Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Clonado molecular del genoma delClonado molecular del genoma delvirus de la fiebre aftosavirus de la fiebre aftosa

Andino, Raúl Héctor

1986

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Andino, Raúl Héctor. (1986). Clonado molecular del genoma del virus de la fiebre aftosa. Facultadde Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1963_Andino.pdf

Cita tipo Chicago:Andino, Raúl Héctor. "Clonado molecular del genoma del virus de la fiebre aftosa". Tesis deDoctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1986.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1963_Andino.pdf

ïeaia lab)

EJ. 1 Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

CLÜNADO MOLECULAR DEL GENOMA DEL VÏRUS

DE LA FIBRE AFTOSA

Raúl Hector Andino

TeSIS para optar al titulo

DOCTOR EN QUIMICA

Director de tesis: Dr. Hector Norberto Torres

1986

Instituto de investigaciones en Ingenieria Genéticay Biologia Molecular (INGEBI)

J CON I CET

a mis padresa mis hermanosa Judith

A lo largo del periodo en que se desarrollo esta tesis doctoralfueron muchas las personas e instituciones que colaboraron paraque este trabajo se pudiera realizar, en especial deseo agradecer:

A] Dr. Hector N. Torres por su direccion, por habermecontagiado su cariño y entusiasmo por la ciencia y por unarelacion que fue mas alla de la tipica Director-becario.

A mis amigos. Ricardo Attar, Daniel Altschuler, GabrielAisemberg, Marta Blumenfeld, Daniel Mendelson, Alberto Ochoa,Daniel Boscoboinik. Esteban Corley 3' Nike Vasquez, con quienescomparti muchomás que pipetas y baños termostaticos.

A Gerardo Kaplan COI')quien comence este trabajo y compartiaquel dificil comienzo, por su compañerismo y generosidad.

A todos los miembros del INGEBIen especial a Mirtha Flawia,Norberto Judewicz, Alberto Kornblihtt, Alejandro Mentaberry,Alejandro Paladini, por la ayuda y enseñanzas que recibí.

A mis compañeros del laboratorio. Pablo Gudman, MonicaTorruella, Alejandro Gutman. Enrique Mesri, Guillermo Taccioliy Eric Grotewold. por la tolerancia demostrada.

A Jorge Zorzopulos su asesoramiento en el problema de expre­sión y por su generosidad al proporcionarnos el vector de expre­sión.

o

A Diego de Mendoza por sus consejos en el metodo de miniMu­ducción.

A los miembros del IIB Fundacion Campomar donde comence este

trabajo, especialmente a Norberto Iusem y Eduardo Caferatta.

A los miembros del Centro de Virología del ClCV, INTA-CastelareSpecialmenLe a Eduardo Palma. Manuel Borca, Maria Susana Rossiy Patricia Polacinu con quienes trabajamos en este proyecto.

A Maria Julia Alvarez y Norberto (nntreras por el exelenteapoyo tecnico.

A Norberto Malariní y Axel Jaroslavsky por el magnifico traba­JO gráfico.

Al ganado bovino que con su mirada de tristeza humeda alen­tó este trabajo desde su comienzo.

Finalmente, a todos que de una u otra forma confiaron enmi vayan tambien mis disculpas (?).

¿QBEVIATURAS

BHK ="Baby hamster kidney", Linea celular de riñon de hamster.BPB =azul de bromo fenol.BrEt .=hromuro de etidio.CDNA =acido deoxirribonucleico copia.

CIBCH =cloroformo.DMSO =dimetíl sulfóxído.DNA =ácido deoxiribonucleico.EDTA= =etilen diamin tetraacetato de sodio.EtOH =alcohol etílico.F.A. =fiebre aftoSa.kpb =1000 pares de bases.mRNA =RNAmensajero.NaAcO =acetato de sodio.NPAO =Nonidet PAD

OIC =cepa de VFA 01 Campos.01K =cepa de VFAo1 Kaufbeuren.pb =pares de bases.RFB =cultivo celular de riñon fetal bovino.RI =intermediar10 replicativo.RNA =ácido rlbonucleico.RNasa =ribonucleasa.R.T. =transcrlptasa inversa.SFB =suero fetal bovino.SSH =mezcla de sintesis de la 1° cadena de cDNATdT =deoxinucleotidil tranferasa terminal.UFC =unidades formadoras de colonias.VFA =virus de la fiebre aftosa.Vpg =protelna viral genómica.

Ademasde las abreviaturas citadas, a lo largo de] escritose utilizan una serie de términos en idioma extranjero. que dadosu frecuente uso en lenguaje científico, y que es dificil

encontrar un término único que los remplace, fueron empleadosen el idioma original.

Enzimasde restricción:

Se utilizan en varios gráficos los siguientes simbolos paraindicar los sitios de reconocimiento de las distintas enzimasde restricción:

BamHI=B

ECOR1=E

Hian=FHindIIl=HPStI=PPvulI=USmal =S

XhOI=X

A partir de RNAgenomico del virus de la fiebre aftosa (VFA)‘

cepa O1 Campos, se sintetizó DNA copia (CDNA) utilizando losmetodos de Nucleasa S1 y RNasa H alternativamente.

Mediante los procedimientos de "tailing" o "blunt end ligation"dicho cDNA fue ensamblado a plasmidos vectores (pBR322 o pATiSSPvuII/B), obteniendose de esta manera una serie de recombinanteslos cuales fueron clonados por transformación en gschericha¿29.1.1 ­

Los clones obtenidos Fueron seleccionados por hibridizaciónen colonias, utilizando como "probes" RNAviral o determinadosfragmentos de cDNAobtenidos previamente.

El analisis de los clones seleccionados mediante enzimas derestricción y secuenciación de DNA indicó que la suma de losinsertos de 5 (Jones representa todo el fragmento "L" del RNAgenómico (8000 baseS).

Posteriormente se obtuvo la secuencia de nucleótidos corres­pondiente al "gen" de Vp]. con dichos datos de secuencia se dedujóla estructura primaria del polipeptido Vpl. La comparación dela secuencia aminoacídica de la cepa 01 Camposcon las secuenciasde otras cepas (A10, 01K y C1) mostró la existencia de tres zonasde variabilidad. correspondientes a los residuos aminoacidicos40-60, 134-160 5' 195-213. the las cuales dos se encuentran enregiones hidrofílicas, mientras que la tercera se halla en undominio hidrfóbico.

El fragmento de cDNAcorrespondiente al "gen" de Vpl fue subclo«nado dentro del vector de transposición miniMu denominado PR13.obteniendose el plásmido pmMVpl. el cual permite que el "gen"de Vp] sea movilizado por transposición de un replicón a otro.

Mediante dicha transposición se obtuvieron péptidos de fusión

formados por Vp1 y ciertas proteínas de la placa basal del fagoT), los cuales presentan, en forma transitoria, los epitopes

¿

inmunogénicosde Vpl en la superficie celular bacteriana.

INDICE

LNTRODUCCI ON

I GENERALIDADES DE LA FIEBRE AFTOSA

l.l BREVE RESEÑA HISTORICA

r-I

ULOLÜLÚQ

I-lI-db-n

UlUïUl

NN[‘J

NNNN

¡P«N

. b

U|

0‘0‘0‘0"

.1 Adsorción,

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA ENFERMEDAD

DefiniciónAgente etiológicoDistribución

C‘QNHHuespedes susceptiblesAspectos clinicosTrasmisión

mUl

CARACTERISTICAS GENERALES DEL VFA

.1 Clasificacion

.2 Caracteristicas generales del virus aftosoEstructura de la cápside viral3

.4 Genomaviral

CICLO VIRAL

internalización y desnudamiento.2 Replicación del RNAy traducción de las proteinas

virales.3 Morfogenesis viral

VARIABILIDAD

.1 Tipos inmunológicos y variabilidad

.2 Bases moleculares de la variabilidad3 Mecanismosmoleculares de variabilidad

CONTROL DE LA ENFERMEDAD

.1 Vacunas a virus vivos (atenuadas)2 Vacunas a virus lnactivados

.3 Vacunas sin intervención del agente infeccioso

UIL‘J-‘wbl‘

NI

12

12

14

19

20202122

Il.

II.II“ll.II.

II.II.II.II.II.II.

LDLJLOLJ

Hu

LOFJ

3‘

UI

q-Js14

mLE_C_Z_NICASDE DNA REcorgmN

VEHICULO DE CLONADO

.1 Plasmidos

.2 Bacteriofagos

DNA A SER CLONADO

.1 Sintesis de DNAcopia

METODOS DE CORTADO DE DNA

.1 El uso de las Enzimas de Restricción

.2.1 sitios de reconocimiento

.1.2 Mapasde restricción

.2 Ruptura mecanica del DNA

METODOS DE ENSAMBLADO DE DNAS

.1 Extremos cohesivos

.2 Colas de homopolimero3 Ligado de extremos romos ("bluut—end")

INTRODUCCION DEL DNA RECOMBINANTE EN EL HUESPED DE

CLONADO

SELECCION DE LOS RECOMBINANTES

.1 Metodos genéticos1.1 Selección de la presencia del vector1.2 Seleccion de la secuencia insertada

.2 Métodospor hibridización de acidos nucléicos3 Métodos inmunológicos

CARACTERIZACION DE LOS RECOMBINANTES

1 Extracción y purificación del DNArecombinante.2 ElectrofOresis en gel (agarosa y poliacrilamida).3 Secuenciación de DNA

49

¡1.8 INGENIERIA GENETICA

IIi-i

Ill.II].Ill.Ill.III.

III.

III.

III.III.III.III.

III.III.

III.

III.III.III.III.

III.lII.III.III

"IN VIVO"

MATERIALES Y METODOS

HHH

H

U1wa. ¡.1

N

NN

OBTENCION DEL RNA VIRAL

.1 Células y medios de cultivovirusProducción viralPurificación viralPurificación del RNAGenómico

TECNICAS GENERALES

1 Extracción fenólica2 Precipitación con EtOH-NaAcO

TECNICAS MICROBIOLOGICAS

1 Cepas bacterianas2 Medios de cultivo bacteriana3 Antibióticos

TRANSFORMACION

.1 Preparación de células competentes para transfor­mación

.2 Transformación con plásmidos

PURIFICACION DE DNA PLASMIDICO

1 Lisis por calentamiento2 Lisis alcalina3 Purificación en gradiente de CsCl-BrEt

ELECTROFORESIS EN GEL

.1 Buffers comunmente usados

.2 Geles de agarosa

.3 Geles alcalinos de agarosa

UIUIUI NNN

54

54

56

5860

61

61

64

666667

68

III.IIIIII

Ill.lll.III.

III.111.

111.111.111.

IIIIII.IIIII]

III.IIIIII.

IIIIIIIIIIII

III.

.6

.6

q

bo

.4 Geles de poliacrilamida nativos

.5 Geles de separación de cadenas

.6 Geles de secuenciación

DIGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION

.1 Reacción enzimática

LIGADO DE MOLECULAS DE DNA "IN VITRO"

.1 Desfosforilación del vector

.2 Reacción de ligado

METODOS DE MARCADO DE DNA

9.1 "Nick translation"9.2 Separación del DNAde los nucleótidos no incorpom

rados9.3 Rellenado de extremos 3' recesivos ("fill-in")9.4 Fosforilación del extremo 5'0H de ácidos nucleicos9.4.1 Desfosforilación9.4.2 Fosforilación9.5 Precipitación con TCA

.10 HIBRIDIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS

10.1 Hibridización en colonias.10.2 Adsorción de las colonias a los filtros.10.3 Ruptura de las bacterias y desnaturalización

del DNA

10.4 Prehibridización.10.5 Hibridización10.6 Lavado del "probe" no hibridizado

.11 SINTESIS DE CDNA

.11.1 sintesis de la primer cadena de CDNA

.11.1.1 Pretratamiento con OHHgCH3

.11.1.2 Reación de transcripción inversa

.11.2 Sintesis de la segunda cadena de cDNA

11.2.1 Método de Nucleasa S1

697070

\l\l L‘U

NI UI

xl UI

NI UI

808081

81

82

83

8A

8h858585

.1 Hidrolisis alcalina del RNA 85¡­ H H p­ I-I I‘J H

Ill 11 _ 1.2 Sintesis de la segunda cadena de cDNA 86

lll.11.2.1.3 Digestión del "loop" con Nucleasa Sl BbIII 11.2 4 Método de la RNasa H 87

111.12 ADICION DE HOMOPOLIMEROSEN EL EXTREMO3' ("TAILING") 88

¡{1.12.1 Adición de homopolimeros 90lIl.12.2 Ensamblado de DNAinserto con el vector 90

¡[1.13 SECUENCIACION DE DNA 91

Ill 13 1 Marcado del DNA 92

Ill.13.2 Obtención del fragmento marcado en un solo extremo 92lII.13.2.1 Recorte con una segunda enzima de restricción 92III.13.2.2 Purificación de la banda marcada en un extremo 92III.13.2.3 Separación de cadenas 03lll.13.3 Reactivos 94III.13.4 Reacciones químicas 96

III.1& ALMACENAMIENTOY MANIPULACIÓN DE SECUENCIAS DE DNA

POR COMPUTACION 98

111.15 MINIMUDUCCION 100

III.15.1 Cepas bacterianas 100III.15.2 Inducción y lisis 100III.15.3 Infección 101

[11.16 "lNMUNOSCREENING" 102

Ill.16.1 Sueros 102III.16.2 Radioinmunoselección 102

IV. QEILflLZACION QE_TECN1CAS 104

IV.1 TRANSFORMACION BACTERIANA 105

IV.1.1 Cepas bacterianas 1061V.1.2 Crecimiento y transformación 107

IV.

IV.IV.

IV.IV.

1V.

1V.

1V.

IV.

IV.

IV.

bbb

R

5.

ELECTROFORESIS EN GEL

1 Geles de agarosa.2 Geles de poliacrilamida

LIGADO DE FRAGMENTOS DE DNA

.1 Preparacion del vector de clonado (desfosforilacion)

SINTESIS DE LA PRIMER CADENA DE cDNA

.1 Rendimiento de cDNA

.2 Longitud de la primer cadena de cDNA

ADICION DE HOMOPOLIMEROS Y ENSAMBLADO

1 Adición de.2 EnsambladoM

homopolimeros

V.l OBTENCION DEL RNA VIRAL

CC

<<<

CCC

.3

.3.

.3.

.3.

.3.

.3.

"CAMINATA"

1 Sintesis de2 Seleccion y

tativos del2.1 Selección2.2 Selección2.3 Seleccion

.2 OBTENCION DE LOS PRIMEOS CLONES DE CDNA

.2.1 Sintesis de cDNA

.2.2 Clonado del CDNA

.2.3 Seleccion de clones portadores de cDNAde VFA

.2.4 Caracterización de los clones seleccionados

SOBRE EL RNA VIRAL

cDNA (método de RNasa H)

caracterización de clones represen­"L"

a partir del pol-3fragmento del RNAgenomico

a partir del pol-6por doble hibridación

108

108

111

112

112

11h

114

118

124

125

128128

132

135

137

146

147

149

151

V.

V.

UIUI

UI

SECUENCIACION DEL "GEN" DE Vpl

.1 Secuenciacion de cDNA

.2 Analisis de la secuencia de Vp]

EXPRESION DE vm EN ESQLL

.1 Vector de expresion

.2 Vector de fusion

UIJ-‘U

del "gen" de Vp1 con los genes del

fago T4Subclonado de la secuencia de Vpl en el miniMuProceso de miniMu-ducciónlnmunoselecciún

VI DISCUSIONVi.VI.VI.VI.

H CLONADO DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA

SECUENCIACION DE Vpl

EXPRESION

PERSPECTIVAS DEL USO DE LAS TECNICAS DE DNA

RECOMBINANTE EN EL CONTROL DE LA FIEBRE AFTOSA

VII BlBLIOGRóFlA

100

163

lóá167

169

172

189

INTRODUCCION

I GENERALIDADES DE LA FIEBRE AFTOSA

1.1 BREVE RESEÑA HISTORIA

En 1514 fue descripto en Italia un brote de enfermedad en ganadocon determinadas características la cuales permiten afirmar quese trató de Fiebre Aftosa. H Frascastorius descrbió que losanimales enfermos presentaban la cavidad bucal recubierta porpequeñas vesículas rojas que con el desarrollo de la enfermedadse observaban tambien en las patas.1

Por otro lado existen evidencias que ya los griegos se habrianocupado de esta enfermedad. De todas maneras recién en 1897Loeffler y Frosch determinan la existencia de un virus como

. 2agente causante de la misma.

