 4

Éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Br

BnO

OSn O~

Se disolvieron 69,3 9 de éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-2,4-dioxo-butírico (0,135 mol, 1 eq) 25 en 750 mi de etanol. Se añadieron 14,11 9 de hidrocloruro de hidroxilamina (0,203 mol, 1,5 eq). La mezcla se

sometió a reflujo durante 2,5 horas y se enfrió. Después se vertió en 1000 mi de agua, y el precipitado se filtró. La torta de filtración se lavó con 500 mi de agua, seguido de 75 mi de éter dietílico, y se secó.


1 H RMN (400 MHz, CDCI3) Ó 1,39 (t, 3H), 4,41 (q, 2H), 5,11 (d, 2H), 5,15 (d, 2H), 6,58 (s, 1 H), 6,99 (s, 1 H), 7,35 (m, 30 10H), 8,16 (s, 1H).

Etapa 5

47

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Br

BnO

o

OBn NH

\

E04709273 16-11-2012

Se suspendió éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en etanol y etilamina (2 M en metanol, 3 eq), la suspensión amarilla resultante se calentó a reflujo (80 oC) bajo nitrógeno, en cuyo punto los

5 reactivos se disolvieron. Se calentó durante 14 horas, y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se formó un precipitado blanco, que se filtró y se lavó con más etanol antes de secarlo a vacío.

10

Tiempo de retención en LC-MS 2,868 minutos [M+Hf = 507 Y 509 (tiempo de funcionamiento 3,75 minutos)

Etapa 6

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-estirilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

N~ H

A una mezcla de ácido trans-2-fenilvinilborónico (0,472 g, 3,2 mmol) y etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-bromofenil)-isoxazol-3-carboxílico (1,079 g, 2,13 mmol) se le añadió bicarbonato sódico (536 mg, 6,39 mmol) seguido de DMF (25 mL) yagua (5 mL). La mezcla se desgasificó mediante evacuación e inyección de nitrógeno (tres veces), seguido de burbujeo de gas nitrógeno a través de la mezcla durante cinco minutos.

15 Se añadió diclorobis(trifenilfosfina)paladio (11) (149 mg, 0,21 mmol) y la mezcla de reacción se calentó bajo una atmósfera de nitrógeno a 80 oC durante siete horas (la mezcla de reacción adquiere un color marrón oscuro después de 10 minutos). La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente, y la mayoría del disolvente se eliminó a vacío. El residuo resultante se repartió entre acetato de etilo (100 mL) yagua (100 mL), y esta mezcla se filtró a través de una almohadilla de celite para eliminar el residuo de paladio. Las fases se separaron y la fase orgánica se

20 lavó con agua (2 x 50 mL), disolución acuosa saturada de cloruro sódico (100 mL) y después se secó sobre sulfato sódico. La mezcla se filtró y los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un sólido marrón (800 mg). La torta de filtración de celite se lavó con diclorometano y después se secó sobre sulfato sódico. La mezcla se filtró y los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un sólido marrón (541 mg). Los lotes combinados de producto se purificaron mediante trituración con una mezcla de acetato de etilo-hexano. Esto

25 proporciona etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-estirilfenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido marrón claro (808 mg, 71 %). LCMS: [M+Hf 531. 1 H RMN (400 MHz, CDCI3) Ó 1,12 (t, 3H), 3,37 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 5,07 (s, 2H), 6,46 (s, 1H), 6,70 (t ancho, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,17 (d, 1H), 7,23 (d, 1H), 7,32-7,44 (m, 15H), 8,09 (s, 1H).

30

Etapa 7

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-fenetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

48

N~ H

E04709273 16-11-2012

Se añadió catalizador de paladio sobre carbono (10%; 50 mg) a una disolución desgasificada de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-estirilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (690 mg, 1,30 mmol) en 1,4-dioxano (50 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se hidrogenó durante un total de 4,75 hrs con más catalizador de Pd sobre carbono (50 mg) añadido a las 0,75 y 2,5 hrs. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de

5 celite, que se lavó con 1,4-dioxano (20 mL) y diclorometano (20 mL). Los disolventes combinados del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un sólido de color crema, que se purificó mediante cromatografía rápida con gel de sílice (20 g, 1ST) eluyendo con un 10 a 50 % de acetato de etilo en hexano. Esto proporciona etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-fenetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido amarillo pálido (609 mg, 88%). LCMS: [M+Hf 533. 1 H RMN (400 MHz, CDCI3) Ó 1,26 (t, 3H), 2,86-2,96 (m, 4H), 3,49 (m, 2H), 5,03 (s, 2H), 5,18 (s, 2H),

10 6,56 (s, 1H), 6,81 (t, 1H), 7,07 (s, 1H), 7,15-7,20 (m, 3H), 7,23-7,28 (m, 2H), 7,31-7,42 (m, 10H), 7,73 (s, 1H).

Etapa 8

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-fenetilfenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico

Sr

N~ H

Se añadió N-bromosuccinimida (207 mg, 1,16 mmol) a una suspensión de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-15 fenetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (564 mg, 1,06 mmol) en acetonitrilo (20 mL). Se añadió nitrato de cerio y amonio

(290 mg, 0,53 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo (lo que proporcionó una disolución naranja homogénea) y se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y el acetonitrilo se eliminó a vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo (50 mL) yagua (50 mL), y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mL) y se secó sobre

20 sulfato sódico. La mezcla se filtró y los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un aceite amarillo que se purificó mediante cromatografía rápida con gel de sílice (20 g, 1ST) eluyendo con un 10-30% de acetato de etilo en hexano. Esto proporciona etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-fenetilfenil)-4-bromoisoxazol-3-carboxílico en forma de un aceite amarillo (326 mg, 53%). LCMS: [M+Hf 613, 611.

Etapa 9

25 Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

N~ H

A una mezcla de 4-morfolin-4-ilmetil-fenil pinacol borano (0,215 g, 0,71 mmol) y etilamida de ácido 5-(2,4-bisbenciloxi-5-fenetilfenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (0,347 g, 0,57 mmol) se le añadió bicarbonato sódico (142 mg, 1,69 mmol) seguido de DMF (10 mL) yagua (2,0 mL). La mezcla se desgasificó mediante evacuación e

30 inyección de nitrógeno (tres veces), seguido de burbujeo de gas nitrógeno a través de la mezcla durante cinco minutos. Se añadió diclorobis(trifenilfosfina)paladio (11) (40 mg, 0,057 mmol) y la mezcla de reacción se calentó bajo una atmósfera de nitrógeno a 80 oC durante 5 horas (la mezcla de reacción adquiere un color marrón oscuro). Se añadieron otros 20 mg (0,029 mmol) de diclorobis(trifenilfosfina)paladio (11) y la mezcla de reacción se calentó a 80 oC durante 15 horas, y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. La mayoría de los disolventes se eliminaron

35 a vacío y el residuo se repartió entre acetato de etilo (50 mL) yagua (50 mL). Esta mezcla se filtró a través de una almohadilla de celite para eliminar los residuos de paladio, y después se separaron las fases y la fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 mL), disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mL) y después se secó sobre sulfato sódico. La mezcla se filtró y los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un aceite marrón. El producto de reacción bruto se purificó mediante cromatografía rápida con gel de sílice (20 g, 1ST) eluyendo con un

40 gradiente de disolvente del 30 al 70 % de acetato de etilo en hexano. Esto proporciona etilamida de ácido 5-(2,4-bis-

49

E04709273 16-11-2012

benciloxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-feni1)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un aceite amarillo (0,110 g, 27%). LCMS: [M+Hf 708.

Etapa 10

Hidrocloruro de etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetiIfenil)-isoxazol-3-5 carboxílico

OH

.Hel

N~ H

A una disolución enfriada en un baño de hielo de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (0,109 g, 0,15 mmol) en diclorometano (4 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno se le añadió una disolución 1,0 M de tricloruro de boro en diclorometano (0,45 mL; 0,45 mmol). La mezcla de

10 reacción se agitó a O oC durante 20 minutos, después a temperatura ambiente durante 3,5 horas. La mezcla de reacción se volvió a enfriar a O oC y se paró mediante la adición de una disolución acuosa saturada de bicarbonato sódico (5 mL). Después de agitar durante 5 minutos se eliminó el diclorometano a vacío y el residuo se repartió entre acetato de etilo (20 mL) yagua (20 mL). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con agua (20 mL), disolución acuosa saturada de cloruro sódico (20 mL) y después se secó sobre sulfato sódico. La mezcla se filtró y

15 los disolventes del filtrado se eliminaron a vacío para proporcionar un aceite marrón claro que se purificó mediante adsorción en gel de sílice y después mediante cromatografía rápida con gel de sílice (10 g 1ST) eluyendo con un O a 5% de metanol en acetato de etilo. Esto proporciona un aceite incoloro que se trituró con HCI 1,0 M en una disolución de éter dietílico (5 mL) para proporcionar hidrocloruro de etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (0,019 g; 24%). LCMS: [M+Hf 528. 1 H RMN (400 MHz, d6-DMSO)

20 Ó 1,08 (t, 3H), 2,60 (m, 4H), 2,90-3,30 (m, 6H), 3,67 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 4,30 (s, 2H), 6,46 (s, 1 H), 6,84 (s, 1 H), 7,05-7,49 (m, 5H), 7,40-7,68 (m, 4H), 8,90 (s ancho, 1H), 9,67 (s, 1H), 9,89 (s, 1H), 10,75 (s ancho, 1H).

25


Los ejemplos de la Tabla siguiente se prepararon mediante métodos análogos a los del Ejemplo 64, y tuvieron las actividades mostradas en el Ensayo de Polarización de Fluorescencia, como se describe más adelante.

Ejemplo Estructura

I

() N

el 66 HO

OH NH

\

50

MH+

457

459

CI50 de Hsp90*

A

Ha 67

68

F

69

70

71 HO

F

OH NH

OH

\

N~ H

el

OH N~ H

F

OH ~\

F

51

419

459

544

546

437

A

A

A

A

A

E04709273 16-11-2012

72 HO

73 HO

74 HO

OH

r:-"O ~~

75

N\ H

O )l-

O

516 A

518 A

500 A

546 A

E04709273 16-11-2012

Los ejemplos adicionales 75a-v de la tabla siguiente se prepararon también mediante métodos análogos a los del Ejemplo 65.

Ejemplo Estructura

75a

52

MH+

540

CI50 de Hsp90

A

HO 75b

75c

OH

F

75d

OH

75e

HO 75f

HO 75g

{J

NH o \ ~OH

NH

\

N~ H

o )lOH

-el

N~ H

r-\ N N-'--1

53

498

542

516

544

518

531

A

A

A

A

A

A

E04709273 16-11-2012

75h

75i

NH

\

F

75k

OH

75m HO

OH

75n

OH NH

\

54

o )l.OH

o )lOH

N~ H

N~ H

532 A

526 A

502 A

512 A

545 A

E04709273 16-11-2012

HO 75p

OH

F

75q Ha

OH

F

75r Ha

OH

75s

OH

75t

OH

55

I N

/

NH

\

N'\ H

N~ H

CI

N~ H

N~ H

Cr

486

531

504

527

500

A

A

A

A

A

E04709273 16-11-2012

HO 75u

OH NH

\

O 75v

Ejemplo 76

Esquema de Reacción

5 Etapa 1

3-(2,4-Bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-5-metilisoxazol

501

517

B

A

E04709273 16-11-2012

Se añadió trifluoruro de boro-trimetiloxonio (Aldrich; 70 mg, 0,47 mmol) a una disolución agitada de 5-(2,4-bisbenciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol (Ejemplo 3, Etapa 1) (120 mg, 0,22 mmol) en

10 diclorometano (3 mi), y la agitación continuó durante 3 h. La mezcla resultante se concentró a vacío para proporcionar un semisólido blanco, que se mezcló con hidrocloruro de hidroxilamina (70 mg, 1,0 mmol), carbonato potásico (120 mg, 0,87 mmol) y metanol (2 mi), y se calentó a reflujo durante 18 h. La mezcla de reacción se repartió entre agua (20 mi) y acetato de etilo (2x10 mi), y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato magnésico anhidro y se evaporaron a vacío para proporcionar un aceite incoloro. El producto bruto se purificó

15 mediante cromatografía en columna, sílice (10 g), eluyendo con hexano, seguido de éter dietílico/hexano (1 :1), para proporcionar 3-(2,4-bis-benciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-5-metil-isoxazol en forma de un sólido blanco (44 mg,37%)

56

Tiempo de retención en LC 5,55 minutos [M+Hf 556,0 Y 558,0 (Tiempo de funcionamiento 8,00 mins)

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R.M.N. (Cloroformo-d) 7,64 (s ArH) 7,35-6,76 (m 14 ArH) 6,34 (sArH) 4,90 (s 2CH2) 4,60 (s 2CH2) 3,79 (s 3CH3) 2,46 (s 3CH3)

Etapa 2

5 4-Bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-5-metil-isoxazol-3-il]-benceno-1 ,3-diol

HO~Br f ~O-~ fI _

HO '/ ~ N·O

Se añadió una disolución de tricloruro de boro (1 M en diclorometano, 1 mi, 1 mmol) a una disolución de 3-(2,4-Bisbenciloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-5-metil-isoxazol (38 mg, 0,068 mmol) en diclorometano (1 mi), y se continuó con la agitación durante 1 h. La mezcla de reacción se repartió entre agua (20 mi) y diclorometano (2x20

10 mi), y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato magnésico anhidro y se concentraron a vacío para producir un aceite marrón. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice (10 g), eluyendo con hexano, seguido de hexano/éter dietílico (3:1, después 1 :1), para proporcionar 4-Bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-5-metil-isoxazol-3-il]-benceno-1 ,3-diol en forma de un aceite incoloro (11 mg, 43%).

