comparación de técnicas de colecta seminal colecta de
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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias
2015
Comparación de técnicas de colecta seminal colecta de semen Comparación de técnicas de colecta seminal colecta de semen
de epidídimo, colecta tradicional y criopreservación, en relación a de epidídimo, colecta tradicional y criopreservación, en relación a
la calidad espermática, en caninos la calidad espermática, en caninos
Yinet Liliana Sánchez Rodríguez Universidad de La Salle, Bogotá
José Eduardo Sánchez Calvo Universidad de La Salle, Bogotá
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UNIVERSIDAD DE LA SALLE
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Programa de Medicina Veterinaria
COMPARACIÓN DE TÉCNICAS DE COLECTA SEMINAL: COLECTA DE
SEMEN DE EPIDÍDIMO, COLECTA TRADICIONAL Y CRIOPRESERVACION,
EN RELACIÓN A LA CALIDAD ESPERMÁTICA, EN CANINOS
Trabajo De Grado
Yinet Liliana Sánchez Rodríguez
José Eduardo Sánchez Calvo
Bogotá, Colombia
2015
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Programa de Medicina Veterinaria
COMPARACIÓN DE TÉCNICAS DE COLECTA SEMINAL: COLECTA DE
SEMEN DE EPIDÍDIMO, COLECTA TRADICIONAL Y CRIOPRESERVACION,
EN RELACIÓN A LA CALIDAD ESPERMÁTICA, EN CANINOS
Trabajo De Grado
Yinet Liliana Sánchez Rodríguez
Código: 14082039
José Eduardo Sánchez Calvo
Código: 14082036
Director
Cesar Augusto Gómez
Bogotá, Colombia
2015
i
Aprobación
Director _____________________________
Dr. Cesar Augusto Gómez
Jurado ___________________________
Dr. José Carlos Coelho
Jurado ____________________________
Dr. Harvey Lozano
ii
Directivos
Rector Hno. Carlos Gabriel Gómez Restrepo
Vicerrector académico Hno. Fabio Humberto Coronado Padilla
Vicerrector de promoción Hno. Carlos Alberto Pabón
Y desarrollo humano
Vicerrector administrativo Dr. Eduardo Ángel Reyes
Vicerrector de investigación Luis Fernando Ramírez H.
Y transferencia
Decano de la facultad de Dra. Claudia Aixa Mutis.
Ciencias agropecuarias
Director de programa Dr. Fernando Nassar Montoya.
Medicina veterinaria
iii
Compromiso
Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la doctrina católica
en asuntos de dogma y moral.
Ni la universidad, ni el director, ni el jurado calificador son responsables de las ideas
expuestas por el graduando.
iv
Tabla de contenido
Aprobación .....................................................................................................................................i
Directivos ......................................................................................................................................ii
Compromiso ................................................................................................................................ iii
Lista de tablas .............................................................................................................................. vii
Lista de figuras ........................................................................................................................... viii
Resumen ....................................................................................................................................... ix
Abstract ........................................................................................................................................ xi
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................. 2
OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 3
Objetivo general ............................................................................................................................ 3
Objetivos específicos ...................................................................................................................... 3
HIPÓTESIS .......................................................................................................................................... 4
IMPACTO E INDICADORES ............................................................................................................. 4
1. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................................... 5
1.1 Evaluación andrológica ........................................................................................................... 5
1.1.1 Examen físico. ....................................................................................................................... 5
1.2 Examen seminal ....................................................................................................................... 6
1.2.1 Examen macroscópico. .......................................................................................................... 6
1.2.1.1. Volumen. ........................................................................................................................... 6
1.2.1.2. Color. ................................................................................................................................ 7
1.2.1.3. Ph ..................................................................................................................................... 8
1.2.2. Examen microscópico. .......................................................................................................... 8
1.2.2.1. Motilidad. ......................................................................................................................... 8
1.2.2.2. Concentración. .................................................................................................................. 8
v
1.2.2.3. Morfología ........................................................................................................................ 8
1.2.2.4. Vigor. .............................................................................................................................. 10
1.3. Métodos de extracción seminal .............................................................................................. 10
1.3.1 Colecta seminal tradicional. ................................................................................................ 10
1.3.2. Colecta directa del epidídimo. ............................................................................................ 11
1.3.3 Composición del semen canino. ........................................................................................... 14
1.4. Crio conservación del semen ................................................................................................. 14
1.5 Factores que afectan al espermatozoide en la crio conservación ........................................... 15
1.5.1 Estrés térmico...................................................................................................................... 16
1.5.2. Estrés osmótico y formación de cristales de hielo ................................................................ 16
1.5.3. Estrés oxidativo. ................................................................................................................. 17
2. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 19
2.1 Localización ........................................................................................................................... 19
2.2 Población y muestra ............................................................................................................... 19
2.3 Variables ................................................................................................................................ 19
2.4 Análisis estadístico ................................................................................................................. 19
2.5. Toma de muestra directa de epidídimo ................................................................................... 20
2.5.1. Recolección de espermatozoides epididimarios. .................................................................. 20
2.5.2. Recolección de semen de forma tradicional . ....................................................................... 25
3. RESULTADOS ............................................................................................................................... 26
3.1 Viabilidad .............................................................................................................................. 26
3.1.1. Viabilidad pre y post congelación para extracción directa.................................................. 26
3.1.2. Viabilidad pre y post congelación para extracción tradicional ........................................... 27
3.2. Motilidad .............................................................................................................................. 28
3.2.1. Motilidad pre y post congelación para extracción directa. ................................................... 28
3.2.2. Motilidad pre y post congelación para extracción tradicional ............................................. 29
3.3 Vigor ...................................................................................................................................... 30
3.3.1. Vigor pre y post congelación para extracción directa. ......................................................... 30
vi
3.3.2 Vigor pre y post congelación para extracción tradicional ..................................................... 31
3.4 Morfología ............................................................................................................................ 32
4. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 34
5. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 37
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 38
ANEXOS ......................................................................................................................................... 43
vii
Lista de tablas
Tabla 1: Parámetros a evaluar microscópicamente en una muestra seminal ............... 12
Tabla 2: Diluyentes utilizados en crio conservación de semen canino.......................... 15
Tabla 3: Viabilidad pre y post congelación para extracción directa ........................... 26
Tabla 4: Viabilidad pre y post congelación para extracción tradicional ..................... 27
Tabla 5: Motilidad pre y post congelación para extracción directa. ............................ 28
Tabla 6: Motilidad pre y post congelación para extracción tradicional. ...................... 29
Tabla 7: Vigor pre y post congelación para extracción directa .................................... 30
Tabla 8: Vigor pre y post congelación para extracción tradicional.............................. 31
Tabla 9: Morfología para toma directa y tradicional. .................................................. 32
viii
Lista de figuras
Figura 1: Materiales utilizados en recolección de Espermatozoides epididimarios ...... 20
Figura 2: Disección del epidídimo ............................................................................... 21
Figura 3: Llenado y lavado del conducto deferente y cola del epidídimo. .................... 22
Figura 4: Envasado de pajillas .................................................................................... 23
Figura 5: Sellado hermético de pajillas. ...................................................................... 23
Figura 6: Curva de enfriamiento y congelación de pajillas .......................................... 24
Figura 7: Mantenimiento de pajillas a temperatura ambiente ...................................... 25
Figura 8: Comparación de viabilidad pre y post congelación para directo. ................. 27
Figura 9: Comparación de viabilidad pre y post congelación para tradicional ......... 28
Figura 10: Comparación de motilidad pre y post congelación para tradicional. ....... 30
Figura 11: Comparación de vigor pre y post congelación para muestra directa ....... 31
Figura 12: Comparación de vigor pre y post congelación para colecta tradicional.... 32
Figura 13: Comparación de porcentaje de anormalidades encontradas entre
tratamientos. ............................................................................................................... 33
ix
Resumen
La obtención de espermatozoides a nivel testicular (conducto deferente) para su
crio preservación, es una potente herramienta para el rescate de células germinales de
animales domésticos con alto valor genético, que murieron repentinamente por
accidente o enfermedad. Este estudio compara dos técnicas de colecta seminal de las
cuales es posible obtener material para llegar a lograr progenie de estas especies, o su
valor zootécnico. El objetivo principal de este estudio es comparar la viabilidad del
material seminal colectado directamente del epidídimo y por medio de colecta seminal
manual que es la que se usa tradicionalmente, en caninos, en la clínica veterinaria de la
Universidad de La Salle. Recolectando 5 muestras de cada tratamiento.
