ZAMORANOCarrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria

Mdulo de Biotecnologa AplicadaArea de Actividad: Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin In Vitro

III. COMPOSICION DE MEDIOS DE CULTIVO

Esta parte del laboratorio permitir al estudiante familiarizarse con la funcin de los diferentes componentes que se incluyen en la elaboracin de un medio de cultivo.

Requerimientos Nutricionales y Hormonalesde un Medio de Cultivo

3.1 A G U A

3.3 Componentes Orgnicos 3.2

Componentes

Macroelementos

Inorgnicos

Microelementos

a) Carbohidratosb) Vitaminasc) Aminocidosd) Reguladores del crecimiento (Hormonas): auxinas, citocininas, giberelinase) Antibiticos

NPKCaMgS

AlBClCoCuFe

IMnMoNiZn

3.4 Componentes IndefinidosAgua de cocoPulpa de bananoExtracto de levaduraJugos de frutaCasena hidrolizadaAgarCarbn activado

Figura 3-1. Complejo de sustancias de un medio nutritivo para inducir crecimiento y desarrollo.

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El medio de cultivo a utilizar depende de varios factores:c) cultivo con el que se esta trabajando;b) tipo de explante utilizado;c) etapa en el proceso de micropropagacin.

3.1 AGUASe utiliza agua destilada y no de la llave. El agua de la llave no es pura ni uniforme ya que contiene entre otros: sales minerales, aceites, productos de la corrosin de las tuberas, compuestos orgnicos, microorganismos, gases disueltos, etc. Las clulas en cultivo son extremadamente susceptibles a sustancias txicas en el medio an en concentraciones muy pequeas, por lo tanto es importante utilizar agua purificada (agua destilada). El agua comprende aproximadamente un 90 a un 95% del medio.

3.2 COMPONENTES INORGANICOS3.2.1 MacroelementosEl balance inico del medio esta conformado por los macroelementos que se agregan.El nitrgeno (N) es agregado al medio en dos formas: como amonio (NH4+) y como nitrato (NO3-). Cuando se agrega el N en forma de NH4+ el pH del medio baja, por lo tanto la acidez del medio aumenta por la liberacin de iones de H+. Cuando se agrega el N en forma de NO3- el pH del medio sube, la acidez del medio disminuye por la liberacin de iones de OH-. El N influencia el crecimiento de las plantas y su deficiencia se manifiesta en hojas clorticas y crecimiento reducido. Es un importante componente de protenas, aminocidos, cidos nucleicos y hormonas naturales de las plantas.

El fsforo (P) es usado en la conversin de energa y en la activacin de enzimas. Es un importante componente de la molcula de ADN. Las dos formas ms comunes en que se agrega el P al medio son como fosfato de potasio (KH2PO4) y como fosfato de sodio (NaH2PO4).

El potasio (K) es usado en la sntesis de carbohidratos y protenas, en la reduccin de nitratos, y en la regulacin de las relaciones hdricas del sistema. Es tambin necesario en la divisin celular. Las dos fuentes ms comunes de potasio en el medio de cultivo son el nitrato de potasio (KNO3) y el fosfato de potasio (KH2PO4).El calcio (Ca) es un componente integral de la pared celular. Se aade al medio como cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 2H2O) o como nitrato de calcio tetrahidratado (Ca[NO3]2 4H2O).

El magnesio (Mg) es usado en la activacin de enzimas y se agrega con el sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O).

El azufre (S) es componente de algunas protenas. Se agrega al medio a travs de los compuestos sulfatados (SO42-).

3.2.2 Hierro

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El hierro participa en la sntesis de clorofila y en el sistema respiratorio. Cuando los iones de hierro se precipitan en el medio, especialmente en la presencia de Ca, el hierro no se hace disponible para las plantas. Para aliviar este problema de disponibilidad se agrega al medio en forma de quelato. El agente quelatado que se agrega mantiene el hierro en solucin y permite que se haga disponible a la planta. Este agente es el EDTA (Ethylenediamine tetracetic acid).En cultivo de tejidos, hay dos formas comunes para agregar el hierro:a) se utiliza el sulfato de hierro (FeSO4 7H2O) mezclado con la sal sdica de EDTA

(Na2EDTA 2H2O)b) o se utiliza la sal sdica de hierro quelatado (FeNaEDTA).

