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Cómo investigar sobre la visión

Salón de Actos. Colegio Paseo Rosales. Molina de Segura

24 de abril, 2012. 18.00h-20.30h

Fundación de Estudios Médicos

de Molina de Segura

Manuel Vidal-Sanz Laboratorio de Oftalmología Experimental

Departamento de Oftalmología Universidad de Murcia,

Murcia, España

Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad

neuronal

http://www.ioba.med.uva.es/



neuronal

Caracterización de la vía retino-colicular

Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto

Neuroprotección en la retina

Degeneración en la retina

Superior Colliculus


neuronal





La población de ganglionares, y amacrinas desplazadas

La población de conos S y de conos LM

El espesor de las capas de la retina

Laboratorio de Oftalmología Experimental, Universidad de Murcia

En la vía visual del roedor adulto hemos desarrollado técnicas para

estudiar cuantitativamente

El volumen de la proyección retino-tectal

METHODS: (1) Labeling of RGCs with FG

Fluorogold

METHODS: Counting FG-labeled RGCs

s

•P1-od-12-2wks

S

Vidal-Sanz et al., Exp Neurol 1988; 102:92; Villegas-Pérez et al., J Neurosci 1988; 8:265. Peinado-Ramón et al., IOVS 1996; 37:489

0

15.000

30.000

45.000

60.000

75.000

90.000

n = 37 n = 27

Total number of FG-labelled RGCs

81,486±4,340

Area = 45.24 mm2

FG-labelled RGCs = 76,390

Mean density = 1,689 cells/mm2

Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:115-126,

S

T N

I

Adult SD rats

82,818±3,949

SCi ON

Vision Res. 2009; 49:637-647

Adult Swis mice Adult C57 mice

0 6250 Salinas-Navarro et al., Vision Res (2009) 49:637-647

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

n = 43 N = 18

Total number of FG-labelled RGCs (Swiss)

48,733±3,954 49,493±3,936

SC ON

Total number of Brn3a+-RGCs

Total nubmer of FG+-CGR

84,682±7,601

Nadal-Nicolás et al, Invest Opththalmol Vis Sci 2009;50:3860-3868; Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387

S

T N

I

Brn3a AS A MARKER FOR NAÏVE AND LESIONED RAT RGCs

80,252±2,210

Brn3a FG

0 3.500

0

15.000

30.000

45.000

60.000

75.000

90.000

n = 14 n = 14

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

n= 9 n= 9

Total number of Brn3a+-RGCs

Total number of OHSt+-RGCs

34,627±1,821

Nadal-Nicolás et al, Invest Opththalmol Vis Sci 2009;50:3860-3868; Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387

S

T

N

I

Brn3a AS A MARKER FOR NAÏVE AND INJURED MICE RGCs

40,437±3,196

Brn3a OHSt

0 4.800

Brn3a+RGCs Brn3a+RGCs isodensity map

DAPI DAPI Isodensity map

96,061 Brn3a+RGCs RE control

240,345 DAPI nuclei Vidal-Sanz et al., Progr. Ret Eye Res. 2012:1-27

S

T N

I

Brn3a+-RGCs and ipRGCs in SD rat retina

0 3.500

Right eye Left eye

S

T N

I

0-2 >21

Brn3a+-RGCs 78,423 ± 2,957 (n=10)

ipRGCs 2,046.50 ± 309.04 (n=10)

Morphometric and

Microscopic analysis

•P7

•P5 •P4 •P3

•P1

•P2

•P21

•P20 •P19 •P18

•P17

•P16

•P15

•P14

•P13

•P12

•P11

•P10

•P9

•P8

•Magnificación x20

•Nervio óptico

•P6

•150 μm

•150 μm

•500 píxeles

Total

ONL

INL

OPL

Authomatic detection of retinal layer limits to determine

its mean width

CNE automática

CNE manual

CNI automática

CNI manual

CPE automática

CPE manual

Histogram of the mean value of the width in several retinal

layers obtained manually and authomatically.

