comparacion de la estructura genetica del puye …
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COMPARACION DE LA ESTRUCTURA GENETICA DEL PUYE Galaxias maculatus
(Jenyns, 1842), ENTRE UN SISTEMA ABIERTO (LAGO LLANQUIHUE) Y UN
SISTEMA CERRADO (SECTOR PICHILAGUNA) MEDIANTE LA UTILIZACION DE
MARCADORES MOLECULARES
Tesis para optar al título de Ingeniero en Acuicultura
Profesor Patrocinante: Dra. Marcela Astorga Opazo
Instituto de Acuicultura
Cesar Alejandro Oyarzo Pacheco
PUERTO MONTT, CHILE
2013
Agradecimientos
Al momento de finalizar este periodo tan importante en mi vida como lo es el término de mi
carrera universitaria con la culminación de la presente tesis, es sin duda imposible no recordar
todas esas personas que estuvieron en este proceso.
Con especial cariño debo agradecer a las personas que estuvieron cada momento y segundo en
este arduo camino, que con su ayuda y amor pude llegar a estas instancias de mejor manera, es
por eso que le doy las gracias eternas a mis padres que me apoyaron en los buenos y malos
momentos sin dudar en ningún instante.
Mi especial agradecimiento a la Dra. Marcela Astorga por su ayuda y paciencia desde mucho
antes del comienzo de esta tesis.
También agradecer al resto de mi familia, que estuvieron siempre apoyándome y dándome
ánimos y fuerzas para seguir adelante, mis más sinceros agradecimientos a mis abuelos, tíos y
hermanas.
Y por ultimo dar las gracias a toda la gente que me acompaño en este recorrido, a mis amigos y
compañeros de carrera, a los profesores con su constante ayuda, a mis compañeros de
laboratorio y a la Universidad que me formo como profesional y persona.
iii
TABLA DE CONTENIDOS
INDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... v
INDICE DE TABLAS ....................................................................................................... vi
RESUMEN ..................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................... viii
1. INTRODUCCION ......................................................................................................... 1
2. HIPOTESIS .................................................................................................................. 6
3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 7
3.1 Objetivo general .................................................................................................. 7
3.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 7
4. MATERIALES Y METODOS ........................................................................................ 8
4.1 Área de estudio ................................................................................................... 8
4.2 Metodología de muestreo .................................................................................... 9
4.3 Análisis Genético............................................................................................... 10
4.3.1 Método de extracción de ADN .................................................................... 10
4.3.2 Electroforesis .............................................................................................. 12
4.3.3 Amplificación de Microsatélites ................................................................... 13
4.3.4 Lectura de Microsatélites ............................................................................ 15
4.4 Análisis estadístico ............................................................................................ 16
iv
5. RESULTADOS ........................................................................................................... 17
5.1 Extracción de ADN ............................................................................................ 17
5.2 Amplificación de Microsatélites ......................................................................... 18
5.3 Estimadores de diversidad genética .................................................................. 19
5.3.1 Lectura Microsatélites ................................................................................. 19
5.3.2 Alelos Compartidos y Privados ................................................................... 20
5.3.3 Heterocigosidad .......................................................................................... 21
5.3.4 Frecuencias alélicas ................................................................................... 22
5.4 Estimadores de diferenciación genética ............................................................ 23
5.4.1 Distancia genética ...................................................................................... 23
5.4.2 Estadístico F ............................................................................................... 24
5.4.3 Diferenciación genética .............................................................................. 25
6. DISCUSION ............................................................................................................... 26
6.1 Extracción y Amplificación de ADN ................................................................... 26
6.2 Diversidad genética ........................................................................................... 26
6.3 Diferenciación genética ..................................................................................... 30
7. CONCLUSION ........................................................................................................... 33
8. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 34
v
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mapa de localización de los 2 sectores ubicados en la Región de Los Lagos,
Chile. ................................................................................................................................ 8
Figura 2. Fotografía correspondiente a la especie G. maculatus fijadas en etanol. ......... 9
Figura 3. Fotografía de un gel de agarosa con 10 muestras de ADN de G. maculatus
con su localidad respectiva. La banda superior muestra el ADN concentrado y la banda
inferior de cada individuo muestra probablemente ARN. ............................................... 17
Figura 4. Fotografía de un gel de agarosa de las muestras del producto de PCR. Se
observan los fragmento de ADN de G. maculatus para cada locus analizado (Gmac 2, 4,
5, 9). Las muestras con el número 1 indican los individuos de la población Lago
Llanquihue y las muestras con el número 2 indican los individuos de la población
Pichilaguna. .................................................................................................................... 19
vi
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Partidores de microsatélites definidos para la especie Galaxias maculatus ..... 14
Tabla 2. Condiciones de PCR a utilizar y su concentración para la especie G.
maculatus. ...................................................................................................................... 14
Tabla 3. Cantidad de muestras obtenidas por cada marcador en su respectiva localidad
....................................................................................................................................... 18
Tabla 4. Cantidad de alelos encontrados en cada microsatélite y en cada población
muestreada. ................................................................................................................... 20
Tabla 5. Número y porcentaje de alelos compartidos en las dos poblaciones. .............. 21
Tabla 6. Número de alelos privados de cada población. ................................................ 21
Tabla 7. Porcentaje de heterocigosidad observada de cada población y de cada
marcador. ....................................................................................................................... 22
Tabla 8. Frecuencia alélica para el locus Gmac 2 y Gmac 9 por cada población. ......... 22
Tabla 9. Frecuencia alélica para el locus Gmac 4 y Gmac 5 por cada población. ......... 23
Tabla 10. Valores del Estadístico F por cada locus. Para el Fis, los valores cercanos a 0
mide exogamia y cercanos a 1 mide endogamia. .......................................................... 24
Tabla 11. Valores de probabilidad y error estándar para la comparación genética entre
las dos localidades mediante la prueba de Fisher. ......................................................... 25
vii
RESUMEN
El puye, Galaxias maculatus, es un pequeño pez, ampliamente distribuido en el
hemisferio sur y de gran interés para la genética de poblaciones por su alta capacidad
para adaptarse a diferentes hábitats, pasando por ambientes lacustres hasta ambientes
marinos. Para establecer posibles diferencias entre estos hábitats, se colectaron 32
individuos desde una localidad abierta, correspondiente al Lago Llanquihue y otra
cerrada, en Pichilaguna, asociados al ciclo de vida que tienen los puyes, un ciclo
migratorio y otro ciclo no migratorio correspondiente a su respectiva localidad. El
objetivo de esta tesis fue determinar el grado de divergencia y estructuración genética
de cada una de las poblaciones a través de estimadores de diversidad y diferenciación
genética por medio de 4 marcadores de microsatélites específicamente desarrollado
para esta especie. Los análisis mostraron una mayor diversidad genética para la
población migratoria, con microsatélites más polimórficos, mayor cantidad de alelos
privados y con una mayor heterocigosidad, la cual tiene mayor tamaño en área respecto
a la población cerrada no migratoria. Además el análisis de diferenciación genética
entre estas dos localidades mostró un Fst de 0,103, con diferencias significativas entre
ambos hábitats (p< 0,001). Estos datos permiten establecer una posible presencia de
un proceso de divergencia genética entre los individuos de ambas localidades, la
población del Lago Llanquihue y la población de Pichilaguna, sin embargo esto puede
ser debido a la ausencia de flujo génico entre localidades debido a que ambos cuerpos
de agua son separados por barreras geográficas.
