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COLEGIO DE POSTGRADUADOS

INSTITUCIÓN DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGRÍCOLAS

CAMPUS MONTECILLO POSTGRADO DE FITOSANIDAD

FITOPATOLOGIA

ETIOLOGÍA DE TRES ENFERMEDADES BACTERIANAS

DE MAÍZ (Zea mays) EN VERACRUZ, MEXICO

ADRIANA ROSALÍA GIJÓN HERNÁNDEZ

T E S I S

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTORA EN CIENCIAS

MONTECILLO, TEXCOCO, EDO. DE MÉXICO

2009

La presente tesis titulada “ETIOLOGIA DE TRES ENFERMEDADES BACTERIANAS DE MAIZ (Zea mays) EN VERACRUZ, MEXICO” realizada por el alumna ADRIANA ROSALÍA GIJÓN HERNÁNDEZ, bajo la dirección del

Consejo Particular indicado, ha sido aprobada por el mismo y aceptada como requisito parcial para la obtención del grado de:

DOCTORA EN CIENCIAS

FITOSANIDAD

FITOPATOLOGÍA

CONSEJO PARTICULAR

Montecillo, Texcoco, Estado, de México, Agosto 2009.

CONSEJERO:

ASESOR:

ASESOR:

ASESOR:

ASESOR:

ASESOR:

DR. RICARDO QUIROGA MADRIGAL

DEDICATORIA

A Dios por demostrarme tantas veces su existencia y con ello

darme fuerza para salir a delante de cada tropiezo.

A mi mami, hermanos, hermanas, sobrinos, porque siempre

han sido fuente de inspiración en todas las cosas que sueño.

Los amo.

A la familia Solís Gutiérrez, por abrirme las puertas de su

corazón, por darme cariño y apoyo incondicional. Los quiero.

Dios hizo de maíz blanco la carne y huesos del hombre

y de maíz amarillo su sangre.

Leyenda maya

i

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por otórgame la beca

para mis estudios académicos y económicos durante mis estudios doctorales.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y SAGARPA por otorgarme

los recursos económicos en mi proyecto de postgrado a nivel doctorado.

Al Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas por ser la institución formadora

de mi superación profesional.

Un especial agradecimiento al Dr. Daniel Téliz Ortiz, por aceptarme para realizar esta

tesis doctoral bajo su dirección. Su apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad

para guiar mis ideas han sido un aporte invaluable, no solamente en el desarrollo de

esta tesis, sino también en mi formación como investigadora.

A los integrantes de mi Consejo Particular: Dr. Daniel Téliz Ortiz, Dr. Rodolfo de la Torre Almaraz, Dr. Carlos de León, Dra. Elizabeth Cárdenas Soriano y Dr. Antonio Mora Aguilera, gracias por su disponibilidad y paciencia, por compartir conmigo sus valiosos conocimientos y no cabe duda que su participación han enriquecido el trabajo realizado y, además, ha significado el surgimiento de una sólida amistad.

A mis profesores y profesoras de fitopatología por guiar mis pasos durante mi estancia doctoral y sobre todo por sus valiosas enseñanzas. A todos ellos gracias. Al Dr. Francisco Osorio Acosta del Colegio de Postgraduados, Campus Veracruz, por todo el apoyo proporcionado para la realización de esta investigación. Ing. Teresa de Jesús Soto Poblete del Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Veracruz, por su valioso apoyo en los recorridos de campo.

Al Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo, por las facilidades para realizar parte de esta investigación en el Laboratorio de Biología Molecular y en el área de invernaderos. Al M.C. Dimas Mejía Sánchez, por sus valiosas aportaciones en la parte de Técnicas moleculares y por demostrarme su amistad incondicional. Al M.C. Juventino Cuevas Ojeda, por su apoyo incondicional y amistad

A Mario Salazar, por su asesoria en los trabajos realizados en el área de virus.

ii

Al al Dr. Daniel Ochoa y Dr. Cristian Nava, por el apoyo y por haber sido parte de mi jurado examinador. A la familia Mata Ortega, por su apoyo incondicional y por su amistad Ing. Salim Rodríguez Salomón del IRPAT, por el tiempo brindado para la conclusión de este trabajo. Ing. Romeo Esponda Gálvez del IRPAT, por el tiempo otorgado y apoyo incondicional para concluir la tesis.

A mis amigos y a migas, los que han pasado y los que han quedado, porque todos

ustedes han sido parte aguas en mi vida y me han enseñado el verdadero valor de la

amistad, gracias: Patricia Rincon, Omar Pérez, Victor Arreola, Ma. Eugenia Cisneros,

Anayanci Sánchez, Camilo Hérnandez, Susana Isabel Robles, Leonides Rosas,

Luciano Martinez, Misael Martinez, Susana Alcántara.

A todos los que en mi cabeza no puedo extraer de mi memoria esta noche.

Detrás de cada línea de llegada, hay una departida. Detrás de cada logro, hay otro desafío. Si extrañas lo que hacías, vuelve a hacerlo. Sigue aunque todos esperen que abandones. No dejes que se oxide el hierro que hay en ti.

ii

iii

CONTENIDO Página

Dedicatoria y agradecimientos i

Contenido iv

Lista de figuras ix

Lista de cuadros xi

INTRODUCCION GENERAL 1

Literatura citada 6

CAPITULO I. BANDEADO DE LAS HOJAS Y PUDRICION DEL TALLO

CAUSADO POR Burkholderia gladioli, UNA NUEVA ENFERMEDAD

DE MAÍZ EN MÉXICO

8

1.1.Resumen 8

1.2.Abstract 9

1.3.Introducción 10

1.4. Materiales y métodos 10

1.4. 1. Muestreo 10

1.4.2. Aislamiento de la bacteria 11

1.4.3. Patogenicidad de los aislamientos 11

1.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 12

1.4.4. Caracterización e identificación del patógeno 12

4.4.1. Caracterización fenotípica 12

1.4.5. Caracterización molecular 13

1.4.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa 13

1.4.5.2. Identificación del género de la bacteria por PCR 13

1.4.5.3.Secuenciación y alineamiento 14

1.4.5.4. PCR especifico para especie 14

1.4.5.5. RFLP 15

1.4.6. Incidencia del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 15

1.4.7. Severidad del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 15

1.5. Resultados 16

1.5. 1. Muestreo 16


1.5.3. Patogenicidad de los aislamientos 16



1.5.4.1. Caracterización fenotípica 18



1.5.5.2. Identificación del género de la bacteria por PCR 18

1.5.5.3.Secuenciación y alineamiento 18

iv

1.5.5.4. PCR especifico para especie 19

1.5.5.5. RFLP 20

1.5.6. Incidencia del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 20

1.5.7. Severidad del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 21

1.6. Discusión 22

1.7. Conclusiones 24

1.8. Literatura citada 31

CAPITULO II. MANCHA FOLIAR DEL MAÍZ OCASIONADA POR

Pantoea ananatis, EN VERACRUZ, MÉXICO.

33

2.1.Resumen 33

2.2.Abstract 34

1.3.Introducción 35


2.4. 1. Muestreo 35

.4.2. Aislamiento de la bacteria del agente causal 36

2.4.3. Patogenicidad de los aislados 36





2.4.5.2. Secuenciación y alineamiento 38

2.4.6. Incidencia de la mancha foliar de maíz 38

2.5. Resultados 39

2.5.1. Muestreo 39







2.5.5.2. Secuenciación y alineamiento 44

2.5.6. Incidencia de la mancha foliar de maíz 45

2.6. Discusión 45



vi

CAPITULO III. RAYADO FOLIAR DEL MAÍZ CAUSADO POR

Acidovorax avenae subsp avenae EN VERACRUZ, MÉXICO

56

3.1. Resumen 56

3.2. Abstract 57

3.3. Introducción 58


3.4. 1. Colecta de material vegetal 59

3.4.2. Aislamiento 59





3.4.5.1. Extracción de DNA 61


…… 3.4.5.3.Secuenciación y alineamiento 62

3.4.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz 62

3.4.6.1. Incidencia 62

3.4.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz 63

3.5. Resultados 64

3.5. 1. Colecta de material vegetal 64

3.5.2. Aislamiento 65





3.5.5.1. Extracción de DNA 66


…… 3.5.5.3.Secuenciación y alineamiento 67

3.5.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz 67

3.5.6.1. Incidencia 67

3.5.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz 67

3.6. Discusión 68



CONCLUSIONES GENERALES 80

vii

Lista de figuras

Página

Figura 1. Síntomas en plantas de maíz ocasionados por Burkholderia

gladioli en Veracruz, México.

25

Figura 2. Síntomas en plantas de maíz inoculadas en invernadero con

Burkholderia gladioli.

25

Figura. 3. Hipersensibilidad en tabaco. 26

Figura 4. Células bacterianas de Burkholderia gladioli mostrando un solo

flagelo polar y la forma bacilar (25000x).

26

Figura 5. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen

rDNA 16s de Eubacterias.

27

Figura 6. Amplificación del producto de 500 Pb del gen 16s rDNA de

Burkholderia.

27

Figura 7. Amplificación del producto de 700 Pb del gen 23s rDNA de

Burkholderia gladioli.

28

Figura 8. Productos de PCR 23s después de la digestión con HaeIII. 28

Figura 9. Productos de PCR 23s después de la digestión con TaqI. 29

Figura 10. Incidencia porcentual de Burkholderia gladioli en plantaciones de

maíz del cultivar AS7573.

29

Figura 11. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de

Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar

AS7573.

30

Figura 12. Distribución y severidad de Burkholderia gladioli en plantaciones

de maíz del cultivar AS7573.

30

Figura 13. Hoja de maíz con manchas irregulares, blanco-grisáceo y color

rojizo ocasionada por Pantoea.ananatis.

49

Figura 14. Prueba de patogenicidad de cuatro cultivares comerciales de

maíz inoculadas con Pantoea ananatis, aisladas de la var.

AS7573, procedentes de tres municipios de Veracruz, México.

49

Figura. 15. Síntomas en plantas de maíz AS7573 inoculadas con Pantoea

ananatis, procedente de Veracruz, México.

50

Figura 16. Hipersensibilidad en hoja de tabaco (Nicotiana tabacum var

xanthi), mostrando la necrosis ocasionada por Pantoea ananatis

infiltrada en la nervadura central.

51

Figura 17. Respuesta de cuatro cultivares comerciales a la inoculación de

cepas de Pantoea ananatis, proveniente de Veracruz, México.

52

Figura 18. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen

rDNA 16s de Eubacterias.

53

ix

Figura 19. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de Pantoea

ananatis en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 en los

municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque

durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.

53

Figura 20. Ubicación de los sítios de muestreo del rayado foliar del maíz

causado por acidovoax avenae subsp avenae, en tres

municípios de Veracruz, México. 2006-2007.

72

Figura 21. Escala arbitraria de severidad para la evaluación del rayado

foliar del maíz causado por Acidovorax avenae subsp. avenae

en Veracruz, México. 2006-2007.

72

Figura 22. Síntomas en campo del rayado foliar del maíz cv AS7573

causado por acidovorax avenae subsp. avenae.

73

Figura 23. Plantas sintomáticas en un corte transversal mostrando necrosis

vascular, en maíz cv AS7573 causado por acidovorax avenae

subsp. avenae

74

Figura 24. Síntomas desarrollados en pruebas de patogenicidad de

acidovorax avenae subsp avenae en maíz cv AS7573.

74

Figura 25 Extracción de DNA mediante el método AP y PLANT-DNAZOL,

de cepas de acidovoax avenae subsp avenae.

75

Fugura 26 Amplificación del producto de aproximadamente 210pb, con los

iniciadores RST63 y RST64 para el género Acidovorax.

75

Figura 27 Incremento de la incidencia de Acidovorax avenae subs avenae

en plantaciones de maíz del cv AS7573, en tres municipio de

Veracruz, México, del 2006-2007.

76

Figura 28. A) mapa de campo de la distribución y B) mapa tridimensional

de la severidad del rayado foliar del maíz cv AS 7573 causado

por acidovorax avenae subsp avenae. en Tlalixcoyan, Ver. 2006-

2007.

77

Lista de cuadros

Página

Cuadro 1.1. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias

reportadas en el banco de genes del Genbank con las

secuencias de los genes 16s ribosomal RNA de las bacterias

aisladas de plantas de maíz con síntomas de bandeado de la

hoja y pudrición del tallo en Veracruz, México. Año 2007.

19

xi

Cuadro 1.2. Ubicación de 14 parcelas de maíz muestreadas en tres

municipios de Veracruz, México, para la evaluación de la

incidencia y severidad del bandeado de la hoja y pudrición del

tallo. 2005 -2007.

21

Cuadro 2.1. Ubicación de las 14 parcelas de maíz Asgrow 7573 muestreadas

en tres municipios de Veracruz, México para la detección de la

mancha foliar del maíz. 2005-2007.

40

Cuadro 2.2. Cepas bacterianas de aisladas de maíz AS7573 en tres

municipio de Veracruz, México. Período 2005-2007.

41

Cuadro 2.3. Resultados de las pruebas de patogenicidad en cuatro cultivares

comerciales de maíz, inoculados con Pantoea ananatis bajo

invernadero en Chapingo, México. 2007.

42

Cuadro 2.4. Caracterización bioquímica, fisiológica y fenotípica de

aislamientos de Pantoea ananatis procedentes de Veracruz,

México. 2006-2007.

43

Cuadro.2.5. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias

reportadas en el banco de genes con las secuencias de los

genes 16s rDNA de las cepas de Pantoea ananatis aisladas de

hojas de maíz Veracruz, México. 2007.

45

Cuadro 3.1. Ubicación de las parcelas de maíz muestreadas en los

municipios de Veracruz, México para la detección de bacterias

en 2006 -2007.