A la Republica Argentina habría llegado desde Europa al promendiar la segunda mitad del siglo pasado, a traves de importacionesde ganado. La enfermedad produjo graves daños por aquellos añossobre todo en los embarque de hacienda en pie, los cualesconstituían la principal forma de exportación de los productospecuarios.

1.2. CARACTERISTICAS GEyERALES DE LA ENFERMEDAD

1.2.1 Definicion

La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad infecciosa. enzoóticaen nuestro país que ataca a herbivoros biungulados. Es altamentecontagiosa y esta caracterizada por una patología febril aguda.Los primeros signos de la enfermedad son: fiebre, anorexia yla clasica formacion de vesículas o aftas. Estas últimas sonerosiones y ulceras superficiales en la mucosa bucal, en losespacios interdigitales y en el epitelio de los pezones.

Presenta una alta morbilidad, no asi mortalidad la cuai estalimitada a animales jovenes. La gravedad de la enfermedad variacon la cepa infectante y la suceptibilidad de la poblaciónj’4

1.2.2 Agente etiológico

El agente causante de la enfermedad es el virus de la fiebreaftosa (VFA)o virus aftoso, perteneciente a la familia de lospicornavirus.

1.2.3 sttribuciOn

Su distribución es muy amplia y abarca a casi todos los paises.si bien ha sido erradicada de algunos.

En Estados |Jnidos de America, el último brote de FA ocurrioen el año 1929 y en Canada se registró en 19 2, Inientras queen Mexico se erradicó en 1953 gracias a una acción conjunta conorganismos norteamericanos que, obviamente, deseaban eliminar1a enfermedad de su vecindad. En Australia no se presentan masdenuncias sobre F.A. desde 1872. Japon no registra brotes desde1908. Los paises escandinavos son considerados libres de laenfermedad desde 1952.

Por otro lado la enfermedad nunca fue detectada en NuevaZelandia, Centroamerica, islas del Caribe y la Polinesia.

Ademas,Francia, Alemania. Inglaterra e Italia son consideradospaises donde la enfermedad esta (Mi vias (ha desaparición c, hasido erradicada recientemente.

En nuestro país pese a existir una región libre de la enfermedad(Patagonia). es considerado junto con los demas paises del ConoSur. comoendémicos respecto de esta enfermedad.

El mapa actual de la distribución de la enfermedad en el mundose muestra en la figura 1.2.3 .

Referenciaw ZONAS CON FA

()20NA5 EN WAS DE ERRAmCAcmN.ZONAS sm FAA

Figura 1.2.3 : Distribución actual de la enfermedad.

1.2;3_Hue59eqes susCegtibles

El ganado bovino, porcino, ovino y caprino es el massusceptible, en ese orden decreciente.

Además de los ya mencionados existen más de 70 especies dentrode 20 familias de mamíreros que han resultado susceptibles ala infección natural o experimental.

Los factores que afectan la susceptibilidad en la especie bovinaestan relacionados con la edad, ya que afecta principalmentey animales jovenes. En general, el nivel nutricional de la hacien—da y la coexistencia de otras enfermedades favorecen suprevalencia.

La incidencia es mayor durante los meses de calor y humedad.mientras que una baja temperatura ambiente tiende a interrumpirel progreso de los brotes en desarrollo.

1.2.5 As ectos_glin¿ggs

La via de infección más importante de este virus es el tractorespiratorio y su principal lugar de multiplicación es inicila­mente la faringe. Subsecuentemente el virus se distribuye a variostejidos. pudiendo detectarse en sangre. leche, vagina rectoaún antes de la aparicion de los primeros signos de la infección.

Luego de un período de incubacion de 2 a 8 dias comienzan aaparecer los primeros signos clinicos antes descriptos (fiebre.anorexia, vesículas en epitelio. etc.:. Las vesiculas aumentanrapidamente de tamano para finalmente romperse, dando lugar ala existencia de areas de epitelio descamado el cual conllevaa una serie de incombenientes para el animal. La presencia devesículas bucales dificultan su alimentación y la de las ubresinterfieren en el ordene y la lactancia. Por último las lesionesinterdigitales dificultan la movilidad del animal. Todo estoredunda en una rapida perdida de peso del mismo asi como en unaacentuada disminución de la producción lechera.

Los títulos virales alcanzan sus más altos niveles en lasprimeras etapas de la enfermedad y declinan gradualmente conla concomitante apariCIÓn de anticuerpos neutralizantes. Luegode 2 o 3 semanas se observa la recuperacion del animal. Sinemgargo es de destacar que el virus puede permanecer por periodosprolongados en la faringe de los animales, los cuales seconvierten en agentes potenciales de propagación.

Es posible distinguir dos formas clínicas de la enfermedad.una benigna, la mas comun, donde la recuperación se produce en

Forma espontanea luego de 2 t) 3 semanas; en ella. la perdidade pese y la Inerma en la produccion lechera son los problemasmas graves. Por otro lado existe una forma grave que se manifiestapot una degeneraciOn miocardica aguda, infarto y muerte súbita.

La propagación del agente es fundamentalmente por contactodirecto: bien a traves de sangre, saliva. materia fecal, semen,leche y carne de animales enfermos; o bien a traves de materialescontaminados con ellos. El virus se encuentra presente en e]aire exhalado y en el ambiente que rodea al ganado infectadohasta dos semanas de concluida la enfermedad.

En resumen pueden señalarse tres aspectos fundamentales encuanto a la transmision de la enfermedad:

-Alto contenido de virus infectivo en tejidos de animalesmuertos. exhudados de lesiones y en secreciones naturales.

-Prolongada supervivencia del virus infeccioso Fuera delcuerpo del animal.

-Rapida transmisión de la infección tanto por contacto directocomo a tFaVéS de DI‘OGUCKOSanimales y aerosoles.

1.3 CARACTERISTICAS GENERALES DEL VFA

De acuerdo a la clasificación del Comite Internacional deTaxonomia de Virus (ICTV) la familia picornaviridae esta compuestapor cuatro generos: Enterovirus, Cardiovirus, Rhionovirus yAftovirus.5 Se los puede diferenciar entre si en base a suscaracteristicas de: sensibilidad al acido. densidad en CsCl.

serologia ysusceptibles (Tabla 1.3.1).

Tabla I.la familia

PROPIEDADES

MiembrosprincipalesSerotipos

Rango dehuésped

manifestaciones

ENTREROVIRUS

poli-eco­

clinicas producidas en

'.1 : Características dePicornaviridae

CARDIOVIRUS

encefalo­coxackievirus miocarditis70

estrecho

Características del viriónDiametro (nm)lnfectividada pH=3Infectividada pH=5-6Densidad enCsCl gr/mlPorcentajede RNAPoli-C

22-28estableestable1,34

29

no

1

amplio

24-30establelábil

1,34

31

si

los generos

RHINOVIRUS

rhinovirus

110

estrecho

24-30lábillábil

1,1.

30

no

Cada uno de estos generos pueden subdividirse enacuerdo a tipificación serológica. 6,7

1.3.2 Caracteristicas generales del virus aftosa

Algunas deen el listado siguiente:

Peso molecular

Coeficiente desedimentación

las caracteristicas mas relevantes son

los

que

las

hucpedes

componen

AFTOVIRUS

VFA

amplio

23-25lablllábil1,á3

31, UI

si

especies de

indicadas

Morfología Icosahedrica. 24 nmde diametro

N’ de capsomeros 32

. 3Den51dad de 1,a3-1.a5 g/cmflotación

Composición quimica 31% RNA. 602 proteinas

RNA 2.7140ó Da (8500 bases)polaridad positiva

Polipéptidos estrucnurales Vpl 3A kDaVpl 30 kDa

V03 20 kDa

vpü 13.5 kDa

Tipos inmunogenicos 7 (A. o, C, SATI, SAT2. SAT3

Asia) ’

Subtipos inmunogénicos 67

Cepas inmunogenicas varios cientos

1.3.3 ggtrucggra de la cágside viral

La capside viral posee una estructura del tipo icosahedrica<Fig.I.3.3), esta formada por cuatro polipeptidos principales( Vpl, Vp2, Vp3 y Vpá). Cada partícula viral posee 60 copiasde cada unc_ de los ¡nismos. Estos polipéptidos estan agrupadosen particulas de las (capsomerOS) ios cuales contienen 5 copiasde Vp1, Vp: y Vps. Cada capside viral esta a su vez conformadapor la agrupación de doce capsómeros.10 Por su parte elpolipeptido VPA esta localizado internamente 3' asociado a] RNAgenbmico.“’12

-10­

CapSIde Viral O Vpl

figura 1.3.3: Representación esquemaiica de la CápSldeviral. Tambien se indica la posible disposición espacial de laproteina inmunogénica (Vpl).

Una caracteristica destacable de las particulas virales essu marcada inestabilidad en medios debilmente acidos y a latemperatura. Un pH menor que 7 o el calentamiento a 56 oojcdeterminan el desensamblamiento de la capside y originan laaparición de capsómeros de 123 y RNA.IJ

Se ha descripto tambien otros componentes “menores” de lascapsides virales. Ejemplo de ello es: Vpo (precursor no clivadode sz y Vpa).1“’15

1.3.á enoma viral

Cada partícula viral esta constituida por una unica inoleculade RNAde simple cadena cuyo peso molecular promedio es de 2,7viobdaltons.16, es decir que contiene aproximadamente 8500 nucleótidosde longitud.17 Su coeficiente de sedimentación es de 355.

Este RNAposee una polaridad positiva, es decir que puede actua:como mensajero. Además compartiendo propiedades con otros inHNAeucarioricos posee en su extremo 3' una region de acido poli­adenilico (poliA) de 20-200 nucleótidos.18 Es notable sin embargoque en su estructura primaria no se detecta una señal de poliade

nilacion (AAUAAA)tal como ocurre en los RNAmensajeros eucarioti. 19 . .cos de origen celular. Esto apoya la hipotesis de que en el

YFAel poliA es un producto cuya codificación genetica debe residir en una secuenCJa de poliU localizada en el extremo 5' de

_. 20-22 . ..la cadena complementaiia. En consecuencna la generaCIOndel poliA en VFA seria a través de un mecanismo totalmentediferente al utilizado por los mRNAeucarióticos celulares.

En el extremo 5' del RNAobtenido de viriones purificados nose encuentran estructuras convencionales, de] tipo DNP. ppr,pppr, o la estructura CAP (m76{5'lpppN...) presente en todoslos mensajeros eucarióticos.23 Sin embargo Se encuentra un poli­peptido pequeño «za-za aminoácidos) llamado Vpg. ESte polipeptidoesta unido covalentemente al RNAa traves de un residuo tirosinaque ocupa la tercera posicion a partir de extremo NH9—terminal.Dita union es de tipo fosfodiester e involucra al ácido uridilico5' terminal del RNA?4 ‘I

El polipeptido Vpg no es necesario para la eficiente traduccion..28del RNA"in vitro ni para la infectividad viralze; incluso

se ha observado que una parte de la población de mRNAviral noposee Vpg .27

Mediante el cionado molecular del genoma viral29 pudo serdeterminado que Vpg esta codificada por tres "genes" distintos,con un alto grado de homología entre si. Las diferencias de cargade las distintas Vpgdeducidas a partir de la secuencia primariade aminoácidos y la presencia o no de metionina. explican haexistencha de las poblaciones heterogeneas de Vpg que han sido

. u 27halladas "in Vivo (ver tabla 1.4.2).

Por otra parte existe una gran homologia entre Vpg de VFA yla de polivirus (22 aa 5/ carga +4) lo cual denota una funciónvital y evolutivamente conservada de este polipeptido

Una interesante particularidad respecto al RNA de VFAes que

presenta un segmento de poliC, localizado a unos 400 nutleótidos-. 30,31del extremo o El tamaño de dicho fragmento es variable

32,33(30-200 bases) en los distintos virus aislados. Este fragmen»to, si tuviese capacidad codificante. debería dar lugar a unapoli-prolina cuya existencia en células infectadas aún no ha

. 28Sido demostrada.

Por otro lado se ha especulado respecto a una posible relacionentre longitud del poliC y la virulencia de las distintas cepas

. 3A.35Virales.posibilidad.33

Sin embargo datos recientes parecen desechar tal

1.3 QICLO VIRAL

El proceso de replicación del VFAtiene lugar en el citoplasmade la celula huesped, caracteristica comun a todos los miembrosde la familia picornavirus.

El ciclo infectivo, a nivel celular vpuede dividirse en lassiguientes etapas:

i)Adsorción, internalización y desnudamiento.ii)Replicacion y traducción de proteinas virales.iii)MaduraciOn. ensamblaje y liberacion de la progenie viral.

1.4.1 Adsorcióng internalización v desnudamiento

La interacción del virus con receptores celúlares es el primerevento en el ciclo de vida de un virus. Dicha interacción esparticularmente interesante ya que representa uno de los mayoresdeterminantes en el control de la susceptibilidad celular a lainfección.

En el caso de VFAse ha sugerido que Vpi estaría directamente

involucrada en esta etapa, ya que el tratamiento de la capsideviral con tripsina cliva exclusivamente a esta proteina y determina la perdida en la capacidad de adsorción del virus a sus recep­

36.37tores celulares.

Por otro lado. ciertas proteínas integrales de la membranaplasmática celular actuaria como receptor.38 La identificaciónde dichas proteinas celulares aún no ha podido ser reali2udaprecisamente, aunque existen ciertos indicios que indicarianque podria tratarse del receptor celular para la proteína fibro­nectina.

En general. la velocidad del fenómenode adsorción esta influen­. . 39 ..Ciado por un gran numero de factores , entre ellos, concentrac10n

celular y virus, pH, temperatura, especies iónicas y su concen­tración en el medio. viscosidad. etc..

En particular la adsorción del VFA. presenta un rango restrinugido de ¡flL siendo su óptimo entre 6,4 y 7,8.¿0‘41 Respecto ala temperatura el VFA muestra un comportamiento independiente,no siendo afectada en un rango de 0°C a 37°Cá0. hecho que espropio de una interacción del tipo ligando-receptor.

Luego de la adsorción se produce la internalización del virusque lo hace inaccesible a los anticuerpos neutralizantes agregadosal medio de cultivo. Aún cuando la localización subcelular delas partículas virales no ha sido bien determinada, se presumeque estos se encuentran en vesículas intracitoplasmaticas origina­das a traves de un proceso de "endocitosis mediado por receptoresespecificos".

El virus es ulteriormente desnudado, quedando el RNA librepara dirigir la sintesis de proteinas virales y su replica­ción.42'43

Durante el proceso de desnudamiento las particulas virales

-14­

sufririan una transformación de estructuras del tipo ¿Os a cap­someros de 125 y moléculas de RNA.

l.ú.2 Replicación del RNAv traducción de las proteinasyirales

a replicación del RNAviral en el grupo de picornavirus. invo­lucra en su primer etapa la transcripción de las cadenas conpolaridad positiva con formachMI de cadenas complementarias depolaridad negativa. En una segunda etapa estas últimas actúancomo molde para Mi producción de nuevas cadenas positivas, lascuales podran actuar bien como RNAmensajero. en el proceso detraducción de proteínas virales. bien como RNAviral precursorde nuevos viriones 0 bien como templado en el proceso de sintesisde mas moleculas de RNA.

Este proceso tiene lugar bajo la forma de un complejo denominadointermediario replicativo (R1). el cual se encuentra asociadoa vesículas de membrana 1isa.48'A9 Se considera generalmenteque dicho complejo RI consiste de una cadena de RNAparentalasociada con 6 a 8 cadenas (negativas) en proceso de sintesis.50

Las primeras etapas del proceso replicativo es coincidentecon la traduccion de] RNA(+) para dar lugar a proteínas virales.entre las que puede destacarse el polipeptido denominado p56.Dicho polipeptido ha sido aislado consistentemente delintermediario replicativo. designandolo comola enzima responsablede la elongación de las cadenas de RNA"in vivo". es decir RNA

. . . ” ¡6 .polimerasa RNAdependiente {rep}icasarÏH ‘ La en21ma es capazde iniciar in vitro" la sintesis de RNAy presenta ademas unaaccividad de poliU polimerasa.

