Clostridios

UNLPAM

Clostridium botulinum

• Gram +

• Anaeróbica

• forma bacilar

• Esporogena

• Reservorio: ubicua

UNLPAM

Clostridium Difficile

Clostridium botulinum stained with gentian violet

UNLPAM

Clostridium botulinum

4 tipos de botulismo:

1. El originado por el consumo de alimentos contaminados con la toxina botulínica preformada

2. Botulismo infantil

3. El botulismo de las heridas.

4. La cuarta clase es la no clasificada, los casos de origen desconocido.

UNLPAM

• Existen 7 tipos de C. botulinum de A al G

basados en los serotipos de sus toxinas.

C. botulinum se divide en 4 grupos basados en caracteres fisiológicos y 16S:

grupo

Característica I (A + proteol. B y F)

II (E + no proteol. B y F)

III no proteol.

IV

Neurotoxina A, B, F E, B, F C, D G

Temp. de crec. mínima 10 3.3 15 ND

máxima 35-40 18-25 40 37

pH mínimo de crecimiento 4.6 5.0 ND ND

Conc. Inhibitoria de NaCl % 10 5 ND ND

aw mínima de crecimiento 0.94 0.97 ND ND

D100 oC min. (esporas) 25 < 0.1 0.1-0.9 0.8-1.12

D121 oC min. (esporas) 0.1-0.2 <0.001 ND ND

UNLPAM

Tolerancia a los métodos de conservación

• Temperatura

• pH

• aw

• Eh (potencial redox) -350mV (Crece +30 y +250mV)

• Conservantes

• Otros microorganismos

NO2

Sorbatos

Parabenos

Nisina

Ascorbatos

EDTA

Matabisulfito

Maleatos

Fumaratos n-monoalquilicos

Humo natural o liquido.

Brotes producidos por alimentos

• Cárnicos ► pescado salado no eviscerado

• Las conservas caseras de hortalizas

• Botulismo infantil ► La miel con recuentos

(104) (normales 1-10 esporas kg-1)

Year

1982 1987 1992 1997 2002

Report

ed C

ases

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

MMWR

Las conservas caseras son las que más habitualmente se asocian a

casos de botulismo.

UNLPAM

Características de la enfermedad:

• El botulismo varía desde una enfermedad que puede pasar desapercibida a la mortalidad en 24h.

• Generalmente los síntomas aparecen rápido 12-36h después de la ingestión de la toxina,

Como la toxina da una parálisis muscular flácida encontramos sus efectos:

• Al comienzo nauseas y vómitos.

• Luego signos y síntomas nerviosos: – Trastornos visuales, diplopía o visión doble o borrosa, pupilas fijas dilatadas

– Problemas para tragar deglutir

– Boca lengua y garganta secas

– Cansancio general

– Descoordinación muscular

– Conflicto respiratorio

– Dolor abdominal, diarrea o estreñimiento

botulismo infantil

• Estreñimiento

• Debilidad

• llanto débil

• escasa succión

• falta de expresión facial

• flojedad progresiva.

Tratamiento

• neutralización de la toxina mediante

sueros específicos

• eliminación por enemas del remanente

intestinal

• lavado estomacal

• tratamiento con eméticos

• respiración artificial

UNLPAM

Dosis infecciosa

• En raton DL50 es de approx 0.1 ng kg-1

• los alimentos deben tener ausencia de la toxina

• condiciones que no permitan el crecimiento de C.

botulinum

It is the most acutely toxic substance known, with a median lethal

dose of about 1 ng/kg when introduced intravenously and 3 ng/kg

when inhaled. This means that, depending on the method of

introduction into the body, a mere 90–270 nanograms of botulinum

toxin could be enough to kill an average 90 kg (200 lb) person.

Factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad

7 neurotoxinas diferentes son producidas por C. botulinum: A, B, C1, D, E,

F y G.

C2 y C3 enzimas ribosilantes ► ej. Ribosilan actina inhibiendo la

polimerizacion y asi la celula pierde estabilidad.

UNLPAM

Las neurotoxinas bloquean la neurotransmisión en las terminales de

las neuronas motoras periféricas. Porque hidrolizan la proteínas

implicadas en la fusión de vesículas sinápticas con la membrana

plasmática, impidiendo la liberación de acetilcolina.

UNLPAM

Botulinum Toxin is the world's deadliest poison and the most poisonous

naturally occurring substances.

• Fig. 1. Schematic structure of botulinum toxin. In the form of single-chain, toxins have relatively little potency as neurotoxins. Neurotoxic activation requires a two-step modification in the tertiary structure of the protein. In the first step, the parent chain is cleaved between amino acids 448 and 449. The result is one light chain (L-chain, amino acids 1-448, approx. 50 kDa) and one heavy chain (H-chain, amino acids 449-1295, approx. 100 kDa) mutually connected by a disulfide bond (-S-S-). The light chain is associated with one atom of zinc (Zn2+). In this form toxin enters the axon terminal. The second activating step, disulfide reduction, occurs only after internalization by the target cell.

Modo de acción:

• Cadenas H → fijación selectiva e

interiorización de la toxina completa.

• Cadena L → bloquean la exocitosis de las

vesículas sinápticas.

UNLPAM

Toxina botulínica mecanismo

• preguntas

Clostridium perfringens Food Poisoning

UNLPAM

Produce 2 enfermedades muy diferentes:

• Intoxicación alimentaria C. perfringens tipo A

– Enterotoxina CPE

– Toxina ß

• Enteritis necrótica que es sumamente rara.

características que potencian su patogenicidad

• tiempo de duplicación de 10 min!!?