Tiempo de retención en LC 2,52 minutos [M+Hf 376,1 Y 378,1 (Tiempo de funcionamiento 3,75 mins)

15 R.M.N. (DMSO-d6) 10,40 (s OH) 9,69 (s OH) 7,22 (ArH) 7,10-6,89 (m 4ArH) 6,5 (s ArH) 3,7 (s OCH3) 2,46 (s CH3)

20

Este compuesto tuvo una actividad 'A' en el ensayo de polarización de fluorescencia de Hsp90.

Ejemplo 76A

El compuesto siguiente está disponible comercialmente (lnterbioscreen) y tuvo una actividad 'B' en el ensayo de polarización de fluorescencia:

Ejemplo Estructura MH+

76A 343

F

Los compuestos siguientes se produjeron según el Ejemplo 76:

Ejemplo Estructura MH+ CI50 de Hsp90

76B 389 A

o

57

76C

Ejemplo 77

o

N/\ ~O

458 A

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Preparación de etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

5 Esquema de Reacción:

~ HO)lAOH

HO

OH NH

\

~ o

HO A OH B~" - ~"JCl".. - I ~ ~O

- ,~")l;l,,n_ /6 SnO OSn (

snO,± - ~o

08n O-N o

sno± -~O-

OSn O-N NH

\

Etapa 1

1-( 5-terc-Butil-2,4-d ihidroxi-fenil)-etanona

\ rO N~

BnoM~~ lA 0-

?" 1.

OSn O-N NH

\

~ 'oUO

58

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Se añadió ácido sulfúrico (4 mi, 75 mmol) a una suspensión de 2,4-dihidroxiacetofenona (22,8 g, 150 mmol) en una mezcla de 2-metil-2-propanol (35 g, 470 mmol) y ácido trifluoroacético (80 mi), bajo una atmósfera de nitrógeno. La suspensión resultante se calentó, a una temperatura del baño de aceite de 75 oC, durante -3 hrs para proporcionar una disolución roja pálida. La disolución resultante se dejó enfriar y se vertió en hielo/agua (350 mi), para

5 proporcionar un precipitado rosa pálido. El sólido se retiró mediante filtración y se lavó con agua (600 mi) y hexano (200 mi) para proporcionar un polvo rosa pálido. Se secó a vacío (40 oC) para proporcionar 1-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-etanona en forma de un polvo naranja pálido (28,8 g, 92%).


RM.N. (Cloroformo-d) 7,35 (s ArH) 6,05 (s ArH) 7,35 (m 2ArH) 2,35 (s 3CH3) 1,15 (s 9 CH3)

10 Etapa 2

1-(2,4-Bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-etanona

~ BnO h OBn

Se añadió bromuro de bencilo (10 mi, 84 mmol) a una disolución de la acetofenona (13,5 g, 65 mmol) en DMF (50 mi), se añadió carbonato potásico (20 g, 145 mmol) y la suspensión se agitó, a temperatura ambiente, durante -4

15 hrs. La suspensión resultante se vertió en agua (200 mi) para proporcionar un precipitado naranja pálido. El sólido se retiró mediante filtración y se lavó con agua. El sólido se resuspendió en diclorometano (150 mi) y la disolución se lavó con agua (2x100 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (100 mi). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta un aceite rojo pálido.

El aceite se resuspendió en 2-metil-2-propanol (100 mi) y se añadió terc-butóxido potásico (7,5 g, 67 mmol), para 20 proporcionar un precipitado amarillo pálido, se añadió bromuro de bencilo (8 mi, 67 mmol) y la mezcla se calentó a

reflujo durante -1 hr. La suspensión resultante se dejó enfriar y se vertió en agua (250 mi), para proporcionar un precipitado naranja pálido. El sólido se retiró mediante filtración y se lavó con agua. El sólido se resuspendió en acetato de etilo (150 mi) y se lavó con agua (2x200 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (100 min). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta un semi-sólido naranja, y la trituración con

25 metanol proporcionó un sólido rosa pálido. El sólido se filtró y se secó a vacío (40 oC), para proporcionar 1-(2,4-bisbenciloxi-5-terc-butil-fenil)-etanona en forma de un polvo rosa pálido (9,1 g, 36%).


RM.N. (Cloroformo-d) 7,65 (s ArH) 7,25-7,15 (m 10ArH) 6,35 (s ArH) 4,95 (s 2CH2) 4,9 (s 2 CH2) 2,4 (s 3CH3) 1,2 (s 9CM)

30 Etapa 3

Éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico

o

Se añadió etóxido sódico (2,8 g, 41 mmol) a una suspensión de la 1-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-etanona (7,8 g, 20 mmol) en etanol (40 mi). Se añadió oxalato de dietilo (4 mi, 29,5 mmol) y la suspensión resultante se calentó a

35 reflujo durante -2 hrs para proporcionar una disolución roja pálida. La disolución se dejó enfriar y se vertió en agua (200 mi), la mezcla se acidificó con ácido clorhídrico (50 mi, 1 M) Y se extrajo con diclorometano (150 mi). Los extractos se lavaron con agua (2x200 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (100 mi). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta una goma amarilla. La trituración con hexano proporcionó un sólido amarillo. El sólido se filtró y se lavó con hexano y se secó a vacío (40 oC), para proporcionar éster etílico de

40 ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico en forma de un polvo amarillo (9,1 g, 93%).

RM.N. (Cloroformo-d) 8,0 (s ArH) 7,5-7,35 (m 11ArH) 6,6 (s ArH) 5,2 (s 2CH2) 5,15 (s 2 CH2) 4,3 (q J 7,1 Hz 2 CH2) 1,4 (s 9 CM) 1,25 (t J 7,1 Hz 3CH3)

Etapa 4

59

Éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO

E04709273 16-11-2012

Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (3,6 g, 52 mmol) a una disolución de éster etílico de ácido 4-(2,4-bisbenciloxi-5-terc-butil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico (9,0 g, 18,5 mmol) en etanol (75 mi), y la suspensión se

5 calentó a reflujo durante -4 hrs. La disolución resultante se dejó enfriar y se vertió en agua (200 mi) para proporcionar un precipitado blanquecino. El sólido se filtró y se resuspendió en diclorometano (150 mi). La disolución se lavó con agua (150 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mi). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta un sólido blanquecino. El sólido se lavó con hexano y se secó a vacío (40 oC), para proporcionar éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma

10 de un polvo marrón pálido (8,0 g, 89%).


R.M.N. (Cloroformo-d) 7,85 (s ArH) 7,4-7,25 (m 10ArH) 6,9 (s ArH) 6,5 (s ArH) 5,1 (s 2CH2) 5,0 (s 2 CH2) 4,35 (q J 7,1 Hz2CM) 1,4 (s 9 CH3) 1,35(tJ7,1 Hz3CH3)

Etapa 5

15 Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO

NH

" Se añadió éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (10,0 g, 20,6 mmol) a una disolución de etilamina en metanol (60 mi, 2,0 M), Y la suspensión se calentó, a una temperatura del baño de aceite 75 oC, durante -2 hrs. La disolución resultante se dejó enfriar y se concentró hasta un aceite marrón pálido, se

20 añadió diclorometano (150 mi) y la disolución se lavó con agua (100 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (75 mi). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta un aceite marrón, que se solidificó en reposo (9,9 g, -cuant.).


R.M.N. (Cloroformo-d) 7,8 (s ArH) 7,4-7,2 (m 10ArH) 7,0 (s ArH) 6,75 (t ancho J 5,4 Hz NH) 6,5 (s ArH) 5,1 (s 2CM) 25 5,0 (s 2 CM) 3,4 (dq J 5,4 Hz, 7,1 Hz 2 CH2) 1,35 (s 9 CH3) 1,15 (t J 7,1 Hz 3CM)

Etapa 6

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-yodo-isoxazo1-3-carboxílico

BnO

NH

" 60

E04709273 16-11-2012

Se añadió N-yodosuccinimida (9,0 g, 40 mmol) a una suspensión de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-tercbutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (9,9 g, 20,4 mmol) en acetonitrilo (60 mi). Se añadió nitrato de cerio y amonio (0,25 g, 0,46 mmol) y la suspensión se agitó durante -18 hrs. La suspensión resultante se concentró, y el residuo se resuspendió en diclorometano (125 mi). La disolución resultante se lavó con una disolución acuosa de metabisulfito

5 sódico (2x100 mi, 5%), agua (100 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (100 mi). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta una goma roja pálida. La trituración con etanol (25 mi) proporcionó un sólido blanquecino, el sólido se retiró mediante filtración y se lavó con etanol. Se secó a vacío (40 oC), para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico en forma de un polvo blanquecino (7,75 g, 62%).


15

20

R.M.N. (Cloroformo-d) 7,45-7,25 (m 11ArH) 6,8 (t ancho J 5,4 Hz NH) 6,6 (s ArH) 5,05 (s 4CH2) 3,5 (dq J 5,4 Hz, 7,1 Hz 2 CH2) 1,35 (s 9 CH3) 1,2 (t J 7,1 Hz 3CH3)

Etapa 7

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO

NH

\ Se añadió una disolución acuosa de fosfato potásico (25 mi, 1,2 M) a una disolución de etilamida de ácido 5-(2,4-bisbenciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico (6,1 g, 10 mmol) y ácido 4-formilfenil borónico (2,35 g, 15,7 mmol) en 1,4-dioxano (75 mi), bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió diclorobis(tri-o-tolil fosfina)paladio(ll) (cat.) y la mezcla se calentó, a una temperatura del baño de aceite de 100 oC, durante -1 hr. La mezcla se dejó enfriar, y la capa acuosa se separó y se extrajo con acetato de etilo (100 mi). Las capas orgánicas combinadas se concentraron para proporcionar una goma marrón pálida.

El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice (600 mi), eluyendo con acetato de etilo/ hexano (1 :3), para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de una espuma amarilla pálida (5,18 g, 88%).


R.M.N. (Cloroformo-d) 9,75 (s CHO) 7,5 (d J 6,9 Hz 2 ArH) 7,2 (d J 6,9 Hz 2 ArH) 7,15-7,0 (m 8ArH) 6,8 (m 2 ArH) 6,65 (t ancho J 5,4 Hz NH) 6,2 (s ArH) 4,8 (s 2CH2) 4,5 (s 2 CH2) 3,2 (dq J 5,4 Hz, 7,1 Hz 2 CH2) 1,1 (s 9 CM) 1,05 (t J 7.Hz 3CH3)

Etapa 8

30 Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO

NH

\ Se añadió cianoborohidruro sódico (65 mg, 1,03 mmol) a una disolución de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (125 mg, 0,21 mmol), morfolina (50 ¡JI, 0,57 mmol) y ácido

61

acético (cat.) en metanol (4 mi), y la disolución se agitó durante -72 hrs. Se añadió diclorometano (50 mi) y la disolución se lavó con agua (2x50 mi) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico (50 mi). La disolución se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta una goma incolora.

El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna, sílice (20 g), eluyendo con acetato de etilo/ hexano 5 (1: 1), para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-

3-carboxílico en forma de un aceite incoloro (35 mg, 25%).