62

Cuadro 3.2. Caracterización bioquímica y fisiológica de aislamientos de

Acidovorax avenae subsp avenae de maíz cv AS7573 con

síntomas de rayado foliar, procedentes de Veracruz, México.

2006-2007.

66

xii

1

INTRODUCCIÓN GENERAL

El maíz es uno de los principales cereales alimenticios cultivados en el mundo. El maíz

de grano blanco se utiliza en México principalmente para la elaboración de las

tradicionales tortillas y tamales, pero también se puede obtener aceite o en la

fabricación de barnices, pinturas, cauchos artificiales y jabones (Financiera Rural,

2009). El maíz de grano amarillo también se puede utilizar para consumo humano o

para la alimentación del ganado y en la producción de almidones (Financiera Rural,

2009).

El maíz es el cultivo agrícola más importante de México, desde el punto de vista

alimentario, industrial y social. En relación con los demás cereales que se producen en

México (trigo, sorgo, cebada, arroz y avena, principalmente), ha tenido una tasa media

anual de crecimiento de 2.0% de 1996 a 2006 (SIAP, 2007). Se estima que durante

2008, la producción de maíz alcanzó los 25.12 millones de toneladas (Mton) cifra que

representa un incremento del 43.1% a la registrada en el año 2000 (Financiera Rural,

2009). El rendimiento promedio se ubicó en 3.30 ton/ha cifra superior en 34% a la

observada en el año 2000. Durante 2007, el estado de Sinaloa ocupó el primer lugar en

la producción nacional de maíz al producir 5.13 Mton) lo que representa el 22% de la

producción nacional; el rendimiento promedio fue de 8.764 ton/ha, el más alto a nivel

nacional. El estado de Jalisco es el segundo productor con un total de 3.25 (Mton) y un

rendimiento de 5.486 ton/ha. El estado de México ocupo el tercer lugar con una

producción de 2.0 (Mton) y un rendimiento de 3.488 ton/ha.

2

Durante 2007, el 67.7% (8.12 (millones de ha (Mha).) del total de la superficie

sembrada en territorio nacional correspondió al cultivo de maíz, mientras que de la

superficie cosechada representó el 67.5% (7.33 Mha). México participa en la

producción mundial de maíz con 2.86% del total (Financiera Rural, 2009).

La producción de maíz puede ser afectada por enfermedades que reducen la

capacidad de la planta para crecer y producir de manera normal (White, 2004). Las

enfermedades causadas por hongos que afectan al cultivo de maíz incluyen

pudriciones, manchas, marchitez, tizones, mildius, carbones y royas (Shurtleff, 1980.,

De León, 1984., Quiroga, 1995., Zuber et al.,1981). Los virus causan importantes

enfermedades en todo el mundo y algunos están muy distribuidos como el potyvirus del

mosaico enanismo del maíz (MDMV), enanismo clorótico de maíz (MCDV), rhabdovirus

del mosaico del maíz (MMV), moteado clorótico del maíz, rayado fino del maíz y

mosaico del maíz (Games et al., 1979., Bootthroyd and Israel, 1980., Bradfute and Tsai,

1983 y White, 2004). Se han encontrado asociados al maíz nemátodos formadores de

nódulos, como Meloidogyne incognita, M. chitwoodi, M. arenaria, M. javanica, que son

parásitos importantes del maíz en el sudeste de los Estados Unidos y en otras regiones

cálidas del mundo (White, 2004., Windham y Williams, 1987., Santo y O’ Bannon,

1981). También se encuentran los nemátodos de las lesiones como Pratylenchus

hexincisus, P. penetrans, P. zea P. minor, considerados los más importantes, porque

están asociados con las raíces del maíz más que cualquier otro nemátodo parásito y

porque causan pérdidas considerables en la producción (White, 2004., Norton y Hinz,

1976., Tarte, 1971).

3

Las enfermedades bacterianas más importantes en el mundo incluyen a la marchitez

bacteriana causada por Pantoea stewartii (sin. Erwinia stewartii. Smith), que es

frecuentemente cuarentenada por varios países y que ocasiona problemas importantes

en la producción de semillas. Actualmente, más de 50 países exigen certificado

fitosanitario que manifiesten que la semilla importada ha sido cultivada en ausencia de

la enfermedad o que la semilla esté libre de la bacteria (Forgey et al., 1982., De León,

1984., Pataky, 1996., Quiroga, 1995), la marchitez y mancha bacteriana de Goss por

Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, fue observada en maíz dentado de

Nebraska desde 1969. Las pérdidas de producción pueden sobrepasar el 50% en

híbridos muy susceptibles (White, 2004., Smidt and Vidaver, 1986). Burkholderia

gladioli (anteriormente Pseudomonas gladioli y P. marginata), se describió

primeramente como un patógeno de gladiolos, causando la pudrición de los bulbos de

gladiolo (McCulloch, 1921); otros hospedantes son cebolla, iris, fresia, orquideas, arroz

y maíz (Tsuchiya, 1963., Keith et al., 2005., Lu and Henn, 2007 and., Gijón et al., 2008).

La pudrición suave de la mazorca, causada por Burkholderia gladioli, fue reportada en

Estados Unidos, los síntomas observados en las hojas fueron lesiones irregulares de

aspecto húmedo, las cuales se extendieron hasta 10 cm de diámetro. En la base de las

mazorcas se observó una pudrición de color marrón y su calidad se dañó (Lu and

Henn, 2007). El rayado bacteriano y mancha foliar por Burkholderia andropogonis (Sin.

Pseudomonas andropogonis) (Ullstrup, 1960., White, 2004) en EUA. La podredumbre

del tallo causada por Erwinia chrysanthemi pv. zeae (sin. E. carotovora f. sp. zeae )

(Dickey et al., 1987, De León, 1984., Quiroga, 1995., White, 2004). La marchitez foliar

es una enfermedad que se encuentra distribuida en todo el mundo, el agente causal es

4

Acidovorax avenae subsp. Avenae (sin. Pseudomonas avenae, Pseudomonas

alboprecipitans y Pseudomonas rubrilineans) (Ullasa, 1967, Schaad, 1975., White,

2004); no hay registro de esta enfermedad en México. El bandeado y moteado de la

hoja del sorgo agente causal Herbaspirillum rubrisubalbicans (Sin. Pseudomonas

rubrisubalbicans (Christopher and Edgerton, 1930). Los primeros síntomas de esta

bacteria en hojas de maíz son manchas acuosas y posteriormente bandeado (Hale y

Wilkie, 1972); no hay registro escrito de esta bacteria en México. En Veracruz se ha

registrado la presencia de enfermedades del maíz, destacando el achaparramiento y el

virus del mosaico de la caña de azúcar (Cano et al., 2000). El achaparramiento del

maíz fue identificado por síntomas y molecularmente como el fitoplasma del Maiz

Bushy Stunt en tres municipios de Veracruz (Alcántara, 2009).

Una enfermedad no descrita anteriormente en maíz se presentó durante los ciclos

2003-2004 en tres municipios maiceros importantes en el estado de Veracruz: Paso de

Ovejas, Cosoleacaque y Tlalixcoyan, ocasionando pérdidas estimadas desde 30%

(Chavero, 2004) hasta 70%, estimación de los productores de la región. Los síntomas

se observaron inicialmente en el cultivar comercial de maíz elotero Asgrow-7573

(AS7573); en hojas se observó amarillamiento, enrojecimiento, quemado y manchas,

falta de fecundación, proliferación de mazorcas, pudrición de mazorcas y granos vanos.

En tallo se observó una pudrición semiacuosa en la corona y necrosis en la base de la

mazorca y retraso en su desarrollo. Inicialmente se consideró que el fitoplasma del

achaparramiento del maíz podría estar involucrado. El laboratorio de diagnostico

fitosanitario Latex en Veracruz, reportó a la bacteria Herbaspirillum rubrisubalbicans

(sin. Pseudomonas rubrisubalbicans) como agente causal del problema, diagnostico

5

que confirmó el Centro Nacional de referencia de Sanidad Vegetal en la ciudad de

México. Los síntomas antes mencionados y la agresividad de la enfermedad no se

habían reportado con anterioridad, y la etiología de la enfermedad permanecía

indefinida. Por la reciente aparición de ésta enfermedad y por su importancia

socioeconómica en la región el objetivo de esta investigación fue determinar la etiología

y biología de esta nueva enfermedad. Para lograr este objetivo la investigación se

dividió en tres etapas, según los síntomas observados: I. Determinar la distribución y

etiología del bandeado de las hojas y pudrición del tallo. II. Distribución y etiología de la

mancha foliar del maíz. III. Distribución y etiología del rayado foliar del maíz.

6

LITERATURA CITADA

Alcántara, M. S. 2009. Detección e incidencia del fitoplasma Maize Bushy Stunt y su

relación con el rendimiento en el maíz en el estado de Veracruz, México.Tesis

maestria en ciencias, Colegio de Postgraduados, Montecillo,Texcoco. 36p.

Boothroyd, C. W., and Israel, H. W. 1980. A new mosaic disease of corn. Plant Dis. 64:

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Cano, R. O., Sierra, M., Jeffers, D., Tosquy, O. H., Palafox, C.A., y Preciado, R.E. 2000.

Respuesta de híbridos de maíz QPM y normales a infestación con Dalbulus

maydis vector del achaparramiento del maíz. In: Memorias de la XIII Reunión

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Chavero, J. J. 2004. Control químico in vitro de la bacteriosis del maíz (Herbaspirillum

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7

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Ullasa, B. A, Mehta, Y. R., Payak, M. M., and Renfro, B. L. 1967. Xanthomonas

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Zuber, M. S., Ainsworth, T. C., Blanco, M. H., and Darrah, L. 1981. Effect of

anthracnose leaf blight on stalk rind strength and yield in F1 crosses in

maize.Plant Dis. 65: 719-722.

http://www.siap.gob.mx/

8

CAPITULO I

BANDEADO DE LAS HOJAS Y PUDRICION DEL TALLO CAUSADO POR

Burkholderia gladioli, UNA NUEVA ENFERMEDAD DE MAÍZ EN MÉXICO

1.1. RESUMEN

Una enfermedad no reportada previamente en siembras comerciales de maíz se

presentó en los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, Veracruz,

México, durante los ciclos de cultivo 2003-2004. La enfermedad se caracterizó por

manchas acuosas, blanco-amarillentas en las hojas, que al coalescer formaron franjas

longitudinales de 0.3 cm de ancho y 8 cm de largo y algunas de las hojas se tornaron

de color rojizo. La hoja bandera se enrolló y mostró una pudrición semiacuosa. El tallo

desarrolló una pudrición semiacuosa en la corona. En la base de la mazorca se

observaron necrosis y detención del desarrollo. Los síntomas inicialmente se

observaron en el cultivar comercial de maíz elotero AS7573. De forma constante, se

aisló de las plantas enfermas de maíz una bacteria, de forma bacilar, aeróbica, Gram

negativa, color blanco, convexas, de borde liso, húmedas, brillantes, que secretaron un

pigmento difusible amarillo en medio B de King. Las bacterias aisladas de las lesiones

fueron identificadas usando pruebas fisiológicas, bioquímicas convencionales y

confirmadas mediante la amplificación por PCR y secuenciación de un fragmento del

rDNA comprendido entre los genes 16s and 23s. La bacteria fue identificada como

Burkholderia gladioli. Este es el primer reporte de B. gladioli causando bandeado y

pudrición del tallo del maíz en México.

Palabra clave: Zea mays, PCR, bacteria.

9

1.1. ABSTRACT

A maize disease epidemy appeared in commercial maize plantings in Cosoleacaque,

Tlalixcoyan and Paso de Ovejas counties, in the state of Veracruz, Mexico in 2003-

2004. Symptoms on leaves were small white-yellow watery spots which coalesced into

dry necrotic stripes 0.3 cm wide and 8 cm long. Some of the infected leaves turned red.

The flag leaf developed rot and necrosis at the basis, inward rolling and dried out. Stem

crown rot and necrosis at the basis of the ears were also observed. These symptoms

were initially observed in the cultivar AS7573 commercial maize plantings. A bacterium

was consistently isolated from diseased maize plants and was characterized by round

white colonies Gram negative, aerobic, rod-shape, opaque, colonies with entire margins

on casaaminoacid peptone and glucose (CPG) media. On B King, the isolates produced

yellow, nonmucoid colonies, with the majority of the strains secreting a diffusible yellow

pigment in the media. The bacterium identity was confirmed by PCR amplification and

sequencing of 16S and 23s genes rDNA fragment. The bacterium was identified as

Burkholderia gladioli. This is the first report of B. gladioli causing leaf stripes and stem

rot of maize in Mexico.

Additional keyword: Zea mays, PCR, bacteria

10

1.3. INTRODUCCION

Una enfermedad no descrita anteriormente en maíz se presentó durante los ciclos

2003-2004, en Paso de Ovejas, Cosoleacaque y Tlalixcoyan, tres municipios maiceros

importantes en el estado de Veracruz, ocasionando pérdidas en la producción

estimadas desde 30% (Chavero, 2004) hasta 70%, según algunos productores. Los

síntomas se observaron inicialmente en el cultivar de maíz elotero AS7573. En hojas,

los síntomas iniciaron como manchas pequeñas acuosas, blanco-amarillo, que al

coalescer formaron franjas longitudinales y algunas de las hojas se tornaron de color

rojizo. Una pudrición semiacuosa y necrosis en la corona del tallo y en la base de los

elotes y retraso en el desarrollo indicaron la posibilidad de una etiología bacteriana. Los

síntomas antes mencionados y la agresividad de la enfermedad no se conocían en

Veracruz, ni el agente causal. Con anterioridad se habían mencionado como posibles

causantes a una bacteria (Herbaspirillum rubrisubalbicans) (Chavero, 2004), dos virus

(potyvirus y geminivirus) y un fitoplasma. Por la reciente introducción de ésta epidemia

y por su importancia socioeconómica en la región, el objetivo de esta investigación fue

determinar la causa del bandeado de las hojas y pudrición del tallo del maíz.