• resistencia térmica de sus esporas

• tolerancia de Eh relativamente elevados

• Las células vegetativas son muy sensibles a la refrigeración y

congelamiento

• Produce 13 tipos de toxinas diferentes, pero se clasifica respecto de

4 de ellas.

Tipado de C. perfringens

Tipo de C. perfringens Toxinas producidas

Alfa Fosfolipasa C

Beta Toxina

necrosante

Epsilon ▲

permeabilidad

vascular

Iota necrótica y ▲

permebilidad

vascular

A + - - -

B + + + -

C + + - -

D + - + -

E + - - +

UNLPAM

intoxicación alimentaria

enteritis necrótica

Tolerancia a los métodos de conservación

• Carne a ebullición puede sobrevivir más de 1h.

• La cocción incompleta (20 min a 70-80 oC) induce la

germinación de las esporas de C. perfringens A.

• Crece entre 6 y 50 oC (Temp. óptima a 43-45 oC)

• investigaciones recientes demostraron que <5 % de un gran

número de aislamientos tenían el gen cpe responsable de la

intoxicación.

Reservorio

Síntomas de la intoxicación

• aparecen a las 8-24h después de la ingestión del alimento y se resuelven espontáneamente en 12-24h.

• Típicamente las victimas padecen – Diarrea

– espasmos o retortijones abdominales intensos

– no suele haber ni vomito ni fiebre.

Esquema

alimento altamente contaminado por Cp las células vegetativas

mueren en el HCl del estomago pero un numero sobrevive debido a la alta densidad

en el intestino se multiplican y esporulan al esporular expresan CPE

Enterotoxina (CPE), altera el transporte de

iones en el íleon y en el yeyuno.

Brotes de intoxicación alimentaria • Los casos identificados ocasionan brotes

de gran magnitud generalmente institucionales

Vehículos alimentarios

• Los alimentos cárnicos son los más involucrados

Identificación del brote:

• encontrar más de 105 ufc/g de alimento contaminado

• demostrar más >106 esporas/g de heces del individuo enfermo

• identificar el mismo serotipo capsular en todos los individuos enfermos y en los alimentos

• se tiende a identificar la CPE (proteína del gen cpe) por elisa

Dosis infecciosa

• Células en el alimento: >106-107 / g

Recuento de C. perfringens Medio agar sulfito hierro cicloserina SIC-agar (Sulphite iron cycloserine)

Triptona 15g

Extracto de levadura 10g

Citrato ferrico 0.5g

Agar 15g

Agua destilada 1l

Esterilizar 121oC 20 min

Agregar a 50oC 10ml solución de sulfito sodico al 5% recién preparada.

10ml solucion de D-cicloserina al 4% (da selectividad inh. Otros grupos) (ambas esterilizadas por filtración)

Se prepara un macerado del alimento con un diluyente que contiene cisteína y se realizan diluciones seriadas. se

agrega 1 ml de las mismas a tubos con tapa rosca y se agrega 10ml del agar sic y una vez que solidifico se agrega una capa

del mismo agar de unos 3 cm y se incuba a 46oC durante 14-18 horas. Contar el número de colonias negras con halo negro y

calcular las ufc/g de alimento.

Identificación de los aislamientos:

Tubos CP para C. perfringens

Capa inferior con medio SIC

Capa central agar acuoso (20 g agar en un litro de agua)

Capa inferior agar SIM (sin sal ferrosa)

SIM sulfuro indol mobilidad (sulphide indole motility)

Triptona 20g

Peptona de soja 6g

Sulfato amonico ferroso 0.2g

Tiosulfato sodico 0.2g

NaCl 5g

Agar 3.5g

Agua destilada 1 litro

Se toman unas colonias bien aisladas de los tubos SIC y se inocula por punción a lo largo de un tubo CP, se incuban de

16-18 h a 46 oC.

Positivo: la capa inferior es muy negra, mientras que la movilidad y la producción de indol son negativas.

UNLPAM

• Clostridium perfringens

• Confirmación:

• Sulfitos reductores anaerobios positivos:

• Tomar 5 colonias:

• GRAM: bacilos cortos y delgados GRAM +

• Licuefacción de gelatina: +

• Nitrato:+

• Movilidad: -

• Lactosa: acido y gas (+)

• Lecitinasa: +

Germinación de esporas de Clostridios sulfito-reductores. Se observa un

crecimiento confluente que impide el recuento. El agar se ha resquebrajado

y elevado con motivo de la formación de gas. UNLPAM

CAA

Si bien se considera obligatorio el análisis de clostridios sulfitos reductores en aguas

de consumo y de preparación de alimentos. El CAA en su Artículo 720bis - (Res. 305,

26.03.93) resuelve las siguientes exigencias microbiológicas: las pastas frescas

rellenas se denominarán entre otras denominaciones: cappellettis, ravioles, panzottis,

tortellettis, agnolottis, de acuerdo a sus características.

Responderán a las siguientes exigencias microbiológicas:

S. aureus coagulasa positiva: menor de 103 UFC/g.

Clostridium. sulfito reductores: menor de 103 UFC/g. y

Salmonella: ausencia en 25g".

VIANDAS A DOMICILIO

Además deberán cumplir con las siguientes especificaciones microbiológicas:

Escherichia coli: ausencia en 5 g. de muestra.

Staphylococcus aureus: ausencia en 1 g. de muestra.

Salmonella: ausencia en 50 g. de muestra.

Clostridium perfringens: ausencia en 50 g. de muestra

UNLPAM

Preguntas ?

UNLPAM