Cada par de testículos se tomó de las prácticas realizadas en la cátedra de
técnicas quirúrgicas en el año 2014 en la misma universidad. Después de tomados los
testículos se lavaron con NaCl al 0.9 %, se disecaba el epidídimo y se procedía a canular
el conducto deferente en el cual se inyectaba el medio para diluir los espermatozoides
directo del epidídimo. Para la colecta tradicional utilizamos el método manual de la
“mano enguantada” y recolectamos 5 muestras en total.
Las variables que se analizaron en el estudio fueron: motilidad espermática (%),
morfología espermática (%), vigor espermático (escala de 0 a 5) y viabilidad del
espermatozoide. Encontrando resultados de promedio de 65% en viabilidad para semen
epididimario pre congelación y 47% pos congelación obteniendo una diferencia
significativa (p≤0.05), en cuanto a la motilidad: 73% pre congelación y 55% post
congelación de Vigor pre congelación 3.4 y post congelación de 2.7. Además obtuvimos
x
el 33% de anormalidades en semen obtenido del epidídimo vs 25% de anormalidades en
semen obtenido por eyaculación.
La célula espermática es susceptible a los factores ambientales sin la protección
del plasma seminal. Pero sigue siendo viable sin este. Es importante estandarizar un
protocolo para obtención de espermatozoides del epidídimo lo cual ayudara a preservar
células germinales de animales en vía de extinción o de alto valor genético.
xi
Abstract
Obtaining level epididymal sperm for cryopreservation, is a powerful tool for
germ cell rescue pets with high genetic merit, who died suddenly by accident or disease.
This study compares two techniques seminal collection of which it is possible to
achieve the material to reach progeny of these species or zoo technical value. The main
objective of this study is to compare the viability of semen collected directly from the
epididymis and through traditional collection, in dogs at the veterinary clinic of the
University of La Salle. Collecting 5 samples of each treatment
Each pair of testicles was taken from the practices carried out in the class of
surgical techniques in 2014 at the same university. After holding the testicles were
washed with 0.9% NaCl, the epididymis was cut and proceeded to catheterize the vas
deferens in which the medium was injected to dilute the direct epididymal sperm. To
use the traditional manual method collects the "gloved hand" and collect 5 samples in
total.
The variables analyzed in the study were: sperm motility (%), sperm
morphology (%), vigor sperm (scale 0-5) and viability of sperm. Finding results in
average viability of 65% for epididymal sperm post-thaw prefreezing obtaining 47%
and a significant difference (p≤0.05), motility about 73% and 55% prefreezing Vigor
post freezing and pre freeze and post-thaw 2.7 3.4 . In addition, we obtained 33% of
abnormalities in epididymal sperm obtained vs 25% of abnormalities in sperm obtained
by ejaculation.
The sperm cell is susceptible to environmental factors without the protection of
seminal plasma. But still viable without it. It is important to standardize a protocol for
xii
obtaining sperm from the epididymis which help preserve germ cells of animals in
danger of extinction or high genetic value.
1
Introducción
En los últimos años todas las técnicas en vía a mejoramiento genético han
venido tomando fuerza ya que es indispensable para generar mayores ingresos
económicos, mayor número de individuos por parto y mayor resistencia a
enfermedades. La muerte inesperada de un animal con alto valor genético puede ser
aprovechada para obtener su material genético. En algunos casos los machos de alto
valor genético pueden tener enfermedades o problemas reproductivos o
comportamentales que indiquen realizar una corrección quirúrgica como la
orquiectomía o vasectomía, en este caso se puede garantizar la crio preservación de este
semen obtenido de la cola del epidídimo y así obtener descendencia de este ejemplar.
La obtención de espermatozoides a nivel epididimario para su crio preservación,
es una potente herramienta para el rescate de células germinales de animales domésticos
con alto valor genético, que murieron repentinamente por accidente o enfermedad.
(Hernández, 2004)
La perspectiva de cruzar razas en todo el mundo se ven facilitadas con la IA; con
la disponibilidad de utilizar un reproductor para hembras en diferentes ubicaciones
geográficas, sobrepasar el efecto de la edad del macho, o incluso su muerte, cuando sus
gametos son preservados adecuadamente en un banco de semen. Particularmente las
razas menos comunes en diversos países pueden acceder al semen de otros lugares,
aumentando la variabilidad genética, aspecto crucial para evitar problemas debido a la
endogamia. (Gobello, 2005)
En este estudio vamos a enfrentar la calidad espermática de un semen obtenido
por colecta tradicional y un semen obtenido de la cola de epidídimo de testículos
2
obtenidos por orquiectomía, evaluaremos la calidad del semen, y viabilidad de los
espermatozoides mediante parámetros macroscópicos y microscópicos.
Planteamiento del problema
Existen razas de caninos de alto valor genético que deben ser castrados por
razones comportamentales, que no pueden realizar monta por algún tipo de
impedimento físico, que no se le puede realizar colecta de semen por los métodos
convencionales por alguna causa traumática o por una enfermedad grave, realizando la
colecta directamente del epidídimo podremos obtener el semen de estos caninos para
crio preservar y confrontar con la forma tradicional de colecta para darle una valoración
comparativa a la colecta directa de epidídimo, determinando si esta técnica es efectiva
para llegar a una inseminación artificial exitosa, con esta técnica también se puede
evitar contagio y diseminación de procesos infección transmitidos en la monta en el
caso de los perros podemos hablar del tumor venéreo transmisible (TVT) el cual es un
tumor que ocurre generalmente en la mucosa de los genitales, esta neoplasia no se
origina por transformación de células del paciente, si no que se trata de un alotrasplante
de células previamente transformadas. (Carlos Gonzalez, 2003) Es transmitido
principalmente durante el coito y se encuentra ampliamente distribuido en el ámbito
mundial, donde los perros callejeros tienen un papel importante en la diseminación.
(Pacheco, 2003).
3
Objetivos
Objetivo general
Comparar la viabilidad del material seminal colectado directamente del
epidídimo y por medio de colecta tradicional, en caninos en la clínica de la Universidad
de La Salle.
Objetivos específicos
1. Evaluar la viabilidad de espermatozoides extraídos directamente de testículos de
perros.
2. Determinar la calidad de la muestra de esperma obtenida por estimulación
manual
3. Establecer la calidad del material biológico pos-congelación.
4
Hipótesis
La calidad del material seminal obtenido por medio de la extracción directa del
epidídimo es igual o mejor que la calidad extraída por medio de la técnica tradicional.
Impacto e indicadores
Generar un documento de los parámetros y de la técnica de manipulación de
semen canino.
Estandarizar una técnica para el almacenamiento de material genético
procedente de epidídimos caninos
5
1. Marco teórico
1.1 Evaluación andrológica
El sistema reproductor del macho realiza tres funciones básicas que son: la
producción y maduración de los espermatozoides en los testículos; la maduración,
almacenamiento y transporte de los espermatozoides en el sistema tubular, y la
deposición de los espermatozoides en el sistema reproductor femenino mediante el
pene, los testículos se componen de dos tipos de tejido, los túbulos seminíferos y el
tejido intersticial. La proporción entre los dos tipos de tejido varía considerablemente
entre especies. Los túbulos seminíferos se abren en conductos colectores llamados vasos
eferentes los cuales, a su vez, se abren en el epidídimo, que es una estructura en forma
de espiral, El epidídimo se divide en cabeza, cuerpo y cola que emergen medialmente y
se localizan en la superficie dorso lateral del testículo en el perro. El movimiento del
espermatozoide a lo largo del epidídimo es el resultado del peristaltismo. La cola del
epidídimo actúa como un almacén de espermatozoides esperando el momento de la
eyaculación y desemboca en el conducto deferente que también actúa como un
reservorio de espermatozoides. (Simpson, 2000).