1.4. MATERIALES Y MÉTODOS

1.4.1. Muestreo

Plantaciones comerciales de maíz AS7573 se muestrearon durante los ciclos

primavera-verano y otoño-inverno de 2005-2007, en los municipios de Cosoleacaque,

Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, del estado de Veracruz, México, para un total de 480

muestras que incluyeron hojas, tallos y mazorcas.

11

1.4.2. Aislamiento de la bacteria

El material con síntomas, aparentemente causados por bacterias, fue seccionado y

desinfestado con hipoclorito de sodio al 1% durante 1min, enseguida se lavó tres veces

durante 30 segundos con agua destilada estéril. Se hicieron cortes que se colocaron en

tubos de ensayo con 10 mL de agua estéril y se dejaron reposar durante 10 min. Parte

de la suspensión se sembró por estría cruzada en los medios casaaminoácidos

peptona glucosa (CPG), B de King (BK) y agar nutritivo (AN). Los cultivos fueron

incubados a 28ºC durante 72 h. Las colonias bacterianas individuales fueron

purificadas y almacenadas a -80ºC en glicerol al 15%.

1.4.3. Patogenicidad de los aislamientos

De 480 muestras de hojas y tallos, se obtuvieron 240 aislamientos bacterianos de

morfología constante y única, de los cuales se seleccionaron 10 de ellos al azar para

tipificarlos y probar su patogenicidad. Se usaron 30 plantas sanas de maíz del cultivar

comercial AS7573 de 45 días de edad. El inóculo se obtuvo de un cultivo de la bacteria

cultivada en medio BK a 30ºC durante 48 h, que se resuspendió en 100 mL de solución

estéril de buffer de fosfatos PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.01 M Na2HPO4, 1.8

mM de KH2PO4, pH 7.4). La base del tallo de las plantas se inyectó con una suspensión

bacteriana de 1x107 UFC/mL ajustado en un espectrofotómetro (Jenway 6405 UV/vis);

posteriormente las plantas inoculadas se cubrieron con bolsas de plástico y se

mantuvieron en un invernadero a 25-30ºC y 80% HR. Después de 8 días, las bolsas de

plástico se retiraron y las plantas se mantuvieron en el mismo invernadero. Los testigos

se inocularon con agua estéril y se mantuvieron bajo las mismas condiciones. El

desarrollo de los síntomas se observó durante 45 días. La bacteria fue reaislada en

12

medio BK a partir del tejido cercano a las áreas infectadas para confirmar la identidad

del organismo.

1.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco

Una suspensión bacteriana de 107 UFC/mL, se infiltró en la nervadura central de cinco

hojas de tabaco (Nicotiana tabacum var xanthi). Las dos plantas tratadas se

mantuvieron a 28ºC durante 24 h. Los testigos se infiltraron con agua estéril.

1.4.4. Caracterización e identificación del patógeno

Los 10 aislamientos se caracterizaron mediante la reacción de Gram (Gregersen,

1978), la citocromo oxidasa C (Kovacs, 1956), el metabolismo oxidativo- fermentativo y

la fluorescencia en medio BK (Schaad et al., 2001). Con propósitos comparativos, se

empleo la guía para la identificación de bacterias fitopatógenas (Schaad et al., 2001).

1.4.4.1. Caracterización fenotípica

Los 10 aislamientos bacterianos se sembraron en medio B de King y se incubaron

durante 5 y 7 días a 30°C. Los crecimientos bacterianos se lavaron tres veces con agua

destilada estéril, con pipeta Pasteur se tomó una alicuota del último lavado, se colocó

una gota en un portaobjetos y se mezcló con una gota de ácido fofostúngstico (1% en

agua destilada, pH 6.9). Las rejillas de cobre con membrana se sumergieron por el lado

de la membrana en la mezcla, se secaron en una caja Petri con papel filtro esterilizado

para su almacenamiento. Las células bacterianas se fotografiaron observando las

rejillas al microscopio electrónico de transmisión (modelo Imaging).

13

1.4.5. Caracterización molecular

1.4.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El DNA se extrajo con el protocolo comercial Plant DNAZOL® (Invitrogen) de las 10

cepas bacterianas aisladas de tallo y hojas. Los oligonucleótidos bacterianos

específicos para Eubacterias fueron FD1 (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) que

corresponde a la posición 8-28 del gen rRNA 16s de E. coli, y el iniciador RD1

(5’AAGGAGGTGATCCAGCC3’) que corresponde a la posición 1526-1542 del gen gyrB

de Xylella fastidiosa y que rinde un fragmento de aproximadamente 1600 Kb. La

amplificación del DNA se desarrolló en una reacción con 25 µL conteniendo 0.2 µM de

cada iniciador, 200 µM dNTP, 1X buffer para PCR, 1.5 mM MgCl2, 2U Taq polimerasa

(todos los reactivos utilizados de Invitrogen) y 10 ng de ADN molde. La PCR consistió

de una desnaturalización inicial de un ciclo de 94 ºC durante 3 min, seguido de 30

ciclos con 94 ºC durante 1 min, 55 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 1 min, con una

extensión final de 72 ºC durante 7 min (Rodrígues et al., 2003). Una alicuota de 10 µL

de la reacción fue analizada por electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 80 V por

90 min en buffer TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio. Se empleó un marcador

molecular de 100 Pb (Invitrogen).

1.4.5.2. Identificación del género de la bacteria por PCR

La identificación de los 10 aislamientos se confirmó usando los iniciadores RHG-F

(5´GGGATTCATTTCCTTAGTAAC3´) cuya posición es 835-851 del 16S rDNA y RHG-

R (5´GCGATTACTAGCGATTCCAGC3´) cuya posición corresponde a 1324-1345 16S

rDNA, específicos para género (LiPuma et al., 1999). La amplificación se desarrolló en

una reacción de 25 µL conteniendo 0.2 µM de cada iniciador, 200 µM dNTP, 1X buffer

14

de PCR, 1.5 mM MgCl2, 2U Taq polimerasa y 10 ng de ADN molde. La amplificación

se inició con una desnaturalización a 95 ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos con 94

ºC durante 1 min, 55 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 2 min, con una extensión final de

72 ºC durante 7 min. Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis

como se mencionó anteriormente.

1.4.5.3. Secuenciación y alineamiento

El DNA fue secuenciado en un equipo Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem

Corp). Las secuencias fueron alineadas y la homología se determinó en el servidor del

National Center of Biological Information (NCBI, 2008).

Una alineación múltiple se construyó usando Clustalx. Un árbol filogenético fue

construido por el método neighbor-joining derivado de las secuencias 16s rDNA, con

10000 repeticiones de bootstrat en el software MEGA 4 (Tamura et al., 2007).

1.4.5.4. PCR especifico para especie

La identificación para especie fue confirmada usando el par de primers LP1

(´5GGGGGGTCCATTGCG´3 cuya posición es 872-886) y LP4 (´5

AGAAGCTCGCGCCACG´3, posición 1523-1508) dirigido a una región específica del

gen rRNA 23S (Whitby et al., 2000). La amplificación se desarrolló en una reacción de

25 µL conteniendo 0.2 µM de cada iniciador, 200 µM dNTP, buffer 1X, MgCl2 1.5 mM,

Taq polimerasa 2U y 10 ng de ADN molde. La amplificación se inició con una

desnaturalización a 95 ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos con 94 ºC durante 1 min,

55 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 2 min, con una extensión final de 72 ºC durante 7

15

min. Todos los productos amplificados fueron visualizados por electroforesis como se

mencionó anteriormente.

1.4.5.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

10 µL del producto de PCR fueron digeridos con las enzimas HaeIII (Roche®), Taq1 y

ApaI (Fermentas®) en un termociclador (Applied Biosystems 2720), utilizando los

programa: HaeIII y ApaI a 37ºC durante 20 h y Taq1 a 65ºC durante 20 h. Los

productos de la digestión fueron analizados en un gel de agarosa al 2%.

1.4.6. Incidencia del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz.

La incidencia y severidad del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz se

evaluó en 14 parcelas comerciales del cultivar AS7573 en los municipios de Tlalixcoyan

(7 parcelas), Cosoleacaque (9 parcelas) y Paso de Ovejas(1 parcela), Ver. En el centro

de cada parcela se eligieron 25 surcos contínuos y 25 plantas por surco, para un total

de 625 plantas evaluadas. La incidencia se evaluó con 0= ausencia, 1= presencia de la

enfermedad. La incidencia se calculó dividiendo el Número de plantas enfermas entre

el total de las plantas muestreadas y el cociente se multiplicó por cien. Las parcelas

con síntomas fueron georeferenciadas con el sistema de posicionamiento global

(GPS38 Personal Navigator) con el fin de registrar y determinar la distribución de la

enfermedad en la región.

1.4.7. Severidad del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz

La severidad de la enfermedad se evaluó con base en una escala desarrollada con

fotografías de 50 plantas completas. Planta sana y valores máximos de severidad

fueron cuidadosamente seleccionados. La escala arbitraria del tejido dañado estuvo

16

conformada de cinco clases: clase 0= 0%, clase 1= 8%, clase 2= 15%, clase 3= 25%,

clase 4= 30% y clase 5= >50 %. Los mapas de distribución y severidad de la bacteria

se generaron con el programa SURFEL®).

1.5. RESULTADOS

1.5.1. Muestreo

De los muestreos realizados en los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de

Ovejas, Veracruz, se obtuvieron un total de 480 muestras de maíz del cultivar comercial

AS7573. Los síntomas observados en campo fueron manchas acuosas, blanco-

amarillentas en hojas, que al coalescer formaron franjas longitudinales y algunas de las

hojas se tornaron de color rojizo. En tallo, una pudrición semiacuosa en la corona y

necrosis, en la base de la mazorca necrosis y detención del desarrollo (Figura 1A, B y

C).

1.5.2. Aislamiento de la bacteria

De las 480 muestras colectadas, en 240 de ellas se aislaron colonias bacterianas en

los medios BK, AN y CPG de morfología constante y única, de los cuales se

seleccionaron 10 al azar para tipificarlos. Los 10 aislamientos bacterianos

seleccionados se caracterizaron como colonias blancas, convexas, de bordes lisos,

húmedos y brillantes.


Las 30 plantas de maíz de 45 días de edad del cultivar comercial AS7573 infiltradas

con la bacteria en invernadero mostraron síntomas similares a los observados en

campo. Los síntomas en hojas iniciaron 8 h después de la inoculación como manchas

acuosas, blanco-amarillas (Figura 2A). A las 72, h las manchas coalescieron y formaron

17

franjas longitudinales de 0.3 cm de ancho y 8 cm de largo las cuales se necrosaron

(Figura 2B) y algunas hojas se tornaron rojizas. La corona del tallo desarrolló una

pudrición semiacuosa (Figura 2C) y el tallo se necrosó (Figura 2D). La hoja bandera se

enrolló y se necrosó (Figura 2E). La base de la mazorca se necrosó y la mazorca no

desarrolló (Figura 2F). Las plantas testigo permanecieron sanas. Los postulados de

Koch se completaron con el reaislamiento y reidentificación de la bacteria como

Burkholderia gladioli (Schaad et al., 2001).


Las bacterias aisladas de las lesiones de hojas y Tallo en maíz fueron positivas a la

reacción de hipersensibilidad en las cinco hojas de tabaco; sin embargo, su virulencia

fue evidente ya que a las 24 h se presentó una flacidez y necrosis de la lámina foliar

completa y no solo del área infiltrada (Figura 3). Los testigos no presentaron la reacción

de hipersensibilidad.


Las 10 cepas bacterianas seleccionadas para este estudio fueron Gram-negativas,

aeróbicas. En medio BK, las cepas produjeron un pigmento difusible de color verde-

amarillo. Todos los aislamientos mostraron reacción de oxidasa negativa, crecieron a

pH 4.0 y utilizaron glucosa, manitol, arabinosa, trealosa, xilosa, sacarosa, celobiosa y

sorbitol, pero no L-rhamnosa ni maltosa. Ninguna de las cepas produjo indol. La

hidrólisis del almidón, levana, licuefacción de gelatina y reducción de nitratos fueron

positivas. Con base en la morfología, fisiología y características bioquímicas, los 10

aislamientos se identificaron como Burkholderia gladioli (Schaad et al., 2001).

B

18

1.5.4. 1. Caracterización fenotípica

Las células bacterianas presentaron forma bacilar con un flagelo polar, como lo

reportan Schaad et al. (2001) para Burkholderia gladioli. (Figura 4).



Las 10 cepas bacterianas selecionadas generaron un producto de aproximadamente

1600 pb cuando se amplificaron por PCR con el juego de iniciadores FD1 y RD1, que

amplifican el gen rDNA 16s de Eubacterias (Figura 5). El análisis en BLAST de las 10

secuencias nucleotidicas del gene rDNA 16s de los aislados bacterianos de maíz con

los sintomas bandeado de las hojas y pudrición del tallo mostraron una homologia de

97 % con secuencias de Burkholderia gladioli.

1.5.5.2. PCR para género

La confirmación del género de los aislados que preliminarmente se identificarón como

Burkholderia se realizó con los iniciadores específicos reportados por LiPuma et al.

(1999), amplificando un fragmento de aproximadamente 500pb. No hubo amplificación

con la cepa de Xanthomonas campestris usada como testigo negativo (Figura 6).


La identidad de los aislamientos se confirmó mediante la alineación de las secuencias.

La secuencia de nucleótidos (Acc. No. EU161873 a EU161878 y EU382089 a

EU382092) tuvieron 100% de similitud entre los aislamientos de las tres localidades y

99% de similitud con secuencias de Burkholderia gladioli depositadas en el Genbank

19

(Cuadro 1.1). Los árboles filogenéticos generados a través de las secuencias del RNA

16s indicaron variación en la secuencias de nucleótidos del fragmento amplificado.