3.2.3 MicroelementosSe requieren en cantidades menores.El boro (B) esta involucrado en el movimiento de azcares, agua y hormonas, as mismo con el metabolismo de N y en la divisin celular. Es txico a niveles muy altos, causando daos severos e incluso muerte de la planta. Se aade al medio como cido brico (H3BO3).

El cloro (Cl) ayuda a estimular la fotosntesis y es necesario en el crecimiento de las plantas. Se requiere en cantidades muy mnimas y es agregado en el compuesto cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 2H2O). Especialmente las plantas leosas son sensitivas al cloro en el medio, por lo que cuando se trabaja con este tipo de plantas se prefiere agregar calcio al medio usando otras fuentes no clorinadas.

El cobalto (Co) es parte integral de la vitamina B12 y ayuda en la fijacin de N. Se agrega en el cloruro de cobalto dihidratado (CoCl2 2H2O).

El cobre (Cu) es necesario en la conversin de energa, en la sntesis de clorofila, y se encuentra como componente de algunas enzimas. Para agregar la cantidad de cobre necesario en el medio se utiliza el sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5H2O).

El iodo (I) es componente de algunos aminocidos pero no se le considera verdaderamente un elemento esencial. En algunos cultivos puede incluso llegar a tener un efecto adverso. Se aade al medio como yoduro de potasio (KI).

El manganeso (Mn) es parte integral de la membrana que recubre los cloroplastos. Se agrega al medio de cultivo como sulfato de manganeso monohidratado (MnSO4 H2O).

El molibdeno (Mo) es importante en la fijacin de N, en la conversin de N a NH4+ y se agrega al medio como molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4 2H2O).

El zinc (Zn) es un activador enzimtico importante en la formacin de clorofila y de la auxina cido indoleactico (AIA). La cantidad de Zn requerida en el medio se agrega en el compuesto sulfato de zinc heptahidratado ((ZnSO4 7H2O).

3.3 COMPONENTES ORGANICOS3.3.1 Suplementos Macro-orgnicos

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3.3.1.1 CarbohidratosLas plantas in vitro requieren de una fuente externa de energa ya que son heterotrficas, no fotosintetizan, por lo tanto no son autosuficientes. Esta fuente de energa es la sacarosa que se usa en el medio a razn de 20 a 40 g/L (2-4%).

La sacarosa es un producto indirecto de la fotosntesis. Es un disacrido que consiste en dos monosacridos ligados qumicamente: fructosa y glucosa. En algunas ocasiones se puede sustituir la sacarosa por glucosa o fructosa agregados por separado, pero la mayora de las plantas responde ms favorablemente a la sacarosa. Cuando se agrega sacarosa al medio, la planta libera unas enzimas que ayudan en la hidrlisis de las molculas de sacarosa; es as como estas molculas se descomponen, durante el proceso, en sus componentes monosacridos.

El manitol es un azcar alcohol que algunas veces se agrega al medio como nutriente y/o para regular el control osmtico del sistema.

3.3.2 Suplementos Micro-orgnicos3.3.2.1 VitaminasLas vitaminas del complejo B son importantes en el metabolismo y el crecimiento de las plantas. Entre las vitaminas que se utilizan en cultivo de tejidos estn:a) Tiamina (vitamina B1). Utilizada en el proceso de respiracin de la planta. Por lo general se la

utiliza a razn de 0.4 mg/L. Es una vitamina esencia que se requiere en casi todos los cultivos.

b) Riboflavina (vitamina B2). Ayuda en la metabolizacin de carbohidratos y en la respiracin celular.

c) Acido nicotnico (niacina o vitamina B3). Estimula el crecimiento de las plantas a travs de su participacin como componente de co-enzimas que actan en las reacciones de energa. Por lo general se agrega al medio entre 0.1 a 10 mg/L.

d) Adenina (vitamina B4). Es parte integral del ADN y el ARN en el ncleo de la clula. Tambin acta como citocinina pero de una manera muy dbil; se utiliza como sulfato de adenina para la promocin y formacin de brotes.