Otro polipeptido viral, p34, podria estar involucrado tambienen la replicación. ya que dicha proteinas presenta evidentesalteraciones en mutantes virales resistentes a guanidinia con

. -.‘ . - . z . ' ' ' .- vdeíwatos en la capaCIdad de SintetlZdr RAA.

-15­

Tambien se ha postulado que Vpg puede jugar cierto papel en.3 . .5 Esta proteina no 5010 se en­la replicación del genomaviral.

cuentra presente en el extremo 55' de la cadena positiva. sinotambien en las cadenas negativas nacientes del intermediarioreplicativo.5"’"57 Basados e”) estos datos Nomoto si Colaboradorespropusieron que Vpg podria acruar como iniciador en la sintesisde RNA.55 Por otro lado es importante destacar que no ha sidoposible detectar Vpg libre en citoplasma. Esto sugiere que estaproteína podria pasar rapidamente a formar parte del El en formade precursor polipeptídico.5e’59

Ademas, se ha determinado que la proteína pila es el polipep­tido precursor de vng. En este sentido es destacable e] hecho

. . 60que plb tambien se encuentra asoczado a membranas.

La iniciacion de la sintesis del RNAviral estaria precedidapor la unión de un residuo uridilico al tercer residuo (tirosina)dentro de la region hidrofilica c-terminal de Vpg. Dicho residuouridílico esta geneticamente determinado ya que su existenciaes coherente con la presencia de un residuo adenílico en laposicion 3' terminal de la cadena negativa. Es importante destacarque Takegami y colaboradores61 demuestran que una fracción crudade membranasde celulas infectadas con poliovirustiene capacidadde sintetizar una nucleotidil-proteina, es decii‘ el extremo .5'de la cadena naciente.

En todo caso los mecanismos de iniciación para la replicaciónde las cadenas positivas y negativas parecen ser los Inismos.quedando por determinar comoocurre la eleccion de los respectivosmoldes.

Durante la transcripcion habria un proceso proteolitico queclivaria al pudipéptido precursor a la altura de] par Gin-Gir.de esta manera el intermediario replicativo se libera de la mem

_16­

brana, conservando a la Vpg en el extremo 5 . La enzimaresponsable de este clivaje seria una proteasa de origen viral.que tambien formaría parte de dicho intermediario.6¿

En cuanto a la traduccion el RNAdel VFAcomo otros picornavirusposee en su extremo 5' una larga secuencia (cerca de ¿00 baseS)que no se traduce al menos "in vitro".28 Toda la secuencia concapacidad codificante esta ubicada en EH segmento que va desdeel lado 3' del poliC al extremo 3' de la molécula de RNA.

Se ha determinado que el RNAmensajero no posee Vpg unida ensu extremo 5'. Esto resulta probablemente de un clivaje post“transcripcional de Vpg por una enzima celular.63 No se comprendeporque Vpg es clivado de las moleculas de RNA que seran mRNA,aunque podria ser que: Vpg interfiera en el proceso de iniciacionde la traduccion "in vivo". o bien. si Vpg cumple un papel enla union de los precursores estructurales al RNAgenomico laausencia de Vpg en los mRNAlos preservaria de un posible secues­tro por parte de las proteínas estructuraleag quizás como unaforma de regulacion.

A partir de los datos de secuenciaciOn de CDNAde VFA17. esevidente que existe un único marco de lectura abierto de 7035nucleótidos (posición 766 a 7800). antes y despues del mismoexisten varios codones de terminacion. Por lo tanto los aftovirusutilizan el mismo modelo de traducción que otros picornavirus,es decir un solo sitio de iniciacion para la traduccion de unapoliproteina precursor de todos los polipéptidos virales.7’64El mensaje de dicha poliprotelna (260 kDa) abarca casi toda la

8longitud del genoma.65'

Esta poliproteina es clivada proteoliticamente incluso durantesu traduccion y a menos que se utilicen condiciones determinadas(inhibidores de proteasas o analogos de aminoácidos) es practica­

-17­

mente imposible su detección en células infectadas.

Un primer ciivaje es realizado por enzimas de origen celulardando lugar a a productos :p20a (P0); pSS (P1); p52 (P2) y p100

7,69-72 _ . .A SU vez GStOS productos primarios SOI] procesados(P3).proteoliticamente dando una serie de polipéptidos intermediariosque a su vez generan todas las proteinas estructuralesy no estructurales (ver Fig.I.3.2).67

PMsn :l. :‘Í :¡‘nn“wc r I Í I 1: Ïj J

vor:l vn l vn en' I ru IL?“ Y" :nu I Ps; l WMo fue ; nu no. ¿no sono. ¡ooo nao:P1005

F m : 9‘00

I \ vn P341 / \pmi 911 —-' P12 ; pu_ I

\>\Íl

I I v

3 : \ 5: ' VP? :, — .' i

Figura 1.3.2: Mapa bioquímico del VFA. Se presenta en lafigura un esquema del RNAgenómico _v la posición relativa delos distintos "genes". Tambien se esquematiza los diferentespéptidos producidos por el virus, en lineas finas losintermediarios y en lineas mas gruesas los productos finales.

Mediante e] analisis de las secuencias en los extremos aminoter­minal y carboxiterminal de las proteinas estructurales se deter­minó la existencia de tres sitio de clivaje proteolitico en e]correspondiente precursor. Entre Vpú y Vp2 el punto de clivajese localizó en el par Ala-Asp, mientras que entre Vp2 y \-‘p3 selocalizó a nivel del Glu-Gly y entre Vp3-VpI el clivaje se pio­dUCeen el par Gln-Thr.73.75

A partir del analisis de los diversos polipéptidos precursores

-18­

fue posible determinar las regiones que codifican para cada unade las proteinas sintetizadas por el virus. Es asi que la codifi­cación genomica puede dividirse en las regiones: P0, P1, P2 yP3. La region P0 codifica para la proteina pZOa o p16 (segúnque sitio de iniciación se utilice), el cual se marca con 355­formilmetionina-tRNA. lo que indica el inicio de latraducción.28’70

La region P1 codifica para las proteinas estructurales de lacapside (ver mas arriba), es decir Vp4, Vp2, Vp3 y Vp1.76"'

La región 2 codifica para p52 que es precursor de p20c y p34.Como se ha indicado anteriormente p34 estaria involucrado enel proceso de replicación.51

La región P3 codifica para la sintesis de la replicasa Viral,p56a, que se halla en el extremo 3'.78 Adyacente al extremo 5'del "gen" de replicasa se localizó p20b, la proteasa viral69y adyacente a su extremo 5' los tres "genes" de Vpg.29 El precur­sor p72 seria el intermediario de estas tres proteinas quedandoen el extremo 5' de P3 la proteina p14, que correspondería alpolipeptido “dador” de Vpg por analogía con poliovirus.61 Enla tabla 1.4.2 se sintetizan las caracteristicas mas importantesde estos polipéptidos.

Tabla 1.4.2: Caracteristicas de los polipéptidos precursoresy productos finales del VFA.

POLI_ POSICION N° DE PESO CARGA FUNCIONPEPTIDO AA. MOLECULAR NETA

Poliprot. 805-7800 2332 258946.8 +37 precursor

P203 805-1455 217 24367,4 —5 ?P16 889-1445 189 21243.1 —7 ?

P88 1456-3615 720 79305,6 +13 precursorVp4 1456-1662 69 7362,3 —3 estructuralsz 1663-2316 218 24410.4 a4 estructural

POLJ__PEPTIDO

V03Vp]

P52P12P34

P100PlaVpg-lVpg-ZVpg-BP20bP56

POSICION

3610-5079366ú-á124126-5079

5080-78005080-55385539-56075608-56795680-575]5752-63906391-7800

N

A

° DED

907153

2424

213470

1.4.? Morfoqenesis viral

-19­

PESO CARGAMOLECULAR NETA

23746.423840,5

54501,016255.035892,0

100844,0l7355,02604,02622,02579,0

23012,052760.0

.L. >10

FUNCION

estructuralestructuralprecursor

9

replicación?

precursordador Vpg?prot. genómicaprot. genómicaprot. genbmicaproteasareplicasa

El proceso morfogenetico del VFAno es conocido en sus detalles.pero por similitud COU otros picornavirus puede considerarseque intervienen precursores que dan origen a particulas maduras.

Pueden detectarse en celulasturas virales que son posibles precursores deEntre ellas. la estructura mas simple aislada hasta el

de VpOes una partícula deVp2), Vpl

De acuerdo al

Vps.

mencionarse que:

-estan siempre presentes en-estan compuestaspor proteinas estructurales.vse comportan según

en experimentos de

posible

145,

r

«se acumulan cuando-da

semejantes a procápsides aisladaslugar a la

ol precursor

la sintesis de RNAviralformación de

infectadas una serie de estruc­

compuesta por

"pulse and chase".

in vitro""in vivo".

copias

79capsides

capside.79‘80presente

(Vp4 y

de estas particulas puede

celulas infectadas.

una relación precursor-capside madura

esta inhibida.vacías

-20­

De ta] forma el ensamblaje de estos posibles precursores dariaorigen a capsides vacias las cuales luego conformarian los virio­nes-Bl-BB

El ingreso ulterior de] RNAa las procápsides. proceso quees tambien poco conocido, darían lugar a la formación de losprovirus. Estos constituyen estructuras sumamente inestablesque se estabilizarian por el procesamiento proteolitiCt) de laVpO. Esto a su vez generaría un reordenamiento de la capsideque constituiria el último paso en la maduración viral.81

1.5 VARIABILIDAQ

1.5.1 Tipos inmunológicos y variabilidad

Desde que se aisló el agente etiológico por primera vez hastael presente ha sido posible identificar 7 tipos inmunológicosdiferentes (Tabla 1.5.1). Las diferencias antigénicas entre ellosson tales que animales convalecientes de la enfermedad causadapor un tipo inmunológico no estan protegidos contra ninguno delos restantes.

Iabla 1.5.1 Tipos serológicos del VFA.

TIPO REFERENCIA N°DE SUBTIPOS AREA AFECTADA

O Valle y Carré (1922 12 Europa, Asia, Africay Sudamerica

A Valle y Carré (1922) 32 Europa. Asia, Africay Sudamerica

C waldmanny y Trautwein<1926> 7 Europa, Asia, Africay Sudamerica

SATI Galloway y Brooksby (1948) 8 Africa y AsiaSATZ Galloway y Brooksby (1948) 3 AfricaSATS Galloway y Brooksby<1948> 4 AfricaAsia Brooksby y Rogers (1957) 3 Asia

A su vez se puede reconocer la existencia de subtipos los cualesHH)son capaces de conferir una sólida inmunidad frente a otrossubtipos del mismo,tipo.

El alto grado de variabilidad antigénica observada en VFAhaceque continuamente se esten aislando nuevos subtipos. Se han reco­nocido hasta el presente al menos65 subtipos diferentes.

Mediante El seguimiento serológico se ha demostrado que durantelos períodos epidemicos e interepidemicos las cepas se modificanconstantemente. observandose que la diferencia, respecto a lacepa original, puede ocurrir gradualmente o en forma brusca.

En zonas donde se lleva a cabo campanas de vacunación adecuadas(ver más adelante). se ha detectado que el virus tiende a alejarseantigenicamente de la cepa vacunal utilizada. debido probable­mente a la continua presion de selección ejercida por el sistemainmunológico del animal.

1.5.2 Bases moleculares de la variabilidad

La variación antigénica es fundamentalmente consecuencia decambios en la estructura primaria de.algunas de los cuatro poli­péptidos que constituye la capside del virión. En el candidatomas probable es Vpi, va que se sabe que dicho polipeptido poseela capacidad de generar anticuerpos neutralizantes del virusen porcindel‘.86 Ademas,el tratamiento proteolítico de viriones.cliva especificamente Vpi 3/ elimina la capacidad de las mismasde generar anticuerpos neutralizantes. Ulteriores evidenciashan permitido confirmar que efectivamente Vpi es portador del(de los) epitope (s) principal(es). Los primeros datos desecuenciación de Vpi permitieron encontrar diferencias importantesa nivel del extremo N-terminal en tipos diferentes.87'88

Desde luego estos cambios deberian estar representados a nivel

de la secuencia nucleotidica del RNAgenómico. Utilizando inicial­mente técnicas de hibridación competitiva y electroforesis bidi­mencional de fragmentos de RNAresistentes a RNasa T1 fue posibledetectar ini 63% de homologia entre los tipos A 3' o y nás del802 entre subtipos A. Estos porcentajes son compatibles con lasobservaciones serológicas.

Por otro lado se observo. a partir de mapas tripticos. quelos productos primarios de las proteinas estructurales variabanmas que D52 0 [3100.

Sin embargo los datos obtenidos por secuenCiación de los DNAcopias (cDNA) han permitido establecer con mucha más preciciónla localización de las areas genómicas con mayor variabilidadentre los distintos tipos si subtipos hasta hoy analizados. Enefecto el area genómica de mayor variabilidad esta por supuestoa nivel de Vpl. En la misma existen al menos dos regiones alta­mente variables, estas son del aa 42 al 60 y del IBA-158 siendoesta última la region hipervarriable, candidata a contener el(los) epitope (s) inmunogenico(s) (ver Vacunas.l.5).

1.5.3 Mecanismosmoleculares de variabilidad

Los virus a RNAposeen una alta tasa de mutación. debido funda­mentalmente a la ausencia de una actividad reparadora asociadaa la replicación ("proof-reading") similar a la asociada a genomasde DNA. La tasa de mutación de los virus de RNAes de variosordenes de magnitud mayor que los genómas a DNAde similar comple­jidad. Por ejemplo en el caso del VFA Pringle89 ha demostradouna tasa de mutación tan alta como 10-4. Por lo tanto. como sugie­re Sobrino y colaboradores90 es necesario considerar que todapoblación de VFA es geneticamente heterogenea. Esto significaque en todo caso la distribución de secuencias en una poblacióndada es la consecuencia por un lado del alto grado de mutación

y por otro lado de la tolerancia funcional del genoma viral.Obviamente la mayor tasa de variabilidad se da en zonas del genomapoco importantes en cuanto al proceso de biosintesis y ensamblajede los viriones.

Otro mecanismode variabilidad a considerar es la recombinacion.la cual ha sido detectada enpoliovirusc'n y en aftovirusgz.

1.6 CONTROL DE_L¿ ENFERMEDAD

En muchos de los paises. donde la enfermedad ha sido erradica­da (Gran Bretaña, Francia. etc.) se ha tenido que apelar a procedimientos costosisimos que incluyen el sacrificio y eliminacnónde todo el stock ganadero infectado, asi comoel riguroso controlsanitario de las importaciones.

En los paises en desarrollo, las restricciones socio-economicasimpiden encarar el problema con enfoques de este tipo. Por ellodeben recurrir a programas de vacunación extensiva como mediode control de la zoonosis.

Es posible mencionar tres tipos de vacunas en base al antígenovacunal empleado:

—Vacunasa virus vivos.—Vacunasa virus inactivado.—Vacunassin intervencion del agente infeccioso.

1.6.1 Vacunas a virus vivos (atenuadas)

Este tipo de vacunas que han producido exelentes resultadosen otras enfermedades, no ha sido exitosa con aftosa. y por lntanto ha sida dejada practicamente de lado (salvo en Venezuela).

Los virus "atenuados", obtenidos por pasajes en sistemas ce­lulares o en especies animales no susceptibles, guardan un delica­do equilibrio entre su capacidad de replicación v su poder inmu­nizante. Por lo tanto el virus vacunal no produce la enfermedadpero al replicarse dentro del animal induce la formación de anti­cuerpos neutralizantes.

Dos de sus principales inconvenientes son:

—Enanimales con cierto nivel de anticuerpos el virus vivoes neutralizado y su replicacion inhibida lo que convierte ala masa viral inoculada en insuficiente por si sola para confe­rir proteccion adecuada.