Cuadro 1.1. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias reportadas

en el banco de genes del Genbank con las secuencias de los genes 16s rRNA de las

bacterias aisladas de plantas de maíz con síntomas de bandeado de la hoja y pudrición

del tallo en Veracruz, México. Año 2007.

1= Número de nucleótidos amplificado por PCR con los iniciadores RHG-F y RHG-R 2 = Base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) 3= Índice de similaridad entre la secuencia de las bacterias aislada y la especie comparada

1.5.5.4. PCR específico para especie

La confirmación de los 10 aislados para la especie gladioli se realizó con los

oligonucleótidos LP1 y LP4 reportados por Whitby et al (2000). Las 10 cepas generaron

un fragmento de aproximadamente 700 pb, el cual coincide con lo reportado por Whitby

et al. (2000) y Keith et al. (2005). No hubo amplificación del fragmento con la cepa

Bacteria aislada Localidad N

1 Num. acc

Banco de Genes

2

Espécie alineada IS

3 Num. acc.

B. gladioli Tlalixcoyan 495 EU161873 B. gladioli 99 EU560426



B. gladioli Cosoleacaque 494 EU161876 B. gladioli 99 EU024168

B. gladioli Paso de ovejas 496 EU161877 B. gladioli 99 AY586517


B. gladioli Paso de ovejas 498 EU382089 B. gladioli 99 EU024170


B. gladioli Paso de ovejas 493 EU382091 B. gladioli 99 AY268165

B. gladioli Paso de ovejas 494 EU382092 B. gladioli 99 EU560426

20

bacteriana de Xanthomonas campestris usada como testigo negativo (Figura 7). El

análisis del rDNA 16s, rRNA 23 y con iniciadores para dominio, género y especie

confirmaron los resultados morfológicos, fisiológicos y bioquímicos indicando que los

aislamientos fueron de Burkholderia gladioli.

1.5.5.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

De los 10 aislamientos en estudio y cuyos productos de amplificación con los

oligonucleótidos RGH-F y RGH-R, se sometieron a digestión con la enzima HaeIII, se

obtuvieron fragmentos de 150, 350, 400 y 500 pb. TaqI generó 3 fragmentos de 150,

300 y 350 (Figura 8 y 9), mientras que ApaI no mostró ningún corte de restricción. Los

patrones de restricción originados por las dos digestiones enzimáticas fueron los

mismos en todas las cepas. Al no obtener diferencias en los patrones de restricción

entre las diferentes cepas se deduce que los sitios de corte de las enzimas utilizadas

están relacionados con regiones conservadas del rDNA 23s.

1.5.6. Incidencia del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maiz

Tlalixcoyan fue el municipio que, en el 2005, presentó mayor incidencia (37.6%),

seguido por Cosoleacaque (17.6%) y Paso de Ovejas (9.76%) (Figura 10 y 11). La

incidencia disminuyó en 2006 a 16.32% en Tlalixcoyan, seguido de 10.72% en

Cosoloacaque y 3.89 % en Paso de Ovejas. La incidencia disminuyó aún más en el

2007, Cosoleacaque 0%, Paso de Ovejas 1.12% y Tlalixcoyan 3.36% (Figura 10 y 11).

Las 14 parcelas muestreadas y georeferenciadas fueron del cultivar comercial AS7573

(Cuadro 1.2).

21

Cuadro 1.2. Ubicación de 14 parcelas de maíz muestreadas en tres municipios de

Veracruz, México, para la evaluación de la incidencia y severidad del bandeado de la

hoja y pudrición del tallo. 2005 -2007.

Clave Municipio Coordenadas Altitud msnm

Ciclo de muestreo

Lat Norte Long Oeste

PCOS1 Cosoleacaque 17.89274 94.63544 21 PV-07 PCOS2 Cosoleacaque 17.89663 94.63498 32 PV-07 PCOS3 Cosoleacaque 17.89242 94.63241 4 PV-07 PCOS4 Cosoleacaque 17.91579 94.62561 11 PV-07 PCOS5 Cosoleacaque 17.89521 94.62979 9 Inv-06 PCOS6 Cosoleacaque 17.89798 94.63171 23 Inv-06 PCOS7 Cosoleacaque 17.89006 94.63934 14 Inv-06 TLAX1 Tlalixcoyan 18.71789 96.12835 9 PV-06 TLAX2 Tlalixcoyan 18.72726 96.11682 24 PV-06 TLAX3 Tlalixcoyan 18.72762 96.11543 21 PV-06 TLAX4 Tlalixcoyan 18.72784 96.11473 22 Inv-06/07 TLAX5 Tlalixcoyan 18.71771 96.12835 12 Inv 06/07 TLAX6 Tlalixcoyan 18.71789 96.11365 8.5 Inv-06/07

PASO1 Paso de Ovejas 19.11247 96.20810 25 OI-06

PV= Primavera-Verano; INV= Invierno; OI= Otoño-Invierno, msnm= Metros sobre nivel del mar

1.5.7. Severidad del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz

La distribución espacial de la severidad sugiere el lento desarrollo de focos de

infección. Al inicio de la floración la severidad fue de 30 a 50%. No se observaron

agregados definidos. Los inicios de focos se presentaron en forma aleatoria dentro de

la plantación y en algunos en los márgenes de la parcela. La distribución aleatoria que

presenta la enfermedad sugiere que la fuente de contagio o de inóculo podría ser la

semilla. Los focos marginales no descartan un factor biológico o de manejo en la

dispersión de la enfermedad (Figura 11).

22

1.6. DISCUSION

Esta nueva enfermedad se presentó en forma epidémica en 2003-2004, inicialmente en

siembras de maíz elotero del cultivar comercial AS7573 y causó alarma entre los

productores de los municipios de Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas,

Veracruz, México. En el presente trabajo, se aisló constantemente de tejidos afectados,

una cepa bacteriana que en medio de cultivo BK, CPG y AN generaron colonias

blanco-grisaceo, convexas, de borde liso, húmedas y brillantes. Los postulados de

Koch se siguieron con 10 cultivos puros seleccionados y los síntomas de las plantas

inoculadas fueron idénticos a los observados en campo. La inoculación artificial de

plantas de tabaco y maíz evidenciaron la alta virulencia de estas cepas, ya que en

tabaco ocasionó la flacidez de la lámina foliar y no solo en la zona infiltrada, lo que

sugiere que la bacteria probablemente tiene la capacidad de desplazamiento inter e

intracelular, posiblemente debido a la presencia de enzimas y/o toxinas de alta

capacidad biodegradante (López, 1994). El análisis del rDNA 16s empleando

iniciadores universales, así como la secuencia parcial de dicha región, confirmaron los

estudios bioquímicos y fisiológicos. El empleo de los iniciadores sugeridos por LiPuma

et al. (1999), aproximó con un 95% de similitud a B. gladioli de todos los aislamientos

analizados. La confirmación definitiva de B. gladioli la soportó el análisis de rDNA 23s

mediante el par de iniciadores LP1 y LP4 (Whitby et al., 2000).

No hay reportes previos en México de B. gladioli en maíz, ni de los síntomas descritos.

En el Estado de Veracruz también se cultiva arroz, sorgo, caña de azúcar que, de

acuerdo con la literatura, son hospedantes de B. gladioli (Hiroyuki et al., 2006.,

McCulloch, 1921). La presencia de esta enfermedad representa un riesgo para dichos

23

cultivos y para hospedantes alternos desconocidos. De acuerdo al analisis de

compararcion nucleotidicas de los tres aislamientos y del patrón electroforético de

restricción indican que esta presente una cepa ampliamente distribuida en las tres

regiones. El análisis de los resultado de detección de la bacteria indicó que se aisló de

cultivares AS7573, no se encontró en criollos y al rededores, probablemente porque fue

introducido por semilla. La adaptabilidad de especies de Burkholderia es en gran parte

desconocida (Keith et al., 2005). La identificación correcta y la determinación de los

factores de virulencia de la bacteria son importantes para la evaluación de riesgo y el

control de la enfermedad en campo (Coenye y Vandamme, 2003). En 2007 la

incidencia del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz han disminuido

aproximadamente a un 1%.

A este respecto, se han registrado enfermedades del maíz en diferentes países que

aparecieron alarmantemente y que en poco tiempo desaparecieron. Como ejemplos se

pueden citar casos como el de la roya del maíz causada por Puccinia polysora que en

la década de los 50s se presentó afectando maíces cultivados en Kenia y Tanzania y

que al poco tiempo desapareció (Robinson, 2000., Rhind et al., 1952). Otro caso es el

de la roya común ( Puccinia sorghi) que se presentó en EEUU a inicios de los años

50s, reportándose un incremento en su incidencia y que al poco tiempo desapareció

(White, 2004 ). La mancha anular del maíz causada por el hongo Hyalothyridium

maydis, se presentó en forma severa en 1999 y 2000 en siembras comerciales de maíz

en la región de Caicedonia, Cauca, en Colombia. Despues de estos dos años, la

enfermedad no se volvió a presentar, aún cuando siguieron sembrándose los mismos

híbridos comerciales que habían mostrado susceptibilidad (Varón et al., 2000.,

24

CIMMYT, 2004., White, 2004). En México, un ejemplo similar es el caso del mildiu

velloso de sorgo causado por Peronosclerospora sorghi (sin. Sclerospora sorghi),

afectando tanto maíz como sorgo. Reportado en México en 1968 y que se distribuyó

eficientemente en la mayoría de los estados del país en donde se sembraba maíz y/o

sorgo. Las instituciones de investigación agrícola del país iniciaron inmediatamente

programas de selección de resistencia a la enfermedad. Sorprendentemente, hacia los

años 80s la enfermedad fue desapareciendo y en la actualidad se le observa solamente

como una curiosidad (De León, comunicación personal).

1.7. CONCLUSIONES

Las plantas enfermas de maíz, colectadas en Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de

Ovejas, Veracruz estaban infectadas por Burkholderia gladioli. La identificación de B.

galdioli, se confirmó utilizando el análisis del rDNA 16s, rRNA 23s y con iniciadores

para dominio, género y especie. De acuerdo al analisis de compararcion nucleotidicas

de los tres aislamientos y del patrón electroforético de restricción indican que esta

presente una sola cepa ampliamente distribuida en las tres regiones. El análisis de los

resultados de detección de la bacteria indicó que se aisló de cultivares AS7573, no se

encontró en criollos y al rededores, probablemente porque fue introducido a México por

semilla. La alta incidencia con que se presentó esta enfermedad en el 2003 disminuyó

con el tiempo y en 2007 la incidencia disminuyó aproximadamente a un 1%. Este es el

primer reporte de Burkholderia gladioli como patógeno del maíz (Zea mays) en México.

25

Figura 1. Síntomas en plantas de maíz ocasionados por Burkholderia gladioli en Veracruz, México. A. Los síntomas iniciales en hojas de maíz aparecen como manchas semiacuosas, blanco amarillentas, B. Necrosis en tallo, C. Necrosis en la base de la mazorca cuyo desarrollo se detiene.

Figura 2. Síntomas en plantas de maíz inoculadas en invernadero con Burkholderia gladioli, proveniente de Veracruz, México. A. Manchas semiacuosas, blanco amarillentas, en hojas, B. Franjas longitudinales en hojas C. Pudrición semiacuosa en la corona, D. Necrosis en tallo, E. Enrollamiento y necrosis de la hoja bandera, F. Necrosis en mazorca cuyo desarrollo se detiene. Año 2007.

C C B A

F D E

C B A

26

Figura. 3. Hipersensibilidad en hoja de tabaco var xanthi, mostrando la necrosis ocasionada por Burkholderia gladioli a las 24 h de haber sido infiltrada en la nervadura central. Año 2007.

Figura 4. Células bacterianas de Burkholderia gladioli mostrando un solo flagelo polar y la forma bacilar (25000x).

27

Figura 5. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen rDNA 16s de Eubacterias. Línea 1 a la 10 son diez diferentes cepas de Burkholderia aislada de plantaciones

comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo en Veracruz. Línea 11, Erwinia sp control positivo. Línea 12, control negativo (agua estéril). M. Marcador molecular de 1Kb (Invitrogen).

Figura 6. Amplificación del producto de 500 Pb del gen 16s rDNA de Burkholderia, Línea 1 a la 10 son diez diferentes cepas de Burkholderia aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo de Veracruz. Línea 11, Xanthomonas campestris utilizado como control negativo. M. Marcador molecular de 100 pb (Invitrogen).año 2007.

1600 Pb

250 Pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

500 Pb

1500 Pb

28

Figura 7. Amplificación del producto de 700 Pb del gen 23s rDNA de Burkholderia gladioli. Línea 1 a la 10 son diez diferentes cepas de Burkholderia gladioli aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo de Veracruz con síntomas de bandeado y pudrición del tallo. Línea 11, control negativo (agua estéril). M. Derecha marcador molecular de 1Kb y 100 pb izquierda (Invitrogen). Año 2007.

Figura 8. Productos de PCR 23s después de la digestión con HaeIII, en gel de agarosa al 2%. Línea de la 1 a la 10 producto de PCR de Burkolderia gladioli aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo .de Veracruz. M (izquierda) Marcador molecular de 100 Pb y M (derecha) Marcador molecular de 50 Pb (Invitrogen). Año 2007.

700 Pb 700 Pb

1500 Pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

500 Pb 450 Pb

350 Pb

150 Pb

1500 Pb

29

Figura 9. Productos de PCR 23s después de la digestión con TaqI, en gel de agarosa al 2%. Línea de la 1 al 10 producto de PCR de Burkolderia gladioli aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo de Veracruz. M (izquierda) Marcador

molecular de 100 Pb y M (derecha) Marcador molecular de 50 Pb. Año 2007.

Figura 10. Incidencia porcentual de Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

350 Pb 300 Pb 150 Pb

1500 Pb

350 Pb

300 Pb

150 Pb

30

Figura 11. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.