1.1.1 Examen físico. Para la realización del examen andrológico se debe comenzar
por hacer una buena anamnesis y examen físico completo del animal para descartar
enfermedades sistémicas o afecciones locales que alteren la reproducción; de igual
manera la evaluación de los órganos del sistema reproductivo es importante. En la
anamnesis el clínico debe obtener una historia completa que incluya la administración
de cualquier tipo de medicamentos, indagación sobre pruebas de laboratorio como la de
6
brucelosis, en particular, así como descartar procesos patológicos de transmisión directa
o sexual en los animales que realizar monta directa (Nunes, 2008).
1.2 Examen seminal
La determinación de las características seminales es un factor clave para predecir el
potencial fertilizante del macho. (A.I.Peña, 2004)
En el epidídimo ocurre la maduración funcional y morfológica de los
espermatozoides de virtualmente todas las especies de mamíferos y se almacenan por
algunos días o semanas en una condición viable y fértil antes de la eyaculación. Hay que
recordar que el número de espermatozoides disponibles para la eyaculación, depende de
las reservas en la cola del epidídimo, conducto deferente y ámpula, y que los
espermatozoides de la cabeza y del cuerpo del epidídimo no participan en la
eyaculación. (Hernández, 2004)
Los espermatozoides recién producidos deben experimentar un proceso de
maduración que les permita fecundar. Para que maduren deben migrar por el epidídimo
(cabeza-cuello-cola) y adquirir las características fecundantes. (Hafez, 2005)
Para la calificación de la fertilidad potencial hay que registrar color, volumen, olor y
características microscópicas como porcentaje de motilidad progresiva, concentración
espermática y porcentajes de espermatozoides vivos. (Wanke, 2006)
1.2.1 Examen macroscópico. Es la que se evalúa a simple vista, sin necesidad de
equipos especiales como un microscopio. Incluye volumen, color y pH.
1.2.1.1. Volumen. Varía según la raza, edad, tamaño, clima, etc. También se ve una
variación con la cantidad recolectada de la tercera fracción. El volumen debe registrarse
7
antes de eliminar ninguna muestra; este valor se necesita para calcular el número total
de espermatozoides en el eyaculado. Se debe medir el volumen del eyaculado el cual
varía según la raza, edad, tamaño y no tiene relación con la fertilidad del animal. Puede
variar desde 1 hasta 40 ml por eyaculado (Feldman, 2000).
El perro eyacula normalmente en tres fracciones:
Primera fracción: Denominada pre espermático y su volumen varía desde gotas
hasta 1 ml aproximadamente, de consistencia acuosa y transparente, el tiempo de
emisión varía entre 30 y 50 segundos.
Segunda fracción: Fracción espermática, más rica en espermatozoides y
proviene del epidídimo, de color gris a blanco lechoso, la duración promedio del
segundo proceso de eyaculación varía entre 50 y 80 segundos. y varía entre 0.5 y
2 ml.
Tercera fracción: Fracción post-espermática o prostática, es la más voluminosa,
compuesta en su totalidad por líquido prostático, de color transparente y acuosa,
su emisión tiene una duración promedio de 3 a 30 minutos y es de
aproximadamente 4 ml (1 - 17 ml). No es necesaria la recolección de líquido
prostático para valorar la movilidad y morfología de los espermatozoides, ni
para la inseminación artificial. (Feldman, 2000).
1.2.1.2. Color. El semen normal es de color blanco lechoso. El color y la opacidad
de la muestra de semen debe observarse inmediatamente después de la recolección. El
color rojo indica la presencia de sangre, ya sea de la superficie del pene o de la próstata.
El color amarillo indica la presencia de orina y partículas blancas pueden ser indicativas
de la presencia de leucocitos (Keuerk, 2013)
8
1.2.1.3. pH. El pH normal del semen canino oscila entre 6,3-7 y depende de la
cantidad de líquido prostático recolectado. Una disminución en el pH podría indicar una
eyaculación incompleta o una inflamación de testículos o epidídimos. (Sorribas C. ,
2000)
1.2.2. Examen microscópico.
1.2.2.1. Motilidad. El semen canino contiene cantidades apreciables de
electrolitos como los cloruros. La motilidad del espermatozoide es incrementada por el
potasio, magnesio y calcio. Las vitaminas presentes en el plasma seminal son ácido
ascórbico, Inositol que ayuda en la regulación de la presión osmótica y trazas de
vitaminas del complejo B. Para evaluar la motilidad se debe observar inmediatamente
después de la recolección, esto para observar los espermatozoides aun cuando la
temperatura de su medio es aceptable para su sobrevivencia. (Bonilla, 2007)
1.2.2.2. Concentración. Se debe calcular la concentración del eyaculado para
conocer el número total de espermatozoides presentes, en cámara de Neubauer y se
cuenta el cuadrado central de 1mm El número de espermatozoides contados en el
cuadrado central grande equivale al número en millones de los mismos por ml; Este
valor es multiplicado por el volumen total del eyaculado para calcular el número total de
células en el mismo. Para el perro se considera normal de 200 a 500 millones de
espermatozoides normales/eyaculado. (Bonilla, 2007)
1.2.2.3. Morfología. La evaluación de la morfología consiste en la coloración de
la muestra de la segunda fracción y se calcula el porcentaje de las células normales
dentro del eyaculado. Sin el examen morfológico del semen cualquier valoración de la
fertilidad es incompleta; se puede usar coloración de Wright, eosina-nigrosina, los
9
espermatozoides aparecen silueteados sobre un fondo negro (nigrosina); fijación del
semen con formol (1- o 2 gotas de formol amortiguado en 1 ml de semen) y luego se
observa con microscopio de luz. (Bonilla, 2007).
Las anormalidades de los espermatozoides se clasifican en primarias y
secundarias:
Anormalidades primarias: este tipo de anormalidades ocurren durante
espermatogénesis (dentro de los túbulos seminíferos), suelen ubicarse en la
cabeza y porción media del espermatozoide.
Anormalidades secundarias: estas son problemas en la maduración del mismo
espermatozoide ocurre durante el tránsito a través del sistema de ductos del
testículo y epidídimo. Como un ejemplo de esta anormalidad es la gota
citoplasmática. Deben ser menores al 20% del esperma defectuoso en el perro
normal.
Las anormalidades no deben ser mayores al 30% de los defectos totales, es decir un
semen normal debe tener un mínimo de 80% de espermatozoides morfológicamente
normales.
En la especie canina, los defectos espermáticos primarios que se sabe que están
asociados a infertilidad son gotas citoplásmicas proximales, defectos del cuello y
defectos de la pieza intermedia. Aunque los defectos secundarios, por ejemplo piezas
intermedias plegadas o colas dobladas o enrolladas, se consideran menos graves que los
primarios, ya que normalmente representan una respuesta transitoria frente a un estrés
puntual, es obvio que si afectan a una gran proporción de los espermatozoides del
eyaculado van a comprometer la motilidad y la fertilidad. (Keuerk, 2013)
10
1.2.2.4. Vigor. Se evalúa el vigor, al mismo tiempo que la motilidad, teniendo
en cuenta la velocidad con la que estos espermatozoides atraviesan el campo. La escala
que se utiliza es de 0 a 4, evaluando como 0 los espermatozoides inmóviles y como 4
los que avanzan rápidamente por el campo y son difíciles de seguir visualmente. Dentro
de estos parámetros se consideran los puntos intermedios. Se considera como valor
mínimo aceptable un vigor de 3. (Gomez V, n.d.)
1.3. Métodos de extracción seminal
1.3.1 Colecta seminal tradicional. Existen varios métodos para la extracción,
el que se describe a continuación, el método de la “mano enguantada”, es el más usado.
Otros son la electro eyaculación, la recolección con vagina artificial o con cono de látex.