R.M.N. (Cloroformo-d) 7,35-7,05 (m 15ArH) 6,7 (t ancho J 5,4 Hz NH) 6,4 (s ArH) 4,9 (s 2CH2) 4,75 (s 2 CH2) 3,6 (t J 4,5 Hz 4 CM) 3, (s 2 CH2) 3,35 (dq J 5,4 Hz, 7,1 Hz 2 CH2) 2,35 (s ancho 4 CH2) 1,15 (t J 7,1 Hz 3CH3) 1,1 (s 9 CH3)

10 Etapa 9

Etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

HO

OH NH

\ Se añadió una disolución de tricloruro de boro (1 mi, 1,0 M en diclorometano) a una disolución de etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (35 mg, 0,05 mmol) en

15 diclorometano (1 mi) a -20 oC (hielo/metanol), bajo una atmósfera de nitrógeno. La disolución resultante se agitó a O oC (hielo/agua) durante -90 mins. Se añadió metanol (2 mi) y la disolución se concentró hasta una goma marrón.

El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa, para proporcionar etilamida de ácido 5-(5-terc-butil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un polvo blanco (sal de formiato) (21 mg,75%).


25

R.M.N. (DMSO-d6) 8,8 (t J 5,6 Hz NH) 7,25 (d J 7,2 Hz 2ArH) 7,15 (d J 7,2 Hz 2ArH) 6,7 (s ArH) 6,45 (s ArH) 3,45 (s ancho 4 CH2) 3,2 (dq J 5,6 Hz, 7,2 Hz 2 CH2) 2,3 (s ancho 4 CH2) 1,1 (s 9 CH3) 1,05 (t J 7,2 Hz 3CH3)


De una manera similar a la preparación del compuesto del Ejemplo 77, se prepararon los Ejemplos 77a-f.

Ejemplo Estructura MH+ CI50 de Hsp90 M{) OH

0:1

HO ~ ~ 77a -...:::: - 480 A lb o

,;o-

OH 0-': NH

\

62

HO 77b 466 A

OH NH

\

NJ HO

77e 478 A

OH NH

\

HO 77d 493 A

OH NH

\ F

Ha 77e 399 A

OH NH

\ "-a

Ha 77f 411 A

OH NH

\

Ejemplo 78

Preparación de etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropilfenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-earboxílieo

63

Esquema de Reacción

HO ..... XO

y OH

BnBr. K,CO, DMF

EtNH2 MeOH

BnBr. ~ K,CO.

MeCN BnO "'"

~ 1.<:'

PPh,PMeBr tQ nBuU. THF BnO "'"

- 1.<:'

OBn OBn

Hz. Pd-C EtOH XOH

y OH

BF •. OE~ h AcOH "'" OH - 1

.<:'

o OH

h NaOEt EtOH

~ OBn (Et02C)2

1 -

Bno.....x ~~~H.HCI ~COzEt -

Bno~ ---~ " .<:'

o OBn

---~ "

OBn o OH

MeCN '"" - "', I

Pd(PP~hClz NazCO. 1 M DMF

BnO 0-'" 'N CO~t

Bno~ BnO o ~ NHEt

'N

NIS. CAN Bno~ BnO 0-'" NHEt

'N ~o

(HOl,sN O

NaCNBH •• AcOH BnO morfolina, MeOH

O

r-\ N O BCI. \..J DCM

r-\ N O \..J

CONHEt

Etapa 1

5 1-(2,4-Bis-benciloxi-fenil)-etanona

Bno,Xo y

OBn

Se añadió carbonato potásico (2,5 eq) a una disolución de 2',4'-dihidroxiacetofenona (1 eq) en acetonitrilo (400 mL), y la suspensión se agitó a temperatura ambiente. Se añadió bromuro de bencilo (2,5 eq) gota a gota a lo largo de 10 minutos, y la mezcla se calentó a reflujo durante 18 horas. La mezcla se enfrió y se evaporó a vacío para

10 proporcionar una suspensión espesa. La suspensión espesa se repartió entre agua y acetato de etilo, y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo adicionalmente con diclorometano, y los extractos orgánicos se combinaron, se secaron (MgS04) y se evaporaron a vacío. El producto se trituró con hexano, se filtró y se lavó con hexano frío y se secó a vacío a 45 oC para proporcionar 1-(2,4-bis-benciloxi-fenil)-etanona en forma de un polvo blanco.

Tiempo de retención en LC 2,704 min [M+Hf 333,3

15 Etapa 2

2,4-Bis-benciloxi-1-isopropenil-benceno

64

Bno,X y

OBn

Se suspendió bromuro de metiltrifenilfosfonio (1,1 eq) en THF ano y se enfrió a O oC bajo nitrógeno. Se añadió nbutillitio 1,6 M en hexanos (1,1 eq) gota a gota, y se agitó durante 30 minutos. Se disolvió 1-(2,4-bis-benciloxi-fenil)etanona (1 eq) en THF ano y se añadió gota a gota a la suspensión. Cuando se completó la adición, se retiró el baño

5 de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante la noche. Se añadió metanol a la mezcla de reacción, y la disolución resultante se evaporó a vacío. Se añadió hexano al aceite resultante y se calentó a reflujo durante 30 minutos, y después se filtró a través de Celite. El licor se evaporó a vacío para proporcionar un aceite que se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con un 30% de EtOAc en hexano, para proporcionar 2,4-bis-benciloxi-1-isopropenil-benceno. Tiempo de retención Rf 0,722, 3:1 Hexano:

10 EtOAc.

Etapa 3

4-lsopropil-benceno-1,3-diol

:COH y

OH

2,4-Bis-benciloxi-1-isopropenil-benceno se resuspendió en disolución en etanol y se añadió un 10% de paladio sobre 15 carbono, que se había humedecido previamente con agua. Se introdujo hidrógeno en el matraz y la mezcla se dejó

con agitación durante 16 horas. El catalizador se filtró de la mezcla de reacción, mediante un método adecuado, y el licor se concentró a vacío, para proporcionar 4-isopropil-benceno-1 ,3-diol en forma de un sólido cristalino blanco.


Etapa 4

20 1-(2,4-Dih idroxi-5-isopropil-fenil)-etanona

:COH yy

O OH

Se resuspendió 4-isopropil-benceno-1 ,3-diol (1 eq) en BF3.OEb (6 eq) y se añadió ácido acético (2 eq). La disolución se calentó durante 16 horas a 90 oC y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. La disolución se añadió gota a gota a un 10% de NaOAc (ac.) y se dejó reposar durante 4 horas, antes de ser extraída con EtOAc. Las fases

25 orgánicas se combinaron y se lavaron con NaHC03 sat. (ac.), después se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentraron a vacío. El aceite residual se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con diclorometano, para proporcionar 1-(2,4-Dihidroxi-5-isopropil-fenil)-etanona en forma de un sólido blanco.


Etapa 5

30 1-(2,4-Bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-etanona

65

::Cosn Yl(

o OSn

Se disolvió 1-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-etanona (1 eq) en DMF y se añadió carbonato potásico (2,2 eq) y después bromuro de bencilo (2,2 eq). La suspensión se calentó, con agitación a 150 oC, bajo nitrógeno, durante 16 hrs. La disolución se enfrió a temperatura ambiente y la mezcla se vertió en HCI 1 M (ac.) y después se extrajo en

5 acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron de nuevo con HCI 1 M (ac.) y después cinco veces con una disolución de salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró a vacío para proporcionar un sólido, que se purificó mediante trituración con éter dietílico: hexano (1 :1) para proporcionar 1-(2,4-bis-benci loxi -5-iso pro pi 1-feni I)-etanona.


10 Etapa 6

Éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico

SnO

Se añadió sodio (2,8 eq) a etanol bajo nitrógeno a temperatura ambiente y se agitó durante 25 minutos para generar etóxido sódico. Se disolvió 1-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-etanona (1 eq) en más etanol y se añadió a la

15 disolución de etóxido sódico. Se añadió oxalato de dietilo (1,64 eq) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió suficiente HCI 1 M (ac.) para acidificar la mezcla de reacción, que se concentró después a vacío. La goma resultante se repartió entre diclorometano y salmuera, y la fase orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó a vacío para proporcionar éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico en forma de una goma

20 amarilla.

Tiempo de retención en LC 3,057 min [M+Hf 475

Etapa 7

Éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

25 Se disolvió éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enoico (1 eq) en etanol con agitación. Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (1,2 eq) y la disolución se calentó a reflujo durante 4 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a vacío. El residuo se repartió entre salmuera y diclorometano. La fase orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró a vacío para proporcionar éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de

30 un sólido.

Tiempo de retención en LC 3,059 min [M+Hf 472

Etapa 8

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

66

NHEt

o

Se disolvió éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en un exceso de etilamina 2 M en metanol y se calentó en el microondas Smith Synthesiser a 120 oC durante 600 segundos. La disolución se concentró a vacío para proporcionar un sólido que se purificó mediante trituración en hexano, para

5 proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico.


Etapa 9

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico

NHEt

o

10 Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) en acetonitrilo an., y se añadió N-yodosuccinimida (2,0 eq), seguido de nitrato de cerio y amonio (0,05 eq), y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a vacío y la goma resultante se repartió entre acetato de etilo y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con 9:1 de hexano: acetato de etilo, para proporcionar

15 etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico en forma de un aceite. Tiempo de retención en LC 2,975 min [M+Hf 597,2

Etapa 10

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico

20 Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) en DMF ano Se añadió Na2C03 1 M (ac.), seguido de ácido 4-formilfenilborónico (2 eq) y después PdCb(PPh3)2 catalítico. Se hizo burbujear nitrógeno a través de la disolución durante diez minutos a temperatura ambiente, tras lo cual la temperatura se elevó a 80 oC bajo una atmósfera de nitrógeno, durante 15 minutos. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo. Esta disolución se lavó con

25 salmuera, después se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró a vacío para proporcionar un aceite. Se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con un 10% de EtOAc en hexano, para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido blanco.


Etapa 11

67

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO /\

N O "---1

Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) en metanol y se añadieron tamices moleculares de 3 A en polvo. Se añadió morfolina (2 eq), seguido de cianoborohidruro sódico

5 (2 eq). Se añadió ácido acético (5 eq) gota a gota y la suspensión se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM y se lavó con NaHC03 sat. (ac.). La fase orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró a vacío. La goma resultante se purificó mediante cromatografía rápida, eluyendo con 1 % de MeOH en DCM para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un aceite incoloro.

10 Tiempo de retención en LC 4,42 min [M+Hf 646,2 método 8

Etapa 12


HO /\

N O "---1

Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico 15 (1 eq) en DCM ano y, bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a O oC. Se añadió 8Cb 1 M en DCM gota a gota y la

disolución se agitó en estas condiciones durante 30 minutos. Se añadió metanol (2 mi) y la mezcla de reacción se concentró a vacío. La purificación de la muestra mediante LC/MS preparativa proporcionó etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-feni1)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido blanco.


20 Este compuesto tuvo una actividad 'A' en el ensayo de polarización de fluorescencia de Hsp90.

De una manera similar a la preparación del compuesto del Ejemplo 78, se prepararon los Ejemplos 78a-u.

CI50 de Ejemplo Estructura MH+

Hsp90

NJ 78a 464 A

O

68

78b

78c

78d

78e

78f

78g

o

1\ HO N N-

'-1

O

¡-N H

o

>-N H

o

H~S H H

- ~ ~ o HN"i,NH H~N~ ~ Ó - o

HO - H

O'N" -../

o

o

69

1\ N o '-1

452

479

424

439

680

636

A

A

A

A

A

Pro-fármaco

véase el Ejemplo 78v

78h

78i

o

78j

o

78k

o

781

o

o N H

):J N H

o N H

Y-N H

70

550

478

464

480

452

Pro-fármaco


A

A

A

A

78m HO

OH

HO 78n

OH

78p HO

OH

HO 78q

OH

78r

NH

\. H N",--",

N~ ~ .-1

NH

\.

NH

\. H N

~ aH NH

\.

NH

\

71

454

495

465

479

608

A

A

A

A

Pro-fármaco


78s HO

480 A

78t HO

493 A

78u HO 466 A

:?" ¡,

OH O-N NH

-\

Ejemplo Estructura MH+ CI50 de Hsp90

O N H

78w 492 A

HN-(

72

o N H

78y 478 A

HN-(

N~ H

78z 466 A

78aa 514 A

78ab HO 478 A

OH NH

\ F

Nr::fF HO

78ac 500 A

NH

\

73

o

~N-\ N H H

HO 78ad 495 A

NH

\

9to

H NH2

78ae HO 521 A

NH

\ N~NH2

HO

78af 479 A

NH

\ O

~N-~ /

HO 78ag 481 A

NH

\ O

~N~ N H H

HO 78ah 481 A

NH

\

74

5

78ai

Ejemplo 78v

"'o N~

NH

\

608

Pro-fármaco


Éster dietílico - éster 4-cloro-5-(dietoxi-fosforiloxi)-2-[3-etilcarbamoil-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-5-il]-fenílico de ácido fosfórico

'" o

CONHEI

A una mezcla sólida de etilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-metoxifenil)-isoxazol-3-carboxílico (11 mg, 2,1 x 10-2 mmol) y MgO (25 mg) en un vial pequeño, se le añadieron 10 gotas de clorofosfato de dietilo. La mezcla resultante se calentó y se agitó a 70 oC durante una hora, y el progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Cuando se enfrió, se añadió MeOH (1 mi) y DCM (1 mi). Tras la filtración, los disolventes se

10 evaporaron y se obtuvo un aceite amarillo. El éster de di-fosforilo se separó mediante CCF preparativa, lo que produjo 4 mg. R¡ = 0,35; 1H RMN ó = 7,95 (1 H, s, ancho); 7,74 (1 H, s); 7,55 (1 H, s); 7,32 (2H, d, J = 9,0 Hz); 6,90 (2H, d, J = 9,0 Hz); 4,30 (8H, q); 3,80 (3H, s); 3,40 (2H, q); 1,35 (12H, t) Y 1,25 (3H, t). LCMS: (M+1f = 661,1 (RT = 7,60 min.)