-La posibilidad de reversión a la forma salvaje es unaconstante amenaza, mas aún teniendo en cuenta la alta tasa demutagenesis observada para estos virus.

1.6.2 Vacunasa virus inactivados

Las vacunas de este tipo han incluido sucesivamente la uti­lización de explanates linguales de animales infectados, particu­las virales producidas en cultivos de epitelio lingual bov1noy más recientemente en cultivos de lineas celulares. todos inacti­vados con formaldehído o alguna de las azurdinas.93_90

En la formulación de las vacunas se han utilizado como adyuvanteel gel de hidroxido de aluminio asociado o no con saponina osus derivados, o bien adyuvantes oleosos tipo Freund incompletoasociado con agentes emulsionantes lipofilicos, a veces combinadoscon agentes hidroi"ilicos.9"98

Algunos de los inconvenietes mas importantes relacionados convacunas de este segundo tipo son:

-25­

i)Inestabilidad del inmunógeno que requiere tran5portealmacenamiento a bajas temperaturas. Este inconveniente es

particularmente grave en paises como la Argentina con rodeosdistribuidos en una amplia superficie de su territorio.

ii)La enorme cantidad de antígeno requerido para mantenerun buen grado de inmunización de los stocks ganaderos y conse­cuentemente el alto costo de producción de los mismos por sistemasconvencionales.

iii)El riesgo relacionado con la pmoduccion y inilizaciónde vacunas a partir de antígeno infeccioso. que lo descalificanen la utilización como preventivo en zonas limpias. libres dela enfermedad o de reciente erradicación.

iV)La dificultad que existe en el cultivo de ciertas cepasde virus aftoso.

De todos modos es necesario reconocer que los buenos programasde vacunación. utilizando este tipo de inmunogeno, hanproporcionado sin duda un control efectivo de la endemia.93

1.6.3 Vacunas sin intervencign_del agente infeccioso

Los recientes avances obtenidos en el campo de la BiologiaMolecular, DNArecombinante e Inmunología han permitido la introducción de nuevos enfoques en cuanto a la posibilidad de obtenerinmunogenos mas estables. inocuos y de elaboración simple y ba­rata. En este sentido el problema se ha encarado según dos enfo­ques diferentes:

i)Sintesis quimica de oligopeptidos inmunogenÍCUs;ii)Biosintesis de la(s) proteína(s) inmunogénica<sï en

sistemas bacterianos.

i)Las proteinas pueden llevar un gran número de sitios quedeterminen su especificidad antigénica. Sin embargo. aparentemente

-26­

solo un número limitado de esos sitios estan involucrados endespertar y evocar la respuesta inmunogenica. Esta observaciónha provisto la base teorica para la posible utilización de inmuno­genos químicamente definidos como posibles vacunas contraenfermedadesvirales.

El mayor problema es la identificación de los sitios inmmnrgenicos en la proteina viral. Algunas (n: las predicciones hansido hechas a partir de: a) medicion de la actividad biologicade ciertos péptidos; b) identificación de sitios que difierenen las variantes antígenicas: C) identificación de sitios quereaccionan con anticuerpos monoclonales neutralizantes; d) estudiode la estructura secundaria de la proteina inmunogenica.

En el caso de VFAse ha tenido la suerte de contar con evidenciac01ncidente utilizando los cuatro conceptos. Strohmaier y colabo­radores muestran que utilizando ciertos péptidos, obtenidos apartir de clivaje con bromuro de cianógeno de la Vpl. es posibleproducir anticuerpos neutralizantes en raton. Estos péptidoscorresponden a los aminoácidos 146 a 154 y 200 a 213.99

Por otro lado a partir de datos de secuencia nucleotidica del"gene" que codifica para la Vpl a podido deducirse ia seCUenciaaminoacidica de distintos tipos y subtipos. De la comparaciónde dichas secuenCJas es posible demostrar la existencia de treszonas de alta variabilidad. estas son las comprendidas por losaminoácidoszúi-óo. 134-160 y 195-213.100 sin embargo la región41-60 se encuentra en una zona hidrofobica por lo que fuedescartada como epitope. En efecto péptidos de esta regiónsintetizados quimicamente no son capaces de gmnerar

. 101ant l CUEI‘DOS.

Al pasar una poblaCion de poliovirus,tipo 3, por columnas deafinidad con anticuerpos monoclonales ha sido posible seleccionarsubpoblaciones virales resistentes a la neutralización. Estudiosposteriores de mapeo con RNasa T1 demostraron la perdida de un

-27­

oligonucleotido correspondiente al nucleótido número 300 de laVpl.102 Por secuenciación del RNAse demostro que las mutacionesque conferian resistencia a la neutralizacion se producentasicamente en una región de 8 aminoácidos codificados por losnucleótidos 277»300.

Las predicciones con estudios de estructura secundaria a partirde deducciones matemáticas tambien muestran a las regiones 140­160 y 195-213 como zonas expuestas candidatas a contener losdeterminantes antigénicos (ver Resultados V.4). Sin embargo lautilización de este último elemento es ciertamente imprecisoya que desconoce la influencia de las interaciones con otrasmacromoleculas (RNA,otras proteinas, etc.).

Con estos datos coincidentes se sintitizaron péptidos corro­pondientes a la región 141-160, los cuales producen buenos titulosde anticuerpos neutralizantes si en coballos generan protecciona la infeccion con virus ("challenge").103 Sin embargo no seha obtenido buena respuesta en bovino.

Una observación interesante realizada por Emini y colaboradoreses la denomiada "priming" de péptidos. En tal reporte se demuestraque conejos que han recibido una pequeña tdosis de péptidossintéticos, insuficientes para producir anticuerposneutralizantes, pueden estimular la respuesta inmunológica frentea la vacunación con insuficiente cantidad de antígeno (el cualpor si mismo no produce respuesta). llegando a obtenerse altosniveles de anticuerpos contra el antígeno empleado.10“

Este fenomeno ha sido observado en otros virus y no hay razonpara no creer que constituya un fenomeno universal y puederepresentar una manera de potenciar la actividad inmunogenicade un determinado antígeno o bien una forma de economizarantígenos de dificil obtención.

ii)Biosintesis en sistemas bacterianos

-23_

En cuanto a 1a expresión de Vp1 en Escherichia coli, Jos prime­ros resultados de inmunización no fueron muy promisorios. Kleidy colaboradores desarrollaron un plasmido que dirigía la sintesisde ¡ni péptido de fusion entre el fragmento trpLE 3/ Vpi. Dichoplasmido inducía a que el 17%de la proteina celular fuese trpLE­Vp1y adicionalmente este péptido era insoluble lo cual lo protejade proteolisis. Sin embargo si bien generaban anticuerposneutralizantes, estos no alcanzan para protejer a los animalescontra una nueva infección.105 Claramente la configuracionadoptada por el peptido difiere de la asumida por Vpl en lacapside viral. En experimentos posteriores se observó que eltiempo de protecion en animales inmunizados con altas cantidadesde inmunógeno, apenas alcanzaba a] mes y medio.Sin embargo muy recientemente. se ha reportado una buena respuestainmunologica. Con dos vacunaciones con 250 ugr de proteína defusión (LE°-Vp1), conteniendo los aminoácidos 1 a 211 de Vp].se logro una buena correlación entre producción de anticuerposneutralizantes y protección durante un período de 11 meses.106

Comparativamente la vacuna producida por este medio fue taneficaz como la mayoria de las vacunas producidas comercialmente.Comose ve en este punto los resultados son controvertidos y

requieren aún para su confirmación de mayores estudios. Decualquier forma, la asociación de este tipo de inmunogenmossintéticos o sintetizados por tecnicas de Ingenieria Geneticaen asociacion con adyuvantes del tipo muramildipeptido sin dudapresentan perspectivas futuras interesantes que merecen unanálisis y estudio en mas detalle (ver Discusión).

I I . TECNICAS DE DNA RECOMBINATE

En los últimos 15 años se ha operado en la biologia una delas mayores revoluciones en el conocimiento. Utilizando tecnicasdc laboratorio se ha hecho posible reprogramai' la informacióngenetica de un organismo de forma tal que pueda cumplir funcionesque son caracteristicas de otros organismos muydiferentes. Estareprogramación, por supuesto. se hace trascendiendo laslimitaciones que imponen las "barreras de especie

Esta introducción no pretende detallar el vasto panorama actualde esta moderna tecnologia,sino mas bien intenta volcar,en formaresumida,una serie de definiciones y conceptos imprescindiblespara la cemprension del contenido de este trabajo.

El método de DNArecombinante consiste en unir moléculas deDNA"in vitro" e introducirlas en celulas vivas donde puedenreplicarse. Las investigaciones utilizando estos metodos sonrelativamente nuevas 3' se han desarrollado rapidamente. En soloo años ha sido posible obtener un númerode significantes exitos.Se han producido en bacterias dos hormonas de mamíferos mediante

107,108la utilización del DNAsintetico. Así mismose han obtenidoen E.coLi polipeptidos similares t) idénticos a los encontradosen eucariontes.109_116 Estas realizaciones hacen pensar en laposibilidad de reprogramar bacterias para la obtención deproductos proteicos en gran escala. Ademas, usando DNArecombinante ha sido posible establecer y confirmar la existenciade una serie de eventos geneticos. tales como la recombinaciónsomatica en inmunoglobulinas, o la presencia de sequencias. . 17-120intercaladas en eucariontes,etc..1

Las moléculas de DNA exogeno insertadas en el vehiculo declonado o vector conforman una entidad nueva que es llamada 955recombinante o DNA chimaera por analogía con la Chimaeramitológica (una criatura con cabeza de león,cuerpo de cabra y

cola de serpiente). La construcción de tales compuestos omoleculas (recombinantes artificiales),constituyen una nuevaclase de recombinaciónde caracteristicas bioquímicas.

El desarrollo de esta moderna tecnologia requirió contar conalgunas herramientas en el campo de la microbiologia y labioquímica. En este sentido constituyó un importante avance laobtención de mutantes de E.coli incapaces de restrigir DNAexógeno(clivandolo especificamenete y degradandolo).121 Por otro ladolas endonucleasas de restricción conforman una herramientafundamentallzz’lza. Actualmente es inconcebible la tecnologiadel DNA sin tales nucleasas.12¿"125 La primer enzima derestricción usada con exito fue la EcoR1.129'13] Estaendonucleasa,que crea extremos cohesivos. fue utilizada en elprimer experimento de construcción ,"in vitro",de una moléculahíbrida .132 A partir de estos hallazgos se han desarrolladodos metodos generales para unir moleculas de DNAde diferentesorigenes (ver más adelante).126'128

Que puede hacerse con las tecnicas de DNA recombinante?Principalmente tres clases de cosas

i)Aislar una secuencia única de una .mezcla compleja demoleculas de DNA. tales como segmentos procedentes de genomaseucariotico. y hacerla replicar para obtener cantidades del ordendel miligramo y asi poder realizar estudios bioquímicos.

ii)Alterar una molécula de DNA.Es posible insertar sitiosde reconocimiento de enzimas de restricción u otro segmento deDNA. al azar o en sitios predeterminados. Es posible tambiensustraer sitios de restricción. o un fragmento de DNAcontenidoentre tales sitios. Tales modificaciones son particularmenteimportante cuando se quiere determinar la función de unadeterminada zona del DNA. Esto es un metodo atractivo cuandoen el estudio de la estructura genetica hacen falta mutantesque no pueden ser obtenidas por otrI) metodo. como en animalesy' plantas. Tambien ha sido posible utilizando oligonucleótidos

sintetizados quimicamente, generar mutaciones

en sitios predeterminados ("site-directed mutagenesis").iiDSintesis en bacterias de péptidos o proteinas que son

de interes en ciencia. medicina o en el comercio.

Se puede mencionar como "ingredientes" esenciales de unexperimento de DNArecombinante son:

a) Un vehiculo (vector o replicon) el cual pueda replicaren una celula viva luego que se le ha insertado el DNAexógeno.

b) -Una molécula de DNApara ser replicada (pasajero), obien una coleccion de ellas.

c) Un metodo para unir el pasajero al vehiculo.d) Una forma de introducir el DNAchimaera en un organismo

huesped en el cual esta puede replicarse (transformación otransfección).

e) Una forma de detección o selección genetica para determinaren que celula esta replicando la molécula recombinante buscada.Esta seleción o "screening" permite obtener el DNArecombinanteen forma pura.

11.1 VEHICULOS DE CLONADO

“JAMMuchos plásmidos han sido utilizados como vehículos de

clonado.Comunmente. E.coli y sus plásmidos constituyen el sistemavector/huesped más versatil para el clonado molecular de DNA.

Cuando se considera un plásmido como vehiculo de clonado esnecesario tener en cuenta ciertas características de estos:

i) Bajo peso molecular.ii) Capacidad de conferir al huesped un fenotipo facilmente

seleccionable.iii)Existencia de sitios de clonado (sitios de restricción)

únicos.

Desde luego no existe en la naturaleza un plasmido con estascaracteristicas y por ello ha sido necesario construirlos"invitro". Una de las mas afortunadas construcciones ha sido larealizada por Bolivar‘ y colaboradores133 ,la cual dio lugar aun plásmido denominado pBR322,que se ha usado ampliamente y delque han derivado la mayoria de los vectores plasmidicos actuales.Una de sus virtudes es que posee seis diferentes sitios derestricción únicos que pueden ser utilizados como sitios declonado.134‘135 Otra de las propiedades de este vector es queposee dos marcadores seleccionables, resistencia ¿a antibióticos(Ampicilina >I tetraciclina); los cuales no solo sirven para laseleccion de la transformacion. sino tambien, cuando estos genesde resistencia son interrumpidos por la inserción de secuenciasexógenas su inactivacion identifica a los plásmidos recombinantes.

11.1.2 Bacteriofagos:

Estos vehiculos de clonado derivados del fago lamnda (Ej1Charon)y constituyen los mejores vectores para el clonado y aislamientode genes eucarióticos. Los derivados de Lamnda tienen tresventajas fundamentales sobre los plasmidos:

1) Se pueden analizar centenares de miles de placas delisis en una simple placa de Petri. mediante la utilización dela tecnica de hibridación de acidos nucleicos "in situ".136

2)El empaquetado "in vitro" de las moleculas de DNArecombinantes ofrece la forma muy eficiente de infección del

137,138huesped.3)Finalmente. millones de fagos empaquetados

independientemente, pueden almacenarse bajo la forma de una simplesolución. contando de este modo con una coleccion de fagoshibridos que pueden portar secuencias representativas de todoun genoma ("Library").139

11.2 DN_A A SER_ CLONADO

Luego de extraer el DNAde un organismo determinado, el mismodebe ser preparado para su clonado según varias estrategias.La generación de fragmentos de tamaño definido utilizandodigestión con endonucleasas (específicas o no) o bien la rupturamecanica del mismo, constituyen los procedimientos mas

. 1A0,141corrientes. .

Es posible utilizar DNAno fraccionado quo represente todoun genoma entero. Pero cuando se busca un gen determinado puederecurrise a ciertas tecnicas de fraccionamiento (Ej:Cromatografíaen columnas del tipo de RPG-51""2 o electrofóresis en gel de

143 , 145agarosa ).

Ademas, el clonado de DNAcopia (cDNA) sintetizado "in vitro"por transcripción inversa de RNApoliadenilado o no, es un procesode amplia aplicacion (ver mas adelante).144

Tambien se ha utilizado DNAsintetizado químicamente (cercade 200 Pares de bases).107'1°8'145'147

11.2.1 sintesis de DNAcepia:

El DNA copia de una molécula de RNA es llamado DNAcomplemetario. y es normalmente abreviado"cDNA". De esta formael termino "clones de CDNA"se utiliza generalmente para describiruna celula bacteriana que porta el DNAcopia de una moléculade RNA. La preparación de tales plasmidos recombinantesnormalmente involucra la sintesis enzimática de un DNAde doblecadena utilizando comomolde determinado RNAo población de estos,

la posterior inserción del DNAsintetizado en un plasmidnvector.