Puntos de muestreo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NO 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Es

pe

so

r d

e l

as

ca

pa

s (

m)

0

10

20

30

40

50

CNE automática

CNE manual

CNI automática

CNI manual

CPE automática

CPE manual

Ortín-Martínez et al., (2010) Invest. Opthahlmol. Vis. Sci. 51:3171-3183

Ortín-Martínez et al., (2010) Invest. Opthahlmol. Vis. Sci. 51:3171-3183

0

25.000

50.000

75.000

100.000

125.000

150.000

175.000

200.000

225.000

250.000

Cones LM Cones S Cones LM Cones S

231,736

±14,51

41,028

±5,074

27,316

±2,235

239,939

±6,494

SD

(n=14)

PVG

(n=12)

Total number of LM- and S-cones in SD or PVG rats

N T

S

I

OI OD

Sprague-Dawley Piebald Virol Glax

OI OD

S

I

T

S-cones LM-cones

0 6500 0 1300 0 900

Piebald Virol Glaxo

Sprague Dawley

RGCs LM Cones

RGCs LM Cones

0 3,500 cells/mm2 0 6,500 cells/mm2 0 1,300 cells/mm2

FG-RGCs Conos-LM Conos-S

N

OD

S

I

T

Sprague Dawley

78.514 243.394 41.820

TRAZADO ANTERÓGRADO DE LA PROYECCIÓN RETINO-TECTAL

1. Inyección intravítrea de la subunidad B de la toxina colérica (CTB)

2. Transporte anterógrado de la CTB a lo largo de la proyección retino-tectal 3.- Corte seriado del cerebro medio. Inmunocitoquímica para revelar la CTB

4.- Análisis densitométrico de áreas intensamente marcadas con CTB

CTB

Avilés-Trigueros et al., Exp Neurol 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835

Control

Avilés-Trigueros et al., Exp. Neurol. 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835

Con 11 Vol = 2.350 mm3

r2 = 0.985

depth (mm)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

are

a (

mm

2)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Volume of the retino-tectal projection

Avilés-Trigueros et al., Exp. Neurol. 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835

Estas técnicas modernas permiten la cuantificación de parámetros biológicos.

Vidal-Sanz et al., Exp Neurol 1988; 102:92-101

Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80. Vidal-Sanz et al., J Neurosci 1987; 7:2894-2909.

Vidal-Sanz et al., Progr Brain Res 2002; 137: 441-450.

Avilés-Trigueros et al., Exp Neurol 2003; 184:767-777

Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835

Vidal-Sanz et al., Eye 2007; 21:S42-S45

Sobrado-Calvo et al., J Comp Neurol 2007; 501:866-78.

Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:115-126

Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:637-647

Nadal-Nicolás et al., IOVS 2009; 50:3860-3868

Ortín-Martínez et al., IOVS 2010; 51:3171-3183

Galindo-Romero et al., Exp. Eye Res. 2011; 92:377-87

Sánchez-Migallón et al., Exp. Eye Res. 2011; 92:260-267

Vidal-Sanz et al., Prog. Ret. Eye Res. 2012; 1-27

Estudios anatómicos de la vía retino-tectal


neuronal





músculo médula espinal

•http://faculty.washington.edu/chudler/chreflex.html

axón células gliales

Degeneración

anterógrada

Degeneración

retrógrada

Sistema nervioso periférico

Sistema nervioso central

Regeneración axonal

Re-extensión y arborización terminal

Diferenciación y sinaptogénesis

Reinervación funcional

Vidal-Sanz et al., J. Neurosci. 1987; 9:2894-2909

Keirstead et al., Science 1989; 246:255-257

Vidal-Sanz et al., J. Neurocytol. 1991; 20:940-952

Whiteley et al., Exp. Neurol. 1998; 154:560-572

Avilés-Trigueros et al., J. Neurosci. 2000; 20:361-372

Vidal-Sanz et al., Prog. Brain Res. 2002; 137:443-452


neuronal





Axón Células gliales

Degeneración

Anterógrada

Degeneración

Retrógrada

Degneración retiniana

Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. (1988) 8:265-280

Villegas-Pérez et al., J. Neurobiol. (1993) 24:23-36

Axotomía

Efectos de la seción del nervio óptico (SNO) en la supervivencia de las CGR

Sobrado-Calvo et al., J. Comp. Neurol. (2007) 501: 866-878

Peinado-Ramón et al., IOVS (1996) 37:489-500

0

500

1000

1500

2000

2500

Control n=20 4 días n=11 5 días n=6 7 días n=6 9 días n=6 12 días n=6

Supervivencia de CGR tras la SNO Densidades (CGR/mm2) de CGR marcadas con FG (media±DS)

Control

SNO *

Peinado-Ramón y cols., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996; 37:489-500

Aplastamiento intraorbitario del nervio óptico

Efectos del aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en la supervivencia de las CGR

0

500

1000

1500

2000

Control n=41 5 días n=8 7 días n=5 9 días n=8 12 días n=5

Control

ApNO

*

Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res. 2009; 89:32-41.