Por lo general se requiere la presencia de una hembra, si se encuentra en celo mejor,
para la provocación del macho y favorecer la producción de una elevada cantidad de
espermatozoides. Si la hembra no está en celo se le puede frotar en su cuarto posterior
secreciones de hembras en estro o feromonas artificiales, para así excitar al macho.El
método de la “mano enguantada” requiere estimulación manual, el glande parcialmente
en erección como consecuencia de la estimulación sexual de la hembra en celo, se
extrae con la mano izquierda del prepucio que lo envuelve y, haciéndolo alrededor por
abajo, se le aplica masaje hasta que se perciba una clara separación entre en glande y el
bulbo del glande. Cuando la reacción es buena, el perro comienza además a realizar
fuertes empujes con la región pélvica, como ocurre en el apareamiento natural. Luego,
corriendo hacia atrás el prepucio, se extiende hacia delante el glande, que ha aumentado
mucho su perímetro con gran rapidez. Por lo general la eyaculación de la fracción rica
en espermatozoides (lechosa, blanquecina) coincide con la completa erección del pene y
11
se recoge con un vaso graduado. En la mayoría de los casos el perro se eleva durante la
eyaculación de la fracción rica en espermatozoides, levantando una extremidad
posterior. Después, manteniendo la sujeción a nivel del cuerpo del pene, el glande se
desvía mediante ligera tracción, primero lateralmente entre las dos extremidades
posteriores del macho en dirección caudal, tal como sucede en el apareamiento natural.
Cuando la relajación súbita del miembro anuncia la conclusión del “apareamiento”
puesto en marcha para obtener el semen, se anula inmediatamente la fijación del pene
(Keuerk, 2013)
1.3.2. Colecta directa del epidídimo. La obtención de espermatozoides a nivel
testicular (conducto deferente) para su crio preservación, es una potente herramienta
para el rescate de células germinales de animales domésticos con alto valor genético,
que murieron repentinamente por accidente o enfermedad entre las especies
domésticas en que se ha aplicado esta técnica se encuentran: bovinos, caprinos,
porcinos, equinos, gatos y caninos (Hernández, 2004).
Las técnicas para la crio-conservación de espermatozoides inicialmente han
tenido un progreso lento; los efectos de la crio-conservación sobre la función
espermática y la fertilidad han sido ampliamente estudiados y descritos, particularmente
en bovinos (Novoa, 2013).
En la tabla 1 se indican los parámetros a evaluar en el examen microscópico del
semen canino, la indicación de cada parámetro y el método de evaluación de cada uno.
12
Tabla 1: Parámetros a evaluar microscópicamente en una muestra seminal
PARÁMETRO INDICACIÓN MÉTODO DE
EVALUACIÓN
Motilidad El mayor indicador de
funcionalidad espermática, ya
que es requerida cuando el
espermatozoide se encuentra en
fase de transporte en el
oviducto; es una manifestación
de la competencia funcional y
estructural del espermatozoide.
Se correlaciona positivamente
con la integridad de membrana
y morfología normal. Se
expresa en porcentaje, y el
valor normal en el perro es de
70% y 90%.
Evaluada por microscopía
de contraste con objetivos
10X o 20X.
Motilidad individual o
Motilidad Progresiva:
igualmente en microscopio
a mayores aumentos (100X
a 200X)
Se observa una gota de
semen entre porta y
cubreobjetos atemperados
a 37°C, se debe observar el
número de
espermatozoides con
movimiento progresivo,
nunca curvo, rotatorio ni
oscilante, también se
expresa en porcentaje
13
Concentración Tiene poco valor como
indicador de la calidad del
semen; la concentración se
multiplica por el volumen y se
da en total de espermatozoides
por eyaculado.
Cámaras de recuentos
celulares(Neubauer)
Morfología Es un indicativo del potencial
fecundante del eyaculado, ya
que las alteraciones interfieren
en la capacidad de movimiento
y fecundante del
espermatozoide.
Tinciones: Negrosina-
eosina en microscopia de
campo claro, fijación de
muestras en solución
formol 10% por
microscopia de contraste
Integridad de
membrana
Para ello debe emplearse la
prueba hiposmótica, ésta mide
la capacidad que presenta
membrana espermática para
permitir el flujo de iones y agua
al interior de la célula
Basada en el conteo de 100
células en la cámara de
Neubauer con microscopía
óptica a 200X, en fase de
contraste, para identificar
espermatozoides con cola
doblada o enrollada.
Tinciones: simples y
triples; tinción fluorescente
Adaptado de: (Torres, 2011).
14
1.3.3 Composición del semen canino. El semen eyaculado se compone de los
espermatozoides suspendidos en el plasma seminal. La porción líquida del eyaculado se
denomina plasma seminal. Está constituido por la secreción de las glándulas accesorias
(ampolla del conducto deferente y próstata, solo en el perro). Así como una minúscula
porción porcentual de productos de secreción del epidídimo. Los diferentes productos
del plasma seminal no se limitan a un mismo origen o glándula. Tiene una gran
variación entre especies, entre individuos dentro de una misma especie, y además se
presentan variaciones estacionales que son más evidentes en las especies de
reproducción estacional. Los iones más frecuentes en el plasma seminal son el sodio y
el potasio, Otros componentes son las prostaglandinas (E y F), enzimas (fosfolipasas,
fosfatasas, etc.), otras proteínas asociadas a la fertilidad como osteopontina, péptidos y
aminoácidos, fosfolípidos por ejemplo colina, lípidos (colesterol, testosterona, etc.),
carnitina, ácido láctico, ascórbico, etc. Otros componentes con actividad antimicrobiana
como inmunoglobulinas A, y con actividad hormonal como andrógenos, estrógenos,
LH, relaxina, etc. (Keuerk, 2013)
1.4. Crio conservación del semen
En cuanto a la crio conservación del semen según (Simpson, 2000) se han
publicado una gran variedad de diluyentes y de protocolos para la congelación y
descongelación de semen. En la tabla 2 observamos una variedad de Diluyentes para
semen congelado que se utilizan actualmente. El autor ha trabajado sobre todo con el
diluyente TRIS, que durante muchos años le ha dado buenos resultados con el semen de
perro y de zorro. En ambas especies, el autor ha obtenido una tasa de concepción del 67-
15
80% después de la deposición intrauterina de 50-150 x 106 espermatozoides por
inseminación, con dos inseminaciones separadas 24 horas.
Tabla 2: Diluyentes utilizados en crio conservación de semen canino.
DILUYENTES PARA SEMEN CONGELADO
Diluyente de Seager(1969): (periodo
medio de conservación del semen 30-35
meses)
Diluyente de Andersen (1975): (
periodo medio e conservación del
semen 18 meses)
Lactosa 11% p/v Tris ( hidroximetil-
metilamina)
2.9 g
Glicerol 4 % v/v Fructosa 1.25 g
Yema de huevo 20% v/v Ácido cítrico 1.32 g
Agua bidestilada 100 ml Agua destilada 100 ml
Dihidroestreptomcina 100 mg/100 ml Glicerol 8% v/v
Penicilina 1000 UI/ml Yema de huevo 20% v/v
Tomado de: (Sorribas C. , 2005)
1.5 Factores que afectan al espermatozoide en la crio conservación
La crio conservación es una técnica mediante la cual el material biológico se
mantiene viable por tiempo indefinido. Gracias a las diferencias de tasas de congelación
y descongelación entre especies, se han planteado diversidad de protocolos de
congelación; lo anterior indica que se hace importante realizar estudios con el semen de
cada especie que sea de interés para el investigador y mediante esto validar una técnica
16
que logre una conservación de las muestras seminales a largo plazo sin que se vea
afectada significativamente la capacidad fecundante del espermatozoide. Las tasas de
enfriamiento y descongelación, están sujetas a transiciones; pues estas dependen de
factores tales como el diluyente, el crio protector, el sistema de empaque y por supuesto
la calidad seminal que es un parámetro altamente variable entre especies (Medina-
Robles, 2007)
1.5.1 Estrés térmico. El enfriamiento del semen disminuye la actividad
metabólica de los espermatozoides y reduce el crecimiento bacteriano gracias a esto se
prolonga la viabilidad de los espermatozoides (Palma, 2001).
El hecho de que los protocolos se basen en establecer tasas de congelación está
en que las células se vuelven menos sensibles en unas próximas horas luego del
eyaculado. Se ha determinado que una muestra seminal puede mantenerse hasta por 16
horas incubado a temperatura ambiente en su propio plasma seminal, lo que lleva a
sugerir que debe haber un rango de por lo menos unas 6 horas antes de congelar que es
cuando se ha alcanzado la máxima resistencia. Aun así, con una curva de congelación
lenta estos cambios de temperatura inducen estrés de membrana, por los cambios en
lípidos que se generan; y del mismo modo los elementos del citoesqueleto presentan
sensibilidad a dichas variaciones de la temperatura, resultando con una
despolimerización prematura de los filamentos de actina; éste es un paso necesario para
permitir la aproximación de la membrana plasmática y el subyacente exterior de la
membrana acrosomal promoviendo así la exocitosis acrosomal. (Watson, 2000).