-35­

Específicamente la sintesis de cDNAinvolucra una serie oe

reacciones enzimáticas que se esquematizan en la figura 11.2.1,según los dos protocolos de sintesis más utilizados. En 111.11y xv.4 se detallan las características de tales reacioues

Metodo de Nucleasa S1 Método de RNasa H

FMDV RNA FMDV RNA

“ A A A A A

TRANSCRIPTASA TRANSCRIPTASA

¡"VERSA INVERSA

A A.A A

T T T 'T‘ 4‘ ’T‘

HIDROLISIS RNasa H

ALCALINA

===:==-= ===: = === == === ==A A AT T T T T T

DNA Pol lDNA l I

(Klenow) po

T”T T(#7 AAA "“_ “"‘--'---—. +

LIGASA(E.co]I,NAD )

NUCLEASA S1

>-l >-l J>-l

Figura 11.2.1: Sintesis de cDNA.Se esquematizan los dosprotocolos utilizados en este trabajo. métodoutilizando NucleasaS1 y el metodo de la RNasa H.

-36­

11.3 METODOS DE CORTADO DE DNA

11.3.1 El uso de las Enzimas de Restricción

Cuando el colifago Lamnda se crece en la cepa C de .co i y

la pmogenie de fagos es utilizada para infectar E.coli K12. elcrecimiento en esta última es muy pobre.148 Se ha demostradoque este fenómeno es causado por una respuesta de la bacteriafrente al fago. Dado que el crecimiento es restringido. el meca­nismo en E.coli responsable de tal fenómeno se denominó "Sistema

de Restricción". Ya que ademas los fagos creciendo en KIZ puedenreinfectar a K12con alta eficiencia. es evidente que la bacteriatiene una forma de protejer a su propio DNA. Este sistema deprotección del DNAendógeno se denominó "Sistema de modificación".

Meselson y Yuan incubaron DNAde Lamnda (que había sido crecido

en Klz) con extractos de la cepa C, y observaron que el DNAeradegradado a fragmentos discretos más pequeños. Esto hizo pensarque las nucleasas involucradas en esta degradación hidrolizabanel DNAen un pequeno número de sitios. es decir poseían sitiosespecificos de corte.

La primera enzima de restrición con sitio especifico de corteaislada y caracterizada fue la de Haemophilusinfluenzae.“9Dicha enzima genera hidrólisis en una secuencia como la que sigue:

5'....GprPylpPupApC....3'3‘....CpApPupPyprG....5'

T

en la cual la hidrólisis se produce en los puentes fosfodiesterindicados con flechas. Dejando el fosfato en el extremo S yun grupo OH libre en el 3'.

Actualmente existe una lista de más de 300 enzimas, las cualesposeen propiedades de reconocimiento si corte diferente. Muchas

de las cuales son provistas comercialmente.

Puedendistinguirse tres tipos de enzimas de restricción:

-Tipo l: no cortan el DNAen secuencias especificas, poresto es que no se las ha usado en Ingenieria Genetica. Estasendonucleasas son complejos multi-enzimáticos de alto pesomolecular que son portadores de varias actividades nucleolitica,metilante y ATPásica.

-Tipo ll: Son enzimas que clivan el DNAen sitios especificos,no hidrolizan ATPni metilan. Las mismas son las utilizadas enlos experimentos de DNArecombinante.

-Tipo lll:esta clase de endonucleasas clivan el DNAen sitiosespecificos y posee actividad ATPasica.

En adelante se tratara solamente el caso de las enzimas detipo II.

II.3.1.1 Sitios de reconocimento

La mayoria de las enzimas de restricción reconocen una secuenciacompuesta por un tetra o hexanucleótido. En un DNAal azar (conte­niendo 50% de pares_ A-T ) un tetranucleótido particular puedeencontrarse en promedio cada 256 pares de bases, mientras quepara una hexanucleotido esa ocurrencia es de 4096 pares de bases.

Otra interesante caracteristica de las enzimas de restricciónes la posición de las uniones que son hidrolizadas. Algunasenzimas cortan el DNAde tal forma que no "sobresalen" basesdel extremo (extremo "romo" o "bluntwend"). Es el caso por ejemplode Hae lll:

5'....GpG pCpC....3'GpG....5'3'....CpCp

T

sin embargo una gran proporción de endonucleasas de tipo IIcortan el DNAde forma tal que producen un extremo con una colade simple cadena (usualmente 2 a A nucleótidOS). El productode la digestión con EcoRl genera extremos de este tipo (pegajososo "Sticky ends")

5'....G pApAprTpC....3'3'....CprTpApAp G....5

Dependiendo de la enzima las colas simple cadena pueden esta]ubicadas en el extremo 3' o 5‘ de los fragmentos de DNA.caracteristica importante en ciertos procedimientos de marcadode DNA(111.9.2.)

Como consecuencia de esto. EcoR1 produce sitios que puedenaparearce (base a base) con cualquier otro extremo generado porECOR](ver mas adelante).

[1.3.1.2 Mapasde restricción

Las enzimas de restricción han sido muy usadas para obtenermapas fisicos del DNAde plasmidos bacteriofagos y virus. Conel fin de comparar diferentes cepas de los mismos asi como parala generación de fragmentos cortos a utilizar en sistemas desecuenciación (ver mas adelante).

Uno de los métodos mas sencillos para "mapear" un determinadoDNAes el de marcar un extremo del fragmento con 32P y luegodigerirlo parcialmente con la enzima deseada. Es entonces posibleseparar los distintos fragmentos obtenmidos por electroforesisen soportes de geles de agarosa o poliacrilamida y de la simpleevaluación del tamaño de los fragmentos es posible deducir elmapade restricción.159

11.3.2 Ruptura mecanica del DNA:Además de la digestión con enzimas de restricción para

producir fragmentos discretos .existe una variedad de tratamientosque producen una ruptura no especifica. Las endonucleasas noespecificas (EthNasa l) y degradación química tambien puedenutilizarse, pero el ¡netodo más aplicado es la rupturamecanica.Dado que las finas hebras de DNAson suficientementefragiles como para ser clivadas simplemente por agitación ensolución, el tratamiento con ultrasonido puede reducir la longituddel DNAa 300 nucleotidos. Las cadenas se rompen esencialmenteal azar respecto a la sequencia de DNA. produciendo en losextremos un corto tracto de simple cadena lo cual debe ser Iomadoen cuenta en los subsiguientes pasos de clonado.

11.4 M TOD_S DE ENSAMBLADO DE_Qfi¿g

ïl.¿.1 Extremos cohesivos

Ciertas enzimas de restricción como se dijo, producen cortes"escalonados" en el DNAde doble cadena, debido a la generacion

extremos de simple cadena.160—161 Estos pueden ser ensambladoscon DNAde otra fuente en virtud de la complementariedad de susextremos. pero dado que esta unión es no-covalente,se debeproceder a la ligadura covalente para obtener moleculas de DNArecombinantes estables.151'152

El fago T4 y gággli producen una enzima,denominada DNALigasa,ligar moleculas de DNAcuando sus extremos 3'OH

nteque es capaz dey 5'P están adjace s. Ademas, con las mismas caracteristicas.

E.gp 1 puede sellai "nicks" en una sola de lasla enzima decadenas del DNAbicatenario. Como es obvio esta reacción esfundamental en los experimentos de DNArecombinante.

Luego de ser "linealizado" con una endonucleasa de restricción

“40..

el DNAde un vehiculo de clonado pueden recircularizarse en simismo sin incorporar DNA exógeno. Como resultado de esto unaproporción alta de los clones obtenidos no portan insertos ensus plasmidos. El único metodo I para prevenir estarecircularización es el de remover los grupos fosfato en los

qextremos 5 de 'las moleculas restringidas, por incubación conFosfatasa alcalina (ver IV.3.1).153

11.4.2 Colas de homopolimeros:

La enzima deoxinucleotidil tranferasa terminal (TdT) se empleapara agregar una extencion de homopolimero (ej.,polladenilar)a cada extremo 3’ del DNAvector. y una extencion complementariaa cada extremo 3‘ del DNA pasajero (Ej: homopolimero de

deoxitimidina).154 Utilizando esta tecnica, el vector y el insertopueden unirse debido a la complementariedad de sus extremos(esquema11.4.2), y no es necesario ligarlos covalentemente antesde la transformacion, ya que la molécula híbrida essuficientemente estable y la reparación del DNAse realiza dentrode la bacteria . Esto hace que dichan reparación sea mucho mas

. . 2 , 2eficiente que la que puede realizarse "in v1tro'.1 6 1 7

CG

III-IIIII’D (a? E8ENSAMBLADO CG

CCCC

CKDOCï

Esguema 11.4.2 Ensamblado de moleculas portando colas dehomopolimeros en los extremos 3'.

-41­

11.4.3 Ligado de extremos romos("blunt-end"):

La DNAligasa «un fago Ti tiene ademas la capacidad de unirmoléculas de DNA de extremos romos (blunt-end). Para estaactividad, el Km aparente de la enzima es de alrededor de 50un de extremos 5‘P. lo cual corresponde ¿a 80 mg de DNA por mlde solución (considerando moléculas de DNAde 5000 pares de basesde largo).155 Una solucion de estas caracteristicas es imposiblede manipular dado su extremada viscosidad. La solucion al problemaes entonces uitilizar una alta concentracion de DNAligasa paraobtener velocidades de reacción razonables a concentracionesde DNAtales como 100-300 ug/ml.15b

11 5 ¿NTRo UCCION DEL DNA RECOMBINANTE EN EL HUESPED DE

CLONAQQ

En 1a gran mayoria de los trabajos utilizando tecnicas de DNA

recombinante se utiliza, como huesped, mutantes E.coli Klz lascuales no pueden restringir DNAexogeno.144

La mayoría de las bacterias no poseen la capacidad de incorpararDNA del medio (competencia "natural"). sin embargo se handescripto dos -procedimientos para conferirles esta propiedad.Se ha demostrado transformacion de E.coli K12 con DNA"desnudo"del fago lamnda o DNAplasmídico, cuando las celulas son sometidas

. ‘, 5a un tratamiento con CaClÓ.15' 1 8

El fenomeno de transformación no es bien comprendido

actualmente. pero se especula que el tratamiento con CaCl2generaría modificaciones de tipo estructural en la membranacelular. permiabilizandola para la entrada de macromoleculas.

si bien la eficiencia de transformación con este método esrelativamente baja <10’-106 transformantes /ug de DNAplasmidico)recientemente se ha publicado un procedimiento con el cual se

-42­

raumenta sensiblemente la eficiencia139 (del orden de108transf0rmantes/ug de DNA). Por otro lado, si se trabaja conesferoplastos y estos son tratados con CaH se pueden adquiriruna eficiencia de transformación sensiblemente más elevada<5>109).El problema es que los esferoplastos no son viables por lo queno puede usarse este metodo para la transformación con plasmidos.

La mayor desventaja de la transformacion con CaCl2 es que estemétodo no es general para todos los microrganismos.

[1.6 SELECCIQN DE LUS RECOMBINANTES

La tarea de selección del clon recombinante deseado dependede la estrategia de clonado seguida. Podria nombrarse tres tiposde metodos de seleccion

i)Metodos genéticosii)Metodos de hibridización de acidos nucleicos.iii)Metodos inmunoquimicos.

11.6.1 Metodos Genéticos:

ll.6.1.1 Selección de la presencia del vector:

Cuandose combina con tecnicas microbiológicas, la selecciongenética es un arma muy simple y poderosa ya que puede aplicarsea una población muy grande.

Todos los vectores portan una cracteristica genetica seleciona­ble. Los vectores plasmídicos llevan genes de resistencia aantibloticos o algún marcador nutricional. y en el caso de losfagos vectores. la formación de placas de lisis es en si mismauna propiedad selecionable. Esta seleción de la presencia delvector constituye el primer paso en la obtención del clonrecombinante buscado.

-¿3_

II.6.1.2 Selección de la secuencia insertada:

Si la secuencia insertada porta un gen que es expresado. estasecuencia puede ser identificada por simple complementación deuna bacteria auxotrófica para la función buscada. De hecho lamayoria de los genes clonados de E.coli han sido identificadospor selección genética. Cuando la fuente de DNA exogeno esheteróloga la identificacion no es tan directa dado que el aparatobiosintetico bacteriano puede ser incapaz de transcribir y/otraducir‘ a partir de dicho DNA. Sin embargo se ha visto queciertos genes eucarioticos son expresados en E.coli y puedencomplementar mutaciones auxotróficas en huespedesbacterianos.160'161

11.6.2 Méto_gs por hibridación de acidos nucleicos

varios métodos de detección de clones recombinantes hanutilizado hibridación DNA-DNAo DNA-RNA.sin embargo, el metododescripto por Grustein a Hogness ha sido el mas versatil y elmas utilizado.162. Este método permitr detectar una secuenciade DNAdeterminada mediante hibridación "in situ" con una sonda("probe") de DNA o RNA radioactiva. Este proceso permitedeterminar rapidamente que colonia porta la secuencia de DNAbuscada. El metodo se basa en adsorber las colonias de bacterias,crecidas en una placa de Petri. a un soporte solido (filtrosde nitrocelulosa.papel de filtro,etc.), la placa de petri seguarda como placa maestra ("master plate"). mientras que lascolonias adsorbidas al filtro guardan la mismaposición relativaque en la placa y pueden ser sometidas a todo tipo de tratamiento,incluidos la ruptura célular' y desnaturalizacion del DNAy launión irreversible de este último al soporte solido. Es entoncesposible realizar una hibridación "in situ" utilizando una sondao "probe" especifico.

Modificaciones a este proceso han hecho posible realizar este

-44...

. . . 163-165 _ rtipo de detecc10nes en placas de 11515 de fagos. Estamodificaciones permiten incluso realizar varias "copias" de la¡nisma placa de Petri. con lo cual se pueden hacer simultaneasutilizando varios "probes".

La gran ventaja del metodo de hibridación es su generalidad,no requiere expresion de la secuencia insertada y puede serapllicada a cualquier secuencia mientras que se cuente con lasonda adecuada.

11.6.3 Métodos inmunológicos

Unode los posibles metodos de selección de clones recombinantesha sido la detección inmunológica de los productos traducidosa partir del gen clonado. La seleccion inmunológica ofrece unaalternativa cuando no es posible usar tecnicas que dependen dehibridación de acidos nucleicos o selección genética.

Los primeros procedimientos empleados fueron inmunoensayos"in situ".166’167 Los fagos recombinantes o E.coli portando losplasmidos chimaera se los hace crecer en placas de agarconteniendo anticuerpos producidos contra la proteína codificadaen el gen deseado. Los fagos o las bacterias recombinantesexpresan los determinantes antígenicos v se produce unainmunoprecipitación alrededor del clon buscado.

Recientemente se han desarrollado otros procedimientos; losmismos utilizan anticuerpos contra la proteina buscada v seefectua una reacción del tipo radioinmunoensayo "in situ".valiendose de ¡ni segundo anticuerpo marcado radiactiva o

. . 168-170 .enZJmatlcamente. Estos metodos son muy senSJbles puestoque utilizando B-galactosidasa como modelo de antígeno ha podidodetectarse cantidades tan bajas como10-20 moleculas por celula.

-45­11.7 CARACTERIZACION DE LOS RECOMBINANTES

Una vez que ha sido aislado el recombinante que porta lasecuencia de DNA buscada es necesario llevar a cabo unacaracterización bioquímica de esta. Esto puede ser simplementela confirmacion que la secuencia clonada es la deseada. o puedeextenderse a una caracterización completa.

Se han desarrollado gran número de tecnicas en función derealizar la caracterización bioquímica del DNA recombinante.A continuación se comentaran brevemente aquellas que por suutilidad resultan las más importantes.