viii
ABSTRACT
The puye, Galaxias maculatus, is a small fish, widely distributed in the southern
hemisphere. It has great interest from the genetic population for its high capacity to
adapt itself to different habitats. This means that it is able to live from lacustrine
environments to marine environments. In order to investigate the differences between
these habitats, we collected 32 individuals from two different localities. The first one
corresponds to an open population from the Llanquihue Lake and the other one to a
close one in Pichilaguna. These environments are associated with the life cycle that
puyes have, as well as their migratory cycle and other non-migratory cycle
corresponding to their respective locality. The objective included analyzing and
comparing the genetic structure of each of the populations through estimators of genetic
diversity and differentiation. This was done by using 4 microsatellite markers specifically
developed for this species. The analysis showed greater genetic diversity for the migrant
population, with microsatellites more polymorphic, more private alleles and greater
heterozygosity, which is larger in area compared to the non-migratory closed population.
Besides, the analysis of genetic differentiation between these two locations showed a
Fst of 0.103, with significant differences between the two habitats (p < 0.001).
Thanks to these data we can assume a possible presence of a genetic process of
divergence between individuals of both locations, Llanquihue Lake and Pichilaguna
population. However, this may be due to the absence of gene flow between localities
because both bodies of water are separated by geographical barriers.
1
1. INTRODUCCION
La especie Galaxias maculatus (Jenyns 1842), más conocida en Chile como puye, es
un pequeño pez de cuerpo alargado que se caracteriza por su carencia de
pigmentación y ausencia de escamas durante su estadio larvario y juvenil, alcanzando
tamaños entre 4 y 6 cm de longitud. En estadio adulto son totalmente pigmentados con
una coloración de tonalidades doradas verdosas alcanzando una longitud de hasta 17
cm (McDowall, 1971; Ferriz & Salas, 1996).
Se distribuye en el hemisferio sur de forma circumpolar, habitando aguas frías, donde
se ha reportado en Australia, Tasmania, Nueva Zelanda y en el sur de Sudamérica
(Chile, Argentina e Islas Malvinas) (McDowall, 1968; Dyer, 2000). En Chile se distribuye
desde los 32° Latitud Sur hasta la Región Patagónica en Tierra del fuego 53° Latitud
Sur (Campos, 1970).
Esta especie se caracteriza por presentar dos tipos de ciclo de vida; diádromo o
migratorio, es decir aquel ciclo en que los peces se movilizan entre un ambiente
dulceacuícola a marino (catádromos), y un ciclo de vida residente o no migratorio en el
cual los peces permanecen en ambientes de agua dulce (potádromos) (McDowall,
1972; Peredo & Sobarzo, 1994). Por lo cual, esta especie se puede encontrar en
hábitats dulceacuícolas, estuarinos y marinos.
Debido a las características en la forma de vida, esta especie es capaz de formar dos
tipos de poblaciones: La primera se denomina abierta, por el hecho de que poseen sus
estados de desarrollo en los diferentes tipos de hábitats, en este caso se ha descrito un
2
ciclo de vida que parte su reproducción en ambientes estuarinos, desde donde pasan
las larvas al ambiente marino, para retornar en estados juveniles al agua dulce a través
de los ríos y lagos, donde finalmente alcanzan el estado adulto y la segunda se
denomina cerrada (landlocked), debido a que desarrollan todo su ciclo de vida en un
solo hábitat, que corresponde a poblaciones presentes en lagos y generalmente no
tienen la posibilidad de trasladarse hacia otros hábitats.
Estos dos tipos de poblaciones puede llegar a tener diferencias en su composición
poblacional y específicamente en su estructura genética, esto debido a que por ser dos
hábitats diferenciados y aislados entre sí, se pueden presentar barreras migratorias que
estarían generando una restricción al flujo génico entre las poblaciones cerradas y
abiertas. Es así que Zattara & Premoli (2005), en lagos del noroeste de la Patagonia
Argentina, establecieron diferencias genéticas entre estos dos tipos de poblaciones,
asociadas a las historia de vida, mostrando un mayor grado de estructuración genética
en aquellas poblaciones no migratorias o residentes que aquellas diadrómicas o
migratorias.
En Chile, Campos (1970) ha indicado que las poblaciones de puye del Lago Calafquén,
no serian migratorias debido a que existen barreras que impiden su migración a través
de ríos, y que por tanto estos peces se habrían adaptado para reproducirse solo en el
lago.
Esto sugiere que para la especie de puye Galaxias maculatus existiría divergencia
genética entre estos dos tipos de poblaciones (abiertas y cerradas), lo cual sería como
resultado de la separación geográfica de las poblaciones y además de las barreras al
3
flujo génico que presentarían las poblaciones cerradas. Además, se esperaría que para
las poblaciones diádromas migratorias los individuos presentes en los distintos hábitats
debieran mostrar una similitud genética debido al constante flujo génico existente, no
mostrando diferencias genéticas entre toda la población abierta presente en los
diferentes hábitats.