Ejemplo 79

15 Preparación de etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetiIfenil)-isoxazol-3-carboxílico

OH NH

" Esquema de Reacción

75

HOO{ ,HO { ,HO{_ .. Sno y Y- 1f!rO OH OH OH

SnO

O

OSn O O ~

SnO

OSn ~H

Etapa 1

1-(2,4-Dihidroxi-fenil)-2-metil-propan-1-ona

snO

HO

OH

SnO

NH

\.

O

OSn NH

" OSn NH

"

5 Se resuspendió resorcinol (1 eq) en BF3.0Eb (6 eq) y se añadió ácido isobutírico (1 eq). La disolución se calentó durante 1,5 horas a 90 oC y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. La disolución se añadió gota a gota a un 10% de NaOAc (ac.) y se dejó reposar durante 4 horas, antes de ser extraída con EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con NaHC03 sat. (ac.), después se secaron sobre sulfato magnésico, se filtraron y se concentraron a vacío para proporcionar 1-(2,4-dihidroxi-fenil)-2-metil-propan-1-ona en forma de un aceite rojo que se

10 usó sin purificación adicional.


Etapa 2

4-lsobutil-benceno-1,3-diol

HO

OH

15 Se añadió cloroformiato de etilo (3 eq) lentamente a una disolución enfriada (O oC) de 1-(2,4-dihidroxi-fenil)-2-metilpropan-1-ona (1 eq) y trietilamina (3 eq) en THF. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante tres horas antes de filtrarla, y el sólido se lavó con THF frío. Los filtrados combinados se enfriaron a O oC y se añadió lentamente borohidruro sódico (4 eq) en un volumen de agua igual al de los filtrados de THF. La mezcla se calentó a temperatura ambiente, se agitó durante tres horas y se diluyó con agua. La mezcla se extrajo dos veces con éter

76

dietílico, los extractos combinados se concentraron hasta sequedad y se resuspendieron en una disolución acuosa de hidróxido sódico del 10% (4 eq). Después de someterla a reflujo durante 90 minutos, la mezcla se enfrió, se acidificó con HCI ac. 5 M Y se extrajo dos veces con éter dietílico. Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato magnésico, se filtraron y se concentraron hasta sequedad para proporcionar 4-isobutil-benceno-1 ,3-diol en forma de

5 un aceite turbio, que se usó sin purificación adicional.

RMN coherente con la estructura.

Ejemplo 3:

1-(2,4-Dihid roxi-5-isobutil-fenil)-etanona

HO

o

10 Se resuspendió 4-isobutil-benceno-1 ,3-diol (1 eq) en BF3.0Eb (6 eq) y se añadió ácido acético (2 eq). La disolución se calentó durante 16 horas a 90 oC y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. La disolución se añadió gota a gota a un 10% de NaOAc (ac.) y se dejó reposar durante 4 horas, antes de extraerla dos veces con éter dietílico. Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con NaHC03 sat. (ac.), después se secaron sobre sulfato magnésico, se filtraron y se concentraron a vacío para proporcionar 1-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-etanona, que se

15 usó sin purificación adicional.

RMN coherente con la estructura.

Etapa 4

1-(2,4-Bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-etanona

BnO

o

20 Se disolvió 1-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-etanona (1 eq) en DMF y se añadió carbonato potásico (4,4 eq) y después bromuro de bencilo (4,4 eq). La suspensión se calentó, con agitación a 150 oC bajo nitrógeno durante 16 hrs. La disolución se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y se concentró hasta sequedad. Este sólido se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, hexanos:acetato de etilo 4:1) y después se re-cristalizó a partir de acetato de etilo:hexanos para proporcionar 1-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-etanona en forma de cristales

25 incoloros.


Etapa 5

Éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-2,4-dioxo-butírico

BnO

O

OBn O o ~ 30 Se añadió sodio (3 eq) a etanol bajo nitrógeno a temperatura ambiente y se agitó hasta que se disolvió

77

completamente. Se añadió 1-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutilfenil)-etanona (1 eq), seguido de oxalato de dietilo (1,5 eq), y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se acidificó con Hel 2 M (ac.) para proporcionar un precipitado amarillo de éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-2,4-dioxo-butírico, que se obtuvo mediante filtración.

5 Tiempo de retención en Le 3,254 min [M+Hf 489,3

Etapa 6

Éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO

OBn o \

Se disolvió éster etílico de ácido 4-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-2,4-dioxo-butírico (1 eq) en etanol con agitación. 10 Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (1,2 eq) y la disolución se calentó a reflujo durante 2 horas. La mezcla de

reacción se enfrió a temperatura ambiente, para proporcionar un precipitado. Este precipitado se obtuvo mediante filtración para proporcionar éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutilfenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido blanco.

Tiempo de retención en Le 3,261 min [M+Hf 486,3

15 Etapa 7

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

BnO

OBn NH

\. Se disolvió éster etílico de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en etilamina 2 M en metanol (10 eq) y se calentó en el microondas Smith Synthesiser a 120 °e durante 600 segundos. La disolución se

20 concentró a vacío para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido blanco que se usó sin purificación adicional.

25

Tiempo de retención en Le 3,112 min [M+Hf 485,3

Etapa 8

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico

BnO

OBn NH

\. Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) y N-yodosuccinimida (2,0 eq), en acetonitrilo, se añadió nitrato de cerio y amonio (0,1 eq) y la disolución se agitó a temperatura ambiente

78

durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a vacío y la goma resultante se repartió entre acetato de etilo y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con 4:1 hexano: acetato de etilo, para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutilfenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico en forma de un aceite.

5 Tiempo de retención en LC 3,089 min [M+Hf 611,2

Etapa 9

Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

OBn NH

\ Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) en DMF y se

10 añadió Na2C03 1 M (ac.) (3 eq), seguido de ácido 4-formilfenilborónico (2 eq) y PdCb(PPh3)2 catalítico. Se hizo burbujear nitrógeno a través de la disolución durante diez minutos a temperatura ambiente, tras lo cual la temperatura se elevó a 80 oC bajo una atmósfera de nitrógeno, durante 2 horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo. Esta disolución se lavó con salmuera, después se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró a vacío para proporcionar un aceite que

15 se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con un 10% de EtOAc en hexano, para proporcionar etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido blanco.

Tiempo de retención en LC 5,57 min [M+Hf 589,1 método B

Etapa 10

20 Etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-iImetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico

OBn NH

\ Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) en metanol y se añadieron tamices moleculares de 3 A en polvo. Se añadió morfolina (2 eq), seguido de ácido acético (5 eq). Después de agitar durante 30 minutos, se añadió cianoborohidruro sódico (2 eq) por partes y la suspensión

25 se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de celite y se concentró hasta sequedad. La cromatografía en columna, eluyendo con un 5% de MeOH en DCM, proporcionó etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un aceite incoloro.

Tiempo de retención en LC 4,53 min [M+Hf 660,2 método B

30 Etapa 11

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

79

OH NH

\ Se disolvió etilamida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) en DCM ano y bajo una atmósfera de nitrógeno se enfrió a O oC. Se añadió 8Cb 1 M en DCM (9 eq) gota a gota y la disolución se agitó durante 30 minutos. Se añadió metanol (2 mi) y la mezcla de reacción se concentró a

5 vacío. La purificación de la muestra mediante LC/MS preparativa proporcionó etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico en forma de un sólido blanco.



De una manera similar a la preparación del compuesto del Ejemplo 79, se preparó el Ejemplo 80. La purificación de 10 la muestra mediante LC/MS preparativa proporcionó el compuesto en forma de un sólido blanco

15

Ejemplo Estructura

80

OH NH

\

MH+

480

CI50 de Hsp90

A

Ejemplo 81

N-[5-(5-Cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-metanosulfonamida

HO

Ejemplo 82

N-[5-(5-Cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-acetamida

Amida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

80

BnO

La amida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-yodo-isoxazol-3-carboxílico (0,45 g, 0,80 mmol) se acopló de manera cruzada a ácido 4-fluorofenilborónico (0,17 g, 1,5 equiv.) mediante el uso de las condiciones estándar descritas anteriormente. El producto bruto, un sólido naranja (0,40 g), se llevó a la siguiente etapa sin purificación

5 adicional.

LCMS (LCO) tR =8,70, MS miz 529,1 [M+Hf

C-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-il]-metilamina

BnO

A una disolución de amida de ácido 5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (0,40 g, 10 0,76 mmol) en THF anhidro (20 mi) bajo argón se le añadió complejo Borano 1 M-THF (1 mi) y la disolución se

sometió a reflujo durante la noche. Después de enfriar, la reacción se paró con metanol (10 mi) y el producto se purificó mediante el uso de una columna Isolute® SPE Flash SCX-2 5 9 para proporcionar 0,30 9 (77% de rendimiento) en forma de un polvo.

15

LCMS (LCO) tR = 7,54, MS miz 515,2 [M+Hf

HO

N-[5-(5-Cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-metanosulfonamida

Se disolvió C-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-il]-metilamina (100 mg, 0,19 mmol) en DCM (3 mi) antes de la adición de cloruro de metano sulfonilo (17 ¡JI, 1,1 equiv.) y trietilamina (30 ¡JI, 1,1 equiv.). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante la noche antes de evaporarla hasta sequedad a vacío, lo que

20 proporcionó el producto bruto protegido con bencilo en forma de un residuo de color azul (90 mg). Este se desprotegió mediante el uso del procedimiento estándar con tricloruro de boro descrito anteriormente y se purificó mediante CCF preparativa (10% de etanol en DCM), y la extracción Soxhlet de la sílice mediante éter proporcionó el compuesto puro en forma de un sólido prácticamente incoloro (8 mg, 10% de rendimiento).

LCMS (LCO) tR = 6,65, MS miz 411 ,2 [M-H]-

25 OH (d 4-MeOH), 7,19 (2H, m, Ar-H), 7,04 (1H, s, Ar-H), 7,03 (2H, m, Ar-H), 6,34 (1H, s, Ar-H), 4,27 (2H, s, CH2NH), 2,81 (3H, s, S02CH3).

HO

81

N-[5-(5-Cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-acetamida

A una disolución de C-[5-(2,4-bis-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-il]-metilamina (100 mg, 0,19 mmol) en DCM se le añadió anhídrido acético (130 !JI, 7,0 equiv.) y trietilamina (81 !JI, 3,0 equiv.). La disolución se agitó a temperatura ambiente hasta que se consumió la amina. El disolvente se eliminó a vacío para proporcionar el

5 producto aceitoso bruto protegido con bencilo teñido de amarillo. Este se desprotegió mediante el uso del procedimiento estándar con tricloruro de boro descrito anteriormente, y se purificó mediante CCF preparativa, y la extracción Soxhlet de la sílice mediante éter proporcionó el compuesto puro en forma de un sólido incoloro (10 mg, 14% de rendimiento).

LCMS (LCQ) tR =6,57, MS miz 377,1 [M+Hf

10 OH (d 4-MeOH), 7,17 (2H, m, Ar-H), 7,01 (1H, s, Ar-H), 6,98 (2H, m, Ar-H), 6,32 (1H, s, Ar-H), 4,37 (2H, s, CH2NH), 1,77 (3H, s, COCH3).