11.7.1 Extracción y purificación del DNArecombinante

varios metodos han sido descriptos para la extracción de DNAplasmldico, en general todos se basan en que los plasmidos poseenuna estructura compacta, debidO'a su "super-enrollamiento", quese mantiene incluso luego de la extración. Esta característicapermite separar el DNAdel plasmldo del DNAcromosómico. Se puedenmencionar como los metodos de extracción mas usados:

i)Lisado clarificado.171ii)Desnaturalización por calentamiento.172iii)Lisis alcalina.173

Si bien estos procedimientos producen DNAsuficientemente puropara la mayoria de los cometidos. se requiere para ciertospropósitos un paso de purificación ulterior. El procedimientogeneralmente seguido con tal objeto es la ultracentrifugacnonen gradiente de CsClz-Bromurode etidio.174

La purificación del DNArecombinante cuando se ha usado elfago lamnda como vector fundamentalmente se basa en infectarE.coli a baja multiplicidad o bien inducir una bacteria lisógena

-bó­

con el fago recombinante. Estos procedimientos producen grandescantidades de virus y una posterior purificacidn en gradientede CsCl9 y extraccion fenólica termina por producir DNAviraldu alta pureza.1'5

[1.7.2 glectroforesis en gel (agarosa y poliacrilamida)

Los primeros experimentos de corte y unión de moléculas deDNA fueron monitoreados por velocidad de Sedimentacion engradientes de sacarosa. Sin embargo esta tecnica tiene dosdesventajas. Primero, las Inoleculas de DNAdeben ser ¡narcadasradioactivamente y su posición determinada por fraccionamientodel gradiente y medic10n de la radioactividad. Segundo. lasmoleculas de DNAde tamaño parecido no pueden ser resueltas.Ambosproblemas fueron superados por el empleo de electroforesisen geles de agarosa o poliacrilamida.

Ya en 1966 se habia utilizado la electroforesis en gel deagarosa para separar diferentes configuraciones moleculares delDNA viral de polioma.176_177 Pero fue en años subsiguientescuando se demostró que la electroforesis en gel puede ser usadapara separar fragmentos de DNAde diferente tamaño.173 Mas aundado que la velocidad de migracion de las moleculas esinversamente proporcional a su peso molecular. es posibledeterminar el tamaño de una determinada molécula cuando lasmovilidades se comparan con patrones moleculares adecuados.

Otra de las ventajas es que el DNAno requiere ser radio-marcadoya que los geles pueden ser tenidos con una tintura intercalantecomo el bromuro de etidio 3' pueden ser detectadas cantidadestan pequeñas como 0.05 ug de DNA. simplemente por irradiacióncon luz ultravioleta.

El tipo de gel utilizado depende del tamaño de las nmléculasa separar. entre 1 y 20 kpb se utiliza agarosa. mientras quepara tamaños menores (20-1000 bp) se emplean geles de

poliacrilamida. En estos últimos es posible incluso separar lasdos hebras de un DNAbicatenario.

Combinandola electrofóresis en gel con digestiones con enzimasde restricción es posible entonces lograr la primeracaracterización fisica del DNArecombinante. de esta manera selogra obtener un "mapa de restricción“ que suele ser sumamenteutil en posteriores manipulaciones.

Frecuentemente es necesario determinar a que banda correspondeuna determinada secuencia, para esto ha sido desarrollado unmetodo que permite transferir el DNA, una vez separado porelectroforesis, a un soporte determinado(filtros de nitrocelulosao algunas membranas de nylon) donde puede ser sometido ahibridación "in situ", utilizando una sonda especifica. Estatecnica denominada "Southern blot" en homenaje a su descubridor.es sumamente util en el proceso de caracterización del DNArecombinante.179

11.7.3 Secuenciación de DNA

La caracterización mas fina que se puede realizar sobre unfragmento de DNAes obtener la secuencia primaria nucleotidos.Varios métodos de secuenciación han sido descriptos, peroactualmente se utilizan fundamentalmentedos

iiTerminadores de cadena.180ii)Degradación química parcial.181

Ambos metodos se basan en la pOSibilidad de generar unapoblación de oligonucleótidos que empiezan todos en ¡ni extremofijo pero que terminan especificamente en un-Lipo de nucleótidoen posicion variable. si esta población es separada porelectroforesis la sequencia puede ser deducida de la "lectura"del electroforetograma.

_[‘8_

El metodo de terminadores de cadena desarrollado por F.Sangercolaboradores se distinge porque los oligonucleótidos son

producidos a partir' de la extensión de un "primer" especifico(extremo fijó). utilizando la enzima DNApolimerasa l de E.coli("Klenow"). La terminacion específica se debe a que las mezclasde incubación se suplementan con un análogo de cada una de lasbases (los 2'.3' dideoxinucleótidos), los cuales pueden serincorporado pero al carecer de OH en posición 3' determinan quela cadena que incorporó un análogo detenga su polimeración. Desdeluego cada una de las mezclas portan un análogo determinado (ej;ddATP). por lo tanto las cadenas polimerizadas con estedideoxinucleótido terminara en los distintos puntos de la cadenadonde deba incorporarse una dA. El analisis por electroforesisde la mezcla de oligonucleótidos en cada reacción permitevisualizar una "escalera" que "saltara" de carril en carrildependiendo que analogo se haya incorporado último.

Por otro lado el metodo de Maxamy Gilbert parte de una bandaúnica marcada radioactivamente en INK)de sus extremos (extremofijo). E1 fragmento de DNAes entonces sometido a una serie dereacciones químicas que lo degradan parcialmente en lugaresespecíficos. Finalmente una separación electroforetica análogaa la utilizada ¡mi el metodo de terminadores de cadena completala tecnica

La utilizacion de uno y otro método casi depende de una eleccionpersonal o bien de la experiencia del laboratorio. sin embargoexisten determinados objetivos para los cuales es aconsejableutilizar uno de ellos en particular. Por ejemplo: determinaciónde ha ubicación 3' orientación de In) fragmento (k: CDNAconvieneutilizar Maxamy Gilbert; la obtención de la secuencia completade un gen ó genoma viral de alrededor de 7000 nucleótidos o mases recomendable usar el método descripto por Sanger.

-49­

11.8 INGENIERIA GENETICA "IN VIVO"

Aparentemente resulta un contra sentido hablar de IngenieriaGenética in vivo" ya que por definición la Ingenieria Geneticaes una serie de técnicas que permiten “in vitro" construir repli­cones "Chlmaera" o recombinantes. Sin embargo recientemente seha apelado a la posibilidad de construir esos mismos recombinantespero en este caso "in vivo". Ciertamente la construcción es menoscontrolada pero tambien la eficiencia con que se obtienen losrecombinantes es muy alta permitiendo de este modo generarchimaeras que dificilmente pudiesen ser obtenidos de otra forma.El empleo de esta tecnica, por otro lado, resulta mucho maseconómico que la (ha construcciones "in vitro". El objetivo delclonado "in vivo" fue originalmente la fusion de genes.Efectivamente. un metodo general para la construcción de fusionesgénicas requiere que la translocación del gen a fusionar seageneralizado. y no limitada a ciertos "loci". Esta falta de unsitio especifico es una caracteristica de los elementos genéticos

182’183 Casadaban"transponibles", tal como el bacteriofago Mu.y Cohen explotaron esta propiedad de Mu y construyeron un fagodefectivo. con capacidad de levar a cabo una trasducciónespecializada y la translocación del gen en cuestión se realizaa virtualmente cualquier sitio de- un dado replicón (cromosomabacteriano. plásmido. etc).

Mu y sus derivados se insertan mas o menos al azar en undeterminado replicón (plásmido, cromosoma.etc). Sin embargo,con respecto al DNAde Mu. el evento de inserción es especifico.Comoen otros transposones, este fago puede insertarse en unade dos orientaciones opuestas; la continiudad fisica del DNAde Mu nunca es alterada por transposición. La inserción de Muinterrumpe al gen "target" aboliendo su función, de aqui sudenominación de Mu, por "mutador".

Si el "gen exógeno portado por Mu no posee señales detranscripción la expresión de este gen dependerá de la habilidad

-50­

de Mude insertarse detrás de señales de transcripción que puedanactuar "activando" el gen translocado. En este caso se puedeestudiar la regulación de ciertos genes que [KH'el seguimientode su producto se convierte en una tarea muydificil o imposible,sin embargo con un gen facilmente "seguible" (como los genesdel operón Lac) fusionado a las señales regulatorias del genen estudio, es posible realizar simples observaciones de laregulación que de otro modoseria imposible.184

Los vectores de Mu que se usan normalmente en este tipo deexperimentos son derivados en los cuales una gran porción delmismo ha sido delecionado (ver Fig.v.5.2). estos vectoresconstruidos "in Vitro" suelen denominarse iniuiMu y en generalposeen ademas del gen a "activar". genes de resistencia a

, _antibioticos para su mejor seguimientolsq'ISD

-5]­

IIl MATERIALES Y METODO;

111.1 OBTENCL N DEL RNA VIRAL

¡11.1.1 Células v Medios de Cultivo

La linea celular BHK21 clon 13 fue obtenida del CentroPanamericano de Zoonosis (CEPANZO).Para su crecimiento se utilizomedio esencial minimo de Eagle (MEM-G) 186suplementado con 10%de suero fetal bovino (SFB) y gentaminicina (¿D ug/mli.

Tambien fue utilizado un subcultivo terciario de riñon fetalbovino (RFB), desarrollado en los laboratorios de Cultivo deTejido del Departamento de Virología de CICV-INTA(Castelar).El medio de cultivo utilizado fue MEM-Gsuplementado con 10%de SFB y 10%de Caldo Triptosa Fosfato.

111.1.2 Virus

Se trabajo fundamentalmente con la cepa viral 01 Campos,proveniente del Centro Panamericano de Fiebre Aftosa. Dicha cepafue cultivada. una vez, En el subcultivo de RFB y dos veces encélulas BHK-Zlclon 13, siendo el producto del segundo cultivoen BHKel inóculo utilizado para la posterior producción viral.

Los virus no fueron clonados. ya que como se explicó en laintroducción. debido al alto grado de variabilidad de estos virus,el clonado viral carece de sentido.

111.1.3 Producción viral

Para la producción de una gran cantidad de masa viral, seutilizaron celulas HHH-21clon 13 crecidas en Inonocapa de 0,8

108 celulas por botella del tipo "Roller". El medio de cultivofue ‘31descripto previamente.

-53­

Cuando las monocapas llegan a confluencia (48-72hs.\ se laslavo con PBS (buffer fosfato salino) pH=7.á, se agregó MEM-Gcon A0 ug/ml de gentamicina y 25 mMde buffei Hepes pH=7.4. Lainfección se realizo a una multiplicidad alta (1 a 10) y se dejóadsorber a 37“C durante 45 min.. Luego de lavar e! inócuh: seagregii a cada Roller el medio de crecimiento celular e incuboa 37°C por 8 a lo horas hasta observar un efecto citopatico total.Entonces se cosechó el sobrenadante, que centrífuga a 1000‘9.El sobrenadante de esta centrifugación se guardó a -70°C.

111.1.4 Purificación viral

El sobrenadante se descongeló rapidamente y se centrifugó a15.000 rpm en rotor Beckman60 Ti. 12 min. a A°C para clarificarloy el sobrenadante de esta ultima centrifugacion se sometióulteriormente a una ultracentrifugación (rotor Sóli. 35.000 rpmdurante 2,5 horas a 4°C). para precipitar el xirus.

El precipitado fue resuspendido en buffer NET «120mm NaCl.50 mMTris.Cl pH=7.6, 1mm EDTA) y luego de adicionar sarhosylNL97 hasta una concentración del 1% final (agregado en friodurante 5 Inin) y se sembró en gradientes continuos de 5-30 %(p/V) de sacarosa en buffer NET (pH=7.6). Estos gradientes selos centrifugó en el rotor Beckman sw ¿o durante 75 min. a 4"C.Luego Se colectaron fracciones y se determinó Ja posición delpico de 1AOSpor absorbancia a 260 nm.

lIl.1.5 Purificación del RNAGenómico

El pico viral así obtenido se diluyó al medio con buffer NET,o\°se agregó SDS hasta el 1 y se extrajo dos veces con

fenol"neutralizado" (ver 111.2.1) la extracción se realizó a60°C. A la fase acuosa se le agregó NaCJ a una concentraciónfinal de 0,15-0 20 M 3: se precipitó con 2 volumenes de etanol(a "20°C toda la noche). Luego se centxifugó a 10000 rpm en rotorSorvall durante l hora a h°C se resuspendió el RNAen buffer

-51‘­

NET con 0,02 % de SDS. Ulteriormente se sembró en gradientediscontinuo de 15-30 % (P/V) de sacarosa en buffer NET (pH=7,6)con 0.02 e de SDS. Luego de centrifugar a 20000 rpm durante 20horas a 22°C en rotor Beckman sw 40, se colectaron fracionesen las cuales se determinó el pico de RNApor absorbancia a 260nm. obteniendose de este modo e] pico correspondiente a 37s.Por último el pico de RNAse diluyó al medio y se precipitó condos volumenes de etanol en presencia de 0,15-0,2 Mde NaCl.

En algunos casos (ver resultados), este paso de purificaciónFue omitido. Luego de las extracciones fenólicas se realizaron

dos extraciones con eter saturado en H20y se precipitó con etanoly Nac}.

Nota: Todo el material utilizado durante la extracción ypurificación del RNAdebe ser libre de RNasas. Para ello elmaterial de vidrio fue tratado a 200°C durante 90 min. y elmaterial de plastico utilizado fue autoclavado a 1.5 atm. durante45 min. Ademáse] material de vidrio (tubos,lana de vidrio,etc.)fue siliconado. dado que los ácidos nucleicos de simple cadenase adsorben facilmente al vidrio.

111.2 IEQELQAS GENERALES

Existen ciertas técnicas de uso general que por su importanciaen todos los experimentos de DNArecombinante conviene detallar

[11.2.1 Extracción fenólica

Este procedimiento se utilza fundamentalmente paradesproteinizar una muestra de DNA. Por sus característicashidrofllicas el DNApermanece en la fase acuosa mientras quelas proteinas se concentran en la interfase. Esta técnica tiene

gran importancia para la inactivación de enzimas, particularmentecuando en los sucesivos pasos de un experimento deben usarseenzimas que por su actividad se contraponen (ej: alguna enzimade restricción y la DNAligasa); o bien para purificar los ácidosnucleicos.

Erotocolo:

-Agregar un volumen de Fenol-ClacH. Agitar vigorosamentecon "vortex" unos 30 seg.

"Centrifugar en microcentrifuga 3 min.-Tomar la fase acuosa y pasarla a otro tubo. procurando no

tamar el material precipitado en la interfase (generalmente lasLmoteinas de la interfase no son visibles tener cuidado de notocar la interfase).

-Agregar a la fase acuosa extraída 1 ml de eter saturado

en Hzo. Agitar vigorosamente y esperar que se separen las fases.Tomarla fase orgánica (superior) y descartarla. Repetir el proce­dimiento dos veces más.

Nota: muchas veces es necesario repetir dos o mas veces la

extracción con fenol-C130H por el alto contenido de proteínasde la muestra. Tambienpor las caracteristicas de las proteinaspresentes puede hacerse necesario una extracción previa con fenolsolamente.

fenol: Fenol destilado (este punto es importante para purifi­car de quinonas que pueden estar presente y que inhiben fuerte­mente a la nmyoria de las enzimas de utilizadas en clonado obien pueden dañar al DNA).Equilibrar secuencialmente dos vecescon IN Tris-ClH (pH=8,0) y tres veces con 0,1M Tris-CIH (pH=8,0).Retirar bien los restos de 'Tris que pudieran quedar alicuotary guardar a -20°C.

l Ci: cloroformo - alcohol isoamilico (24:1)

-56­

Eggol-Clagfi: mezclar un volumen de fenol preparado comodescripto antes, con un volumen de GlacH-isoamilico, agitarvigorosamente y! centrifugar :3 2000 11mla temperatura ambiente.Separar la fase superior que se forma (agua desplazada por elcloroformo>. Alicuotar y guardar a -20“C, la alícuota en usopuede ser conservada a á°C durante un mes.

¡11.2.2 Precipitación con EtOH-NaAco

Todos los protocolos implican la utilización de variasprecipitaciones con EtOH—NaAcOya que esto permite cambiar elbuffer que se está utilizando por otro. Tambien se utiliza comoforma de purificar las muestras de ciertos contaminantes queno precipitan con EtOH.

Protocolo:

-Agregar a la muestra 1/10 del volumen de NaAcO (pH: 5.2)y dos volumenes de etanol (EtOH).

-Poner 15 min. a -70°C y centrifugar 10 min. en microcen­trifuga.

-Descartar sobrenadante 3' agregar l ml de EtOH 70% paralavar las sales de las paredes y el fondo del tubo.