1.5.2. Estrés osmótico y formación de cristales de hielo. En el proceso de la
crio preservación las células son sometidas a un medio hipertónico, por lo que la célula
17
en un inicio se encoge, pero retoma su volumen normal cuando el crio protector entra a
la célula (N Songsasena, 2002)
Otras alteraciones o fenómenos que ocurren en el proceso son el choque térmico
y la formación de grandes cristales d hielo intracelular. Estos procesos ocurren si la
curva de congelación es muy rápida, lo que genera la deshidratación progresiva de la
célula. (Pickett, 1987)
La tasa de congelación está directamente relacionada con la permeabilidad de la
membrana celular y las células que tienen una mayor permeabilidad al agua requieren
de una mayor tasa de congelación para sobrevivir idealmente el hielo formado durante
la congelación se conducirá a un aumento de la presión osmótica en el medio sin
congelar, que a su vez sacara más agua de la célula; la concentración de sales aumentará
tanto intra como extracelular mientras el agua se congela y la temperatura tiene que
disminuir para proteger a las proteínas de la concentración de sales por lo tanto las tasas
de congelación demasiado rápidas causa daños estructurales por la formación de hielo
intracelular y las tasas de congelación demasiado lentas causaran daño a las proteínas
debido a las sales; el daño de la mayoría de las células se produce durante la
congelación y el deshielo, por esta razón la descongelación del semen en general debe
hacerse muy rápido para disminuir la posibilidad de daños por el crecimiento
extracelular de cristales de hielo. (Crabo., 2001).
1.5.3. Estrés oxidativo. El estrés oxidativo en los espermatozoides consiste en
el daño de los componentes estructurales y fisiológicos que surgen en ellos cuyo efecto
está directamente relacionado con la disminución de la sobrevivencia y capacidad
fecundante. (Villa, 2009).
18
El daño de membrana en los espermatozoides causado por los ROS, está dado
por la alteración de su permeabilidad ya que se afectan las bombas de Na+ y Ca2+,
teniendo como consecuencia el ingreso de estos cationes al interior del espermatozoide,
alterando la osmolaridad, permitiendo la formación de fosfatos de calcio pocos solubles,
agotamiento del ATP y activación por medio del Ca de enzimas proteolíticas y
fosfoglucolipídicas, provocando así el daño proteico y lipídico, al igual que alteraciones
en el ADN y finalmente la muerte celular. (Villa, 2009)
19
2. Materiales y métodos
2.1 Localización
El proyecto se realizó en las instalaciones de la universidad de la Salle; el
laboratorio de reproducción animal y la clínica de pequeños animales de la Universidad.
2.2 Población y muestra
Se utilizaron cinco pares de testículos de caninos, estos fueron obtenidos desde
las prácticas de orquiectomías realizadas en la clínica de la universidad de la Salle por
los estudiantes de técnicas quirúrgicas.
Para el método de colecta tradicional se utilizaron cinco perros aparentemente sanos de
la clínica veterinaria de la universidad la Salle con previa autorización de propietario.
2.3 Variables
Las variables que se analizaron en el estudio fueron: motilidad espermática (%),
morfología espermática (%), vigor espermático (escala de 0 a 5) y viabilidad del
espermatozoide.
2.4 Análisis estadístico
Para el análisis de los resultados obtenidos en las pruebas de laboratorio el
estudio se apoyó básicamente de la herramienta estadística descriptiva del programa
Excel® , además se empleó un análisis de varianza y anova simple para estimar las
diferencias entre las medias de los valores obtenidos en cada grupo evaluado; utilizando
el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI®.
20
2.5. Toma de muestra directa de epidídimo
La recolección de los testículos se realizó conforme se realizaban las prácticas
de orquiectomías en la clínica de la universidad de la Salle, las cuales se realizaban cada
quince días. Inmediatamente se realizaba la orquiectomía se colocaban los testículos en
una caja de Petri y eran trasladados lo más rápido posible al laboratorio de reproducción
de la universidad de la Salle.
A cada testículo se le realizó un lavado externo con solución salina fisiológica
(NaCl al 0.9%) para remoción de sangre y contaminantes externos. (Figura 1)
Figura 1: Materiales utilizados en recolección de Espermatozoides epididimarios.
Fuente: Autores, 2014
2.5.1. Recolección de espermatozoides epididimarios. Para realizar la
recolección de los espermatozoides epididimarios se procedió a realizar la disección de
los testículos retirando todas las túnicas para poder así canular el conducto deferente.
21
Se localizó en el epidídimo la porción correspondiente a la cola del mismo en el
cual se realizaron cortes horizontales y verticales con chuchillas minora (Figura 2)
Figura 2: Disección del epidídimo. Fuente: Autores, 2014
Se utilizó un catéter G24 0,7 mm. X 19 mm el cual se acoplo al conducto
deferente, este catéter se acopló a un venoclisis el cual estaba adaptado con una jeringa
que contenía 5 ml de medio diluyente TRIS. La porción seccionada del epidídimo se
coloca cerca de la caja de Petri y se toma el testículo con cuidado.
Al acoplarse el catéter al conducto deferente se procede a realizar el lavado de
este. Se observa que la cola del epidídimo se va llenando y va apareciendo en el
extremo seccionado anteriormente el contenido epididimario como vemos en la figura 3.
22
Figura 3: Llenado y lavado del conducto deferente y cola del epidídimo. Fuente:
Autores, 2014
Fueron evaluados parámetros espermáticos. Posteriormente tras de confirmar
viabilidad espermática se procedió a envasar el semen en pajillas de 0.5 ml (figura 4 y
5).
Estas se colocaron en gradillas dentro de una canastilla previamente enfriada 5
ºC, y esta se colocó en vapores de nitrógeno durante 20 minutos hasta alcanzar -25 ºC;
luego se sumergió directamente en el nitrógeno líquido. (Figura 6).
23
Figura 4: Envasado de pajillas. Fuente: Autores, 2014
Figura 5: Sellado hermético de pajillas. Fuente: Autores, 2014
24
Figura 6: Curva de enfriamiento y congelación de pajillas. Fuente: Autores, 2014
La descongelación de pajillas se realizó en baño de María a una curva de
descongelación de 37°C, por 40 segundos e inmediatamente se evaluaron las variables
descritas. Igualmente se mantenían las próximas pajillas a evaluar a temperatura
ambiente, como lo muestra la figura 7.
25
Figura 7: Mantenimiento de pajillas a temperatura 35ºC. Fuente: Autores, 2014
2.5.2. Recolección de semen de forma tradicional . Para realizar el estudio de
este parámetro se utilizaron 5 perros aparentemente sanos entre los 2 y 8 años de edad,
provenientes de la clínica veterinaria de la universidad de la Salle con previa
autorización del propietario. Argumentando el objetivo de nuestro estudio los
propietarios de los caninos accedían. Cada perro se llevó a un ambiente tranquilo
cercano a la clínica. Y utilizando la técnica descrita por (Root, 2005): sujetando el pene
del perro y el prepucio prolapsando el pene haciendo presión en la zona proximal al
glande y masajeando hacia la apertura prepucial. El eyaculado se recolectaba mediante
un embudo acoplado a un tubo de recolección y con la mano cerrada se protegía de
cambio bruscos de temperatura a la muestra seminal, mientras se llevaba al laboratorio
de la Universidad de La Salle para realizar la evaluación y crio preservación.
26
3. Resultados
Se realizó una comparación de las variables utilizadas pre y post congelación por
cada método y entre ellos, arrojando los resultados que presentamos en las siguientes
gráficas. Demás salidas estadísticas y análisis de varianza ver anexo 1.