Ejemplos 83, 84 Y 85

Etilamida de ácido 5-(5-etil-4-hidroxi-2-metoxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (83); Etilamida de ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)isoxazol-3-carboxílico (84);

15 Etilamida de ácido 5-(5-etil-2,4-dimetoxifenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (85)

o

A un matraz cargado con argón que contenía etilamida de ácido 5-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (25 mg, 0,055 mmol) y N,N-(Diisopropil)aminometilpoliestireno [PS-DIEA] (35 mg, 3,83 mmol/g, 2,4 equiv.) se le añadió DCM anhidro (2,3 mi) y metanol anhidro (0,25 mi). Con una agitación suave, se

20 añadió (Trimetilsilil)diazometano 2 M en hexanos (28 !JI, 1,0 equiv.) y la disolución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se hizo burbujear argón a través de la disolución durante 10 mins, la resina se filtró, y los compuestos volátiles se eliminaron a vacío. El residuo bruto se purificó mediante HPLC semi-preparativa para proporcionar etilamida de ácido 5-(5-etil-4-hidroxi-2-metoxifenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (83) (5,52 mg, 21 %), etilamida de ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-

25 carboxílico (84) (1,14 mg, 4%), etilamida de ácido 5-(5-etil-2,4-dimetoxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (1,46 mg, 5%) y el material de partida sin metilar.

83: LCMS (LCT) tR = 4,95, MS miz 466,4 [M+Hf

84: LCMS (LCT) tR = 5,14, MS miz 466,4 [M+Hf

(85): LCMS (LCT) tR = 5,45, MS miz 480,4 [M+Hf

30 Los datos de RMN confirmaron las asignaciones.

Ejemplo 86

5-( 5-Clo ro-2-h id roxi -fe n i 1)-4-( 4-mo rfol i n-4-i Imeti I-fen i I)-isoxazo 1-3-carbo xam ida de eti lo

Etapa 1

35 2-Benzoiloxi-5-cloro-benzoato de metilo

82

Una mezcla de 5-cloro-2-hidroxi-benzoato de metilo (2,5 g, 13,4 mmol), K2C03 (3,7 g, 26,8 mmol) y bromuro de bencilo (2,98 g, 17,4 mmol) en acetona (30 mi) se sometió a reflujo durante 12 horas. Después de enfriar, se evaporó la acetona. Se añadió EtOAc (100 mi) y se filtró. La capa orgánica se lavó después con HCI1 M (1 x 80 mi),

5 salmuera (2 x 80 mi) y se secó con Na2S04. Tras la filtración y la evaporación del disolvente, se obtuvo un semisólido amarillo (3,2 g). 1H RMN (d6-acetona) Ó = 7,73 (1 H, d); 7,60 - 7,30 (1 H + 5H, m); 7,28 (1 H, d); 5,30 (2H, s) y 3,90 (3H, s).

10

Etapa 2

1-(2-Benciloxi-5-cloro-fen il)-2-(trifenil-A 5 -fosfan iliden)-etanona

C1

o

A una suspensión agitada de bromuro de trifenilfosfonio (2,14 g, 6,0 mmol) en THF seco (30 mi) a temperatura ambiente se le añadió n-BuLi 1,6 M en hexano (5,25 mi, 8,39 mmol). La suspensión naranja se agitó durante 3 horas. A continuación, se añadió lentamente una disolución de 2-benzoiloxi-5-cloro-benzoato de metilo (0,83 g, 3,0 mmol) en THF (8 mi). La mezcla resultante se agitó a 60 oC durante 2 horas y se filtró después de enfriarla. Se

15 añadió DCM (100 mi) al filtrado y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 80 mi). Tras la filtración y la evaporación del disolvente, se obtuvo un aceite amarillo (2,0 g). Después se purificaron mediante cromatografía, se eluyeron con EtOAc : hexano / 1 : 1, lo que proporcionó 0,97 9 de sólidos. R¡ = 0,43. 1 H RMN (d6-acetona) ó = 7,80 - 7,52 (20H, m); 7,40 - 7,20 (1 H + 1 H + 1 H, m); 5,25 (2H, s); 4,72 (1 H, s, trans-H) y 4,62 (1 H, s, cis-H). LCMS: (M+1f = 521,2 (RT = 5,94 min.)

20 Etapa 3

4-(2-Benciloxi-5-cloro-fenil)-2,4-dioxo-3-(trifenil-A5-fosfaniliden)-butirato de etilo

CI

COOE!

oaz o o

A una disolución de 1-(2-benciloxi-5-cloro-fenil)-2-(trifenil-A5-fosfaniliden)-etanona (0,49 g, 0,94 mmol), NEb (96 mg, 0,94 mmol) y DMAP (12 mg, 0,09 mmol) en tolueno seco (20 mi) a temperatura ambiente, se le añadió

25 clorooxoacetato de etilo (0,38 g, 2,78 mmol) en tolueno (5 mi). La mezcla se agitó durante 2 horas y se vertió en agua (50 mi). La capa orgánica se separó y la capa ac. se extrajo con EtOAc (2 x 40 mi). Las capas orgánicas combinadas se lavaron después con disolución sat. de NaHC03 (2 x 40 mi), ácido cítrico sat. (1 x 40 mi), salmuera ~1 x 40 mi) y se secaron. Se purificó el aceite bruto (0,36 g) mediante cromatografía, eluyendo con EtOAc. R¡ = 0,88. H RMN (d6-acetona) Ó = 7,75 - 7,40 (15H, m); 7,30 (1 H, dd); 7,15 (1 H, d); 7,05 (1 H, d); 5,10 (2H, s); 3,60 (2H, q) Y

30 1,10 (3H, s). LCMS: (M+1f = 621,2 (RT = 6,49 min.)

Etapa 4

3-(2-Benzoiloxi-5-cloro-benzoil)-3-bromo-3H-azirin-2-carboxilato de etilo

83

CI

A una disolución de 4-(2-benciloxi-5-cloro-fenil)-2,4-dioxo-3-(trifenil-A5-fosfaniliden)-butirato de etilo (0,143 g, 0,23 mmol) en DCM (8 mi) a temperatura ambiente, se le añadió una mezcla de TMSN3 (40 mg, 0,35 mmol) y NBS (62 mg, 0,35 mmol) en DCM (6 mi). La disolución resultante se agitó durante 2 horas. Tras la evaporación del disolvente,

5 el producto bruto se purificó mediante CCF preparativa. Se obtuvo un sólido amarillo (38 mg). Rr = 0,73 (EtOAc:hexano 1 :2). 1H RMN (d6-acetona) Ó = 7,80 (1 H, d); 7,60 (1 H, dd); 7,40 (5H, m), 7,30 (1 H, d); 5,20 (2H, s); 4,10 (2H, q) Y 1,00 (3H, t). LCMS: (M+1f = 438,0 (RT = 7,32 min.)

10

Etapa 5

5-(2-Benzoiloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxilato de etilo

CI

Se calentó a reflujo 3-(2-benzoiloxi-5-cloro-benzoil)-3-bromo-3H-azirin-2-carboxilato de etilo (55 mg, 0,12 mmol) en tolueno seco durante 2 horas. Tras la evaporación del disolvente, se obtuvo un sólido bruto (34 mg) y se purificó mediante CCF preparativa (EtOAc: hexano /1 : 2). R¡ = 0,73 (fluorescente). 1H RMN (d6-acetona) Ó = 7,60 (1H, d); 7,50 (1 H, dd); 7,40 (1 H, d); 7,30 (5H, m); 5,25 (2H, s); 4,42 (2H, q) Y 1,40 (3H, t). LCMS: (M+1f = 438,0 (RT = 7,09

15 min.)

Etapa 6

5-(2-Benciloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxamida de etilo

a

CONHEI

A una disolución de 5-(2-benzoiloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxilato de etilo (30 mg, 6,8 x 10-2 mmol) en 20 EtOH (1 mi), se le añadió etilamina (70 % en agua, 1 mi). La disolución se calentó a 100 oC en un reactor de

microondas CEM® (200 W) durante una hora. Tras ello, el disolvente se evaporó y el compuesto se purificó mediante CCF preparativa para proporcionar un sólido (20 mg). R¡ = 0,39 (EtOAc: hexano / 1 : 4). 1H RMN (d6-acetona) Ó = 8,10 (1H, s, ancho); 7,50 (1H, d); 7,45 -7,35 (1H + 1H, m); 7,25 (5H, m); 5,20 (2H, s); 3,40 (2H, q) Y 1,20 (3H, t). LCMS: (M+1f = 437,1 (RT = 6,57 min.)

25 Etapa 7

5-(2-Benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfeni1)-isoxazol-3-carboxamida de etilo

84

Una mezcla de 5-(2-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxamida de etilo (30 mg, 5,6 x 10-2 mmol), Pd(Ph3P)4 (4 mg, 3,5 x 10-2 mmol), 4[4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1 ,3,2]dioxaborolan-2-il)-bencil]morfolina (63 mg, 0,2 mmol) y disolución de NaHC03 1 M (0,2 mi) en DME (1 mi) se agitó a 80 oC bajo gas argón durante 16 horas. Después de enfriar, la disolución se diluyó con agua (8 mi) y se extrajo con EtOAc (2 x 20 mi). Las capas orgánicas

5 combinadas se lavaron con salmuera (1 x 20 mi) y se secaron. Tras la filtración y evaporación de los disolventes, el producto bruto se purificó mediante CCF preparativa, lo que proporcionó 30 mg de sólido. R¡ = 0,44 (EtOAc). 1H RMN (d6-acetona) Ó = 8,25 (1 H, s, ancho); 7,60 (1 H, d); 7,55 (1 H, dd); 7,45 (1 H, d); 7,30 - 6,90 (9H, m); 5,00 (2H, s); 3,55 (4H, m); 3,45 (2H + 2H, s + q); 2,30 (4H, m) y 1,20 (3H, t). LCMS: (M+1f = 532,2 (RT = 4,39 min.)

Etapa 8

10 5-( 5-Cloro-2-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fen il)isoxazol-3-carboxamida de etilo

CONHEt

A una disolución de 5-(2-benciloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxamida de etilo (25 mg, 4,7 x 10-2 mmol) en DCM (5 mi) a O oC, se le añadió 8Cb 1 M en DCM (0,15 mi). La disolución amarilla turbia resultante se agitó después a O oC durante 15 minutos y a temperatura ambiente 3 a 4 horas hasta que se aclaró.

15 Después, la disolución se diluyó con MeOH (1 mi). Después se añadió NaHC03 sat. (1 mi) y se extrajo con EtOAc (2 x 2 mi) y se secó. Después el disolvente se filtró y se evaporó, el aceite bruto se purificó mediante CCF preparativa (EtOAc: MeOH /50: 1), lo que proporcionó 12 mg de sólido. 1H RMN (d4-MeOD) Ó = 7,60 (2H, d); 7,50 - 7,30 (1H + 1 H + 1 H, m); 7,00 (2H, d); 3,70 (4H, m); 3,60 (2H, s); 3,50 (2H, q); 2,60 (4H, m) y 1,25 (3H, t). LCMS: (M+1f = 442,2 (RT = 3,54 min.)

20 El isómero 4-hidroxi se preparó de una manera similar a la de su homólogo 2-hidroxi como sigue:

Ejemplo 87

5-(3-Cloro-4-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)isoxazol-3-carboxamida de etilo

Etapa 1

25 4-Benzoiloxi-3-cloro-benzoato de metilo

3-Cloro-4-hidroxi-benzoato de metilo (1,0 g, 5,36 mmol) proporcionó un sólido bruto (1,57 g). 1H RMN (d6-acetona) Ó

= 8,00 (1 H, d); 7,95 (1 H, dd); 7,60 - 7,40 (5H, m); 7,35 (1 H, d); 5,40 (2H, s) y 3,90 (3H, s).

Etapa 2

30 1-( 4-Benciloxi-3-cloro-fen il)-2-(trifenil-A 5 -fosfan iliden)-etanona

85

el

4-Benzoiloxi-3-cloro-benzoato de metilo (1,5 g, 5,40 mmol) proporcionó un sólido bruto (2,5 g). Rf = 0,31 (EtOAc : hexano / 1 : 1). 1 H RMN (d6-acetona) Ó = 8,05 (1 H, d); 7,90 (1 H, dd); 7,85 - 7,35 (20H, m); 7,20 (1 H, d); 5,30 (2H, s); 4,60 (1 H, s, trans-H) y 4,50 (1 H, s, cis-H). LCMS: (M+1f = 521,2 (RT = 5,29 min.)

5 Etapa 3

4-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-2,4-dioxo-3-(trifenil-J...5-fosfaniliden)-butirato de etilo

~~ ~.h ~oo

o o

1-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-2-(trifenil-A5-fosfaniliden)-etanona (1,84 g, 3,53 mmol) proporcionó un sólido bruto (1,43 g). 1H RMN (d6-acetona) Ó = 8,00 - 7,35 (22H, m); 7,20 (1H, d); 5,35 (2H, s); 3,55 (2H, q) Y 1,14 (3H, s). LCMS:

10 (M+1f = 621,2 (RT = 7,29 min.)