Supervivencia de CGR tras el aplastamiento del NO (ApNO) Densidades (CGR/mm2) de CGR marcadas con FG (media±DS)

0

20

40

60

80

100


0

20

40

60

80

100


Parrilla–Reverter et al., Exp Eye Res 2009;89:32-41 Peinado-Ramón y cols, IOVS 1996;37:489-500

SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO)

SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES TRAS SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO)

SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO)

DEGENERACIÓN DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES INDUCIDA POR AXOTOMÍA REALIZADA A LA MISMA DISTANCIA DEL DISCO ÓPTICO

APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO)

EFECTO DEL MECANISMO DE LESIÓN (1 semana y 3 meses)

Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.

Axotomía 14 días, Ax14d1oi40 Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.

30 días después 90 días después

SECCIÓN NERVIO ÓPTICO (SNO)

APLASTAMIENTO NERVIO ÓPTICO (ApNO)


Cronología de los cambios degenerativos según el tipo de lesión

Discretas variaciones en la distancia a la que se produce la axotomía, resultan en diferencias sustanciales en el inicio, curso y severidad de la degeneración de las células ganglionares.

El curso de la muerte inducida por axotomía depende, además de la distancia y del tiempo transcurrido, del mecanismo de lesión inflingida, esto es de si se ha producido sección o aplastamiento.

Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80

Villegas-Pérez et al., J Neurobiol. 1993; ;24:23-36

Peinado-Ramón et al., IOVS. 1996; 42:2074-84

Vidal-Sanz et al., Neurotox Res 2000; 2:215-227.

Salvador-Silva et al., J Comp Neurol. 2000; 417:431-447.

Sobrado-Calvo et al., J Comp Neurol. 2007; 501:866-78.

Agudo et al., Mol. Vis. 2008; 4:1050-1063

Agudo et al., IOVS. 2009; 50:424-31.

Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41.


Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387

Sánchez-Migallón et al., Exp Eye Res 2011;92:260-267.

Degeneración Retiniana






neuronal

(Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-280)

SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO

SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO E INJERTO DE NERVIO PERIFÉRICO


(Villegas-Pérez, MP., Vidal-Sanz M. et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-280)

La población de CGR que sobrevive a la

sección del nervio óptico es mayor (2-4 veces)

cuando tras la sección se apone un injerto de

nervio periférico autólogo

GRAFTED

AXOTOMIZED

SURVIVERS

¿Cuál es el concepto de neuroprotección?

Se entiende por neuroprotección la posibilidad de prevenir, ralentizar o disminuir el proceso de muerte neuronal inducida por lesión o enfermedad.

Neuroprotección: Estudios experimentales

¿Qué evidencia tenemos sobre la neuroprotección?

Parrilla-Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41 Peinado-Ramón et al., IOVS 1996;37:489-500

0 días 2 días 4 días 6 días 8 días 10 días 12 días 14 días

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 días 2 días 4 días 6 días 8 días 10 días 12 días 14 días

0%

20%

40%

60%

80%

100% Degeneración secundaria Degeneración secundaria

Neuroprotección

Lesión Lesión

Neuroprotección

SUPERVIVIENCIA DE CÉLULAS GANGLIONARES TRAS SECIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO) + BDNF

SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS GANGLIONRES TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO) + BDNF

Peinado-Ramón et al., IOVS 1996;37:489-500

SUPERVIVIENCIA DE CÉLULAS GANGLIONARES TRAS SECIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO) + BDNF

0

20

40

60

80

100

Control

n=14

ApNO-7d

n=14

BDNF-7d

n=7

ApNO-9d

n=8

BDNF-9d

n=7

ApNO-12d

n=11

BDNF12d

n=5

Control

ApNO

BDNF

0

20

40

60

80

100

Control

n=14

Axot-7d

n=6

BDNF-7d

n=7

SNO-7d

n=6

BDNF-9d

n=5

SNO-12d

n=6

BDNF-12d

n=4

Control

SNO

BDNF

Parrilla-Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41

SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS GANGLIONRES TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO) +

BDNF

BDNF

Una semana tras la aplicación de FG

MÉTODOS: Sección intraorbitaria del NO

Supervivencia de CGR tras la axotomía Densidades de CGR marcadas con FG o Brn3a-(media ±SD)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