Figura 12. Distribución y severidad de Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de bandeado de la hoja y pudrición del tallo en el ciclo Primavera-Verano 2005 (Abril-Agosto), en Tlalixcoyan, Ver.

31

1.8. LITERATURA CITADA

Chavero, J. J. 2004. Control químico in vitro de la bacteriosis del maíz (Herbaspirillum rubrisubalbicans). Tesis de licenciatura, departamento de Fitotecnia. Universidad Autónoma Chapingo.75p.

Coenye, T., and Vandamme, P. 2003. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environ.Microbiol. 5:719-729.

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32

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White, G. D. 2004. Plagas y Enfermedades del Maíz. The American Phytopathological Society. Ed. Mundi-prensa.78p.

33

CAPITULO II

MANCHA FOLIAR DEL MAÍZ OCASIONADA POR Pantoea ananatis, EN

VERACRUZ, MÉXICO.

2.1. RESUMEN

Una nueva enfermedad en siembras comerciales de maíz Asgrow 7573 se presentó

epidémicamente en los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de Ovejas,

estado de Veracruz, México, durante el 2003-2004. Los síntomas en hojas fueron

manchas acuosas, verde oscuro, que posteriormente se necrosaron, y tomaron un

aspecto blanco-grisáceo. Las bacterias aisladas de las lesiones fueron identificadas

usando pruebas fisiológicas, bioquímicas convencionales y se caracterizaron

molecularmente mediante la amplificación por PCR de un fragmento del rDNA del gene

16s y secuenciación. El agente causal de la mancha foliar del maíz en Veracruz,

México fue Pantoea ananatis (Sin. Erwinia ananas). Las secuencias de nucleótidos

obtenidas se depositaron en el National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Este es el primer hallazgo de Pantoea ananatis en maíz en México.

Palabra clave: Erwinia ananas, PCR, Zea mays, secuenciación.

34

2.2. ABSTRACT

A new disease in maize plants Asgrow 7573 occurred during 2003-2004 in the counties

of Cosoleacaque, Tlalixcoyan and Paso de Ovejas, in the state of Veracruz, Mexico.

Leaf symptoms consisted in of dark green, water-soaked which later became white-gray

to necrotic. Bacteria isolated from the lesions were identified by physiological and

biochemical tests, and were molecularly characterized by PCR amplification of a

fragment of the 16s rDNA gene and sequencing. The causal agent of the leaf spot

disease of maize in Veracruz, Mexico was identified as Pantoea ananatis (Syn. Erwinia

ananas). Nucleotide sequences were deposited at the National Center for

Biotechnology Information (NCBI). This is the first report of Pantoea ananatis in maize

in México.

Keywords: Erwinia ananas, PCR, Zea mays, sequencing.

35

2.3. INTRODUCCION

El maíz proporciona el 39% de la proteína y el 59 % de la energía de los mexicanos,

como resultado de un consumo anual per capita de 209.8 kg (Morris y López, 2000). En

el 2009 se sembraron con maíz 193,326 ha en el estado de Veracruz, con una

producción de 217,145 toneladas y un rendimiento de 2.2 ton/ha (Oeidrus, 2009).

La producción de maíz puede ser afectada por enfermedades que reducen la

capacidad de la planta para crecer y producir de manera normal (White, 2004). En este

Una enfermedad de etiología desconocida se presentó epidémicamente en 2003-2004

en siembras de maíz del cultivar comercial Asgrow 7573 en los municipios de

Tlalixcoyan, Cosaloacaque y Paso de Ovejas, del estado de Veracruz. Los síntomas en

hojas consistieron de manchas irregulares, acuosas, color verde oscuro, que después

se necrosaron y tomaron un color blanco-grisáceo; la hoja finalmente se tornó de color

rojizo. Estos síntomas no se habían reportado anteriormente en el cultivo de maíz en

México. El objetivo del presente estudio fue identificar la causal de esta mancha foliar

del maíz en el estado de Veracruz, México.

2.4. MATERIALES Y MÉTODOS

2.4.1. Muestreo

En los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, del estado de

Veracruz, México, se muestrearon 14 parcelas de maíz del cultivar comercial AS7573,

durante 2005-2007. EL muestreo en cada plantación comercial consistió en seleccionar

7 surcos sembrados y dentro de cada surco se muestreó una de cada cinco plantas. En

total de seleccionaron 60 plantas por municipio. Las parcelas muestreadas fueron

36

georeferenciadas, utilizando el sistema de posicionamiento global (GPS38 Personal

Navigator) para determinar la distribución de la enfermedad en las diferentes regiones.

2.4.2. Aislamiento del agente causal

El aislamiento se realizó de hojas que mostraban manchas irregulares, acuosas que

sugerían la posibilidad de una etiología bacteriana. El material fue seccionado y

desinfestado con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 min, se lavó tres veces durante

con agua destilada estéril. Los cortes fueron colocados en tubos de ensayo con 10 mL

de agua estéril y se dejaron reposar durante 10 min. Parte de la suspensión se sembró

por estría cruzada en los medios casaminoácidos peptona glucosa (CPG), B de King

(BK), agar nutritivo (AN) y tripticasa de soya agar (TSA). Los cultivos fueron incubados

a 28C durante 72 h. Las colonias bacterianas individuales fueron purificadas y

almacenadas a -80C en glicerol al 15%.


De 180 muestras colectadas, se obtuvieron 100 aislamientos bacterianos de morfología

constante y única, de los cuales se seleccionaron 10 cepas al azar para tipificarlos y

probar su patogenicidad. Para esto, se inocularon 20 plantas sanas de maíz de 45 días

de edad de cada uno de los cultivares comerciales AS7573, Nutria, Orca y CP560.

AS7573 fue seleccionado, porque en este cultivar se presento la epidemia del 2003 y

porque es el más común en la región. Algunos productores mencionaron que habían

probado a Orca y Nutria y las encontraron con cierta tolerancia. CP560 se incluyó

porque el Colegio de Postgraduados, Campus, Veracruz la estaba promocionando en

la región. El inóculo se obtuvo de un cultivo de la bacteria en caldo tripticasa de soya

(TSB) que se incubo a 30C durante 48 h. Un ml de este cultivo se resuspendió en 100

37

ml de medio TSB, se incubó en agitación durante 4 h. El cultivo fue centrifugado

durante 1 min. a 12000 rpm y el sedimento fue resuspendido en solución estéril de

buffer de fosfatos PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.01 M Na2HPO4, 1.8 mM de

KH2PO4, pH 7.4). La concentración del inóculo se ajustó en un espectrofotómetro

(Jenway 6405 UV/vis). A las hojas se les hicieron heridas con una aguja de 29 G y

posteriormente fueron asperjadas con una suspensión bacteriana de 1x106 UFC/ml

(Paccola et al., 2001). Posteriormente, las plantas se cubrieron con bolsas de plástico y

se mantuvieron en un invernadero (28-32C con 80% HR). Las 30 plantas testigo de

cada cultivar comercial fueron inoculados con agua estéril y se mantuvieron bajo las

mismas condiciones. El desarrollo de los síntomas se supervisó durante 60 días. La

bacteria fue reaislada en TSA a partir del tejido cercano a las áreas infectadas para

confirmar la identidad del organismo.


Una suspensión bacteriana de 106 UFC/mL, se infiltró en los espacios intercelulares de

la nervadura central de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi). Las plantas

tratadas se mantuvieron a 28ºC durante 24h. Las plantas de tabaco testigo fueron

infiltradas con agua estéril.


Las cepas se caracterizaron por la morfología de la colonia en TSA, la movilidad,

morfología celular, prueba de Ryu (Suslow, 1982; Schaad et al., 2001), y por la

producción de catalasa, oxidasa, oxidación y fermentación de la glucosa, producción de

indol y la producción de ácido a partir de azúcares (Schaad et al., 2001 y Paccola et al.,

2001).

38



El DNA se extrajo de las 10 cepas bacterianas seleccionadas con el protocolo

comercial Plant DNA Zol® (Invitrogen). Los iniciadores bacterianos universales usados

fueron FD1 Eubacteria (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) del gen rRNA 16s y el

iniciador RD1 Eubacteria (5’AAGGAGGTGATCCAGCC3’) (Rodrigues et al., 2003). La



(Invitrogen) y 10 ng de ADN molde. La PCR consistió de una desnaturalización inicial

de un ciclo de 94 ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos con 94 ºC durante 1 min, 55

ºC por 30 seg y 72 ºC por 1 min, con una extensión final de 72 ºC durante 7 min

(Rodrígues, et al., 2003). Una alícuota de 10 µL de la reacción fue analizada por

electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 80 V por 80 min en buffer TBE. El gel se

tiñó con bromuro de etidio. Se empleó un marcador molecular de 1Kb (Invitrogen).


El DNA fue secuenciado (cepas ADVER07, ADVER08 Y ADVER09) en un equipo

Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem Corp). Las secuencias fueron alineadas y la

homología se determinó en el servidor del National Center for Biological Information

(NCBI, 2008).

2.4.6. Incidencia de la mancha foliar del maíz

La incidencia de la mancha foliar de maíz se evaluó en 14 parcelas comerciales del

cultivar AS7573 en los municipios de Tlalixcoyan (7 parcelas), Cosoleacaque (9

parcelas) y Paso de Ovejas(1 parcela), Ver. En el centro de cada parcela se eligieron

39

25 surcos contínuos y 25 plantas por surco, para un total de 625 plantas evaluadas. La

incidencia se evaluó con 0= ausencia, 1= presencia de la enfermedad. La incidencia se

calculó dividiendo el Número de plantas enfermas entre el total de las plantas

muestreadas y el cociente se multiplicó por cien. Las parcelas con síntomas fueron

georeferenciadas con el sistema de posicionamiento global (GPS38 Personal

Navigator) con el fin de registrar y determinar la distribución de la enfermedad en la

región.

2.5. RESULTADOS

2.5.1. Muestreo

De las 14 parcelas muestreadas, se obtuvieron 360 muestras (Cuadro 2.1).

Los síntomas observados en campo fueron hojas con manchas irregulares, verde

oscuro de aspecto húmedo, y con un halo amarillo. En síntomas avanzados las

manchas adquirieron un color blanco-grisáceo y las hojas se tornaron de una

coloración rojiza (Figura 13).

40

Cuadro 2.1. Ubicación de las 14 parcelas de maíz Asgrow 7573 muestreadas en tres

municipios de Veracruz, México para la detección de la mancha foliar del maíz. 2005-

2007.

Clave Municipio Coordenadas Altitud msnm

Ciclo de muestreo


PCOS1 Cosoleacaque 17.89274 94.63544 21 PV-07 PCOS2 Cosoleacaque 17.89663 94.63498 32 PV-07 PCOS3 Cosoleacaque 17.89242 94.63241 4 PV-07 PCOS4 Cosoleacaque 17.91579 94.62561 11 PV-07 PCOS5 Cosoleacaque 17.89521 94.62979 9 Inv-06 PCOS6 Cosoleacaque 17.89798 94.63171 23 Inv-06 PCOS7 Cosoleacaque 17.89006 94.63934 14 Inv-06 TLAX1 Tlalixcoyan 18.71789 96.12835 9 PV-06 TLAX2 Tlalixcoyan 18.72726 96.11682 24 PV-06 TLAX3 Tlalixcoyan 18.72762 96.11543 21 PV-06 TLAX4 Tlalixcoyan 18.72784 96.11473 22 Inv-06/07 TLAX5 Tlalixcoyan 18.71771 96.12835 12 Inv 06/07 TLAX6 Tlalixcoyan 18.71789 96.11365 8.5 Inv-06/07


PV= Primavera-Verano; INV= Invierno; OI= Otoño-Invierno, msnm= metros sobre nivel del mar

2.5.2. Aislamiento del agente causal

De las 380 muestras analizadas, en 130 se aisló un tipo de colonia bacteriana en los

medios BK, AN, CPG, y TSA (cuadro 2.2). Los 10 aislamientos bacterianos

seleccionados se caracterizaron como colonias amarillas de consistencia húmeda,

elevación convexa de borde liso (Schaad et al., 2001).

41

Cuadro. 2.2. Cepas bacterianas de aisladas de maíz AS7573 en tres municipio de

Veracruz, México. Período 2005-2007.


De las 120 plantas de maíz AS7573 inoculadas con las cepas CECOSO, CETLALIX

CEPASO, el 100 % de las plantas fueron afectadas por la bacteria. El cultivar Orca

presentó una incidencia de solamente 11.6%, siendo la variedad con el menor

porcentaje de plantas afectadas (Cuadro 2.3, Figura 14). Los síntomas se expresaron a

los 8 días en AS7573 y a los 15 días en el resto de los cultivares. En los puntos donde

se realizaron las heridas se observaron pequeñas manchas irregulares color verde

oscuro de aspecto húmedo (Figura 15A) (Paccola et al., 2001). A los 20 días después de

la inoculación (DDI), se observaron los halos amarillos alrededor de las manchas (Figura

15 B). A los 30 DDI las manchas coalecieron y tomaron un color blanco-grisáceo (Figura

15 C); finalmente la hoja tomó una coloración rojiza (Figura 15 D): Estos síntomas son

similares a los reportados en Brasil por Paccola et al (2001). En la espiga se desarrolló

una pudrición semi-acuosa, tomaron color obscuro y las hojas cercanas se necrosaron

(Figura 15 E). Los testigos permanecieron sanos (Figura 15 F). Los postulados de Koch

se completaron con el reaislamiento e identificación de la bacteria de los tejidos

Municipio No. de muestras colectadas

No. de cepas aisladas

Tlalixcoyan 120 70

Cosoleacaque 120 20

Paso de Ovejas 120 40

Total 360 130

42

inoculados. Los síntomas se observaron en las lesiones producidas artificialmente, y

también donde cayeron las gotas producidas por la aspersión, lo que indica que la

bacteria encontró las condiciones adecuadas de humedad y temperatura para

desarrollarse.