e) Acido pantotnico (vitamina B5). acta como co-enzima en el metabolismo de grasas. Se agrega al medio en forma de pantotenato de calcio.

f) Piridoxina (vitamina B6). Al igual que el cido nicotnico estimula el crecimiento de las plantas actuando en las reacciones de energa.

g) Acido ascrbico (vitamina C). Se utiliza como antioxidante para prevenir la oxidacin de compuestos fenlicos.

h) Tocoferol (vitamina E). Para mejorar y promover la dispersin en cultivos en suspensin.i) Biotina (vitamina H). Utilizada en el metabolismo de grasas, protenas y carbohidratos.j) Inositol o myo-inositol. Es un azcar-alcohol que esta incluido dentro del complejo de la

vitamina B. Se agrega en casi todos los medios de cultivo a razn de 100 mg/L y como suplemento de la sacarosa. Es parte integral de varios tipos de membranas de algunos organelos como los cloroplastos.

k) Acido flico (vitamina Bc o M). tiene funciones de vitamina B y tiene actividad de co-enzima.

3.3.2.2 Aminocidos

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Se utilizan en la sntesis de protenas. Importantes en cultivo de tejidos podemos encontrar los siguientes: alanina, arginina, asparagina, cistena, glutamina, glicina, lisina, prolina, serina, tirosina. De stos los ms comnmente utilizados son la cistena y la glicina.

3.3.2.3 Reguladores del CrecimientoLas hormonas reguladoras del crecimiento son de los compuestos ms importantes que se incluyen en un medio de cultivo. Del propsito del medio de cultivo que se esta preparando depende el tipo y la dosis de hormona a utilizar.

3.3.2.3.1 AuxinasLas auxinas estimulan el agrandamiento y alargamiento celular, adems de que promueven la divisin celular en cultivo de tejidos. Se utilizan ya sea combinadas con citocininas durante la etapa de multiplicacin (etapa II), o sin citocininas durante la etapa de enraizamiento (etapa III). Al preparar soluciones madre de auxinas, stas se disuelven con unas gotas de una solucin 1M de hidrxido de sodio (NaOH) o de una solucin 1M de hidrxido de potasio (KOH).

Estas sustancias son esenciales en los siguientes procesos:a) en el cultivo de meristemas;b) en el cultivo de pices caulinares no son esenciales pero promueven el crecimiento;c) en los procesos de morfognesis directa e indirecta;d) en el enraizamiento de microesquejes en la etapa III;e) en la induccin de embriognesis somtica.

El tipo de crecimiento deseado va a determinar el tipo de auxina que se va a escoger y la concentracin requerida. La cantidad de auxina tambin depender del nivel natural existente de hormona en el explante (auxina endgena) y sto se calcula a travs de experimentos en los que se comparan dosis diferentes de auxinas en el medio de cultivo (auxina exgena). La interaccin entre las cantidades endgenas y exgenas de auxina en el explante y en el medio, respectivamente, van a promover la sntesis/produccin de auxina en el explante.

Hay dos tipos de auxinas: naturales y sintticas. De las auxinas naturales el cido indolactico (AIA) es el ms utilizado. El AIA es fotosensible, se degrada en presencia de la luz, por lo tanto se debe almacenar en la oscuridad.

Las auxinas sintticas tienen un efecto fisiolgico similar al de las auxinas naturales y se producen sintticamente; las ms utilizadas son: a) el cido indolbutrico (AIB) como es ms estable en la luz que el AIA, se prefiere para la

induccin de races;b) el cido naftalenactico (ANA) se utiliza para la induccin de races, pero tambin para

promover crecimiento de tejido calloso;c) el 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) es una auxina sinttica que tambin tiene

propiedades herbicidas a altas concentraciones. Se utiliza mucho en cultivo de tejidos para inducir la formacin de callo.

3.3.2.3.2 Citocininas

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Estas sustancias reguladoras del crecimiento son utilizadas en cultivo de tejidos para estimular la divisin celular, especialmente si se agregan junto con una auxina. A altas concentraciones inducen la formacin de brotes adventicios e inhiben la formacin de races; promueven la multiplicacin de tallos y la proliferacin de yemas laterales a travs de la disminucin de la dominancia apical. Las citocininas ayudan, as mismo, a dilatar el proceso de envejecimiento de las clulas e influencian el transporte de las auxinas. Al preparar soluciones madre de citocininas, stas se disuelven con unas gotas de una solucin 1M de cido clorhdrico (HCl).