Una de las ramas apropiadas para el estudio de poblaciones es la genética de
poblaciones, cuya problemática es describir la variación genética y su distribución en las
poblaciones, con el objeto de dar explicación a fenómenos evolutivos. Estas
poblaciones, están sujetas a cambios evolutivos en los que subyacen cambios
genéticos, los que a su vez están influenciados por factores como la selección natural y
la deriva genética que actúan principalmente disminuyendo la variabilidad de las
poblaciones que es el caso de las poblaciones residentes, o factores como la migración
y mutación que actúan aumentándola, teniendo el caso de las poblaciones migratorias
que interactúan entre lagos, ríos, estuarios y mar.
Es por eso que para la especie de G. maculatus las condiciones intrínsecas de
presentar dos tipos de ciclo de vida, uno diadrómico y uno residente determinará el
grado de flujo génico que presentarán las poblaciones. Generalmente las poblaciones
diadrómas que migran entre estuario, mar, río y lago muestran altos niveles de
variabilidad genética y ausencia de divergencia genética entre estos tipos de hábitat,
debido a que constituyen una única población con un tamaño efectivo alto lo cual no
permitirá la acción del proceso de deriva genética al azar. Por otro lado, se espera que
las poblaciones residentes o no migratorias muestren bajos niveles de variabilidad
4
genética y alta divergencia en relación a los otros tipos de hábitats, esto debido a que
conforman poblaciones cerradas que no presentan flujo génico, lo cual reduce su
tamaño efectivo poblacional y los expone a procesos de deriva genética, o bien si sus
tamaños son altos se someten a procesos de selección natural diferencial entre hábitats
(Hartl & Clark, 1997).
Estudios recientes de Galaxias maculatus, muestran altos niveles de variabilidad
genética en las poblaciones abiertas, que son atribuidos a la mantención histórica de
altos tamaños poblacionales, gracias a la posibilidad de usar, tanto hábitats marinos
como dulceacuícolas (Victoriano et al., 2012).
El hecho de conocer la variabilidad genética nos permite obtener estimadores para la
caracterización de diversos grupos como cepas, grupos o poblaciones, lo que nos
permitirá discriminar entre ellos, identificar las poblaciones fuentes, estimar divergencias
poblacionales e identificar el flujo génico entre diferentes poblaciones. Para lograr
estimar adecuados niveles de variabilidad se requiere de marcadores de alta resolución
y que muestren un nivel de variabilidad suficiente para diferenciar grupos. Un adecuado
tipo de marcador molecular para el estudio de estas poblaciones (residente y migratoria)
corresponde a los microsatélites, debido a su alto nivel de variabilidad detectado. Los
marcadores de microsatélites que hoy en día existen para la especie de puye G.
maculatus se han utilizado efectivamente para evaluar la estructura de la población y la
conectividad entre las poblaciones naturales de la Patagonia Argentina en América del
Sur (Carrea, 2009).
5
Es por ello que a la fecha disponemos de los marcadores adecuados para comenzar
estudios en este ámbito con el fin de obtener información sobre variabilidad genética,
diferenciación genética, niveles de flujo génico entre poblaciones, entre otros, utilizando
marcadores moleculares altamente variables (microsatélites), de esta manera podemos
establecer medidas de manejo de este recurso de forma adecuada, sin llegar a reducir
ni dañar sus poblaciones, si es que estas llegaran a ser cerradas. Por otro lado, es
relevante entender cómo se comporta esta especie debido a que ha llegado a ser un
recurso de importancia en la acuicultura y en las pesquerías ya que a la fecha se
extraen individuos para su cultivo (Murillo & Ruiz, 2002) y para su venta directa o
exportación. Esta especie se ha considerado un símil de la angula que es consumida en
países europeos, debido a esto es que se ha extraído como recurso por su alto precio
(Barile et al., 2003).
La presente tesis plantea determinar el grado de divergencia y estructuración genética
de la población migratoria de G. maculatus que se encuentran en el Lago Llanquihue y
la población residente del sector de Pichilaguna a través de análisis genéticos.
6
2. HIPOTESIS
H1. Los individuos del Lago Llanquihue y del sector Pichilaguna forman poblaciones
diferentes genéticamente, existiendo divergencia genética entre ellas debido a la
ausencia de flujo génico, presentando una alta diversidad genética para la población
abierta y una baja diversidad genética para la población cerrada.
7
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Determinar el grado de divergencia genética y estructuración poblacional entre las
poblaciones de puyes (Galaxias maculatus) presentes en un lago abierto (Lago
Llanquihue) y las presentes en un lago cerrado (Laguna Pichilaguna)
3.2 Objetivos específicos
- Determinar la diversidad genética poblacional del puye G. maculatus en el Lago
Llanquihue y Pichilaguna en el sur de Chile.
- Determinar la diferenciación genética entre la población migratoria del Lago
Llanquihue y la población residente de la Laguna Pichilaguna.
8
4. MATERIALES Y METODOS
4.1 Área de estudio
El área de estudio comprendió 2 localidades ubicadas en la Región de Los Lagos y
seleccionadas según los 2 tipos de ciclos de vida del Puye (Figura 1): i) Lago
Llanquihue (41°15´32´´S y 73º00´07´´O); ii) Pichilaguna (41°16´20”S y 73°03´53”O).
Figura 1. Mapa de localización de los 2 sectores ubicados en la Región de Los Lagos,
Chile.
9
4.2 Metodología de muestreo
En cada localidad se muestreó y se colectó un mínimo de 30 individuos de diferentes
estadios de vida a través de un arrastre con red. La red utilizada tiene una extensión de
10 metros de largo y 1,5 metros de profundidad, con flotadores cada 30 cm en la relinga
superior y pesos cada 30 cm en la relinga inferior, el claro de malla es de 2,5 mm.
Los peces capturados fueron fijados “in situ” con etanol al 95% en envases de 300 ml
(figura 2), y trasladados al Laboratorio de Genética Molecular del Instituto de
Acuicultura de la Universidad Austral de Chile, Sede Puerto Montt, en el cual se
mantuvieron a una temperatura de -20°C.
Figura 2. Fotografía correspondiente a la especie G. maculatus fijadas en etanol.