«Recentrifugar y sacar absolutamente todo las gotas deEtOHque pudieran quedar (si es necesario centrifugar unos segun­dos y volver a tomar con una pipeta pasteur de punta afinada)

-Resuspender el DNAen un volumen adecuado de Hoo.

Nota 1: Es de destacar que no es necesario secar el precipitadobajo vacío ya que la contidad de EtOH no impide una buena resus­pención y tampocointerfieren las subsiguientes reacciones

Nota 2: En nuestras manos concentraciones menores a 100 ngnmde DNApueden presentar problemas. como no precipitar hien opresentar dificultades en la resuspención.

111.3 TECNICAS MICROBIOLOGICAS

111.3.1 Cepas bacterianas

En la siguiente lista se incluyen las cepas de E.coli utilizadadurante el trabajo; las cepas que especificamenLe se utilizaronen las técnicas de miniMu-duccion se detallan mas adelante(111.15.1).

HBIOLF. hsd szn (rb'.mb'). supEáá. ara-12.. galK-Z. lacsY]. proAZ. rpsL 20 (strr). xyl-S. mtl—1, Lamnda . recAlS.9

DuizF-. endAl, hstl? (r _.m _), supEaá, (hi-1, Lamnda'k k.recAl. gyrA96. relA1?.

MCIOGlzaraDIBQ.delta<ara. leu> 7697, delta lac x74, galU", gaIK-. hsr_, hsm+, StrA.100

III.3.2 medios de cultivo bacteriano

En general se utilizo siempre el medio LB tanto liquido comosolido:

Medio LB (liquido)triptona 10 grextracto de levadura 5 grcloruro de sodio 10 grHooc.s.p. 1 litroagustar el pH a 7,2 con OHNa.Autoclavar 20 min. a 1,5 atm.

En el caso de medio solido basicamente es lo mismo pero seagrega 2% final de agar.

-58­

El "soft" agar es tambien lo mismo que el LB liquido con elagregado de 0,74 final de agar.

¡[1.3.3 Antibióticos

-Ampici1ina: Solución stock: 100 mg/ml en HOO. Esterilizadapor filtración y guardada a ¿“C se conserva por un mes y medio.Concentración de trabajo 50 a 100 ugr/ml.

"Cloranfenicol: Solucion stock: 40 mgíml en 1002 EtOH. Guardara —20°Cse conserva por 6 meses.Concentración de trabajo 30 ug/ml.

—Estreptomicina; Solución stock: 20 Ing/ml en HÓO. Puede serguardada a a°c por 2-3 meses. Concentracibn de trabajo 25 ng ml.

-Tetraciclina:Soluci0n stock: 12,5 mg/ml de hidroclururo de

tetrciclina en EtOH/HZO(50% v/v). Guardar a -20“C. La tetraciclina es sensible a la luz por lo tanto debe guardarse en frascooscuro. Concentración de trabajo 15 ug/ml.

Nota: los medios de cultivo conteniendo antibióticos puedenguardarse a 4°C por 15 a 20 días, salvo en e] caso de latetraciclina la cual es mas sensible y por ello no es convenientealmacenar medios conteniendo este antibiótico.

111.4 IgéysrogmACIQn

III.1 fregargngn de_;elulas competentcspara tiansformnciOn

ComoSe explico en la introducción las celulas de gággLi nnincorporan DNAdel medio salvo que sean tratadas con CaClÓ. Muchosson ios protocolos que han sido desarrollados para hacercompetentes bacterias, aqui se describira solamente aquel que

-59­

en nuestras manosdio mejor resultado.

Dichos resultados fueron obtenidos para las cepas Hbiol, MC1061para DH], sin embargo en la mayoria de los experimentos se

utilizo MC1061(ver lV.1).

_¿otocolQ

«Inocular 5 m1 de medio de cultivo LB liquido con una coloniaaislada de Mc1061. Incubar toda la noche a 37°C.

-Inocular con el cultivo anterior 100 ml de LB contenidosen un Erlermeyer de 500 ml. Crecer con agitación (la buena

aeraciOn es fundamental) a 37°C hasta alcanzar una D0550=0.5(las celulas deben estar en el mejor estado posible por elloque es importante que el -cultivo se encuentre en etapalogaritmica, ver IV.1.2).

"Cosechar las bacterias por centrifugación. 5 min. a 10000rpm y a°C.

Nota: a partir de este momentoes importante que las celulasno esten a temperaturas mayores de 4°C.

—Resuspender el precipitado en AO ml de 'be l frio. Dejar5 min. en hielo. Centrifugar 5 min. a 10000 rpm y 4°C.

—Resuspender-el precipitado en .4 nu de Tft) II frio. Dejaren hielo S min.. Alicuotar de a 200 ul en tubos Eppendorf. Coge­

lar inmediatamente por inmersión en N2 liquido. Guardar a -70°C.

Nota: las células competentes mantienen su estado de competen­cia (eficiencia de transformación) por un mes por lo menos.

-60­

be I

BUmM KACO

IOOmM KC]

10m” CaCl2’0 r 13 mM rnClz¡—I5%glicerol

llevar a pH=5.8 con HAco

T_f‘b_u

JOmMPipes

75mM (.aCl2lOmM KC]

15k glicerolllevar a pH=6,5 con KOH

Esterilizar ambassoluciones por filtrado, y guardar a 4°C.

111.4.2 Transformación con plasmidos

—Descongelar un tubo de bacterias sumergiendolo en Hzo porun min (temperatura ambiente). A continuación mantenerlo en hielodurante 10 min..

—Agregar 30 pl de bacterias a un tubo Eppendorf conteniendola solución de DNA.Dejar 30 min en hielo.

«Dar un golpe de calor de 2 min. a 42°C. Enfriar rápidamenteen hielo por 2 min.

—Agregar 1 ml de medio LB (tibio), incubar J hora :3 37°Ccon agitación <’así se permite la recuperación de la tacteriay la expresion de los genes de resistencia).

—Enel plaqueo se utilizaron dos metodologías:

-61 ­

i)"Soft" agar: se agrega a las bacterias transformadasmi de "soft" agar<debe estar a 42°C) y se vuelca sobre la placa.LN

se deja solidificar 20 min. a temperatura ambiente y luego seincuba la placa de petri invertida.( este método rinde medioorden de magnitud más de eficiencia de transformacion pero lascolonias quedan menos accesibles para procesos subsiQUientes«ej. hibridación en coloniaS).

ii)Rastrilleo: se agrega 200 id. de bacterias a una [flacade petri conteniendo el medio 3' se esparse con un rastrillo oespatula de Drigalsky. Debe tenerse cuidado de que todo e! medioagregado se seque bien. sino aparecen cespedes de bacterias puesestas pueden "nadar" por la gota de medio sobrante. Incubar todaia noche a 37°C, en general con 12-14 horas de incubación permitenobtener colonias de tamano adecuado.

Nota: se considera una buena eficiencia de transformacion106-5x106 transformantes/pgr de pBR322.

111.5 PURLFICACION DE DNA PLASMIDIQQ

172111.5.1 Lisis nor calentamiento(método de Holmes)

Este método se basa en una lisis suave de las bacterias seguidapor un rápido colentamiento a ¡00°C. de esta manera una estructurade DNAmás compacta como los plasmidos se mantienen en soluciónmientras que DNA cromosómico se desnaturaliza junto con granparte de las proteinas formando con ia pared y membrana celularuna red insoluble que precipita al centrifugar a baja velocidad.

Portocolo:

-Inocular 5 mi de medio LB liquido conteniendo antibióticos

-63­

adecuados. Incubar toda la noche a 37°C.Centrifugar a 5000 rpm por 10 min.y resuspender en

350 pl de STET, transferir a un tubo Eppendorf.

5151;se Sacarosa5% Triton X-IOOSOmM EDTA

50mMlris-CIH (pH=8)

-Centrifugar 5 min. en microcentrifuga y resuspender en350 ul de STET.«Agregar 25 ul de lisozima (10 mg/ml) e inmediatamente

calentar a IOO’C por 40 seg (evitar que la lisozima actue porpor mucho tiempo, de esta manera se uünimiza la literaCJÓn deDNAcromosómiCO).

—Centrifugar en microcentrifuga por 10 min.. Traspasarel sobrenadante a otro tubo y agregar un volumen de isopropanol.

-Dejar 10 min. a -20°C y centrífugar 10 min.-Lavar el precipitado con EtOH 70% (se debe tener cuidado

en eliminar bien todo el EtOH70%).

—Resuspender el precipitado en 10 ul de Hzo.

El'DNAasí obtenido es susceptible de ser cortado con enzimasde restricción pero un paso ulterior de purificación (extracciónfenólica) asegura una mayor calidad del DNAa ser sometido aestas reaciones. La cantidad de DNAobtenido a partir de 5 mlde cultivo depende del plasmido extraido, para pBR322 es delorden de 3 ugr.

.. . - . . “3111.5.2 LlSlS alcalina(metodo de Birnb01n)]l

El Fundamento de este método es que cuando se desuaturalizauna poblacion de DNAsy se renaturaliza rapidamente aquellasestructuras mas compactas, comoplasmidos superenrrollados. pueden

volver a su forma nativa mientras que el DNAcromosómico formauna red insoluble. Ademas este método contempla H) posibilidadde desproteinizar parcialmente la solución mediante lu formacionde complejos SOS-proteina los cuales precipitan on alta sal.

-lnocular medio liquido LB (10 ml) con el clon que portael plásmido a extraer. incubar toda la noche a 37°C.

—Centrífugar y resuspender en 1 ml de solución l.—Transferir a un tubo Eppendorf y recentrífugar en micro»

centrífuga.

SOmMGlucosa

25mMTris-ClH (pH=8,0)lUmM EDTA

Nota: la solución I puede ser autoclavada (15 min. a 1 atm.)y guardada a 4“C.

—Resuspender en 100 ul de Solución l.-Agregar 200 ul de Solucion lI. mezclar bien y dejan 5 min.

en hielo.

Samu0,2 N OHNa

1% SDS

Nota: esta solución debe ser preparada fresca a paitir desoluciones madres (ION OHNa. loz SDS)

UI-Agregar 150 ul de Solución III y mezclar bien. Incubar10 min. en hielo.

52l22192_ll_"5M" ACOK (pH=4.8)

(60 ml de 5M ACOK 11,5 ml de acido acético glacial

28.5 ml de Hzo)

-64­

Nota: luego de agregar la soluciones Il y III se debe mezclarbien pero no violentamente para evitar la ruptura del DNAcromosomico.

—Centrifugar 5 min en microcentrifuga y transeferir elsobrenadante a otro tubo.

"Extraer una vez con fenol-CIBCH y dos veces con Eter.-Precipitar con dos volumenes de EtOHy NaAco (ver 111.2.2).

-Resuspender en 200 ul de H20 3/ agregar 20 ul de RNasa 1(1 mg/ml). lncubar 30 min. a 37°C.

mAgregar 24 ul de NaAcO <3M. pH=5.2) y 300 ul de EtOH. lncubar10 min. a temperatura ambiente y centrifugar 10 min. ( los tiemposde esta precipitación deben ser respetados estrictamente paraevitar la precipitación de oligonucleótidos de RNA).

—Resuspender en 25 ul de Hzo.

El DNAobtenido por este metodo pude ser usado para la mayoriade los ensayos enzimáticos utilizados en ingenieria genetica.El rendimiento de este metodo es de 5 ugr de plásmido (pBR322>cada 5 ml de cultivo.

Nota: este protocolo puede ser empleado para purificacionesen gran escala (ej: 1 litro de cultivo), transformandoproporcionalmente los volumenes de cada solución.

111.5.3 Purificación gp gradiente de CsCl-BrEt

Se trata de una ultracentrifugación de equilibrio en ungradiente de cloruro de cesio conteniendo bromurode etidio.

Este metodo permite resolver moleculas de DNAcon distintosgrados de superenrrollamiento si se basa en el hecho de que lasestructuras superenrrolladas intercalan menos colorante (y porello conservan una densidad mayor) que las estructuras menossuperenrolladas.

Ademasde la separación explicada anteriormente, este metodopermite tambien eliminar proteínas y RNAya que estos poseenuna densidad muydiferente de por si.

_rot0colo:

La muestra de DNAse obtiene utilizando cualquiera de losmétodos antes descriptos (generalmente se usó lisis alcalina).Es necesario partir de 2 litros de cultivo.

“Resuspender el DNA luego de Ha última precipitación en 7

ml de Hzo.-Agregar 0.5 m1 de BrEt (10 mg/ml) y pesar la solución (esto

debe ser lo mas exacto posible).-Agregar una cantidad igual de CsCl (50% P/P), disolver bien

y transferir a un tubo de ultracentrifuga.-Centrifugar a 45000 rpm por 36 horas a 20°C.-Luego de la centrifugación se visualizan dos bandas bajo

iluminación con luz blanca. la banda inferior corresponde alDNA plásmidico y debe ser extraída teniendo cuidado de nocontaminarla con la otra banda (DNA cromosómico y plasmidorelajadO). Es necesario tener cuidado de no exponer la bandade plásmido a la luz, ya que al contener BrEt el DNAse degrada.

-Extraer el BrEt de la siguiente manera: agregar un volumen

de butanol saturado con Hzo, mezclar bien y dejar que se separenlas fases ( fase superior es la fase organica ), sacar la faseorganica y repetir la operación AM6veces hasta que desaparescael color rosado de la fase acuosa.

"Dializar contra Buffer TE (2 litros) haciendo varios cambios.-Alicuotar la muestra y guardar a -20°C.

-66­

111.6 ELECTROFORESIS EN GEL

El métOÓCJde elección para separar. identificar. y purificarfragmentos (k3 DNAes la electroforesis en gel. El tipo de gelpuede ser agarnsa (entre 0,1% a 2%. p/v), o poliacrilamida (entre4% a 20%. PÍV).

Esta tecnica es simple , rápida y permite resolver mezclasde fragmentos de DNAque no pueden ser resueltos por otros metodostales comocentrifugación en gradientes de sacarosa.

Por otro lado la localizacion del DNAen el gel es directapor tinción con BrEt y observación de la fluoresencia delcolorante intercalado en el DNA(se puede detectar hasta 20 ngrde DNAbajo iluminación con luz de 300 nm). La otra forma dedetección es por exposición a una pelicula autorradiografjca.cuando el DNAesta marcado radioactivamente.

Las caracteristicas de las cubas electroforeticas pueden versedetalladamente en el manual de laboratorio editado por T Maniatisy colaboradoresl75. En general puede decirse que la migracion

de un fragmento de DNAes inversamente proporcnonal al 10910de su peso molecular, 3' es por eSto que este puede calcularsea partir de la corrida electrforetica

111.6.1 Buffers comunmentegsados

Tris-acetato (TAE)

Solucion de trabajo:

0.04MTris-acetato0,001M EDTA

Solución "stock"(50x):

rris base zac grácido acético glacial 57.1 ml0.5” EDTA (pH=8.0) 100 ml

HZOc.s.p. l litro

Igjs-borato (TBE)

Solucion de trabajo:

0.089MTris-borato0.002M EDTA

Solucion "stock" (5*):

Tris base 54 gr.ácido borico 27.5 gr.0.5M EDTA 20 ml.

11H 0 C.S.p. 1 tro2

III.6.2 Geles de Agarosa (nativa)

-Pesar la cantidad de agarosa solida necesaria para obtenerel porcentaje deseado.

Nota: usualmente se utiliza una concentración del 0,7% paramuestras de PMentre 20 kpb y 1 kpb.

-Agregar el volumen exacto de buffer TAEln—Calentara baño maria hasta que toda Ia agarosa este disuelta—Dejar enfriar hasta 55-60°C 5; volcar sobre el suport(‘ del

gel (vidrio. cuba electroforeríca. etc.)

-68­

«Una vez que la agarosa a gelificado. poner el gel en lacuba electroretica y agregar el buffer de corrida (TAE1x)

Sembrar las muestras con el gel sumergido en el buffer.Lasmuestras deben tener 5% de BPB (V/V).

50%glicerol0,25% de Azul de bromofenol5% de SDS

-Conectar la fuente de poder y correr a 5-15 V/cm (la mejorresolución se obtiene a 5 V/cm)

-Dejar que el BPB migre hasta 3/4 partes del gel. entoncesrortar la corriente y sumergir el gel en una solucion conteniendo0.5 ug/mi de Bromuro de Etidio (BrEt), dejar 15 min. y observaren un ransiluminador de luz ultravioleta de 300 nm.