Entre las citocininas utilizadas en cultivo de tejidos estn:a) el 6-benzylaminopurina (BA o BAP) es una citocinina sinttica muy comnmente utilizada

para estimular el crecimiento de yemas axilares;b) el 2iP (IPA; 6-[ ,-dimethylallylamino]purine o N6-[2-isopentenyl]adenine) es una hormona

natural que promueve una rpida divisin celular por lo que en algunas plantas causa un crecimiento irregular;

c) la kinetina (6-furfurylaminopurine) es otra citocinina sinttica que con el BAP son las ms comnmente utilizadas en cultivo de tejidos;

d) el zeatin es otra hormona natural 10 veces ms potente que la kinetina y, por lo tanto, su precio es bastante elevado.

3.3.2.3.3 GiberelinasEste grupo de sustancias ocurre naturalmente en las plantas e influencian el alargamiento de las clulas y la elongacin de tallos. No se utiliza mucho en cultivos in vitro. In vitro las giberelinas inducen la elongacin de entrenudos y el crecimiento de meristemas y yemas. Tambin ayudan a romper la dormancia de embriones aislados o semillas. Por lo general esta sustancias inhiben la formacin de tallos y races adventicias. De todas las giberelinas la ms usada en vitrocultivos es AG3 o cido giberlico3.

3.3.2.3.4 AncymidolEs un retardante del crecimiento cuyo efecto in vitro es similar a la de las citocininas. Comercialmente se le conoce como A-Rest.

3.3.2.3.5 EtilenoEs un gas producido por las plantas que tiene efecto en su crecimiento. Si se concentra dentro de los contenedores donde estn creciendo las vitroplantas su efecto puede ser bastante daino.

3.3.2.4 AntibiticosEn micropropagacin los antibiticos no son muy utilizados en forma rutinaria para atacar contaminantes ya que a menudo no son efectivos adems de que pueden matar el cultivo o inducir inestabilidad gentica. Se utilizan ms comnmente en experimentos de transferencia de genes para controlar o eliminar el Agrobacterium.

El uso de antibiticos en cultivo de tejidos se debe hacer de una forma profilctica y de ninguna manera debe ser un sustituto de las tcnicas aspticas que se deben manejar en el laboratorio. Hay que recordar que ningn antibitico es efectivo contra todos los microorganismos que potencialmente pueden causar contaminacin. Si se lo utiliza, es conveniente limitar el tratamiento a la etapa del cultivo donde la profilaxis sera de ms beneficio. La seleccin del

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antibitico a utilizar se debe hacer una vez que se conozcan cules son los microorganismos causantes de la contaminacin.

Se pueden utilizar los siguientes antibiticos:ampicilina, carbenicilina, sulfato de gentamicina (autoclavable), ribavirin (agente antiviral de amplio espectro), estreptomicina. Otros antibiticos como la penicilina, terramicina y tetraciclina se han probado en cultivo de tejidos pero no han dado buenos resultados.

3.4 COMPONENTES INDEFINIDOS3.4.1 Agentes GelatinizadoresEl agar es un polisacrido derivado de extractos de varias especies de algas rojas, con un alto peso molecular y con la capacidad de gelatinizar un medio de cultivo. Aunque es considerado como un material inerte, el agar natural contiene cantidades mnimas de algunos elementos por lo que se le considera como un compuesto qumicamente indefinido.

Existen diferentes tipos de agar, y diferentes casas comerciales lo venden bajo diferentes nombres. La calidad del agar depende de varios factores, entre ellos, la poca del ao en que el alga ha sido colectada, el nivel de contaminantes, el proceso de manufactura y la manera en que el producto ha sido purificado. Cualquier nivel de impurezas en el agar puede tener efecto en la respuesta del vitrocultivo.