10
4.3 Análisis Genético
4.3.1 Método de extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó para cada individuo de la especie G. maculatus en la
zona de la aleta caudal mediante el método estándar fenol/ cloroformo/ alcohol
isoamílico y precipitación con etanol (Doyle & Doyle 1987).
Este método consistió en extraer aproximadamente 100 mg. de tejido de la aleta caudal
de cada uno de los individuos e introducirlos en un tubo eppendorf de 1,5 ml
previamente esterilizado. A cada tubo se le agregó 300 µl de buffer de lisis y se
procedió a triturar con una tijera hasta dejar cada muestra uniforme y homogénea con el
fin de ayudar al buffer de lisis en la liberación del ADN del interior de cada célula. Estos
buffers de extracción contienen:
1) Detergentes, como sodio dodecilo sulfato (SDS) a una concentración final del 1%
2) Una molécula quelante (p. ej. EDTA, ácido etileno amino tetra acético, 50 mM).
3) Sales (p. ej. Cloruro de sodio, NaCl 20 mM)
4) Tris-HCl 20 mM con pH entre 7.5 y 8.2
5) Proteinasa K (concentración de 5 µl)
Las muestras fueron agitadas durante unos segundos en vórtex y se incubaron en un
baño termorregulador a 40° C durante toda la noche.
Al día siguiente se agregó a cada muestra 150 µl de NaCl a 5M, se agitó en el vortex
durante 2 minutos y se centrifugó por 5 minutos a 12.000 RPM a temperatura ambiente.
11
Se traspasó el sobrenadante a un tubo esterilizado y rotulado volviendo a agregar 150
µl de NaCl a 5M, se agitó nuevamente por 2 minutos y se centrifugó por 5 minutos a
12.000 RPM.
Se traspasó el sobrenadante (alrededor de 300 µl) a un tubo esterilizado y se agregó 40
µl de NaCl a 0.2M y 2 volúmenes (600 µl) de etanol puro a cada uno de los tubos. Se
centrifugó por 10 minutos a 12.000 RPM. Se votó el sobrenadante dejando el pellet que
se encontraba adherido en el fondo del tubo eppendorf por acción de la centrifuga, se
agregó 300 µl de agua esterilizada con el fin de resuspender y disolver el pellet que se
encontró adherido en el fondo del tubo.
Luego se agregó 300 µl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se agitó por 30
minutos en el vortex para eliminar proteínas como las nucleasas. Después se centrifugó
a 8000 RPM por 5 minutos.
Luego se transfirió el sobrenadante a un tubo esterilizado teniendo cuidado de no
transportar proteínas que quedan en la interfase. A cada tubo se le agregó un volumen
(300 µl aprox.) de cloroformo: alcohol isoamílico y se agitó por 10 minutos en el vortex
con el fin de eliminar residuos lipídicos. Se centrifugó a 8000 RPM por 5 minutos. El
sobrenadante se transfirió a su tubo rotulado y esterilizado añadiendo 2 volúmenes de
etanol puro (600 µl). Al mezclar en este paso se visualizará el ADN suavemente. El
etanol se utilizó para remover las concentraciones residuales de sales y promover la
precipitación del ADN, sin embargo se incubó por 30 minutos a -20°C para ayudar que
el ADN decante en su totalidad.
12
Posteriormente se centrifugó a 12.000 RPM por 12 minutos. Se eliminó el sobrenadante
y se agregó 750 µl de alcohol al 70% para eliminar todas las sales que permanezcan en
la solución. Luego se centrifugó a 13.000 RPM por 5 minutos. Se eliminó el alcohol y los
restos de este líquido que aun quedaron fueron extraídos en una estufa a 35 grados.
Posteriormente se resuspendió el pellet con 100 µl de agua destilada y se dió unos
giros a los tubos con la mano para disolver el pellet. Las muestras de ADN obtenido,
fueron guardadas a -20°C.
4.3.2 Electroforesis
Terminada la etapa de extracción de ADN, se llevó a cabo la corroboración de la
obtención ADN mediante electroforesis, la cual se basa en la migración de las
macromoléculas de ADN con carga en un campo eléctrico.
La preparación del gel de agarosa al 1% consistió en 60 mg de agarosa con 60 ml de
TAE (relación de 1/1). Esta mezcla se calentó en un microondas con el fin de que la
solución quede totalmente homogénea. Se agregó 3,5 µl de sbyr-safe que permite
visualizar el ADN en luz ultravioleta. El gel de agarosa se deja enfriar hasta que se
solidifique.
Luego se extrajo 5 µl de ADN concentrado de cada una de las muestras y se dejó en
papel parafilm para su mejor consistencia. A cada muestra se le agregó 1,5 µl de Blue
13
Juice que permite darle peso y color a la muestra cuando se encuentre en el gel de
agarosa.
Posteriormente se sembró las muestras de ADN dentro de cada espacio hecho en el
gel de agarosa y se efectuó la separación electroforética con una diferencia de voltaje
de 73 a 84 volt por unos 30 minutos.
Finalizado el proceso de electroforesis se llevó el gel a un transluminador para registrar
los resultados en una fotografía por medio de una cámara digital Cannon PC 1089.
4.3.3 Amplificación de Microsatélites
La herramienta molecular utilizada que servirá para analizar poblaciones serán los
microsatélites. En este trabajo se utilizó los partidores (Tabla 1) descritos por Carrea
(2009) denominados:
Gmac 2; Gmac 4; Gmac 5; Gmac 9.
14
Tabla 1. Partidores de microsatélites definidos para la especie Galaxias maculatus
Locus Secuencia 5´- 3´
Gmac 2F TCAGTTGCCTGTCTTTCAAC C
Gmac 2R CACCGTATCTAGAGTTGATACTCAAAG
Gmac 4F CTTCTTACCTGGCTGGCTCA
Gmac 4R TTTGTCCCCTCTTTTCCGTA
Gmac 5F CAAAAGGCAGACCAATCAGG
Gmac 5R TTGTTGAGATAGGCCGAGGT
Gmac 9F CTCAATCACCCGCTCCTC
Gmac 9R ATCCCGATTCCTTCTGAGGT
Los volúmenes de los reactivos para la preparación de la mezcla de trabajo de
amplificación de ADN son entregados en la tabla 2.