3.1 Viabilidad
3.1.1. Viabilidad pre y post congelación para extracción directa. Se realizó
el estudio de resultado de la viabilidad entre los tratamientos, primero de las muestras
tomadas directamente del epidídimo, comparando la viabilidad espermática pre y post
congelación. Ver tabla 3
Tabla 3: Viabilidad pre y post congelación para extracción directa
Directo N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Pre 5 0,65 A 0.05 0,6 0,7
Post 4 0,47 B 0.05 0,4 0,5
*Letras diferentes indican diferencia significativa. (p ≤0,05)
27
Figura 8: Comparación de viabilidad pre y post congelación para directo.
3.1.2. Viabilidad pre y post congelación para extracción tradicional.
Posteriormente se procedió a comparar la viabilidad presente en el semen extraído por
colecta manual (tradicional) pre y post congelación. Ver tabla 4
Tabla 4: Viabilidad pre y post congelación para extracción tradicional
Tradicional N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Pre 5 0,81 0.05 0,75 0,9
Post 5 0,73 0.13 0,5 0,84
28
Figura 9: Comparación de viabilidad pre y post congelación para tradicional
3.2. Motilidad
3.2.1. Motilidad pre y post congelación para extracción directa. Se realizó el
estudio de resultado de la motilidad entre los tratamientos, primero de las muestras
tomadas directamente del epidídimo, comparando la motilidad espermática pre y post
congelación. Ver tabla 5
Tabla 5: Motilidad pre y post congelación para extracción directa.
Directo N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Pre 5 0.73 0.19 0.4 0.9
Post 4 0.55 0.17 0.4 0.8
29
Figura 9: Comparación de motilidad pre y post congelación para tradicional
3.2.2. Motilidad pre y post congelación para extracción tradicional.
Posteriormente se procedió a comparar la motilidad que poseía el semen extraído por
colecta manual (tradicional) pre y post congelación. Ver tabla 6
Tabla 6: Motilidad pre y post congelación para extracción tradicional.
Tradicional N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Pre 5 0.83 0.05 0.75 0.85
Post 5 0.73 0.15 0.5 0.9
30
Figura 10: Comparación de motilidad pre y post congelación para tradicional.
3.3 Vigor
3.3.1. Vigor pre y post congelación para extracción directa. En el parámetro
vigor se evaluó igualmente las muestras por toma directa del epidídimo comparando los
resultados obtenidos pre y post congelación. Ver tabla 7
Tabla 7: Vigor pre y post congelación para extracción directa
Directo N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Pre 5 3,4 0.54 3,0 4,0
Post 4 2,75 0.5 2,0 3,0
31
Figura 11: Comparación de vigor pre y post congelación para muestra directa
3.3.2 Vigor pre y post congelación para extracción tradicional. Se realizó la
comparación también para muestras obtenidas por método tradicional pre y post
congelación. Véase tabla 8
Tabla 8: Vigor pre y post congelación para extracción tradicional
Tradicional N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Pre 5 3,6 0.54 3,0 4,0
Post 5 3,6 0.54 3,0 4,0
32
Figura 12: Comparación de vigor pre y post congelación para colecta tradicional.
3.4 Morfología
En este parámetro presentamos los resultamos como (%) de espermatozoides
con anormalidades, no discriminamos por tipo de anormalidades como se puede ver en
la tabla 9. Estas anormalidades varían entre defectos de cabeza, cola etc.
Tabla 9: Morfología para toma directa y tradicional.
Tratamientos N Promedio Desviación
estándar
Min Max
Directo 5 0.33 0.10 0.2 0.5
Tradicional 5 0.25 0.08 0.2 0.4
Total 10 0.29 0.10 0.2 0.5
33
Figura 13: Comparación de porcentaje de anormalidades encontradas entre
tratamientos.
34
4. Discusión
Utilizando la técnica de flujo retrogrado fueron recolectados espermatozoides de la
cola del epidídimo, para así comparar los parámetros seminales comunes y establecer si
es posible criopreservarlo. En el proceso se estableció que la viabilidad espermática es
menor en el tratamiento pos congelación de la toma directa del epidídimo, esto según
(E. Korochkina, 2014) se debe a que el espermatozoide canino proveniente del
epidídimo tiene una baja tolerancia a la congelación comparada con el proveniente del
eyaculado, lo que podría derivarse de la falta de líquido prostático.
En cuanto a la viabilidad espermática vemos la tendencia a bajar en la colecta
directa del epidídimo con un promedio de 65% de viabilidad pre congelación vs 47%
de viabilidad pos congelación. Con una diferencia de 18%. (Hori T, 2004) Obtuvo
resultados similares en cuanto a la baja de viabilidad pos congelación de los
espermatozoides, pero con un resultado más amplio en su estudio con espermatozoides
obtenidos del epidídimo de perros Beagle, en cuanto a la viabilidad de estos encontró un
promedio pre congelación de 89.1% de viabilidad vs 53.1% viabilidad pos congelación.
Con una diferencia de 36%.
La motilidad total pos congelación disminuye. El promedio de motilidad para las
muestras tomadas directas del epidídimo pre congelación fue de 73% y post
congelación fue de 55%, contrario a lo encontrado por (Hori T, 2004) quien obtuvo
promedios pre congelación de 89.4% en motilidad y 19.5% pos congelación en
muestras tomadas del epidídimo de caninos raza Beagle. Se debe tener en cuenta que los
promedios post congelación pueden bajar con la manipulación y descongelación de la
muestra. En cuanto al estudio realizado por (J.M. Tebet, 2006) quien realizo trabajos de
35
crio preservación de espermatozoides epididimarios de gatos domésticos, tuvo
resultados similares a los obtenidos en este trabajo, teniendo como resultados un
promedio de motilidad de 77% pre congelación y de 59% pos congelación.
En cuanto al tratamiento de colecta tradicional tenemos resultados de promedio de
motilidad pre congelación de 83% vs una motilidad pos congelación de 73%,
disminuyendo 10% la motilidad, lo cual difiere del estudio realizado por (Hori T,
2004), quien encontró un promedio de motilidad pre congelación en colecta tradicional
de 94.2% y pos congelación de 25.8%, disminuyendo un 68% la motilidad.
Si realizamos la comparación de la resistencia a la congelación entre tratamientos
(directo vs tradicional) vemos que la colecta tradicional tiene mayor motilidad pos
congelación, esto se puede atribuir a la falta del líquido prostático de la muestra directa
del epidídimo. Según (Bonilla, 2007), la motilidad del espermatozoide es incrementada
por el potasio, magnesio y calcio El cual incluye el plasma seminal. Las vitaminas
presentes en el plasma seminal son ácido ascórbico, inositol que ayuda en la regulación
de la presión osmótica y trazas de vitaminas del complejo B.
El vigor de los espermatozoides para la extracción directa del epidídimo pos
congelación disminuyó. Esto está directamente relacionado con los resultados
obtenidos en el parámetro motilidad. Contrario al resultado obtenido en el estudio de
(Novoa, 2013) en el que se obtuvo constante viabilidad y vigor con los espermatozoides
obtenidos del epidídimo de toros post congelación.
En el parámetro morfología según los estudios realizados, no existen
prácticamente diferencias en la calidad de los espermatozoides procedentes de
epidídimo en comparación con los obtenidos de eyaculados. Según (J.M. Tebet, 2006)
36
no hay diferencia significativa comparando la morfología de espermatozoides obtenidos
del epidídimo y del eyaculado de gatos. Este resultado difiere de (An TZ, 1999) y
(Villaverde AI, 2006) quienes describen que los espermatozoides epididimarios
presentan un alto porcentaje de gotas citoplasmáticas proximales, (34.5% y 20.9%,
respectivamente), al igual que ocurre con las distales, según indican 44.5%.
La gota protoplásmica o citoplásmica, se considera anormal, esta suele
desprenderse de los espermatozoides tras la eyaculación, y está compuesta de
citoplasma residual. Puede localizarse en la región del cuello, donde se conoce como
gota proximal, o cerca del anillo citoplásmico, donde se le denomina gota distal.
(Donald's, 1981).
Según Amirat citado por (A Ribeiro-Peresa, 2014) la utilización de
espermatozoides congelados, provenientes del eyaculado o del epidídimo, es
indispensable para un buen programa de inseminación artificial, ya que la manipulación
de espermatozoides frescos o congelados otorga una viabilidad corta del material. El
objetivo de congelar células espermáticas es la producción de un banco de las mismas,
teniendo a disposición un material sin plazo de vencimiento, potencializando la
eficiencia de la reproducción animal. Sin embargo, el proceso de crio preservación
resulta en la disminución de la fertilidad cuando se compara con semen fresco.