Etapa 4

3-(4-Benzoiloxi-3-cloro-benzoil)-3-bromo-3H-azirin-2-carboxilato de etilo

B~~ Br,

~ o

4-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-2,4-dioxo-3-(trifenil-A 5 -fosfaniliden)-butirato de etilo (0,74 g, 1,19 mmol) proporcionó un 15 sólido (0,168 g) tras purificación en columna y CCF preparativa. R¡= 0,24 (EtOAc : hexano / 1 : 6). 1 H RMN (d6-

acetona) ó = 8,00 (1 H, d); 7,90 (1 H, dd); 7,50 (1 H, d); 7,40 (5H, m); 5,40 (2H, s); 4,05 (2H, q) Y 0,95 (3H, t). LCMS: (M+1f = 438,1 (RT = 7,27 min.)

20

Etapa 5

5-(4-Benzoiloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxilato de etilo

CI

B.o Br

CDDE.

3-(4-Benzoiloxi-3-cloro-benzoil)-3-bromo-3H-azirin-2-carboxilato de etilo (68 mg, 0,16 mmol) proporcionó un sólido (20 mg) tras CCF preparativa y cristalización (EtOH). R¡ = 0,26 (fluorescente) (EtOAc: hexano /1 : 4). 1H RMN (d6-acetona) ó = 8,00 (1 H, d); 7,90 (1 H, dd); 7,50 (1 H, d); 7,40 (5H, m); 5,35 (2H, s); 4,45 (2H, q) Y 1,40 (3H, t). LCMS: (M+1f = 438,0 (RT = 7,39 min.)

25 Etapa 6

5-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxamida de etilo

86

CI

BzO

CONHEt

5-(4-Benzoiloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxilato de etilo (10 mg, 2,3 x 10-2 mmol) proporcionó un sólido bruto (8 mg). R¡ = 0,53 (EtOAc: hexano / 1 : 2). 1 H RMN (d6-acetona) Ó = 8,15 (1 H, s, ancho); 8,00 (1 H, d); 7,90 (1 H, dd); 7,50 (1 H, d); 7,40 (5H, m); 5,32 (2H, s); 3,42 (2H, q) Y 1,20 (3H, t).

5 Etapa 7

5-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfeni1)-isoxazol-3-carboxamida de etilo

5-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxamida de etilo (10 mg, 2,3 x 10-2 mmol) proporcionó un sólido bruto (10 mg), que se usó después en la siguiente etapa sin purificación adicional.

10 Etapa 8

5-(3-Cloro-4-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-feni1)-isoxazol-3-carboxamida de etilo

5-(4-Benciloxi-3-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-feni1)-isoxazol-3-carboxamida de etilo (8 mg, 1,5 x 10-2 mmol) proporcionó un sólido bruto (2 mg) después de purificarla dos veces mediante CCF preparativa (EtOAc: MeOH / 50 :

15 1). 1H RMN (d4-MeOD) Ó = 7,70 (2H, d); 7,60 (1H, d); 7,45 (1H + 1H, m); 7,00 (2H, d); 3,80 (4H, m); 3,75 (2H, s); 3,50 (2H, q); 2,82 (4H, m) y 1,25 (3H, t). LCMS: (M+1f = 442,2 (RT = 4,47 min.)

Ejemplo 88

3-[4-(4-Bromo-fenil)-isoxazol-5-il]-5-cloro-2,6-dihidroxibenzaldehído

Bt

20 Etapa 1

3-(4-Bromo-fenil)-6-cloro-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-8-carbaldehído

87

Sr

CHO

Se disolvió 3-(4-bromo-fenil)-6-cloro-7-hidroxi-cromen-4-ona (0,35 g, 1 mmol) y hexametilentetramina (0,14 g, 1 mmol) en ácido acético glacial (20 mi) y se calentó durante la noche a 100 oC. Se añadió HCI 6 M caliente (10 mi) y la mezcla se calentó durante otra hora antes verterla en agua. El precipitado formado se filtró, se lavó y se secó para

5 proporcionar el producto deseado puro en forma de un sólido marrón pálido.

LCMS (LCQ) tR = 8,27, MS miz 377,3 / 379,2 [M-Hr

Etapa 2

3-[4-(4-Bromo-fenil)-isoxazol-5-il]-5-cloro-2,6-dihidroxibenzaldehído

Bf

a

OH

10 A una disolución de 3-(4-bromo-fenil)-6-cloro-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-8-carbaldehído (53,5 mg, 0,14 mmol) en EtOH (6 mi), se le añadió hidrocloruro de hidroxilamina (100 mg, 1,4 mmol). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 16 horas. El EtOH se evaporó y se añadió EtOAc (20 mi). La capa orgánica se lavó con NaHC03 sat. y se secó. Se obtuvo un sólido (33 mg) cuando el aceite resultante se trituró con éter. 1 H RMN (d6-DMSO) Ó = 9,83 (1 H, s); 8,70 (1H, s); 8,21 (1H, s); 7,78 (2H, d) Y 7,68 (2H, s). LCMS: (M+1f = 394,1 (RT = 8,60 min.)

15 Ejemplo 89

20

25

Hidroxiamida de ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

MeO

Etapa 1

1-( 5-Etil-2,4-d ihid roxi-fenil)-2-(4-fluoro-fenil)-etanona

HO

F

Se disolvió etil resorcinol (5,37 g, 39 mmol) y ácido 4-fluorofenilacético (6,00 g, 39 mmol) en eterato - SF3 (40 mi). La disolución se calentó a 80 oC durante 4 horas. Cuando se enfrió, se añadió agua (100 mi) cuidadosamente y la disolución se extrajo con EtOAc (2 x 80 mi). Las capas orgánicas se lavaron después con NaHC03 sat. (precaución) (2 x 100 mi) y salmuera (2 x 100 mi), y se secaron con Na2S04. Tras la purificación con carbón decolorante, se obtuvo un jarabe verde oscuro (10,5 g). R¡ = 0,4 (EtOAc:n-hexano / 1 :3). El compuesto se usó en la siguiente etapa

88

sin purificación adicional. 1H RMN (d6-acetona) Ó = 7,80 (1 H, s); 7,35 (2H, m); 7,00 (1 H, m); 6,35 (1 H, s); 4,35 (2H, s); 2,55 (2H, q) Y 1,10 (3H, t).

Etapa 2

Éster etílico de ácido 4-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-3-(4-fluoro-fenil)-2,4-dioxo-butírico

HO

OH 5 F

A una disolución de 1-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-2-(4-fluoro-fenil)-etanona (10,3 g, 37,6 mmol) en piridina seca (100 mi) a O oC se le añadió clorooxoacetato de etilo (15,4 g, 112,8 mmol). La disolución se agitó a O oC durante 4 horas y a temperatura ambiente durante 16 horas. La capa ac. se neutralizó con HCI 1 M Y se extrajo con DCM (2 x 100 mi). Las capas de DCM combinadas se lavaron después con HCI 2 M (2 x 80 mi), NaHC03 sat. (1 x 100 mi), salmuera (1

10 x 100 mi) y se secaron con Na2S04. Tras la filtración y la evaporación del disolvente, se obtuvo un aceite marrón oscuro (11,4 g). R¡ = 0,22 (EtOAc:n-hexano / 1 :2). La LCMS demuestra que es una mezcla del producto deseado [(M-1r = 373,1, RT = 7,27) Y el carboxilato de cromeno ciclado [(M-1r = 355,4, RT = 7,83) en una proporción de aprox.6 : 1. Se purificó una pequeña cantidad de muestra mediante CCF prep. para el análisis espectroscópico. 1H RMN (d6-acetona) Ó = 7,75 (1 H, s); 7,30 (2H, m); 7,00 (1 H, m); 6,45 (1 H, s); 4,65 (1 H, s); 4,25 (2H, q); 2,55 (2H, q) Y

15 1,10 (6H,t)

Etapa 3

Éster etílico de ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7 -hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico

Se sometió a reflujo éster etílico de ácido 4-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-3-(4-fluoro-fenil)-2,4-dioxo-butírico (3,22 g, 8,6 20 mmol) en una mezcla de HCI 0,8 M Y MeOH (20 mi / 20 mi) durante 3 horas a 100 oC. Tras ello, se evaporó el MeOH

y la capa ac. se extrajo con EtOAc (2 x 60 mi). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaHC03 sat. (1 x 80 mi), salmuera (2 x 80 mi), agua (1 x 80 mi) y se secaron con Na2S04. Tras la purificación con carbón decolorante y la evaporación del disolvente, se obtuvo un sólido marrón pegajoso. Después se extrajo con éter caliente, y se obtuvo un sólido amarillo oscuro (0,26 g). R¡ = 0,43 (EtOAc:n-hexano /1 :2). LCMS: (M + 1f = 357,3 (RT = 7,83). 1H RMN

25 (d6-acetona) Ó = 9,75 (1 H, s); 7,80 (1 H, s); 7,25 (2H, m); 7,10 (1 H, m); 6,90 (1 H, s); 4,05 (2H, q); 2,70 (2H, q); 1,20 (3H, t) Y 0,95 (3H, t).

Etapa 4

Éster etílico de ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7 -metoxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico

F

30 Se añadió yodometano (0,10 mi, 12 equiv.) a una disolución de éster etílico de ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico (50 mg, 0,14 mmol) y carbonato potásico (58 mg, 3,0 equiv.) en acetona, y la mezcla se sometió a reflujo durante la noche. Después se evaporaron los compuestos volátiles a vacío y el residuo se repartió entre agua (15 mi) y EtOAc (15 mi). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 y se evaporó hasta sequedad a vacío para proporcionar un producto cristalino blanco (45 mg, 87% de rendimiento)

89

5

OH (CDCi3), 7,96 (1H, s, Ar-H), 7,27 (2H, m, Ar-H), 7,12 (2H, m, Ar-H), 6,92 (1H, s, Ar-H), 4,16 (2H, q, C02CH2CH3), 3,95 (3H, s, OCH3), 2,71 (3H, q, CH2CH3), 1,24 (3H, t, C02CH2CH3), 1,04 (3H, t, CH2CH3)

Etapa 5

Hidroxiamida de ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

A éster etílico de ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7-metoxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico (25 mg, 0,068 mmol) en etanol (2,5 mi) se le añadió hidroxilamina (50% en agua, 1 mi) y la disolución se agitó durante 48 h. Los compuestos volátiles se evaporaron a vacío y el residuo se purificó mediante CCF preparativa (10% de MeOH en DCM) para proporcionar el producto deseado en forma de un sólido marrón claro (3 mg, 12% de rendimiento).

10 LCMS (LCT) tR = 6,54, MS miz 373,17 [M+Hf

15

OH (d6-Acetona), 10,73 (1 H, s ancho), 8,59 (1 H, s ancho), 7,39 (2H, m, Ar-H), 7,07 (2H, m, Ar-H), 7,00 (1 H, s, Ar-H), 6,55 (1 H, s, Ar-H), 3,82 (3H, s, OCH3), 2,48 (2H, q, CH2CH3), 1,30 (1 H, s ancho), 1,01 (3H, t, CH2CH3).

Ejemplo 90

Hidroxiamida de ácido 5-(5-etil-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

HO

A éster etílico de ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico (25 mg, 0,070 mmol) en etanol (2,5 mi) se le añadió hidroxilamina (50% en agua, 1 mi) y la disolución se agitó durante 48 h. Los compuestos volátiles se evaporaron a vacío y el residuo se purificó mediante CCF preparativa (15% de MeOH en DCM) para proporcionar el producto deseado en forma de un sólido marrón (2 mg, 8% de rendimiento).

20 LCMS (LCT) tR = 5,63, MS miz 359,13 [M+Hf

OH (d6-Acetona), 10,72 (1 H, s ancho, CONH), 8,69 (1 H, s ancho, Ar-OH), 8,59 (1 H, s ancho, Ar-OH), 7,39 (2H, m, ArH), 7,06 (2H, m, Ar-H), 6,99 (1 H, s, Ar-H), 6,52 (1 H, s, Ar-H), 2,49 (2H, q, CH2CH3), 1,31 (1 H, s ancho), 1,08 (3H, t, CH2CH3).

25 Resultados Biológicos

La actividad ATPasa intrínseca de HSP90 se puede medir mediante el uso de HSP90 de levadura como sistema modelo. El ensayo, basado en el uso de verde malaquita para la medida del fosfato inorgánico, se usó para ensayar la actividad inhibitoria de HSP90 de algunos de los compuestos de los Ejemplos de la presente memoria.

Ensayo de ATPasa con Verde Malaquita

30 Materiales

Los productos químicos son de la pureza más alta disponible comercialmente, y todas las disoluciones acuosas se producen en agua AR. Debido a la necesidad de minimizar la contaminación con fosfato inorgánico, se deberían tomar precauciones con las disoluciones y los aparatos utilizados en los ensayos. El material de vidrio y los pHmetros se lavan con agua doblemente destilada o desionizada antes del uso, y, cuando sea posible, se debería

35 usar material de plástico. Se usan guantes para todos los procedimientos.