Tabla 2. Condiciones de PCR a utilizar y su concentración para la especie G.
maculatus.
Reactivo Solución Trabajo Solución Final Volumen (µL)
Buffer PCR 10 X 1 X 1.5
MgCl2 50 mM 1.8 µM 0.6
dNTPs 2.5 mM 200 µM 1.2
Partidor (F) 10 µM 0.2 mM 0.5
Partidor (R) 10 µM 0,2 mM 0.5
Taq. Pol. 5 µ / µM 1 U 0.2
H2O -- -- 9.5
ADN -- -- 1.0
Total 15
Los microsatélites fueron amplificados mediante el método de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), que consiste en replicar u obtener múltiples copias para su estudio
posterior. Cada tubo se colocó en el termociclador (Termociclador, Bioer TC96/G/H (b))
utilizando el siguiente programa:
15
- Una desnaturalización del ADN a 95° por 5’
- Seguido de un acoplamiento de 35 ciclos a 95° por 45’’
- Alineamiento a 59° por un minuto
- Un minuto a 72° para la extensión
- Luego de los ciclos se realizó una extensión final a 72° por 10’
Posteriormente, se realizó la electroforesis del producto de PCR para la determinación
de los tamaños de los fragmento de ADN la cual es de similar preparación que la
electroforésis de la extracción de ADN, con la diferencia de que el gel se encontró a una
concentración de un 1.5% y se hace migrar a 75 volts.
4.3.4 Lectura de Microsatélites
La lectura de los fragmentos de ADN obtenidos a través de la amplificación de los
microsatélites se realizó mediante un secuenciador automático a través del servicio de
secuenciación de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
Una vez obtenidos los archivos de la lectura de los microsatélites, las muestras fueron
analizadas mediante el software Peakscanner, para obtener el tamaño y la posición de
los peaks de cada alelo y así ser ingresados al software estadístico.
Además, con los datos entregados por el software Peakscanner se analizó los alelos
compartidos y privados de las dos poblaciones estudiadas.
16
4.4 Análisis estadístico
Para estimar la variabilidad genética y el grado de diferenciación de las poblaciones se
utilizó el programa estadístico Tools For Population Genetic Analyses, TFPGA 1.3
(Miller, 1997), en el cual se obtuvo los estimadores de diversidad y diferenciación
genética de cada una de las localidades analizadas, estos estimadores fueron:
- Heterocigosidad, este indicador estima el porcentaje de individuos heterocigotos
dentro de cada población y para cada microsatélite.
- Frecuencias alélicas, este indicador entrega la proporción en el cual se va a encontrar
un determinado alelo dentro de su locus respectivo para cada localidad.
- Distancia e Identidad genética, está basado en el análisis de distancia de Nei (1972),
en donde se calcula las medidas de distancia y de identidad genética entre poblaciones
analizadas en base a las diferencias en las frecuencias alélicas.
- Estadístico F, es el índice de fijación que mide el grado de heterocigosis y endogamia
en sus diferentes niveles (intrapoblacional, interpoblacional y total).
- Diferenciación genética de poblaciones (Test exacto de Fisher), analiza la
diferenciación de las poblaciones comparadas en base a las frecuencias alélicas,
determinado por un p mayor o menor a 0,05 y su respectiva desviación estándar.
17
5. RESULTADOS
5.1 Extracción de ADN
Para el protocolo de extracción de ADN de la especie Galaxias maculatus se obtuvo un
total de 34 muestras de ADN para el Lago Llanquihue y 30 muestras de ADN para la
población Pichilaguna.
La calidad del ADN para muestras del Lago Llanquihue y muestras de Pichilaguna se
pueden visualizar en el gel de agarosa realizado por medio de la electroforesis (Fig. 3),
mostrando una buena obtención de ADN para ambas localidades.
Figura 3. Fotografía de un gel de agarosa con 10 muestras de ADN de G. maculatus
con su localidad respectiva. La banda superior muestra el ADN concentrado y la banda
inferior de cada individuo muestra probablemente ARN.
18
5.2 Amplificación de Microsatélites
Se obtuvieron los cuatro marcadores analizados (Gmac 2; Gmac 4; Gmac 5 y Gmac 9)
a través de la amplificación de estos en los individuos de cada localidad.
Los números de muestras obtenidas para cada marcador por localidad se observan en
la tabla 3.
Tabla 3. Cantidad de muestras obtenidas por cada marcador en su respectiva localidad
Locus Lago Llanquihue Pichilaguna
Gmac 2 33 29
Gmac 4 31 27
Gmac 5 34 30
Gmac 9 34 30
Promedio 33 29
El tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos para cada locus fueron similares a los
encontrados por Carrea et al. (2009). Encontrándose valores para el marcador Gmac 2
de 176-192 pares de base, Gmac 4 de 200-256 pares de base, Gmac 5 de 186-242
pares de base y Gmac 9 de 129-147 pares de base (Fig. 4).
19
Figura 4. Fotografía de un gel de agarosa de las muestras del producto de PCR. Se
observan los fragmento de ADN de G. maculatus para cada locus analizado (Gmac 2, 4,
5, 9). Las muestras con el número 1 indican los individuos de la población Lago
Llanquihue y las muestras con el número 2 indican los individuos de la población
Pichilaguna.
5.3 Estimadores de diversidad genética
5.3.1 Lectura Microsatélites
Para la lectura de los microsatélites realizado por el programa Peakscanner se obtuvo
una alta cantidad de alelos por marcador, siendo el marcador Gmac 4 el que mayor
cantidad presento, con 11 alelos diferentes, altamente polimórfico respecto a los otros 3
microsatélites, mientras que el marcador Gmac 9 presentó solo 5 alelos dentro de las
dos poblaciones muestreadas. Para el caso de las poblaciones, el Lago Llanquihue
20
muestra una mayor cantidad de alelos encontrados por microsatélite, en comparación a
la población Pichilaguna (Tabla 4).
Tabla 4. Cantidad de alelos encontrados en cada microsatélite y en cada población
muestreada.