Cuadro 2.3. Resultados de las pruebas de patogenicidad en cuatro cultivares

comerciales de maíz, inoculados con Pantoea ananatis bajo invernadero en Chapingo,

México. 2007.


Las bacterias aisladas de las lesiones en maíz a las 24 h después de la infiltración con

la bacteria causaron necrosis en hojas de tabaco por lo que la reacción se consideró

positiva (Figura 16).

Cultivar comercial

CEPAS No. de plantas inoculadas

No. de plantas enfermas

(%) Plantas enfermas

CECOSO 40 40 100 Asgrow 7573 CETLALIX 40 40 100

CEPASO 40 40 100 Total 120 120 100

Nutria CECOSO 40 28 70 CETLALIX 40 35 85.5 CEPASO 40 32 80

Total 120 105 78.5

Orca CECOSO 40 2 5 CETLALIX 40 7 17.5 CEPASO 40 5 12.5

Total 120 14 11.6 CP-560 CECOSO 40 10 25

CETLALIX 40 19 47.5 CEPASO 40 11 27.5

Total 120 40 33.3

43


Las cepas bacterianas fueron Gram-negativas, móviles, anaeróbicas facultativas,

oxidasa negativa, catalasa e indol positivo. Las características morfológicas, fisiológicas

y bioquímicas se muestran en el Cuadro 2.4. Con base en la morfología, fisiología y

características bioquímicas los 10 aislamientos se identificaron como Pantoea ananatis

(Schaad et al., 2001., Paccola et al., 2001).

Cuadro 2.4. Caracterización bioquímica, fisiológica y fenotípica de aislamientos de

Pantoea ananatis procedentes de Veracruz, México. 2006-2007.

(+) Reacción positiva, (-) Reacción negativa, (NR) No Reportado,

a Datos de Paccola et al. 2001,

b

Datos Schaad et al., 2001.

Características Cepas aisladas de maíz Reportada

a Reportada

b

Hipersensibilidad en tabaco

+ + -

Morfología celular Bacilar Bacilar Bacilar Producción de pigmento amarillo

+ + +

Producción de Indol + + + Reducción de nitrato - - - Producción de H2S - - - Producción de ácido apartir de:

Glucosa + + NR D-manosa + + NR Sorbitol + + + L-rhannosa + + + Sacarosa + + + Melobiosa + + + D-arabinosa + + + Manitol + + + Maltosa + + + Celobiosa + + + Ureasa - - - Oxidasa - - - Catalasa + + + Licuefacción de la Gelatina

+ + +

Hidrolasa de arginina - - -

44



Las tres cepas seleccionadas para la amplificación generaron un producto de

aproximadamente 1600 Pb cuando se amplificaron por PCR con el juego de iniciadores

FD1 y RD1, que amplifican el gen rDNA 16s (Rodrígues et al., 2003). (Figura 17).


La secuenciación del fragmento de ADN amplificado con los iniciadores FD1 y RD1,

permitió identificar a Pantoea ananatis por comparación con las secuencias

depositadas en el Genbank. La secuencia de nucleótidos (Acc. No. EU189058,

EU189059 y EU189060) mostraron un 100% de homología entre los aislamientos de

las tres localidades. La cepa ADVER07 y ADVER09 (Pantoea ananatis de Tlalixcoyan y

Cosoleacaque) presentaron una homología del 99% con un aislado de China (acc.

DQ517335), reportado por Fei (2006). La cepa ADVER08 (Pantoea ananatis de Paso

de Ovejas) presentó una homología del 99% con un aislado de Sudáfrica (acc.

DQ512490), reportado por Goszczynska (2006) (Cuadro 2.5).

45

Cuadro. 2.5. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias reportadas

en el banco de genes con las secuencias de los genes 16s rDNA de las cepas de

Pantoea ananatis aisladas de hojas de maíz Veracruz, México. 2007.

1 = Número de nucleótidos amplificado por PCR con los iniciadores RHG-F y RHG-R 2= Base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) 3= Índice de similaridad entre la secuencia de las bacterias aislada y la especie comparada

1.5.6. Incidencia de la mancha foliar de maíz

Tlalixcoyan fue el municipio que, en el 2005, presentó mayor incidencia (14.4%),

seguido Paso de Ovejas (7.5%) por Cosoleacaque (6.2%) y (Figura 17). La incidencia

disminuyó en 2006 a 4% en Tlalixcoyan, 3% en Paso de Ovejas, 0% en Cosoloacaque

y. La incidencia disminuyó aún más en el 2007, Cosoleacaque 0%, Paso de Ovejas

1.9% y Tlalixcoyan 1.2% (Figura 18). Las 14 parcelas muestreadas y georeferenciadas

fueron del cultivar comercial AS7573 (Cuadro 2.1).

2.6. DISCUSIÓN

En este estudio, se describe “la mancha foliar como una nueva enfermedad del maíz en

el estado de Veracruz. Las bacterias aisladas de las muestras de maíz de los

municipios de Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz, fueron Gram

Bacteria aislada N1 Num. acceso

Banco de genes

2

Especie alineada IS3 Num. acceso

Pantoea ananatis 594 EU189058 Pantoea ananatis 99 DQ517335



46

negativa, de color amarillo de consistencia húmeda, y fueron identificadas como

Pantoea ananatis (Sin. Erwinia ananas) (Schaad et al., 2001 y Paccola et al., 2001).

Esta bacteria se describió por primera vez por Serrano en 1928, como el agente causal

de la pudrición del fruto de piña. El género Erwinia ananas fue transferido al género

Pantoea como Pantoea ananas en base a los estudios de hibridación de ADN

(Mergaert et al., 1993) y en 1997, la especie fue corregida con el nombre de “ananatis”

(Trüper y De Clari, 1997).

Las pruebas de patogenicidad en plantas de tabaco y maíz evidenciaron la

patogenicidad de la bacteria ya que en tabaco la reacción de hipersensibilidad fue

positiva a las 24 h, lo cual coincide con lo reportado por Paccola et al. (2001) y Azad et

al. (2000). Los síntomas en las plantas de maíz de los cultivares comerciales AS7573,

Nutria, Orca y CP-560, iniciaron a los 15 DDI, mostrando pequeñas manchas

irregulares color verde oscuro de aspecto húmedo. A los 30 DDI las manchas en las

hojas coalecieron y finalmente se tornaron de color blanco-grisaceo. Síntomas similares

fueron observados por Paccola et al. (2001). Los síntomas se observaron en las

lesiones producidas artificialmente, y también y más rápido sobre la superficie

asperjada, lo cual coincide con Azad et al. (2000). El factor ambiental fue fundamental

para la expresión de los síntomas; temperaturas de 28-32°C y humedad relativa de

80% fueron adecuadas para el desarrollo de la enfermedad, lo cual coincide con Azad

et al. (2000)

Los factores ambientales influyen en la gravedad de las enfermedades causadas por P.

ananatis. En el caso del maíz y eucalipto, alta humedad y temperaturas moderadas

entre 20 y 25°C, aumentan la incidencia de la enfermedad (Paccola et al., 2001;

47

Coutinho et al., 2000). En contraste, en pasto Sudán (Sorghum sudanense), la

infección aumentó a los 32°C con una humedad relativa alta (Azad et al., 2000).

Condiciones calientes, secas y con vientos han agravado la severidad de la necrosis

del tallo del arroz causada por P. ananatis (Cother et al., 2004). Las heridas naturales,

daño por insectos y por contacto de planta a planta, podrían ser un factor crucial en la

entrada del patógeno y desarrollo de la enfermedad, debido a que P. ananatis

probablemente reside epifíticamente en las hojas de maíz, como en el cultivo de arroz y

pasto Sudán (Watanabe et al., 1996; Azad et al., 2000). La caracterización bioquímica

mostró que las 10 cepas seleccionadas presentaron características semejantes a las

de P. ananatis, debido a que todas las cepas fueron positivas a indol, glucosa, D-

manosa, sacarosa, melobiosa, D-arabinosa y catalasa, mientras que fueron negativas a

la oxidasa, ureasa e hidrolasa de arginina (Schaad et al., 2001; Paccola et al., 2001).

La confirmación definitiva de P.ananatis la soportó el analisis de rADN 16s mediante el

par de iniciadores universales para eubacterias FD1 y RD1 (Rodrigues et al., 2003), el

cual aproximó con un 99% de homología a P. ananatis para las tres cepas

secuenciadas. Brady et al (2006), mencionaron que la secuenciación del rDNA 16s

debe ser combinado con el análisis de AFLPs como una herramienta de diagnóstico

para distinguir entre especies del género.

No hay reportes previos en México de los síntomas causados por P. ananatis en maíz.

Considerando que en el estado de Veracruz también se cultiva arroz, melón, pasto

Sudán, eucalipto, cebolla y piña, todos ellos hospedantes de P. ananatis (Watanabe et

al.,1996; Wells et al. 1987; Cother et al., 2004; Azad et al., 2000; Coutinho et al, 2000;

Gitaitis y Gay, 1998., Serrano, 1928), la presencia de esta enfermedad representa un

48

riesgo para dichos cultivos, ya que P. ananatis puede ocasionar graves pérdidas

económicas. En pasto Sudán puede llegar a causar 50% de pérdida del área foliar

(Azad et al., 2000). En cebolla se han registrado pérdidas del 100% (Gitaitis y Gay,

1997). En maíz provoca la senescencia foliar y una drástica disminución en el tamaño y

el peso de grano (Pinto, 1995, citado por Paccola et al., 2001).

En 2007 la incidencia de la mancha foliar de maíz han disminuido en promedio a 4%.

En México, aun no se ha determinado el impacto en el rendimiento y la calidad del

grano ocasionada por P. ananatis, por lo cual es necesario continuar con las

investigaciones necesarias para entender la epidemiología de esta nueva enfermedad y

desarrollar estrategias de manejo para reducir los riesgos y diseminación en zonas

productoras de maíz y de cultivos alternos de importancia económica.

2.7. CONCLUSIONES

El agente causal de la mancha foliar del maíz fue Pantoea ananatis, de acuerdo con las

pruebas fisiológicas, bioquímicas, PCR y secuenciación. Este es el primer reporte de

esta enfermedad y del patógeno en México.Las pruebas de patogenicidad demostraron

que el 100% de plantas inoculadas del cultivar comercial AS7573 se infectaron,

mientras que en el cultivar Orca solamente hubo una incidencia de 11.6 %. En 2007 la

incidencia de la mancha foliar de maíz ha disminuido en promedio a 4%.

El impacto en el rendimiento y la calidad del grano de maíz ocasionada por Pantoea

ananatis en México no se ha determinado

49

Figura 13. Hoja de maíz con manchas irregulares, blanco-grisáceo y color rojizo ocasionada por Pantoea.ananatis.

Figura 14. Prueba de patogenicidad de cuatro cultivares comerciales de maíz inoculadas con Pantoea ananatis, aisladas de la var. AS7573, procedentes de tres municipios de Veracruz, México: Cosoleacaque (CECOSO), Tlalixcoyan (CETLALIX) y Paso de Ovejas (CEPASO). 2007.

50

Figura 15. Síntomas en plantas de maíz AS7573 inoculadas con Pantoea ananatis, procedente de Veracruz, México. A. Manchas pequeñas irregulares color verde oscuro de aspecto húmedo B. Mancha con presencia de halos amarillos 20 días después de la inoculación (DDI) C. Manchas blanco-grisáceo 30 DDI. D. Hoja de color rojizo E. Espiga con pudrición. F. Hoja de planta Testigo inoculada con agua estéril.

A B

C D

E F

51

Figura 16. Hipersensibilidad en hoja de tabaco (Nicotiana tabacum var xanthi), mostrando la necrosis ocasionada por Pantoea ananatis infiltrada en la nervadura central.

52

Figura 17. Respuesta de cuatro cultivares comerciales a la inoculación de cepas de Pantoea ananatis, proveniente de Veracruz, México. A. Orca, B. CP-560, C. ASGROW-7573. D. Nutria.

B

C D

A

53

Figura 18. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen rDNA 16s de Eubacterias. Línea 1 a la 11 son cepas de Pantoea ananatis aisladas de maíz Asgrow 7573, procedentes de Veracruz, México. Línea 12, control positivo(Erwinia sp). Línea 13, control negativo (agua estéril libre de nucleasas), M= Marcador molecular de 1Kb (Invitrogen).

Figura 19. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de Pantoea ananatis en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de mancha foliar en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.

1600 Pb

250 Pb

1000 Pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

54


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56

CAPITULO III

RAYADO FOLIAR DEL MAÍZ CAUSADO POR Acidovorax avenae subsp avenae EN VERACRUZ, MÉXICO

3.1. RESUMEN

Siembras comerciales de maíz Asgrow 7573 en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de

Ovejas y Cosoleacaque en 2006-2007 mostraron una enfermedad caracterizada por

presentar manchas pequeñas irregulares de aspecto húmedo en hojas, que se

extendieron a lo largo de la lámina foliar, formando una raya translucida, que se tornó

color blanco-pajizo y frecuentemente el tejido presentó desgarramiento y aspecto

atizonado. En la espiga, en ocasiones, se observó una pudrición, debido a que las

hojas superiores enfermas la envolvían. En algunas de las plantas sintomáticas se

hicieron cortes transversales, y en todas se observó necrosis vascular. En los medios

de cultivo BK, AN y CPG se aislaron constantemente colonias bacterianas, las cuales

se caracterizaron por su color blanco-cremoso, redondas y convexas. La patogenicidad

se confirmó en plántulas sanas de maíz. Las cepas bacterianas se identificaron como

Acidovorax avenae subsp avenae con base en pruebas fisiológicas y bioquímicas. EL

género Acidovorax fue confirmado mediante PCR utilizando el par de iniciadores

RST63 y RST64 que amplifican un fragmento de 210 pares de bases de DNA

ribosomal. El incremento de la enfermedad del 2006 al 2007 señala su importancia

potencial y la necesidad de considerarla en los programas de manejo del cultivo.