(1) Placas multipocillo de poliestireno de fondo plano de 384 pocillos Greiner (Greiner 781101) o de 384 pocillos

90

Costar (VWR).

(2) Tampón de ensayo de (a) Tris-HCI 100 mM, pH 7,4, (b) KCI 150 mM, (c) MgCI2 6 mM. Almacenado a temperatura ambiente.

(3) Verde malaquita del 0,0812% (p/v) (M 9636, Sigma Aldrich Ud., Poole, RU.). Almacenado a temperatura 5 ambiente.

(4) Poli(alcohol vinilico) al 2,32% (p/v) USP (P 1097, Sigma Aldrich Ud, Poole, RU.) en agua en ebullición (véase el Comentario 1), dejado enfriar, y almacenado a temperatura ambiente.

(5) Molibdato de amonio al 5,72% (p/v) en ácido clorhidrico 6 M. Almacenado a temperatura ambiente.

(6) Citrato sódico del 34% (p/v). Almacenado a temperatura ambiente.

10 (7) ATP 100 mM, sal disódica, calidad especial (47699, Sigma Aldrich). Almacenado a -20 oC.

(8) Proteina HSP90 de levadura expresada en E. coli, purificada >95% (véase, p.ej., Panaretou et al., 1998) y almacenada en alícuotas de 50 uL a -80 oC.

1. Diluir los compuestos de ensayo hasta 500 !-1M en agua AR (la concentración de DMSO será del 2,5%). 15 Transferir 2,5 1-11 de estos compuestos directamente desde la placa hija a la placa de ensayo, proporcionando

una concentración de ensayo final de 100 fJM. Para obtener valores de CI50 de 12 puntos, se llevan a cabo diluciones en serie 1:2 para producir un intervalo de concentraciones de ensayo de 100 !-1M a 97,6 nM (2,5% de DMSO), y se transfieren 2,5 1-11 de cada concentración a la placa de ensayo. La columna 1 de la placa de ensayo no contiene compuesto, como control negativo. También se usa una fila adicional sin compuesto como

20 valor de fondo.

25

30

35

40

2. Preparar ATP diluyendo una disolución de reserva 100 mM hasta 925 I-IM con tampón de ensayo, y poner una alícuota de 5 1-11 de ATP diluido en cada pocillo, incluyendo los controles (concentración final de ensayo 370 ~M).

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

Añadir 5 ~I de tampón a la fila de valor de fondo.

Diluir la preparación de enzima hasta 1,05 I-IM con tampón de ensayo, y poner una alícuota de 5 1-11 en cada pocillo de compuesto y en la columna de control negativo.

Colocar los reactivos en el fondo del pocillo, cubrir la placa con un sellador de placas e incubar durante la noche a 37 oC.

En primer lugar por la mañana preparar el Reactivo de Verde Malaquita. Añadir 2 partes de Disolución de Verde Malaquita, 1 parte de Disolución de Poli(alcohol vinílico), 1 parte de Disolución de Molibdato de Amonio, y 2 partes de agua AR

Invertir para mezclar, y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora hasta que el color cambie de marrón a amarillo dorado.

Añadir 401-11 de Reactivo de Verde Malaquita a cada pocillo, dejando 5 mins para que se desarrolle el color.

Añadir 51-11 de Reactivo de Citrato Sódico a cada pocillo (véase el comentario 2)

Volver a cubrir con un sellador de placas y agitar en un agitador de placas durante al menos 15 mins.

Medir la absorbancia a 620 nM mediante el uso de un lector de placas adecuado (p.ej. Victor, Perkin Elmer Life Sciences, Milton Keynes, R.U.). En estas condiciones, la absorbancia del control es 0,9 a 1,4, Y el valor de fondo es 0,2-0,35, lo que da una proporción de señal respecto de ruido de -12. El factor Z' calculado a partir de los datos obtenidos mediante el uso de estas condiciones está entre 0,6 y 0,9.

Comentarios

(1) El poli(alcohol vinílico) se disuelve en agua en ebullición con dificultad, y es necesario agitar durante 2-3 h.

(2) El intervalo de tiempo entre la adición del reactivo de verde malaquita y el citrato sódico se debería mantener tan corto como sea posible para reducir la hidrólisis no enzimática del ATP. Una vez que se añade citrato

45 sódico, el color es estable durante hasta 4 h a temperatura ambiente.

(3) Los compuestos se pueden añadir a las placas de ensayo mediante el uso de un Robot Biomek FX (Beckman Coulter). Se puede usar de manera conveniente un dispensador Multidrop 384 (Thermo Labsystems,

91

Basingstoke, R.U.) para añadir los reactivos a la placa.

(4) Las condiciones de ensayo se optimizaron con respecto al tiempo, la concentración de proteína y de sustrato para alcanzar una concentración de proteína mínima a la vez que se mantenía el diferencial de señal respecto del ruido.

5 (5) La señal respecto del ruido (S/N) se calcula mediante el uso de la ecuación siguiente:

(S-B)/~(SD de S)2 + (SD de B)2

(6) Para determinar la actividad específica de HSP90, se prepara un intervalo de concentraciones de fosfato inorgánico (0-10 I-IM) Y se mide la absorbancia a 620 nm como se ha descrito. La actividad específica se

10 calcula a partir de la curva de calibración resultante.

Los compuestos ensayados en el ensayo anterior se asignaron a uno de dos intervalos de actividad, concretamente A = <50 I-IM; B = >50 I-IM, Y esas asignaciones se informaron anteriormente.

También se empleó un ensayo de inhibición del crecimiento para el estudio de los inhibidores de HSP90 candidatos:

Determinación de la citotoxicidad mediante ensayo de Sulforrodamina B (SRB): cálculo de la concentración 15 inhibitoria del 50% (CI 50).

20

Dia 1

1)

2)

3)

Dia2

Determinar el número de células mediante un hemocitómetro.

Mediante el uso de una multipipeta de 8 canales, añadir 160 1-11 de la suspensión de células (3600 células/pocillo o 2 x 104 células/mi) a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos.

Incubar durante la noche a 37 oC en un incubador de CO 2.

4) Se preparan disoluciones de reserva de los fármacos, y se llevan a cabo diluciones en serie de cada fármaco en medio para proporcionar las concentraciones finales en los pocillos.

5) Mediante el uso de una multipipeta, se añaden 40 1-11 de fármaco (a concentración final 5x) a pocillos 25 cuadruplicados.

6) Los pocillos de control están a cada lado de las placas de 96 pocillos, en los que se añaden 40 1-11 de medio.

7) Incubar las placas en un incubador de CO 2 durante 4 dias (48 horas).

Dia6

8) Desechar el medio y sumergir la placa lentamente en un 10% de ácido tricloroacético (TCA) helado. Dejarlo 30 durante alrededor de 30 mins en el hielo.

9) Lavar las placas tres veces en agua del grifo sumergiendo las placas en baños de agua del grifo y eliminarla mediante una pipeta.

10) Secar en un incubador.

11) Añadir 100 ~I de SRB del 0,4% en ácido acético del1% a cada pocillo (excepto la última fila (lado derecho) de 35 la placa de 96 pocillos, esta es el control del 0%, es decir, sin fármaco, sin tinción. La primera fila será el control

del 100% sin fármaco, pero con tinción). Dejarlo durante 15 mins.

12) Eliminar mediante lavado la tinción SRB sin unir con cuatro lavados de ácido acético deI1%.

13) Secar las placas en un incubador.

14) Solubilizar SRB mediante el uso de 100 ~I de Tris-base 10 mM y poner las placas en un agitador de placas 40 durante 5 mins.

15) Determinar la absorbancia a 540 nm mediante el uso de un lector de placas. Calcular la absorbancia media para los pocillos cuadruplicados y expresarla como un porcentaje del valor de los pocillos de control sin tratar.

16) Trazar los valores de % de absorbancia frente allog. de la concentración de fármaco y determinar la C15o.

92

A modo de ilustración, el compuesto del Ejemplo 2 proporcionó una CI50 en el intervalo 'A' «50 uM) para el ensayo de detención del crecimiento con SRB.

También se empleó un ensayo de Polarización de Fluorescencia para el estudio de algunos de los compuestos de los Ejemplos:

5 Ensayo de Polarización de Fluorescencia

La polarización de fluorescencia {también conocida como anisotropía de fluorescencia} mide la rotación de una especie fluorescente en disolución, en la que cuanto más grande sea la molécula más polarizada estará la emisión de fluorescencia.

Cuando el fluoróforo se excita con luz polarizada, la luz emitida también está polarizada. El tamaño molecular es 10 proporcional a la polarización de la emisión de fluorescencia.

La sonda marcada con fluoresceína - RBT0045864-FAM -

se une a HSP90 { humano de longitud completa, de levadura de longitud completa o del dominio N-terminal de HSP90 } y se mide la anisotropía {rotación del complejo sonda:proteína}.

15 El compuesto de ensayo se añade a la placa de ensayo, se deja equilibrar y la anisotropía se mide de nuevo. Cualquier cambio de la anisotropía es debido a la unión competitiva del compuesto a HSP90, lo que libera la sonda.

Materiales

Los productos químicos son de la pureza más alta disponible comercialmente, y todas las disoluciones acuosas se producen en agua AR.

20 1) Placa de ensayo negra de 96 pocillos Costar nO 3915

2) Tampón de ensayo de (a) Tris 100 mM de pH 7,4; (b) KCI 20 mM; (c) MgCb 6 mM. Almacenado a temperatura ambiente.

3) BSA (albúmina de suero bovino) de 10 mglml (New England Biolabs nO B9001 S)

4) Sonda 20 mM en 100 % de concentración de reserva en DMSO. Almacenado en la oscuridad a TA. La 25 concentración de trabajo es 200 nM diluido en agua AR y almacenado a 4 oC. Concentración final en el ensayo

80nM.

5) Proteína HSP90 humana de longitud completa expresada en E. coli, purificada >95% (véase, p.ej., Panaretou et al., 1998) Y almacenada en alícuotas de 50 ¡JL a -80 oC.

Protocolo

30 1) Añadir 100 ¡JI de tampón 1 x a los pocillos 11 A Y 12A (=Blanco de PF)

2) Preparar la mezcla de ensayo - todos los reactivos se mantienen en hielo con una tapa sobre el recipiente, ya que la sonda es sensible a la luz.

Tampón de FP 1x de Hsp90

10 mglml de BSA (NEB)

Sonda 200 ¡JM

Hsp90 humano de longitud completa

93

i. Conc Finaln

10 mi

5,0 ¡JI

4,0 ¡JI

6,25 ¡JI

1x

5 ¡Jg/ml

80 nM

200 nM

3) Alicuotar 100 1-11 de mezcla de ensayo en todos los demás pocillos

4) Sellar la placa y dejarla en la oscuridad a temp. ambiente durante 20 minutos para equilibrarla

Placa de Dilución de Compuestos - serie de diluciones 1 x 3

1) En una placa de fondo en v de 96 pocillos claros - {n' VVVR 007/008/257} añadir 1 O ~I de DMSO del 100% a los 5 pocillos B1 a H11

2) A los pocillosA1 a A11 añadirles 17,5 ~I de DMSO del 100%

3) Añadir 2,5 ~I de comp. a A1. Esto proporciona comp. de reserva 2,5 mM {5Ox} - suponiendo comp. 20 mM.

4) Repetir para los pocillos A2 a A1 O. Control en las columnas 11 y 12.

5) Transferir 5 ~I de la fila A a la fila B - no a la columna 12. Mezclar bien.

10 6) Transferir 5 ~I de la fila B a la fila C. Mezclar bien.

7} Repetir para la fila G.

8) No añadir compuesto a la fila H - esta es la fila O.

9) Esto produce una serie de diluciones 1x3 desde 50 ~M hasta 0,07 ~M.

10) En el pocillo B12 preparar 20 ~I de compuesto patrón 100 ~M.

15 11) Tras la primera incubación, la placa de ensayo se lee en un lector de placas Fusión™ a-FP (Packard BioScience, Pangboume, Berkshire, R.U.).

12) Tras la primera lectura, se añaden 2 1-11 de compuesto diluido a cada pocillo para las columnas 1 a 10. En la columna 11 {proporciona la curva patrón} solamente añadir el compuesto en B11 - H11. Añadir 2 1-11 de comp. patrón 100 mM a los pocillos B12 - H12 {es el control positivo}

20 13) El factor Z' se calcula a partir de los controles de valor cero y los pocillos positivos. Generalmente proporciona

25

un valor de 0,7 - 0,9.