Locus Lago Llanquihue Pichilaguna total alelos
Gmac 2 5 2 6
Gmac 4 11 8 11
Gmac 5 7 7 8
Gmac 9 4 3 5
Promedio 6,75 5 ---
5.3.2 Alelos Compartidos y Privados
Los alelos compartidos corresponden a aquellos que podemos encontrar en todas las
poblaciones analizadas, en este caso las poblaciones Lago Llanquihue y Pichilaguna.
Los alelos privados son aquellos alelos exclusivos de una población dentro del total de
poblaciones analizadas. Estos dos tipos de alelos sirven para ver la conectividad de las
localidades estudiadas.
En estos casos, las dos poblaciones mostraron amplios porcentaje de alelos en común
por cada marcador (Tabla 5). Para el caso de alelos privados, la población del Lago
Llanquihue muestra una mayor cantidad respecto a la población Pichilaguna (Tabla 6).
21
Tabla 5. Número y porcentaje de alelos compartidos en las dos poblaciones.
Locus n° %
Gmac 2 1 16,7
Gmac 4 8 72,7
Gmac 5 6 75,0
Gmac 9 2 40,0
Total 17 56,7
Tabla 6. Número de alelos privados de cada población.
Locus Lago Llanquihue Pichilaguna
Gmac 2 4 1
Gmac 4 3 0
Gmac 5 1 1
Gmac 9 2 1
Total 10 3
5.3.3 Heterocigosidad
Respecto a las poblaciones analizadas, el Lago Llanquihue mostró una heterocigosidad
observada promedio de un 63,64%, la cual fluctuó entre 39,5 y 87,7 y la población
Pichilaguna mostró una heterocigosidad observada promedio de 51,3% con una
fluctuación entre 3,3 y 78,4.
En el caso de los marcadores, el que mayor heterocigosidad presentó fue el
microsatélite Gmac 4 con un 89,6%, mientras que el marcador que registró un menor
porcentaje de heterocigosidad fue el Gmac 2 con un 24,7% (Tabla 7).
22
Tabla 7. Porcentaje de heterocigosidad observada de cada población y de cada
marcador.
Heterocigosidad %
Poblaciones Loci
Lago Llanquihue Pichilaguna Gmac 2 Gmac 4 Gmac 5 Gmac 9
63,64 51,3 24,7 89,6 85,64 47,57
5.3.4 Frecuencias alélicas
Este tipo de análisis nos permite saber en qué proporción se encuentra un determinado
alelo dentro de un locus. En los marcadores Gmac 2 y Gmac 9 se registró altas
frecuencias de alelos específicos a pesar de que los marcadores son polimórficos. El
marcador Gmac 2 para el alelo 180 registró un 75% de frecuencia para el Lago
Llanquihue y un 98% para Pichilaguna y Gmac 9 registró cerca de un 70% para el alélo
139 en las dos poblaciones (Tabla 8). Respecto a los marcadores Gmac 4 y Gmac 5 no
se registró una alta frecuencia de algún alelo en particular siendo altamente
polimórficos estos dos marcadores (Tabla 9).
Tabla 8. Frecuencia alélica para el locus Gmac 2 y Gmac 9 por cada población.
Locus Gmac 2 Lago Llanquihue Pichilaguna Locus Gmac 9 Lago Llanquihue Pichilaguna
Alelos n=33 n=29 Alelos n=34 n=30
176 16,6 0 129 0 3,3
178 4,5 0 137 16,2 28,3
180 75,7 98,3 139 69,1 68,3
182 0 1,72 141 10,3 0
184 1,5 0 147 4,4 0
192 1,5 0
23
Tabla 9. Frecuencia alélica para el locus Gmac 4 y Gmac 5 por cada población.
Locus Gmac 4 Lago Llanquihue Pichilaguna Locus Gmac 5 Lago Llanquihue Pichilaguna
Alelos n=31 n=27 Alelos n=34 n=30
200 9,7 0 186 14,7 26,7
204 17,7 0 194 0 33,3
208 14,5 1,9 202 16,2 10
212 4,8 3,7 210 26,5 3,3
216 11,3 3,7 218 14,7 0
220 6,5 14,8 226 29,4 11,7
224 3,2 35,2 234 5,9 8,3
228 1,6 22,2 242 5,9 6,7
232 6,5 9,3
248 6,5 9,3
256 17,7 0
5.4 Estimadores de diferenciación genética
5.4.1 Distancia genética
Al comparar la población Lago Llanquihue y Pichilaguna, la distancia genética registro
un valor de 0,198, mostrando que las dos poblaciones muestreadas no comparten
alelos en ese valor y tienen una identidad genética del 0,819, es decir comparten alelos
en dicha cifra.
24
5.4.2 Estadístico F
Mide la reducción de heterocigosis que existe a diferentes niveles dentro de una
jerarquía poblacional; dentro de la misma población (Fis), entre las dos poblaciones
(Fst) y dentro del total de poblaciones muestreadas (Fit). Por ende, también mide los
niveles de endogamia que pueden existir en estas poblaciones para cada caso y las
subdivisiones que se pueden formar.
Dentro de los loci analizados el que mayor porcentaje presentó fue Gmac 4 con un Fit
de 40,61% y un Fis de 33,38% indicando un alto grado de endogamia y de
diferenciación dentro del total de las poblaciones muestreadas en comparación con los
otros loci (Tabla 10).
Tabla 10. Valores del Estadístico F por cada locus. Para el Fis, los valores cercanos a 0
mide exogamia y cercanos a 1 mide endogamia.
Locus F (Fit) Theta (Fst) f (Fis)
Gmac 2 0,2755 0,1359 0,1615
Gmac 4 0,4061 0,1085 0,3338
Gmac 5 0,3602 0,1369 0,2588
Gmac 9 0,0615 0,0133 0,0489
Todos los loci 0,3136 0,1038 0,2341
25
5.4.3 Diferenciación genética
La comparación de cada locus en las dos poblaciones muestreadas con un test exacto,
mostró diferencias significativas (p<0,05) para los 4 loci (Tabla 11). En relación a la
comparación de la población Lago Llanquihue y Pichilaguna, con el total de loci
analizados, también mostró diferencias significativas, con un p = 0,0001.
Tabla 11. Valores de probabilidad y error estándar para la comparación genética entre
las dos localidades mediante la prueba de Fisher.
Lago Llanquihue v/s Pichilaguna
Loci p s.e.