37
5. Conclusiones
Es posible preservar material genético de un animal, en este caso canino después de
su muerte o su castración profiláctica por medio de la crio preservación de los
espermatozoides obtenidos del epidídimo.
El material seminal extraído por colecta directa del epidídimo demuestra un
promedio un poco mayor de células con daño estructural y menor resistencia a la crio
preservación que en el método tradicional pero existe una gran posibilidad de obtener
una fecundación con este método.
Se recomienda realizar método de crio preservación automatizado para disminuir el
impacto negativo que se genera viéndose más afectadas las células espermáticas
obtenidas por colecta directa, aunque se debe tener en cuenta el costo de los equipos y
el mayor gasto de nitrógeno líquido.
Los espermatozoides recuperados de la cola del epidídimo de los caninos son
viables según los estándares establecidos y los autores citados anteriormente.
La célula espermática se mantiene post congelación ofreciendo resultados en
parámetros espermáticos como motilidad y viabilidad cercanas a los promedios
obtenidos con muestras de eyaculación completa de caninos, es recomendable a futuro
realizar estudios sobre la capacidad fecundante de este semen obtenido directamente del
epidídimo.
38
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Inter-Medica .
42
Watson, P. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal
Reproduction Science, 60, 481-492.
43
ANEXOS
SALIDAS VIGOR POST X TTOS
Resumen Estadístico para Vigor.post
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 4 2,75 0,5 18,1818% 2,0 3,0
Tradicion
al
5 3,6 0,547723 15,2145% 3,0 4,0
Total 9 3,22222 0,666667 20,6897% 2,0 4,0
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 1,0 -1,63299 1,63299
Tradicion
al
1,0 -0,555556 -1,52145
Total 2,0 -0,311654 -0,0246042
Tabla ANOVA para Vigor.post por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
44
Entre
grupos
1,60556 1 1,60556 5,76 0,0474
Intra
grupos
1,95 7 0,278571
Total
(Corr.)
3,55556 8
Tabla de Medias para Vigor.post por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
Directo 4 2,75 0,263899 2,30875 3,19125
Tradicion
al
5 3,6 0,236039 3,20533 3,99467
Total 9 3,22222
Pruebas de Múltiple Rangos para Vigor.post por Ttos
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Directo 4 2,75 X
45
Tradicion
al
5 3,6 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
* -0,85 0,837216
* indica una diferencia significativa.
VIGOR PRE X TTO
Resumen Estadístico para Vigor.pre
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 5 3,4 0,547723 16,1095% 3,0 4,0
Tradicion
al
5 3,6 0,547723 15,2145% 3,0 4,0
46
Total 10 3,5 0,527046 15,0585% 3,0 4,0
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 1,0 0,555556 -1,52145
Tradicion
al
1,0 -0,555556 -1,52145
Total 1,0 0 -1,65985
Tabla ANOVA para Vigor.pre por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,1 1 0,1 0,33 0,5796
Intra
grupos
2,4 8 0,3
Total
(Corr.)
2,5 9
Tabla de Medias para Vigor.pre por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
47
Directo 5 3,4 0,244949 3,00059 3,79941
Tradicion
al
5 3,6 0,244949 3,20059 3,99941
Total 10 3,5
Pruebas de Múltiple Rangos para Vigor.pre por Ttos
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Directo 5 3,4 X
Tradicion
al
5 3,6 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
-0,2 0,798825
* indica una diferencia significativa.
48
VIA.POST X TTOS
Resumen Estadístico para Via.post
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 4 0,475 0,05 10,5263% 0,4 0,5
Tradicion
al
5 0,738 0,136821 18,5394% 0,5 0,84
Total 9 0,62111
1
0,171788 27,6582% 0,4 0,84
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 0,1 -1,63299 1,63299
49
Tradicion
al
0,34 -1,77339 1,79668
Total 0,44 0,239246 -1,31706
Tabla ANOVA para Via.post por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,153709 1 0,153709 13,06 0,0086
Intra
grupos
0,08238 7 0,0117686
Total
(Corr.)
0,236089 8
Tabla de Medias para Via.post por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
Directo 4 0,475 0,0542415 0,384306 0,565694
Tradicion
al
5 0,738 0,0485151 0,656881 0,819119
Total 9 0,62111
1
50
Pruebas de Múltiple Rangos para Via.post por Ttos
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Directo 4 0,475 X
Tradicion
al
5 0,738 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
* -0,263 0,17208
* indica una diferencia significativa.
VIA.PRE POR TTOS
Resumen Estadístico para Via.pre
51
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 5 0,65 0,05 7,69231% 0,6 0,7
Tradicion
al
5 0,818 0,055857 6,82848% 0,75 0,9
Total 10 0,734 0,101675 13,8522% 0,6 0,9
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 0,1 0 -1,36931
Tradicion
al
0,15 0,51491 0,277676
Total 0,3 0,146857 -0,664235
Tabla ANOVA para Via.pre por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,07056 1 0,07056 25,11 0,0010
Intra
grupos
0,02248 8 0,00281
Total
(Corr.)
0,09304 9
52
Tabla de Medias para Via.pre por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
Directo 5 0,65 0,0237065 0,611344 0,688656
Tradicion
al
5 0,818 0,0237065 0,779344 0,856656
Total 10 0,734
Pruebas de Múltiple Rangos para Via.pre por Ttos
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Directo 5 0,65 X
Tradicion
al
5 0,818 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
* -0,168 0,077311
5
* indica una diferencia significativa.
53
M.POST X TRATAMIENTO
Resumen Estadístico para M.post
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 4 0,55 0,173205 31,4918% 0,4 0,8
Tradicion
al
5 0,73 0,15248 20,8876% 0,5 0,85
Total 9 0,65 0,178536 27,467% 0,4 0,85
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 0,4 1,25708 1,17938
Tradicion 0,35 -0,952745 -0,191567
54
al
Total 0,45 -0,103764 -1,24351
Tabla ANOVA para M.post por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,072 1 0,072 2,75 0,1410
Intra
grupos
0,183 7 0,0261429
Total
(Corr.)
0,255 8
Tabla de Medias para M.post por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
Directo 4 0,55 0,0808438 0,414826 0,685174
Tradicion
al
5 0,73 0,0723089 0,609096 0,850904
Total 9 0,65
Pruebas de Múltiple Rangos para M.post por Ttos
55
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Directo 4 0,55 X
Tradicion
al
5 0,73 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
-0,18 0,256476
* indica una diferencia significativa.
M.PRE. POR TTOS
Resumen Estadístico para M.Pre.
56
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 5 0,73 0,198746 27,2255% 0,4 0,9
Tradicion
al
5 0,83 0,0570088 6,86853% 0,75 0,9
Total 10 0,78 0,147573 18,9196% 0,4 0,9
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 0,5 -1,40411 1,07545
Tradicion
al
0,15 -0,369527 -0,081024
Total 0,5 -2,84037 3,54999
Tabla ANOVA para M.Pre. Por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,025 1 0,025 1,17 0,3110
Intra
grupos
0,171 8 0,021375
Total
(Corr.)
0,196 9
57
Tabla de Medias para M.Pre. Por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
Directo 5 0,73 0,0653835 0,623386 0,836614
Tradicion
al
5 0,83 0,0653835 0,723386 0,936614
Total 10 0,78
Pruebas de Múltiple Rangos para M.Pre. Por Ttos
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Directo 5 0,73 X
Tradicion
al
5 0,83 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
-0,1 0,213228
* indica una diferencia significativa.
58
MORFO. POR TTOS
Resumen Estadístico para Morfo.
Ttos Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo
Directo 5 0,33 0,109545 33,1953% 0,2 0,5
Tradicion
al
5 0,254 0,0841427 33,1271% 0,2 0,4
Total 10 0,292 0,100421 34,3909% 0,2 0,5
Ttos Rango Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
Directo 0,3 0,772569 0,796385
Tradicion 0,2 1,76083 1,72901
59
al
Total 0,3 1,35827 0,335456
Tabla ANOVA para Morfo. Por Ttos
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,01444 1 0,01444 1,51 0,2535
Intra
grupos
0,07632 8 0,00954
Total
(Corr.)