Los compuestos ensayados en el ensayo anterior se asignaron a uno de dos intervalos de actividad, concretamente A = <10 I-IM; B = >10 I-IM, Y esas asignaciones se informaron anteriormente. A modo de ilustración, el compuesto del Ejemplo 2 proporcionó una CI50 en el intervalo 'A'.

94

REFERENCIAS

Anteriormente se citaron varias publicaciones para describir y revelar de manera más completa la invención y el estado de la técnica a la que pertenece la invención. A continuación se proporcionan las citas completas de estas referencias.

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97

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (A) o (B) o una sal, N-óxido, hidrato o solvato del mismo:

(A) (B)

en la que

5 R1 es un grupo de fórmula (lB)

R

Q_(Alk2).-(Z),-(Alkl)~ OH


R representa uno o más sustituyentes opcionales,

(lB)

Alk1 y Alk2 son radicales alquileno C1-C6 o alquenileno C2-C6 divalentes sustituidos opcionalmente,

10 p, r y s son independientemente O ó 1 ,

15

Z es -0-, -S-, -(C=O)-, -(C=S)-, -S02-, -C(=O)O-, -C(=O)NRA-, -C(=S)NRA-, -S02NRA-, -NRAC(=O)-, -NRAS02- o _NRA_ en las que RA es hidrógeno o alquilo C1-C6, y

Q es hidrógeno o un radical carbocíclico o heterocíclico sustituido opcionalmente;

R2 es (i) un grupo de fórmula (lA):

-Ar 1_(Alk 1) p-(Z), -(Alk2)s-Q (lA)


Ar1 es un radical arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, y

Alk\ Alk2, p, r, s, Z, RA y Q son como se definen en relación con R1;

(ii) un radical carboxamida; o

20 (iii) un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático en el que un carbono del anillo está sustituido opcionalmente, y/o un nitrógeno del anillo está sustituido opcionalmente con un grupo de fórmula -(Alk 1)P-(Z)r (Alk2)s-Q en la que Q, Alk\ Alk2, Z, p, r y s son como se definieron anteriormente en relación con el grupo (lA); y

R3 es un grupo carboxilo, carboxamida o éster de carboxilo,

25 la expresión "sustituido opcionalmente" significa sustituido con hasta cuatro sustituyentes compatibles, y cada uno de los cuales se selecciona independientemente de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6), hidroxi, hidroxialquilo (C1-C6), mercapto, mercaptoalquilo (C1-C6), alquiltio (C1-C6), halógeno (que incluye fluoro, bromo y cloro), trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, fenilo, -COOH, -COORA, -CORA, -S02RA, -CONH2, -S02NH2, -CONHRA, -S02NHRA, -CONRARB, -S02NRARB, -NH2, -NHRA, _NRARB, -OCONH2, -OCONHRA, -OCONRARB, -NHCORA, -

30 NHCOORA, -NRBCOORA, -NHS020RA, -NRBS020H, -NRBSO~ORA, -NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHRB, -NRACONHRB, -NHCONRARB, o -NRACONRARB en las que RA y R son independientemente un grupo alquilo (C1-C6), y

el término "carboxamida" significa un grupo de fórmula -CONH2 o un grupo metilaminocarbonilo, etilaminocarbonilo o isopropilamino carbonilo, o un grupo de fórmula -CONRB(Alk)nRA en la que

98

Alk es un radical alquileno, alquenileno o alquinileno divalente sustituido opcionalmente,

nesOó1,

RB es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C6 o alquenilo Cr C6,

RA es hidroxi o carbocíclico o heterociclilo sustituido opcionalmente,

5 o RA y RB junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo N-heterocíclico que puede contener opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados de O, S Y N, Y que pueden estar sustituidos opcionalmente en uno o más átomos de C o N del anillo.

2. Un compuesto según la reivindicación 1 en el que R3 es un grupo carboxamida.

3. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que el compuesto es uno de fórmula (A).

10 4. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el átomo de carbono del anillo adyacente al grupo hidroxilo en el radical (lB) está sin sustituir.

5. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que, en R1, cada uno de p, r y s es O, y Q es hidrógeno.

6. Un compuesto según la reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 cuando sean dependientes 15 de la reivindicación 2, en el que R1 es fenilo sustituido opcionalmente, en el que la expresión "sustituido

opcionalmente" tiene el significado definido en la reivindicación 1.

7. Un compuesto según la reivindicación 5 en el que R1 es 2-hidroxifenilo, sustituido opcionalmente además con uno o más de hidroxi, metilo, etilo, metoxi, etoxi, cloro, o bromo.

8. Un compuesto según la reivindicación 5 en el que R1 es 2,4-dihidroxifenilo, sustituido en la posición 5 con 20 metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo, cloro, o bromo.

9. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que, en R1, p, r y s son cada uno O, y Q es un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido opcionalmente, en el que la expresión "sustituido opcionalmente" tiene el significado definido en la reivindicación 1.

10. Un compuesto según la reivindicación 9 en el que Q es un anillo fenilo o piridilo sustituido opcionalmente, en el 25 que la expresión "sustituido opcionalmente" tiene el significado definido en la reivindicación 1.

11. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que, en R1, p y/o s son cada uno 1 y res O.

12. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que, en R1, cada uno de p, r, y s es 1.

13. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que, en R1, P Y s son cada uno O y res 1.

14. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que R2 es 2-, 3-, o 4-piridilo, 2- o 3-30 furanilo, 2- o 3-tienilo, o tiazolilo sustituidos opcionalmente, en el que la expresión "sustituidos opcionalmente" tiene

el significado definido en la reivindicación 1

15. Un compuesto según la reivindicación 14 en el que los sustituyentes opcionales presentes en R2 se seleccionan de metoxi, etoxi, metilendioxi, etilendioxi, fluoro, cloro, bromo, y trifluorometilo.

16. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el que R2 es fenilo sustituido en la posición 4 35 con metoxi, etoxi, fluoro, cloro, bromo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, o piperidinilo.

17. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que R2 tiene la estructura parcial:

en la que el grupo amino sustituido _NR10R11 se selecciona de morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropilamino, dietilamino, ciclohexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-

40 acetilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, dióxido de tiomorfolinilo, 4-hidroxietilpiperidinilo, y 4-hidroxipiperidinilo.

99

18. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17 en el que R3 es etilaminocarbonilo o isopropilaminocarbonilo.

19. Un compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula (ID), o el regioisómero de fórmula B del mismo,

HO

(ID)

5 en la que cada R representa independientemente un sustituyente opcional seleccionado de los sustituyentes opcionales como se definieron en la reivindicación 1 y R3 representa un grupo carboxamida como se definió en la reivindicación 1.

20. Un compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula (lE), o el regioisómero de fórmula B del mismo,

HO

(lE)

10 en la que R3 representa una carboxamida como se definió en el grupo de la reivindicación 1; Rg representa -CH2NR10R11 o _NR10R11 en las que el grupo amino sustituido _NR10R11 es un grupo solubilizante seleccionado de morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropilamino, dietilamino, ciclohexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, N-metilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, dióxido de tiomorfolinilo, 4-hidroxietilpiperidinilo, o 4-hidroxipiperidinilo; y Rs representa un sustituyente

15 opcional seleccionado de los sustituyentes opcionales como se definieron en la reivindicación 1.

21. Un compuesto según la reivindicación 20 en el que R3 es etilaminocarbonilo CH3CH2NHC(=O)-, o isopropilaminocarbonilo (CH3)2CHNHC(=O)-; el grupo amino sustituido _NR10R11 en R9 es morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropilamino, dietilamino, ciclohexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, N-metilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, dióxido de tiomorfolinilo, 4-

20 hidroxietilpiperidinilo, o 4-hidroxipiperidinilo; y Rs es etilo, isopropilo, bromo, o cloro.

22. Un compuesto según la reivindicación 1 seleccionado de:


Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-piperidin-1-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

25 Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-etilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-[4-(isopropilamino-metil)-fenil]-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-(4-ciclohexilaminometil-fenil)-5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

Etilamida de ácido 4-[4-(terc-butilamino-metil)-fenil]-5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico

30 Etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-{4-[(2-metoxi-etilamino)-metil]-fenil}-isoxazol-3-carboxílico

100

1 sopropilamida de ácido 5-(2, 4-d ih id roxi -5-isopropil-fen i 1) -4-( 4-morfoli n-4-i Imelil-fen i 1) -isoxazol-3-carboxi 1 ico

1 sopropilamida de ácido 5-(2, 4-d ih id roxi -5-isopropil-fen i 1) -4-[4- (4-melil- piperazi n-1-i Imelil) -fen il]-isoxazol-3-carboxi 1 ico

Eli lamida de ácido 5- (5-lerc-bulil-2, 4-d ih id rox i-fen i 1) -4-[4-( 4-melil-pi peraz in -1-i Imeli 1)-fen il]-isoxazol-3-carboxi lico

Eli lamida de ácido 5- (5-lerc-bulil-2, 4-d ih id rox i-fen i 1) -4-( 4-pi perid i n-1-i Imelil-fen i 1) -isoxazol-3-carboxi lico

5 Elilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isobulil-fenil)-4-( 4-piperidin-1-ilmelil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico

Eli lamida de ácido 5- (5-lerc-bulil-2, 4-d ih id rox i-fen i 1) -4-( 4-morfoli n-4-i Imeli 1-fen il)-isoxazol-3-carboxil ico

Eli lamida de ácido 5- (5-lerc-bulil-2, 4-d ih id rox i-fen i 1) -4-( 4-d ieli laminomelil-fen i 1)- isoxazol-3-carboxi 1 ico

Eli lamida de ácido 3- (5-cloro-2, 4-d ih id roxi-fen il)-4- (4-morfoli n-4-i Imeli 1-fen i 1) -isoxazol-5-carboxi lico

Elilamida de ácido 4-(4-dielilaminomelil-fenil)-5-(4,6-dihidroxi-Z -melil-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxilico

10 Eli lamida de ácido 4- (4-d ieli laminomelil-fen i 1)-5-( 4'-fl uoro-4,6-d i h id rox i-bifen i 1-3-il)- isoxazol-3-carboxi lico

Elilamida de ácido 4-(4-dielilaminomelil-fenil)-5-(4,6-dihidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxilico

Eli lamida de ácido 5- (2'-fl uoro-4, 6-d ih id roxi -bifen i 1-3-il)-4-( 4-pi rrol id i n-1- il meli I-fen il)-isoxazol-3-carboxil ico

Eli lamida de ácido 5- (4, 6-d ih id rox i-bifen i 1-3-il) -4-( 4-morfol in -4-il melil-fen i 1)-isoxazol-3-carboxi lico

Eli lamida de ácido 5- (2, 4-d ih id rox i-5-feneli 1-fen i 1) -4-( 4-morfoli n-4-il meli I-fen il)-isoxazol-3-carboxi lico

15 Isopropilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-( 4-piperidin-1-ilmelil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico

Elilamida de ácido 4-(4-dielilaminomelil-fenil)-5-(5-elil-2,4-dihidroxi-fenil)-isoxazol-3-carboxilico

Eli lamida de ácido 5- (5-elil-2, 4-di h id rox i-fen i 1) -4-[4-( 4-melil-piperazin -1-il meli 1) -fen i 1]- isoxazol-3-carboxi lico

Eli lamida de ácido 5- (5-elil-2, 4-di h id rox i-fen i 1) -4- (4-morfoli n-4- i Imeli I-fen i 1)- isoxazol-3-carboxi lico

Elilamida de ácido 5-(5-cloro-2,4-dihidroxi-fenil)-4-(4-dielilaminomelil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico

20 Elilamida de ácido 5-(5-cloro-2, 4-dihidroxi-fenil)-4-[4-(4-melil-piperazin-1-ilmelil)-fenil]-isoxazol-3-carboxilico

Eli lamida de ácido 5- (5-cloro-2, 4-d ih id roxi-fen il)-4- (4-morfoli n-4-i Imeli 1-fen i 1) -isoxazol-3-carboxi lico

y las sales, hidratos y solvatos de los mismos.

23. Un compuesto según la reivindicación 1 que es etilamida de ácido 5-(2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico, o una sal, hidrato o solvato del mismo.

25 24. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para el uso en medicina humana o veterinaria.

25. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 25 en forma de una disolución o suspensión del 30 compuesto en un vehículo fisiológicamente aceptable estéril, por ejemplo solución salina acuosa.

27. Una composición farmacéutica según la reivindicación 26 en forma de una disolución o suspensión del compuesto en solución salina acuosa estéril.

28. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para el uso en el tratamiento del cáncer.

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compuestos de isoxazol como inhibidores de las proteínas de choque térmico

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