Gmac 2 0,0006 0,0006
Gmac 4 0,0001 0,0001
Gmac 5 0,0001 0,0001
Gmac 9 0,0057 0,0020
26
6. DISCUSION
6.1 Extracción y Amplificación de ADN
Los resultados de la extracción de ADN fueron los esperados para las dos localidades
estudiadas para Galaxias maculatus, obteniendo ADN concentrado y visible para
realizar los análisis posteriores.
Con las muestras de ADN obtenidas se logró amplificar los 4 microsatélites (Gmac 2;
Gmac 4; Gmac 5 y Gmac 9), definidos por Carrea et al. (2009), lo cual varió entre
localidades, llegando a obtener un máximo de 34 datos para el marcador Gmac 5 y
Gmac 9 en la población del Lago Llanquihue y un mínimo de 27 datos para el marcador
Gmac 4 en la localidad de Pichilaguna.
6.2 Diversidad genética
La cantidad de alelos encontrados en cada uno de los loci muestra rangos similares a
los observados por Carrea et al. (2009) para los mismo microsatélites. Además la
especie G. maculatus resultó ser altamente polimórfica, mostrando en las dos
poblaciones que todos los loci analizados son polimórficos, esto concuerda con
estudios realizados para la misma especie, donde Zattara & Premoli (2005) encuentran
que cada microsatélite analizado fue polimórfico en al menos una población de todas
las poblaciones muestreadas. Otro estudio realizado con la especie Galaxias vulgaris
27
en Nueva Zelanda, mostró que los 7 loci analizados resultaron ser polimórficos en al
menos 1 localidad (Wallis et al. 2001). Dados estos datos podemos afirmar que existe
una tendencia en la familia Galaxiidae a tener locus polimórficos.
Se encontró un total de 30 alélos con 4 microsatélites en las dos poblaciones
analizadas, de los cuales 17 alelos son compartidos, lo cual corresponde a un 56%.
Respecto a los alelos privados o exclusivos, la población Lago Llanquihue tiene mayor
cantidad, con 10 alelos privados, correspondientes a un 33% respecto a la población
Pichilaguna con solo 3 alelos privados correspondientes a un 10%. El número de alelos
encontrados por Carrea et al. (2009) en el análisis de muestras de los ríos de la
Patagonia Argentina es el mismo observado en los 4 microsatélites analizados en esta
tesis, teniendo como diferencia una mayor cantidad de individuos muestreados.
Se ha observado en otras especies, como Galaxiella pusilla presente en dos regiones
separadas del sur de Australia un bajo porcentaje de alelos compartidos entre
localidades, llegando a tener solo 25 alelos comunes, correspondientes a un 14% de un
total de 178 alelos (Coleman et al. 2010). Por otro lado, Zattara & Premoli (2005),
publican en su estudio 15 alelos compartidos de un total de 20, equivalentes a un 75%
en la comparación de los sectores norte y sur para la especie G. maculatus; Además
muestran para el sector norte el 25% restante en alelos privados y el sector sur sin
alelos privados.
Estos datos pueden ser muy variables debido a los distintos factores que pueden
afectar, como lo es la distancia geográfica de las poblaciones comparadas o el origen
28
filogeográfico de las poblaciones estudiadas, entre otros más, siendo necesario hacer
estudios que profundicen esos temas.
Respecto a la heterocigosidad, la especie G. maculatus mostró altos valores, con un
63% para la localidad del Lago Llanquihue y un 51% para la localidad de Pichilaguna.
Respecto al tipo de vida de esta especie, los resultados de heterocigosidad fueron los
esperados, con un mayor porcentaje para la población abierta (Lago Llanquihue) y un
menor porcentaje para la población cerrada (Pichilaguna). Según el estudio de Zattara
& Premoli (2005), los valores de heterocigosidad observada para las poblaciones
cerradas que se estudiaron no alcanzaría más del 29%, correspondiente al lago de
mayor área y perímetro. Coleman et al. (2010), registró una heterocigosidad observada
entre un 20 a un 65% dentro de todas las poblaciones cerradas que estudió. Mientras
que King et al. (2003), analizó dos poblaciones abiertas y una cerrada en Nueva
Zelanda para la especie Galaxias brevipinnis con valores de heterocigosidad de 73 y
64% para las poblaciones diadrómicas y un 42% para la población cerrada.
Para ambos tipos de ciclo de vida en los diferentes estudios revisados se registran altos
valores en los dos casos, pero existe una tendencia hacia valores más altos en
heterocigosidad para las poblaciones abiertas. Así, poblaciones o grupos de
poblaciones genéticamente aisladas o cerradas, se esperaría que lleguen a presentar
menores valores de variabilidad producto de su aislación y disminución de aporte de
nuevas variedades genéticas. Además, las poblaciones aisladas unas de otras tienden
eventualmente a mostrar una alta heterogeneidad en sus frecuencias alélicas, así como
29
la presencia de distintos alelos únicos, esto producto de posible ausencia de flujo
génico entre ellos y procesos de aislamiento.
Las frecuencias alélicas mostradas por los cuatro microsatélites resultaron ser bastante
variables, teniendo altas frecuencias para un alelo en especifico como es el caso de los
microsatélites Gmac 2 y Gmac 9 donde alcanzan porcentajes sobre el 75% para el alelo
180 y sobre el 69% para el alelo 139 respectivamente, para las dos localidades. Los
microsatélites Gmac 4 y Gmac 5, no mostraron altas frecuencias de algún alelo en
particular o alelo común, teniendo valores similares en todos los alelos encontrados, en
comparación con los microsatélites Gmac 2 y Gmac 9.
Los alelos que llegan a presentar frecuencias muy altas pueden indicar, a largo plazo,
un proceso de deriva génica, ya que se encuentra que un solo alelo presenta
frecuencias mayores al 70%, dejando valores de menos de un 10% para cada uno de
los restantes alelos, lo que muestra una posible tendencia a la fijación de un único alelo
en la población y a la posible pérdida de otros. La deriva genética puede llevar a la
pérdida de alelos de baja frecuencia y a la larga perdida de variabilidad genética,
haciendo más frágil a las poblaciones. Este proceso ocurre principalmente cuando los
tamaños poblaciones son muy reducidos.