Palabra clave: Asgrow 7573, PCR, bacteria, pruebas bioquímicas, pudrición de espiga.

57

3.2. ABSTRACT

An epidemic disease developed in commercial plantings of maize cv 7573

Asgrow in 2006-2007 in Tlalixcoyan, Paso de Ovejas and Cosoleacaque counties

in the State of Veracruz, Mexico. Symptoms consisted in small irregular watery

spots on the leaves, which coalesced into translucent strips, initially white-brown

in color; later the tissue in the strips teared off and got a papery appearance.

Ears wrapped by the upper diseased leaves sometimes became rot. Vascular

necrosis was observed in cross sections of stems of symptomatic plants.

Bacterial colonies constantly isolated in BK, AN and CPG media were creamy-

white, round and convex. Pathogenicity was confirmed in healthy maize

seedlings. Bacterial isolates were identified as Acidovorax avenae subsp avenae

based on physiological and biochemical tests. Genus Acidovorax was confirmed

by PCR using the pair of primers RST63 and RST64 which amplify a fragment of

210 bp. Disease incidence increased in a regional average from 2006 (%) to

2007 (%) which indicates its potential importance and the need to consider it in

crop management programs.

Keywords: Zea mays, Acidovorax Asgrow 75-73, PCR, bacteria, biochemical

tests, ear rot.

58

3.3. INTRODUCCION

Una enfermedad no descrita anteriormente en maíz en México se presentó durante los

ciclos 2003-2004 en tres municipios maiceros importantes en el estado de Veracruz:

Paso de Ovejas, Cosoleacaque y Tlalixcoyan., ocasionando pérdidas estimadas desde

30% (Chavero, 2004) hasta 70%, según comentarios de los productores. Los

patógenos que se han encontrado asociados a este síndrome son Burkholderia gladioli

asociado con síntomas de manchas acuosas, blanco-amarillentas en hojas, que al

coalescer formaron franjas longitudinales y algunas de las hojas se tornaron de color

rojizo. En la corona se observó una pudrición semiacuosa y necrosis. La mazorca

mostró necrosis y detención del desarrollo (Gijón et al., 2008). Pantoea ananatis se

asoció con síntomas de manchas irregulares, verde oscuro de aspecto húmedo, y con

un halo amarillo en hojas. En síntomas avanzados las manchas adquirieron un color

blanco-grisáceo y las hojas se tornaron de una coloración rojiza. El fitoplasma del

enanismo arbustivo del maíz (MBS) se asoció con síntomas de amarillamiento,

enrojecimiento y secado del follaje, reducción en el crecimiento de la planta, falta de

fecundación y proliferación de mazorcas (Alcántara et al., 2009).

Dentro del síndrome se observaron síntomas diferentes a los antes descritos, como

plantas de maíz amarillentas, hojas con rayado translúcido a lo largo de la lámina foliar,

que posteriormente tomó un color blanco café, se desgarró y terminó con un aspecto

atizonado. Necrosis en los haces vasculares fue observada en cortes transversales del

tallo. En la espiga en ocasiones se observó una pudrición, debido a que las hojas

superiores enfermas la envolvían. Estos síntomas, al igual que los causados por

Burkholderia gladioli, Pantoea anantis y el fitoplasma MBS, inicialmente fueron

59

observados en el cultivar comercial AS7573 en los municipios de Tlalixcoyan,

Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz.

Por la alarma epidémica con que se presentó este síndrome, por las pérdidas de

cosecha (hasta 70%) consignadas por los productores, por la importancia del maíz en

el Estado de Veracruz, y por que la etiología del rayado foliar permanecía indefinida el

objetivo de esta investigación fue identificar el patógeno y determinar la distribución de

la enfermedad.

3.4. MATERIALES Y METODOS

3.4.1. Colecta de material vegetal

Muestras de plantas amarillentas, hojas con rayado translucido a lo largo de las

nervaduras, que posteriormente se tornaron color blanco-pajizo y el tejido presentó

desgarramiento o aspecto papeloso, se colectaron en los municipios de Cosoleacaque,

Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, Veracruz, en 2006-2007. De 14 parcelas comerciales

con el cultivar comercial (cv) Asgrow 7573, se colectaron de 1 a 60 muestras en cada

parcela según la incidencia de la enfermedad, para un total de 180 muestras.

3.4.2. Aislamiento

El material con síntomas de rayado acuoso, pudrición en la espiga y necrosis vascular

el tallo fue seccionado y desinfestado con hipoclorito de sodio al 1% durante un min,

enseguida se lavó tres veces durante 30 segundos con agua destilada estéril. Los

cortes fueron colocados en tubos de ensayo con 10 mL de agua estéril y se dejaron

reposar durante 20 min. Parte de la suspensión se sembró por estría cruzada en los

medios casaaminoácidos peptona glucosa (CPG), B de King (BK) y agar nutritivo (AN).

60

Los cultivos fueron incubados a 30ºC durante 72 h. Las colonias bacterianas

individuales fueron purificadas y almacenadas a -80 ºC en glicerol al 15%.


De las 180 muestras colectadas en 100 se aisló un tipo de colonia bacteriana en los

medios BK, AN y CPG, de morfología constante y única, de los cuales se seleccionaron

10 cepas al azar para tipificarlas y probar su patogenicidad. Se emplearon 50 plantas

sanas de maíz de 45 días de edad del cv. comercial AS7573. El inoculo se obtuvo de

un cultivo de la bacteria en BK a 30ºC durante 48 h, el cual se resuspendió en 100 mL

de solución estéril de buffer fosfatos PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.01 M

Na2HPO4, 1.8 mM de KH2PO4, pH 7.4). Las hojas fueron picadas superficialmente con

una aguja de 29 G y asperjadas con una suspensión bacteriana de 108 Cel/ml,

tomando como referencia el tubo número 2 de la escala de Mc Farland, citado por

Barret (1975). Veinte plantas testigo se asperjaron con agua destilada. Las plantas se

cubrieron con bolsas de plástico, con pequeñas perforaciones, por una semana, y se

mantuvieron en un invernadero (28-30ºC y 80% HR). El desarrollo de los síntomas se

supervisó durante 60 días, y de los tejidos infectados se hicieron reaislamientos en BK

para confirmar la identidad del organismo.


Una suspensión bacteriana 108 Cel/ml se infiltró en los espacios intercelulares de hojas

de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi) a través de la nervadura central. Las plantas

tratadas se mantuvieron a 30ºC durante 24h. Las hojas de tabaco testigo fueron

infiltradas con agua estéril.

61


Los aislamientos se caracterizaron mediante la prueba Gram (Barret, 1967), prueba de

KOH al 3% (Suslow et al., 1982), la prueba de catalasa, oxidasa (Weller et al., 1975.,

Trujillo y Hernández, 1992), La hidrólisis del almidón, licuefacción de la gelatina,

hidrolasa de arginina, producción de H2S (Schaad, 1998) y el crecimiento en D-xylosa,

fructuosa, D-manitol, sorbitol y sacarosa (Schaad et al., 2001).


3.4.5.1. Extracción del DNA

Se probaron dos protocolos con la finalidad de obtener el mejor método para la

extracción del DNA de cepas bacterianas aisladas de síntomas de rayado foliar del

maíz: EL método AP (Sambrook et al., 2001) y el método comercial de PLANT-

DNAZOL®. La integridad del DNA se verifico por electroforesis utilizando un gel de

agarosa al 1 % a 80 V por 70 min en buffer TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio.

3.4.5.2. Reacción en cadena de la polimersa (PCR)

Para la amplificación de los productos de PCR, se utilizaron los iniciadores RST63

(5´TCCGGCGGCGCGCTCACCGTGGTGCTG3`) y RST64

(5´AGCGCGGCGGCGTAGGCGCGCGAG3´) sugeridos por (Schaad et al., 2001). La



(Invitrogen) y 10 ng de DNA molde. La PCR consistió de una desnaturalización inicial

de un ciclo de 94ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos con 94ºC durante 1 min, 55ºC

por 30 segundos y 72ºC por 2 min, con una extensión final de 72ºC durante 7 min. Una

62

alicuota de 10 µL de la reacción fue analizada por electroforesis en un gel de agarosa

al 1% a 80 V por 90 min en buffer TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio.

(Rodrigues, 2003). Se empleó un marcador molecular de 100 Pb (Invitrogen).


Se realizó la secuenciación del DNA de 3 cepas (ACITLALIX, ACICOSO ACIPASO) en

un equipo Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem Corp). Las secuencias fueron

alineadas y la homología se determinó en el servidor del National Center for Biological

Information (NCBI, 2008).

3.4.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz

3.4.6.1. Incidencia

Catorce parcelas de maíz cv AS7573 en etapa de espiga con síntomas de rayado foliar,

amarillamiento completo de la planta, desgarramiento y aspecto papeloso y

enrojecimiento foliar, se localizaron para evaluar la incidencia de los síntomas en los

municipios de Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Ver. En cada parcela se

seleccionaron 20 puntos en forma de zigzag y en cada punto se eligió un surco al azar.

De diez plantas continuas por surco se contó el número de plantas con síntomas de la

enfermedad y se calculó el porcentaje de incidencia. El porcentaje de incidencia en la

parcela se obtuvo promediando el porcentaje de incidencia en cada punto. Las parcelas

con plantas de rayado foliar se georeferenciaron (GPS38 personal navigator), con el fin

de localizar la ubicación de la plantación en la región. Con los puntos georeferenciados

se generó un mapa de ubicación geográfica de los sitios muestreados con el programa

ArcMap 9.3® (Cuadro 3.1 y Figura 20).

63

Cuadro 3.1. Ubicación de las parcelas de maíz muestreadas en los municipios de

Veracruz, México para la detección de bacterias en 2006 -2007.

PV= Primavera-Verano; INV= Invierno; OI= Otoño-Invierno. Msnm= metros sobre nivel del mar

3.4.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz

La severidad de la enfermedad se midió utilizando una escala visual arbitraria de los

síntomas. Se fotografiaron al menos 50 hojas con el fin de obtener diferentes grados de

severidad ocasionada por el patógeno. Planta sana y valores máximos de severidad

Clave Municipio Coordenadas Altitud

msnm Ciclo de

muestreo


PCOS1 Cosoleacaque 17.89274 94.63544 21 PV-07




PCOS5 Cosoleacaque 17.89521 94.62979 9 Inv-06



TLAX1 Tlalixcoyan 18.71789 96.12835 9 PV-06



TLAX4 Tlalixcoyan 18.72784 96.11473 22 Inv-06/07

TLAX5 Tlalixcoyan 18.71771 96.12835 12 Inv 06/07

TLAX6 Tlalixcoyan 18.71789 96.11365 8.5 Inv-06/07


64

fueron cuidadosamente seleccionados. La escala arbitraria estuvo conformada de cinco

clases 0= 0% 1= 8%, 2= 15%, 3= 25%, 4= 30%, 5= >50% (Figura 21).

En una parcela de maíz del genotipo Asgrow 7573, en el municipio de Tlalixcoyan, a

18º 42.892' latitud norte y 96º 07.401' longitud oeste se validó la escala diseñada y se

determinó la severidad de la enfermedad durante el ciclo de cultivo primavera-verano

2007. En el centro de la parcela se eligieron 25 surcos continuos y 25 plantas por surco

y se evaluó la severidad de cada planta y la posición de la planta en el surco.

El mapa de distribución y severidad de la enfermedad dentro de la parcela se elaboró

con el programa Surfer. La severidad de cada planta se representó con la escala

arbitraria establecida.

3.5. RESULTADOS

3.5.1. Colecta de material vegetal

De cada uno de los tres municipios se colectaron 60 muestras de plantas enfermas de

maíz cv AS7573, haciendo un total de 180 muestras. Los síntomas de las plantas

muestreadas eran hojas con manchas pequeñas irregulares de aspecto húmedo, que

se extendieron a lo largo de la lámina foliar, formado un rayado translucido, que se

tornó color blanco-pajizo y frecuentemente el tejido presentó desgarramiento y aspecto

papeloso. En la espiga en ocasiones se observó una pudrición, debido a que las hojas

superiores afectadas la envolvían (De León, 1984., CIMMYT, 2004) (Figura 22 A, B, C,

D y E). En algunas de las plantas sintomáticas se hicieron cortes transversales, y en

algunas se observó necrosis vascular (Figura 23).

65

3.5.2. Aislamiento

De las 180 muestras colectadas en 100 se aisló un tipo de colonia bacteriana en los

medios BK, AN y CPG. De los 100 se seleccionaron 10 y se caracterizaron como

colonias color blanco-cremoso, redonda y convexa (Schaad et al., 2001).


Las 40 plantas de maíz de 45 días de edad del cv AS7573, infiltradas con la bacteria en

invernadero mostraron los síntomas similares a los observados en campo. El 100% de

las plantas presentaron síntomas a los 15 días después de la inoculación (DDI). En las

hojas se observaron manchas acuosas color verde olivo. A los 30 DDI Ias manchas

coalecieron y formaron rayas extendidas a lo largo de la hoja. A los 40 DDI el rayado se

tornó de color blanco-pajizo (Figura 24 A, B, C)


La reacción de hipersensibilidad en hojas de tabaco fue positiva a las 24 h después de

la inoculación, la lámina foliar del área infiltrada presentó perdida de turgencia y

necrosis.


Las 10 cepas bacterianas seleccionadas fueron Gram-negativas, aeróbicas. Todas

mostraron respuesta positiva a catalasa, oxidasa, hidrólisis del almidón, licuefacción de

la gelatina, la producción de H2S y reducción de nitratos (Weller et al., 1975., Schaad,

1998). En BK no produjeron fluorescencia ni hidrolasa de arginina. Las 10 cepas

utilizaron D-xilosa, D-manitol, sorbitol, pero no sacarosa (Schaad et al., 2001) (Cuadro

66

3.2). Con base en la morfología, fisiología y características bioquímicas los 10

aislamientos se identificaron como Acidovorax avenae subs avenae (Sin.