0,09076 9
Tabla de Medias para Morfo. Por Ttos con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
Ttos Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
Directo 5 0,33 0,0436807 0,258775 0,401225
Tradicion
al
5 0,254 0,0436807 0,182775 0,325225
Total 10 0,292
Pruebas de Múltiple Rangos para Morfo. Por Ttos
60
Método: 95,0 porcentaje LSD
Ttos Casos Media Grupos
Homogéneos
Tradicion
al
5 0,254 X
Directo 5 0,33 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
Directo -
Tradicional
0,076 0,142451
* indica una diferencia significativa.
MOTILIDAD POR DIRECTO
Resumen Estadístico para motilidad
61
directo Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo Rango
post 4 0,55 0,173205 31,4918% 0,4 0,8 0,4
pre 5 0,73 0,198746 27,2255% 0,4 0,9 0,5
Total 9 0,65 0,2 30,7692% 0,4 0,9 0,5
directo Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
post 1,25708 1,17938
pre -1,40411 1,07545
Total -0,184532 -1,22577
Tabla ANOVA para motilidad por directo
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,072 1 0,072 2,03 0,1970
Intra
grupos
0,248 7 0,0354286
Total
(Corr.)
0,32 8
Tabla de Medias para motilidad por directo con intervalos de confianza del 95,0%
62
Error Est.
directo Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite Superior
post 4 0,55 0,0941124 0,39264 0,70736
pre 5 0,73 0,0841767 0,589253 0,870747
Total 9 0,65
Pruebas de Múltiple Rangos para motilidad por directo
Método: 95,0 porcentaje LSD
directo Casos Media Grupos
Homogéneos
post 4 0,55 X
pre 5 0,73 X
Contrast
e
Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
post - pre -0,18 0,29857
* indica una diferencia significativa.
63
VIABILIDAD POR DIRECTO
Resumen Estadístico para viabilidad
directo Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo Rango
post 4 0,475 0,05 10,5263% 0,4 0,5 0,1
pre 5 0,65 0,05 7,69231% 0,6 0,7 0,1
Total 9 0,57222
2
0,103414 18,0723% 0,4 0,7 0,3
directo Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
post -1,63299 1,63299
pre 0 -1,36931
Total -0,276303 -0,601823
Tabla ANOVA para viabilidad por directo
64
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,0680556 1 0,0680556 27,22 0,0012
Intra
grupos
0,0175 7 0,0025
Total
(Corr.)
0,0855556 8
Tabla de Medias para viabilidad por directo con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
directo Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
post 4 0,475 0,025 0,433199 0,516801
pre 5 0,65 0,0223607 0,612612 0,687388
Total 9 0,57222
2
Pruebas de Múltiple Rangos para viabilidad por directo
Método: 95,0 porcentaje LSD
directo Casos Media Grupos
Homogéneos
65
post 4 0,475 X
pre 5 0,65 X
Contrast
e
Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
post - pre * -0,175 0,079312
1
* indica una diferencia significativa.
VIGOR POR DIRECTO
Resumen Estadístico para vigor
directo Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo Rango
post 4 2,75 0,5 18,1818% 2,0 3,0 1,0
pre 5 3,4 0,547723 16,1095% 3,0 4,0 1,0
Total 9 3,11111 0,600925 19,3155% 2,0 4,0 2,0
66
directo Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
post -1,63299 1,63299
pre 0,555556 -1,52145
Total 0,0223967 0,689501
Tabla ANOVA para vigor por directo
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,938889 1 0,938889 3,37 0,1090
Intra
grupos
1,95 7 0,278571
Total
(Corr.)
2,88889 8
Tabla de Medias para vigor por directo con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
directo Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
post 4 2,75 0,263899 2,30875 3,19125
pre 5 3,4 0,236039 3,00533 3,79467
Total 9 3,11111
67
Pruebas de Múltiple Rangos para vigor por directo
Método: 95,0 porcentaje LSD
directo Casos Media Grupos
Homogéneos
post 4 2,75 X
pre 5 3,4 X
Contrast
e
Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
post - pre -0,65 0,837216
* indica una diferencia significativa
MOTILIDAD POR TRADICIONAL
Resumen Estadístico para motilidad
tradicion
al
Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo Rango
post 5 0,73 0,15248 20,8876% 0,5 0,85 0,35
pre 5 0,83 0,0570088 6,86853% 0,75 0,9 0,15
68
Total 10 0,78 0,120646 15,4675% 0,5 0,9 0,4
tradicion
al
Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
post -0,952745 -0,191567
pre -0,369527 -0,081024
Total -2,15034 1,67867
Tabla ANOVA para motilidad por tradicional
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,025 1 0,025 1,89 0,2068
Intra
grupos
0,106 8 0,01325
Total
(Corr.)
0,131 9
Tabla de Medias para motilidad por tradicional con intervalos de confianza del
95,0%
Error Est.
tradicion Casos Media (s Límite Límite
69
al agrupada) Inferior Superior
post 5 0,73 0,0514782 0,64606 0,81394
pre 5 0,83 0,0514782 0,74606 0,91394
Total 10 0,78
Pruebas de Múltiple Rangos para motilidad por tradicional
Método: 95,0 porcentaje LSD
tradicion
al
Casos Media Grupos
Homogéneos
post 5 0,73 X
pre 5 0,83 X
Contrast
e
Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
post - pre -0,1 0,16788
* indica una diferencia significativa.
70
VIABILIDAD POR TRADICIONAL
Resumen Estadístico para viabilidad
tradicion
al
Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo Rango
post 5 0,738 0,136821 18,5394% 0,5 0,84 0,34
pre 5 0,818 0,055857 6,82848% 0,75 0,9 0,15
Total 10 0,778 0,107166 13,7745% 0,5 0,9 0,4
tradicion
al
Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
post -1,77339 1,79668
pre 0,51491 0,277676
Total -2,79632 3,84944
Tabla ANOVA para viabilidad por tradicional
71
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0,016 1 0,016 1,47 0,2607
Intra
grupos
0,08736 8 0,01092
Total
(Corr.)
0,10336 9
Tabla de Medias para viabilidad por tradicional con intervalos de confianza del
95,0%
Error Est.
tradicion
al
Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
post 5 0,738 0,0467333 0,661797 0,814203
pre 5 0,818 0,0467333 0,741797 0,894203
Total 10 0,778
Pruebas de Múltiple Rangos para viabilidad por tradicional
Método: 95,0 porcentaje LSD
tradicion
al
Casos Media Grupos
Homogéneos
post 5 0,738 X
72
pre 5 0,818 X
Contrast
e
Sig. Diferenci
a
+/-
Límites
post - pre -0,08 0,152406
* indica una diferencia significativa.
VIGOR POR TRADICIONAL
Resumen Estadístico para vigor
tradicion
al
Recuent
o
Promedi
o
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
Mínimo Máximo Rango
post 5 3,6 0,547723 15,2145% 3,0 4,0 1,0
pre 5 3,6 0,547723 15,2145% 3,0 4,0 1,0
73
Total 10 3,6 0,516398 14,3444% 3,0 4,0 1,0
tradicion
al
Sesgo
Estandarizado
Curtosis
Estandarizada
post -0,555556 -1,52145
pre -0,555556 -1,52145
Total -0,625 -1,46966
Tabla ANOVA para vigor por tradicional
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Entre
grupos
0 1 0 0,00 1,0000
Intra
grupos
2,4 8 0,3
Total
(Corr.)
2,4 9
Tabla de Medias para vigor por tradicional con intervalos de confianza del 95,0%
Error Est.
tradicion
al
Casos Media (s
agrupada)
Límite
Inferior
Límite
Superior
post 5 3,6 0,244949 3,20059 3,99941
74
pre 5 3,6 0,244949 3,20059 3,99941
Total 10 3,6
Pruebas de Múltiple Rangos para vigor por tradicional
Método: 95,0 porcentaje LSD
tradicion
al
Casos Media Grupos
Homogéneos
pre 5 3,6 X
post 5 3,6 X
Contraste Sig. Diferenci
a
+/- Límites
post - pre 0 0,798825
* indica una diferencia significativa.