Caractersticas del agar:a) se solidifica a 45oC;b) se torna lquido a la temperatura de ebullicin del agua (100oC);c) es estable in vitro ya que no es degradado por enzimas vegetales;d) no reacciona con ninguno de los componentes del medio de cultivo;e) la concentracin utilizada para hacer un medio semi-slido es de 0.5 - 1% (peso/vol), o sea de

5-10 g/L (8 g/L es la recomendacin general);f) la gelatinizacin del agar en el medio depende de dos factores:

la marca del agar ya que a la misma concentracin diferentes marcas de productos presentan diferentes niveles de dureza;

el pH del medio ya que a un pH ms bajo el agar tiende a no gelatinizar muy bien.g) la dureza del medio puede afectar tambin la presin osmtica del medio. A medida que el

nivel de agar se incrementa, tambin se incrementa el potencial hdrico del medio, reduciendo el crecimiento del cultivo.

El Agar, Bacto-agar, Difco-agar son agentes gelatinizadores derivados de algas marinas. Hay otros agentes gelatinizadores que no son a base de agar como el Gelrite o Phytagel que es tambin un polisacrido derivado en forma natural, producido por la fermentacin de la bacteria Pseudomonas elodea.

Las ventajas del Gelrite sobre los agentes gelatinizadores a base de agar son:a) es un agente gelatinizador con un alto grado de pureza;b) es completamente claro/cristalino cuando solidifica;c) se utiliza a una concentracin 4x menor que el agar;d) es bastante uniforme y puro;

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e) no contiene compuestos fenlicos como los contienen algunos tipos de agentes gelatinizadores a base de agar.

f) no es afectado por la acidez del medio de cultivo.La desventaja del Gelrite es que pude contribuir al problema de vitrificacin (las plantas se tornan de una apariencia vidriosa e hinchadas). El Agargel de la Compaa Sigma es una mezcla de agar y phytagel que fue formulada para controlar este problema.

3.4.2 Carbn ActivadoAlgunas plantas se caracterizan por liberar unos pigmentos caf a negros despus de un corte. Estos pigmentos son compuestos fenlicos y taninas que se oxidan y posteriormente dificultan el crecimiento y desarrollo del cultivo in vitro. El carbn activado es un compuesto antioxidante ya que contribuye a absorber esos compuestos fenlicos cuando estn presentes. Cuando se utiliza se agrega a razn de 0.2 - 3% (peso/vol).

Otras alternativas al uso de carbn activado para contrarrestar la accin de los compuestos fenlicos son:a) el cido ctrico que se puede utilizar en el medio o durante el proceso de preparacin del

explante;b) el cido ascrbico, que al igual que el cido ctrico se puede utilizar en el medio o durante el

proceso de preparacin del explante. El cido ctrico y el cido ascrbico se pueden utilizar solos o combinados. Si se les utiliza juntos como solucin antioxidante durante la preparacin de los explantes, se prepara una solucin que contenga 150 mg/L de cido ctrico y 100 mg/L de cido ascrbico;

c) la cistena adicionada al medio de cultivo.

3.4.3 Agua de CocoEl agua de coco es un medio bastante complejo que contiene un rango amplio de compuestos orgnicos e inorgnicos. Se utiliza en el medio de Knudson C para la germinacin asimbitica de embriones de orqudeas in vitro; se usa en cantidades de 100 a 150 mg/L de medio de cultivo. Debe ser filtrado antes de su uso y se puede mantener en refrigeracin.

3.4.4 Extracto de levaduraEs una fuente natural de vitaminas.

3.4.5 Casena hidrolizadaEs una mezcla indefinida de protenas que se utiliza en cultivo de tejidos como una fuente indefinida de nitrgeno orgnico. Es un cido suave producido a travs de la hidrlisis de la casena, una protena de la leche.

3.5 REFERENCIAS

Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). 1991. Cultivos de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. W. Roca y L. A. Mroginski (Eds.). Cali. Colombia. 969 p.

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Dodds, J. H. y L. W. Roberts. 1995. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University Press. 256 p.

Kyte, L. y J, Klein. 1996. Plants from test tubes. An introduction to micropropagation. Timber Press, Portland, Oregon. 240 p.

Pierik, R. L. M. 1987. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht. 344 p.

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Mdulo de Biotecnologa AplicadaInorgnicos3.3.1.1 Carbohidratos3.5REFERENCIAS