7 d (n=8) 9 d (n=8) 12 d (n=8)

BDNF+IONT FG+RGCs

BDNF+IONT Brn3a+RGCs

VEHI+IONT FG+RGCs

VEHI+IONT Brn3a+RGCs

Sanchez-Migallón et al., Exp Eye Res 2011; 92:260-267

FG

Brn3a 81,639

83,891 0 3.500

SNO+BDNF

80,406

40,388

7 days 9 days

61,923 48,454

SNO+VEH

21,475 16,856

Brn3a+RGCs

Sanchez-Migallon et al., Exp Eye Res 2011; 92:260-267 0 3.500

12 days

Control ApNO SNO Control

LA LESIÓN DEL NERVIO ÓPTICO INDUCE CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LA RETINA

0

500

1000

1500

2000

2500

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

Número total de genes y secuencias EST reguladas Número de genes sobre-regulados o infra-regulados

Num

ber

of genes

overe

xpre

ssed

Num

ber

of genes

dow

nre

gula

ted

Num

ber

of re

gula

ted s

equences

Genes regulados por ApNO Genes regulados por SNO

Genes regulados por ambas lesiones y específicos de cada tipo de lesión

SNO SNO &

ApNO

ApNO

Genes

ESTs

SNO SNO &

ApNO

ApNO

VS VS

Agudo et al., Mol. Vis. 2008;14:1050-63; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009;50:424-31

IONC regulated genes

IONC regulated ESTs

IONT regulated genes

IONT regulated ESTs

IONT&IONC regulated genes

IONT&IONC regulated ESTs

La SNO regula más secuencias que el ApNO

SNO induce principalmente la sobre-regulación mientras que el ApNO induce

principalmente la infra-regulación

Estos estudios documentan que el curso y magnitud de la muerte de CGR inducida por axotomía se puede modificar con factores neurotróficos.

Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80.

Villegas-Pérez et al., J. Neurobiol. 1993; 20:940-952

Peinado-Ramón et al., IOVS. 1996; 37:489-500.

Vidal-Sanz et al., Neurotox Res. 2000; 2:215-227

Agudo et al., Mol. Vis. 2008; 4:1050-1063

Agudo et al., IOVS. 2009; 50:424-31.

Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res. 2009; 89:32-41.

Galindo-Romero et al, Exp Eye Res. 2011; 92:377-387

Sanchez-Migallon et al., Exp Eye Res. 2011; 92:260-267


Los estudios moleculares indican que tanto el aplastamiento como la sección del nervio óptico activan vías de muerte intrínsecas y extrínsecas.

Así, pues, las estrategias de neuroprotección deberían considerar agentes capaces de modificar todas estas vías, de forma individual o en combinación

Universidad de Murcia

Universidad de Murcia

María Paz Villegas Pérez

Jaime Miralles de Imperial

Mercedes Salvador Silva

Paloma Peinado Ramón

Inmaculada Sellés-Navarro

Ana Mª Gómez Ramírez

Paloma Sobrado Calvo

Román Blanco Velasco

Lidia Coll Alcaraz

María Elena Rodríguez Gzlez

Marcelino Avilés-Trigueros

Antonio García Avilés

Mª Elena Aguilera Meseguer

José Alía Benítez

Sergio Mayor Torroglosa

María Lafuente López-Herrera

Marco A. Marco Gomariz

José Martínez Morales

Natalia Hurtado Montalbán

Amanda Ortíz Gomariz

Jose Manuel Bernal Garro

Guillermo Parrilla Reverter

Manuel Salinas Navarro

Marta Agudo Barriuso

Isabel Cánovas Martínez

Maria Isabel Soro Martínez

Mª Cruz Pérez Marín

Luis Alarcón Martínez

Francisco M. Nadal Nicolás

Manuel Jiménez López

Diego García Ayuso

Fco. Javier Valiente Soriano

Arturo Ortín Martínez

Luis Montalbán Soler

Caridad Galindo Romero

Sergio Rodríguez Llarena

Cómo investigar sobre la visión

Salón de Actos. Colegio Paseo Rosales. Molina de Segura

24 de abril, 2012. 18.00h-20.30h

Fundación de Estudios Médicos

de Molina de Segura

Manuel Vidal-Sanz Laboratorio de Oftalmología Experimental

Departamento de Oftalmología Universidad de Murcia,

Murcia, España


neuronal



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