(Pseudomonas avenae) (Schaad et al., 2001).

Cuadro 3.2. Caracterización bioquímica y fisiológica de aislamientos de Acidovorax

avenae subsp avenae de maíz cv AS7573 con síntomas de rayado foliar, procedentes

de Veracruz, México. 2006-2007.

(+)Reacción positiva, (-) Reacción negativa, (NR) no reportado aDatos Schaad et al., 2001.


3.5.5.1. Extracción del DNA

El mejor método para la extracción de DNA de bacterias fue el AP, ya que permitió

obtener el DNA íntegro, de buena calidad, sin signos de degradación o fragmentación

(Figura 25). Con el método comercial de PLANT-DNAZOL, el DNA extraído mostró

presencia de RNA, que puede interferir en la correcta amplificación del DNA (Figura

25). Estos resultados evidencian la efectividad del protocolo de AP.

Características Cepas aisladas de Maíz Reportada

a

Hipersensibilidad en tabaco + + Reducción de nitrato + + Producción de H2S + + Hidrólisis de almidón + + Fluorescencia en BK - - Licuefacción de gelatina + + Hidrolisis de arginina + + Utilización de fuentes de carbono:

Sorbitol + + Manitol + + Xilosa + + Sacarosa - - Maltosa - NR Oxidasa + + Catalasa + +

67


La confirmación de los aislados para el género Acidovorax se realizó con los iniciadores

específicos reportados por Schaad et al (2001), que amplificaron un fragmento de

aproximadamente 210 pb. No hubo amplificación con la cepa de Erwinia spp usada

como testigo negativo (Figura 26). Para los oligonucleotidos RST63 y RST64 utilizados

en este estudio, se creó un protocolo de amplificación.


Las cepas secuenciadas de ACITLALIX, ACICOSO y ACIPASO se compararon en el

GenBank e indicaron una homología del 92%, 93% y 95% respectivamente, lo cual

confirmó su identidad filética con el género Acidovorax (NCBI, 2008).

3.5.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz

3.5.6.1. Incidencia

La incidencia del rayado foliar en Tlalixcoyan fue del 14.88%, en Paso de Ovejas 3.84%

y en Cosoleacaque 3.04% en 2006 (Figura 27). La incidencia se incremento en el 2007

a 45.92%en Tlalixcoyan, 8.64% en Paso de Ovejas y 4.48% en Cosoleacaque. La

mayor incidencia del rayado foliar del maíz ocurrió en Tlalixcoyan en los dos años.

3.5.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz

La distribución espacial de la severidad del daño inducido en la parcela estudiada

sugiere el lento desarrollo de focos de infección. El porcentaje mayor de severidad

(50%) correspondió al foco inicial de infección que se originó en una orilla. Se

observaron posteriormente agregados de mayor tamaño, y la infestación dentro del

68

surco se extendió a entre surcos. Además se observó un gradiente de infección desde

las orillas de la plantación, lo cual fue atribuido a plantaciones vecinas enfermas.

La exploración gráfica, muestra un efecto de orilla; la diseminación de la enfermedad

ocurre a lo largo de los surcos y no entre surcos. Esto sugiere que la diseminación de

la enfermedad se da por efecto de orilla y de manejo (riego, fertilización, labores del

cultivo) (Figura 28). El grado 1 de severidad (8 %) fue el más frecuente.

3.6. DISCUSIÓN

El rayado foliar del maíz se caracterizó por manchas acuosas, inicialmente amorfas,

que coalescieron en rayas de dos mm de ancho, color blanco pajizo a lo largo de la

hoja. Esto es diferente al bandeado foliar causado por Burkholderia gladioli, que es de

color rojizo, de 8 mm de ancho y también a lo largo de la hoja.

Las bacterias aisladas de las muestras de maíz provenientes de Tlalixcoyan,

Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz, fueron Gram negativa, catalasa y oxidasa

positiva. Se caracterizaron por presentar colonias color blanco-cremoso, redonda,

convexa y fueron identificadas como Acidovorax avenae subsp avenae (Sin.

Pseudomonas avenae) (Schaad et al., 2001). La enfermedad se descubrió por primera

vez en la caña de azúcar en Hawai, EE.UU., y en Queensland, Australia, en la década

de 1920 (Martin y Wismer, 1961).

La patogenicidad de Acidovorax avenae subsp avenae quedó demostrada con las

pruebas de patogenicidad en plantas maíz cv AS7573. Las hojas de todas las plantas

69

inoculadas presentaron manchas acuosas color verde olivo a los 15 DDI. A los 30 DDI

Ias manchas coalecieron y se extendieron a lo largo de la hoja formando un rayado

translúcido. A los 40 DDI el rayado bacteriano se torno de color blanco-pajizo

(CIMMYT, 2004., De León, 1984., White, G.D. 2004., McGee, 1988). Las temperaturas

de 28-30C en el invernadero aceleraron la reproducción de los síntomas ocasionados

por Acidovorax avenae. Hu et al. (1997) mencionó que las condiciones que favorecen

la expresión de los síntomas de las subespecies de Acidovorax avenae son los tejidos

jóvenes y temperaturas entre 27 y 30°C. Las condiciones antes mencionadas, heridas,

aberturas naturales como estomas e idatodos y la humedad relativa, son los factores

cruciales para el desarrollo y reproducción de la bacteria (Bradbury, 1973).

Las 10 cepas patógenas seleccionadas, se caracterizaron como gram negativas,

aeróbicas, móviles, no produjeron pigmento fluorescente, positivo a la hipersensibilidad

en tabaco, no utilizaron como fuente de carbono a la arginina, pero si a L-arabinosa,

estas características fueron determinantes en este estudio para diferenciar al género

Acidovorax de otras bacterias fitopatógenas fenotípicamente similares como

Pseudomonas y Burkholderia (Schaad et al., 2001). EL crecimiento positivo de

Acidovorax avenae en D-xilosa, sorbitol, D-manitol, la reducción de nitratos, hidrólisis

de almidón y la patogenicidad en maíz, la ubicaron dentro de la subespecie avenae

(Schaad et al., 2001). La única subespecie que infecta al maíz es Acidovorax avenae

avenae.

El mejor método para la extracción de DNA partir de colonias bacterianas fue el AP, ya

que permitió obtener el DNA integro y de buena calidad, sin degradación o

70

fragmentación. La amplificación por PCR confirmó utilidad y reproducibilidad del

protocolo AP.

Los análisis de alineamiento de las secuencias nucleotídicas en el Genbank

confirmaron la identidad filética con el género Acidovorax, sin embargo, la especie con

la cual alineó fue citrulli, por la carencia de secuencias de la especie avenae en el

Genbank. Pero la patogenicidad en maíz y las pruebas bioquímicas específicas para

especie confirmaron su identidad como Acidovorax avenae avenae.

La incidencia del rayado foliar del maíz aumentó del 2006 al 2007; en Tlalixcoyan de

14.8 a 45.9 %, en Paso de Ovejas de 3.8 a 8.6% y en Cosoleacaque de 3 a 4.4%. Esto

contrasta con la incidencia en maíz de Burkholderia gladioli (Gijón et al. 2008) y

Pantoea ananatis que disminuyeron en el tiempo. Acidovorax avenae avenae es

transmitida por semilla en arroz (Shakya et al., 1985) pero no hay evidencia de su

transmisibilidad en maíz, que pudiera explicar el incremento de la incidencia de 2006 a

2007.

71

3.7. CONCLUSIONES

Las plantas de maíz cv AS7573 con síntomas de rayado foliar, colectadas en

Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz fueron afectadas por

Acidovorax avenae subsp avenae. La identificación de la bacteria se confirmó utilizando

el análisis genotípico, fenotípico, pruebas bioquímicas y de patogenicidad. El

alineamiento de las secuencias nucleotídicas confirmaron su identidad filética con el

género Acidovorax. No se identificó a nivel de especie, por comparación de secuencias

nucleotídicas, por la carencia de secuencias de Acidovorax avenae en el Genbank. El

incremento de la enfermedad del 2006 al 2007 señala su importancia potencial y la

necesidad de considerarla en los programas de manejo del cultivo.

72

Figura 20. Ubicación de los sítios de muestreo del rayado foliar de maíz causado por acidovoax avenae subsp avenae, en tres municípios de Veracruz, México. 2006-2007. México

Figura 21. Escala arbitraria de severidad para la evaluación del rayado foliar de maíz causado por Acidovorax avenae subsp. avenae en Veracruz, México. 2006.2007

Clase 0= 0% Clase 1= 8% Clase 2= 15% Clase 3 = 25% Clase 4= 30% Clase 5= >50%

73

Figura 22. Síntomas en campo del rayado foliar del maíz cv AS7573 causado por acidovorax avenae subsp. avenae. A. Planta con amarillento general, B. Espiga con pudrición, C. Hoja con rayado translucido, D. Hoja con rayado blanco-pajizo, E. Hoja con tejido desgarrado, E. Hoja con

aspecto papeloso o atizonado.

A B C

D E F

74

Figura 23. Plantas sintomáticas en un corte transversal mostrando necrosis vascular, en maíz cv AS7573 causado por acidovorax avenae subsp. avenae.

Figura 24. Síntomas desarrollados en pruebas de patogenicidad de acidovorax avenae subsp avenae en maíz cv AS7573. A. Manchas acuosas verde olivo en hojas, B. Rayado foliar C. Rayado

color blanco-pajizo.

C B C

75

Figura 25. Extracción de DNA mediante el método AP y PLANT-DNAZOL, de cepas de acidovoax avenae subsp avenae. Línea 1, DNA de buena calidad obtenido por el Protocolo AP. Línea 2, PLANT-DNAZOL que muestra DNA degradado. Línea 3, PLANT-DNAZOL con DNA de buena calidad pero con contaminación de RNA.

Figura 26. Amplificación del producto de aproximadamente 210pb, con los iniciadores RST63 y RST64 para el género Acidovorax. Línea 1 a la 5 son cepas de Acidovorax aisladas de maíz cv AS7573, procedentes de Veracruz, México. Línea 6, control negativo (Erwinia spp), M= Marcador molecular de 100pb (Invitrogen).

RNA

AP PLANT-DNAZOL PLANT-DNAZOL

DNA

M 1 2 3 4 5 6

1500 Pb

500Pb

210 Pb

M 1 2 3 4 5 6

M 1 2 3 4 5 6

76

Figura 27. Incremento de la incidencia de Acidovorax avenae subs avenae en plantaciones de maíz del cv AS7573, en tres municipio de Veracruz, México, del 2006-2007.

ACICOSO ACITLALIX ACITLALIX ACIPASO ACIPASO

77

Figura 28. A) mapa de campo de la distribución y B) mapa tridimensional de la severidad del rayado foliar del maíz cv AS 7573 causado por acidovorax avenae subsp avenae. en Tlalixcoyan, Ver. 2006-2007.

A

B

78


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80

CONCLUSIONES GENERALES

La epidemia del maíz que se presentó en el 2003-2004 en los municipios de

Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz fue causada por un complejo

de patógenos. El fitoplasma Maize Bushy Stunt estuvo involucrado y fue motivo de una

tesis no incluida en la presente investigación. Tres bacterias fueron identificadas como

parte del complejo: BUrkholderia gladioli, Pantoea ananatis y Acidovorax avenae subsp

avenae.

La identificación de B. galdioli, se confirmó utilizando el análisis del rDNA 16s, rRNA

23s y con iniciadores para dominio, género y especie. El análisis filogenético y el uso

de enzimas de restricción indicaron que no existió variabilidad entre los aislamientos de

los tres municipios muestreados, lo que sugiere que el patógeno no se encontraba en

la región y fue introducido recientemente a México mediante semilla infectada. La alta

incidencia con que se presentó esta enfermedad en el 2003 disminuyó con el tiempo y

en 2007 la incidencia disminuyó aproximadamente a un 1%. Este es el primer reporte

de Burkholderia gladioli como patógeno del maíz (Zea mays) en México.

De acuerdo con las pruebas fisiológicas, bioquímicas, PCR y secuenciación, el agente

causal de la mancha foliar del maíz fue Pantoea ananatis. Este es el primer reporte de

esta enfermedad y del patógeno en México.

Las pruebas de patogenicidad demostraron que el cultivar comercial AS7573 se

presentó en 100% de plantas inoculadas mientras que en el cultivar Orca solamente

hubo una incidencia de 11.6 %. Temperaturas de 28-32C con una humedad relativa de

80% en invernadero fueron óptimas para el desarrollo de la enfermedad. El impacto en

81

el rendimiento y la calidad del grano de maíz ocasionada por Pantoea ananatis en

México no se ha determinado, por lo cual es necesario continuar la investigación para

entender la epidemiología de esta nueva enfermedad, y desarrollar estrategias de

manejo para reducir los riesgos y diseminación en zonas productoras de maíz.

Las plantas colectadas con síntomas de rayado foliar de maíz del cultivar comercial

AS7573, colectadas en Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz fueron

afectadas por Acidovorax avenae subsp avenae, se confirmó utilizando el análisis

genotípico, fenotípico, pruebas bioquímicas y de patogenicidad. El alineamiento de las

secuencias nucleotidicas confirmaron su identidad filetica con el género Acidovorax. No

se estableció la identidad a nivel de especie, por comparación de secuencias

nucleotidicas, por la carencia de secuencias de Acidovorax. avenae en el Genbank.

Apesar que la incidencia de la enfermedad oscilo .entre 14.88% y 45.92 en el 2006 y

2007, a nivel nacional e internacional no hay muchos estudios sobre el comportamiento

de la bacteria.

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