Es así que, King et al. (2003) registró el proceso de deriva génica para una población
cerrada de G. brevippinis, llegando a encontrar microsatélites monomórficos o solo
dimórficos en sus frecuencias alélicas, es decir, con un único alélo o solo 2 alélos. Si
bien en el caso de nuestro estudio se encontró en dos microsatélites frecuencias altas,
30
esto requiere de varias generaciones para poder evaluar cambios y poder señalar la
presencia de esta fuerza evolutiva en las poblaciones que se están estudiando.
6.3 Diferenciación genética
La distancia genética, es una herramienta que se puede utilizar de mejor manera en la
comparación de poblaciones de distintas especies para ver su cercanía o distancia
genética, aunque de igual manera sirve para ver el grado de cercanía o alejamiento de
poblaciones de una misma especie. En la comparación de las dos poblaciones
analizadas (cerrada y abierta) la distancia genética de Nei nos entregó un valor de
0,198, indicando que en dicho valor ambas localidades no se asemejan en sus
frecuencias alélicas. Zattara & Premoli (2005) registraron un 0,082 de distancia genetica
para todas las poblaciones cerradas de G. maculatus, mientras que Wallis et al. (2001)
registró un 0,16 de distancia genética en poblaciones de G. vulgaris en Nueva Zelanda.
Barker & Lambert (1988) encontraron el rango de distancia genética entre 0,041 a 0,081
para 4 poblaciones diádromas distribuidas en las costa de Nueva Zelanda.
Por lo tanto, se puede inferir que poblaciones no migratorias de especies dentro del
género de los Galáxidos muestran un mayor grado de divergencia genética que
poblaciones con un ciclo migratorio.
El grado de divergencia y estructura poblacional también fue medido por el promedio
del valor Fst del estadístico F de Wright, que mide el grado de subdivisión que puede
existir entre la población del lago Llanquihue y la población Pichilaguna, dando en este
31
caso un Fst de 0,1038 indicando un grado de divergencia esperado para esta especie
en las localidades estudiadas. Zattara & Premoli (2005) registran los valores más altos
conocidos para G. maculatus en poblaciones con ciclos de vida cerrado, con Fst de
0,1880. Sin embargo, existen valores mucho mayores para otras especies no
migratorias de Galaxias spp., tales como G. paucispondylus Fst = 0,21 (Allibone &
Wallis, 1993) o G. vulgaris Fst = 0,33 (Wallis et al., 2001), en donde se registra un alto
grado de divergencia. También se han realizado investigaciones en poblaciones
migratorias de G. maculatus, donde Barker & Lambert (1988) registran valores de Fst =
0,05 en 4 poblaciones del norte de Nueva Zelanda y Pavuk (1994) registra valores de
Fst = 0,09 en 8 poblaciones de Tasmania y una del oeste de Australia.
Al grado de subdivisión medido por el estadístico F se suma la prueba exacta de Fisher
que mide la diferenciación que existe entre las dos poblaciones de puyes comparadas,
en el que dio un p menor a 0,05 mostrando que si existen diferencias genéticas
significativas entre la población del lago Llanquihue y la población de Pichilaguna.
Todos estos datos que se han obtenido a través de herramientas como lo son la
distancia genética de Nei´s, el estadístico F o la prueba exacta de Fisher nos permiten
inferir que ambas localidades analizadas, Lago y Laguna presentarían diferencias
genéticas significativas, lo cual puede indicar que las distancia entre ellas y la
característica de cerrada que presenta Pichilaguna, estarían actuando como barrera al
flujo génico entre ellas. Si este patrón continua o se acentúa podemos llegar a
establecer la presencia de un proceso de divergencia genética entre estas dos
poblaciones.
32
En efecto, ha sido demostrado que en poblaciones de especies no migratorias de
Galaxias existe un mayor grado de divergencia entre poblaciones, medido por Fst
(Wright, 1978) y por distancias genéticas de Nei (Nei 1972), que para poblaciones de
especies migratorias (Allibone & Wallis, 1993).
Además, el proceso de incremento de la divergencia genética procedería más rápido
cuando tamaños efectivos de población son pequeños, por el efecto combinado de
cuellos de botellas y endogamia (Nei et al., 1975), y teniendo en cuenta un flujo génico
restringido que promovería a su vez una mayor divergencia inter-población (Hartl &
Clark, 1997), lo que estaría ocurriendo en la localidad de Pichilaguna, una laguna de
tamaño 700 veces más pequeña en área y 28 veces menor en perímetro y sin aparente
flujo génico respecto al lago Llanquihue.
Por lo tanto, en base al desarrollo de esta tesis se ha logrado el objetivo de determinar
el grado de divergencia y estructuración genética en la comparación de una población
abierta y una población cerrada de Galaxias maculatus y mediante la aplicación del
método científico se ha aceptado la hipótesis 1 que planteaba que los individuos de la
localidad del Lago Llanquihue y Pichilaguna forman poblaciones diferentes
genéticamente, existiendo un posible proceso de divergencia genética entre ellas
debido a la ausencia de flujo génico.
33
7. CONCLUSION
La especie G. maculatus que se encuentra ampliamente distribuida en el sur de Chile, y
presentando dos ciclos de vida (poblaciones abiertas y cerradas), en base a este
estudio muestra diferencias genéticas significativas entre ambos tipos de poblaciones.
Estas poblaciones estarían en un posible proceso de divergencia, basado en los valores
que muestran los índices de diversidad y diferenciación genética, como lo es
principalmente las diferencias estadísticamente significativas mostradas por la prueba
de Fisher.
Por último, se observa que existe una mayor diversidad alélica para la población
migratoria (Lago Llanquihue) en relación a la población cerrada de Pichilaguna. Esto
puede ser causado por que el Lago Llanquihue tiene una mayor área y perímetro o por
los diferentes hábitats en los que pueden vivir los puyes
Por lo tanto, se acepta la hipótesis que plantea la ocurrencia de un proceso de
divergencia genética debido a un bajo o nulo flujo génico entre la población del Lago
Llanquihue y la población de Pichilaguna y la baja diversidad genética mostrada por la
población cerrada en comparación con una mayor diversidad mostrada por la población
abierta migratoria.
34
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