-Los geles se fotografian utilizando una maquina PolaroidMP-áy pelicula de alta sensibilidad Polaroid N°667.

Nota: los fragmentos de DNA lineales pueden ser corridosen geles conteniendo 0.5 ug/ml de BrEt (la temperatura de laagarosa no debe ser mayor a 55°C al agregar el Br.Et.>.

111.6.3 Geles alcalinos de agarqgg

Los geles alcalinos se utilizan para realizar electroforesisdesnaturalizante de DNA.

Protocolo

-Pesar la cantidad de agarosa necesaria para obtener elporcentaje deseado. Agregar el volumen adecuado de 50mm NaCly 1mMEDTAy disolver en baño Maria como antes

-Dejar enfriar a 50°C y volcar sobre el soporte de laelectroforesis. Una vez polimerizado. introducir en la cubaelectroforetica y agregar una buena cantidad de buffer alcalino.

_69_

dejar equilibrar por lo menos 30 min.

Buffer Alcalino30mM OHNa

1mM EDTA

Nota: el OHNa en caliente puede producir hidrolisis depolímero de agarosa, debido a esto se disuelve lar agarosa enNaCl y luego se equilibrar en OHNa-EDTA.

—Lasmuestras que van ha ser analizadas en un gel alcalinodeben ser precipitadas con EtOHy resuspendidas en buffer alcalinode sembrado.

Buffer Alcalino de Sembrado50mm NaOH

lmM EDTA

2,5% Ficoll0.025% verde de bromocresol

-Correr el gel a 7,5 V/cm.

111.6.4 Geles de Poliacrilamida nativos

-El gel se arma entre vidrios y posee un -#pesor de 0.a mm.las dimensiones de los vidrios depende del tip- de gel a correr,en general se utilizaron de dos longitudes de .10 cm u 80 cm delargo.

-Preparar la solución de acrilamida:-"Solucion Stock Acrilamida 30%" lo suficiunte para obtener

el porcentaje deseado.

Solucion Stock Acrilamida 30%Acrilamida 30% (P/V)Bis-acrilamida 1,0%

-70­

Nota: La acrilamida debe guardarse en -frasco oscuro (esestable al menos por un mes y medio a temperatura ambiente).

-TBE 10h 5 ml

—H90 c s.p. 50 ml-Uesgasear con vacio (el oxigeno inhibe la polimerización)

En el momento de armar el gel agregar 50 ul de TEMEDy 300ul de persulfato de amonio 102.

-VO]car dentro de los vidrios ya preparados, colocar el peiney dejar polimerizar (si tarda más de 30 min hay que armarnuevamente e] gel. pues la solucion no va ha polimerizar)

-Armar 1a cuba electroforetica vertical y sembrar la muestrasconteniendo 5% de BPB. Correr a 25 V/cm.

Precaución: no debe excederse los 38 watts pues se correel riesgo que se rompan los vidros.

III.6.5 Geles de separación de cadenas

«El gel debe estar compuesto por:

-52 (P/V) de acrilamida—0,1%N,N' metilen bisacrilamida-50mMTris-borato(pH=8.3>-1mM EDTA

-Luego que el gel esta completamente gelificado (entre 60a 90 min. ya que el bajo porcentaje de "crosslinker retardala gelificación). precorrer en el mismo buffer zi 8 V/cm antesde sembrar el DNA.

111.6 6 geles g__secuencíación

vPara geles de 8%preparar la siguiente solución:

ml de la Solución Stock de Acrilamida 30%.21 gr. de urea

—5 ml de TBE 10x

-H90 c s.p. 50 ml.

—Desgasear y agregar 50 ul de TEMEDy 300 ul de persulfatode amonio 10%.

-Verter dentro de los vidrios ya preparados y dejar gelificar.-Esta electroforesis debe correrse a 1200 Volts y 25 mA(re­

cordar no pasar de 40 watts)

III.7 QJGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION

Cada enzxmade restricción posee ciertas condiciones de reacciónóptimas, información que es suministrada por los laboratorioscomerciales que las venden. Las variables mas importantes sonla temperatura de incubación y la composición del buffer. Sinembargo, se las pueden agrupar en tres grandes grupos condistintos requerimientos en cuanha a la composición del buffer(alta, media, y baja sal), y en general puede decirse que lamayoria de las enzimas funcionan bien ¡a 37°C. Utilizando estascondiciones generales es posible realizar incubaciones simultaneascon dos o mas enzimas lo que representa una ventaja operativa.

Ill.7.1 Reacción enzimática

Una tipica reacción de restricción contiene 0,2 a JJ) ugr deDNAen un volumen de 20 ul

"Agregar a un cierto volumen de solución con DNA, H20 C.S.p.17 ul.

Agregar 2 ul de buffer de reaccion adecuado para la enzima

-72­

con la que se esta trabajando.-Agregar 1 ul de enzima de restricción (5000 Urml) e incubar

a la temperatura adecuada (usualmente 37°C) por una hora o mas‘

Nota: en general incubaciones prolongadas o exceso de enzimano causan problemas a menos que la preparación enzimática poseanucleasas. Frecuentemente las preparaciones rapidas de plasmidos(ver en III.5.1 y 111.5.2) pueden contener DNasas por ello noes recomendable períodos de incubación muy largos para DNApreparados de esta forma.

-Detener la reacción con 2 ul de 0,1M EDTA.Si se desea conti­nuar con otras incubaciones no es necesario este paso.

Buffer NaCl Tris-ClH(7,5) MgClZ DTT

"Baja sal" 0 10 mM 10 mM 1 mM

"Core" o 50 mn 10 mM 10 mM 1 mM

"Media sal"

"Alta sal" 100 mM 50 mM 10 mM 1 mM

Nota: es importante recordar que todas las soluciones utiliza­das en ensayos de restricción deben estar hechas con reactivos

muypuros y H20 bidestilada, y debe autoclavarse si esto es posimble. para su conservación. El material de plastico utilizado(tips o tubos eppendorf) deben ser nuevos sobre todo cuando tomancontacto directo con las soluciones de enzimas de restricción(recordar que estas suelen ser muysensibles a las impurezas).

111.8 LIQáQQ_QE MOLECULASDE DNA "IN ïI1RO"

Se han publicado interesantes y sofisticados estudios Sobreel comportamiento de le: DNAligasale7, sin embargo (Ml nuestrasmanos los mejores resultados se han obtenido luego de determinarempíricamente las condiciones experimentales. A continuacionse comentan las condiciones mas corrientemente usadas. para masdetalle ver "Optimizacion de Tecnica (IV.3.1).

III.8.1 Desfosforilación del vector

Comoya se ha menc10nado en la Introduccion, la recirculariza­clon del vector en Sl mismo es un evento altamente probable.Por ello es (uu? resulta importante desfosforilarlo logrando deesta manera que la gran mayoria de los clones sean recombinantes.

La fosfatasa alcalina tiene la capacidad de remover gruposfosfatos expuestos, y generalmente se usa para desfosforilarel vector de clonado. Pueden ser empleadas dos fosfatasas:Fosfatasa alcalina de bacterias (BAP) y Fosfatasa alcalina deintestino de ternero (CIP), prefiriendose esta última ya que escompletamente inactivada a 68°C en presencia de SDS.

ELQLQQQLQ

-20 ugr de DNAplasmídico resuspendido en 450 ul de Hgo—50 ul de Buffer CIP 10x

Buffer CIP 1g:

0,5M Tris-ClH (pH=9,0)

lOmM MgCl2

ImM ZnCl2lOmHespermidina

-Agregar 1 ul de CIP ( 0.2 unidades)

-Incubar 30 min. a 45°C—Agregar 1 ul mas de CIP e incubar 30 min. a 45°C

-Agregar 400 ul de Hzo y 100 ul de STE 10­

TE_1 n x

lODmMTris-CIH (pH=8,0)1M NaCl

lOmM EDTA

“Incubar 15 mín. a 68°C

—Extraer dos veces con fenol-CIBCH, dos veces con CISCH.tres veces con eter y precipitar con EtOH"NaACO.Lavar con 70%de EtOH.

111.8.2 EggCCión de Ligado

—Agregar en un tubo:

1 ul de Buffer de Ligasa 10x1 pl de 74mM ATP

1 u] DNAvector( ver curva de optimizacion Fig.Iv.3.1)CDNAa ligar (ver Resultados)

H20 c.s.p. 9.5 ul0,5 U. de DNALigasa (esta debe ser concentrada, ej.:1u:ul)

—Incubación si lo que se quiere ligar son fragmentos "hlunt­end". debe incubarse a temperatura ambiente durante 5 horas.Si lo que se liga es "Sticky ends", incubar a 10°C por 5-10 horas.

Nota 1: para la ligación de "Sticky ends" es convenienteusar menor concentración de Ligasa (0,05 U.en 10 ul de mezclade reacción).

Nota 2: attas concentraciones (ha DNAinhiben la reaCCiOn(ver proxima sección y ResultadOS)

Nota 3: la concentración de glicerol en la reaccion nopuede ser mayor del 5* (v/v).

111.9 METODOS DE MARCADO DE DNA

¡11.9.1 :Nick TranslaLLpn"(DNAPolimerasa de g¿gg¿¿>

La DNApolimerasa de Escherichia coli agrega nucleotidos alos extremos 3'OH internos de una molécula de DNAdoble cadenaque posee "nicks". Ademas. esta enzima, en virtud de su actividad5' a 3' exonucleolitica. puede remover los nucléotidos del lado5' da] "nick". La eliminación de los nucleótidos del lado 5'y la adición secuencial de nucleótidos en el lado 3’ generanel movimiento o tras}ado del "nick" ("nick translation") a lolargo de] DNA.188 Incluyendo en la mezcla de reacción uno delos nucleotidos marcado radioactivamente es posible preparar

. . . qDNAmarcado con alta act1v1dad específlca ( 108 cpm/ug). 189’1'0

.Poner en tubo Eppendorf

lpl de DNA(0.5 ugr>5 ul de Buffer de “Nick Translation" 10x (500mMTris.Cl,

pH=7.5

SOmMflgClz).1 ul de dCTP SmM

1 ul de dGTP 5mM

1 u l de dTTP SmM

37 ul de HÓO

3 ul de dATP«3‘? (>2ooo Ci/mmol, 30 uCi)1 nl de mezcla enzimática (DNasa/DNA [mu I. 1000 U/ml de

DNApoll / 0,1 ng/ml de DNasa)

—Laincubación se realiza a 16°C durante 1 hora.-Detener la reación con 2 ul de 0,5M EDTAy 1/10 volumenes

de BPB.

Nota: puede usarse cualquiera de los nucleótídos marcadoen vez o ademas de] dATP (al usar más de un nucleótido marcadose obtiene mayoractividad específica).

Ill.9.2 ¿"paración del DNAde los nucleotidos no incorporados

Para la separación del DNA marcado de los nucleotidos noincorporados se utiliza_cromatografia de filtración en gel.

a. Preparación de la columnaz-Armar una columna de SepharosaCL ¿B de alrededor de 2,5 ml (en una pipeta plastica de 2 ml).La columna se equilibra con Buffer TE pasando un volumen de 5a IÜ ml.

BM10mMTris-CIH pH=8,01 mM EDTA.

Nota: la Sepharosa CL ¿B es el soporte que dio mejoresresultados en cuanto a rapidez si resolución. sin embargo puedeusarse del mismo modo Sephadex G-25 o G-50 y tambien Sephacryl5-300 0 5-400.

b. Cromatografíazse siembra la muestra en la columna. Semonitorea con un contador Geiger. debe observarse la salida dedos picos bien separados. Cuando la radiactividad del primerpico se encuentra cerca del extremo de salida de la columna secomienza a recoger fracciones de aproximadamente 50 u] (4 gotas).

A partir de aqui el monitoreo se realiza en los tubos en quese esta colectando.( ver graficos en Resultados)

¡11.9.3 Rellenado de extremos 3' recesivos ("Fill-in")

El fragmento grande de las DNApolimerasa I de E.coli consistede una cadena polipeptidica simple (PM=76.000) porducida portratamiento proteolitico de la DNApol I intacta con subtilisina.192 El fradmento de Klenow tiene la actividad polimerasa de S'a3', pero ha perdido la actividad exonuclelitica de 5'a 3' Poresto es que si se incuba un DNAcon extremos 5' protruyentesla incorporación de nucleótidos solo se produce en los extremosde los fragmentos.

Reacción:

-Se mezcla en un tubo

0.5 a 1 ugr de DNA cortado con la enzima adecuada(5'"protruding"). En general el volumen del DNAes de 20 ul yaque viene de una reacción de restricción

1 ui de cada uno de los 3 dNTPs<5mM)frios.3 ul del dXTP«¿32? (2500 Ci/mmol. 30uCi).1 ul de Buffer "core" 10x

4.5 ul de H200,5 ul de DNApol. fragmento de Klenow (50 U/ml).

Nota: dependiendodel sitio de restricción a rellenar (fill­- 2in) se utiliza el dXTP 3 P que primero se incorpora y los

restantes frios. Si no se ponen los frios la marcación no esbuena. probablemente debido a cierta actividad exonucleoliticaque cohexistiría con ciertas enzimas de restricción y podriaremover algunos nucleótidos del extremo 3'.

-Incubar 20 min a temperatura ambiente (zo-25°C).

-78­

-Agregar entonces 1 ul de solución 250uMdNTP no marcados.

250gm dNTP

dATP 250uM

dTTP 250m“

dCTP 250mM

dGTP 250mm

—Incubar 10 min a temperatura ambiente.

-La incubación se detiene por agregado de 1/10 de volumende BPB, dado que en general la separación de los fragmentos serealiza en una corrida electroforetica.

lll.9.A Fosforilacion del extremo 5'OHde acidos nucleicos

La enzima TA Polinucleótido quinasa cataliza la transferenciadel fosfato de posición gamma de la molécula de ATP al extremo5'OH de las moleculas de DNAo RNA.191 Por lo tanto si se incubaDNAo RNA, desfosforilado en el extremo 5' terminal. con ATPmarcado con 32P en posición gamma se puede marcar el extremodel polinucleótido.

Para obtener el DNAdesfosforilado se realiza una incubaciónprevia con la enzima fosfatasa alcalina (CIP o BAP), en el casode RNAen general no es necesario debido a que la mayoria delas RNasas cortan el RNAdejando el fosfato en el extremo 3'.

III.9.4.1 Desfosforilación:

-Mezclar en un tubo:DNAlinealizado (10 ugr)50 ul de Buffer CIP 10x

Buffer CIP 10x

10y

10%

COT]

-79­

0,5MTristlH (pH=9,0)IUmH MgCl9

lmM ZnClz­lOmMespermidina

—Agregarcantidad suficiente de H 0 para 500 ul-Agregar 0,02 unidades de CIP k 2% U/ml)-Incubar 30 min. a 45°C-Agregar 0,02 unidades más de enzima y repetir la incubación.

-Parar la reacción agregando 350 p} de Hzo y 100 ul de STE(lOOmM Tris-CIH pH=8,0, 1M Nac}, lOmM EDTA) y 50 ul de SDS

-Se incuba por 15 min a 68°C. Entonces se extrae dos veces

fenol. dos veces con fenol-C13CH y dos veces con C13CH.Finalmente se realiza una precipitación con ECOH-NaACO.

Ill.9.4.2 FosforLlación

-Resuspender el DNAen 14 u] de Hoo-Agregar el ATP'X3¿P (>2.500 Ci/mmol,30 pci)«2 ul de Buffer de PNK 10x

Buffer ENK 10x0.5M Tris-ClH (pH=7.6)

0.1M MgCl2SOmMDitiotreitol<DTT)1mMespermidinamMEmm

(PNK)—Agregar1 ul de polinuceótldo quinasa (20 u.)»1ncubar 30 min. a 37°C.-Agregar 2 ul de EDTApara parar la reacción. Se extrae con

fenol-C13CH y se precipita con EtOH.

Para separar el DNAde los nucleótidos se usa lo descripto

-80­

anteriormente (ver iII.9.2).

[11.9.5 Precipitación con TCA

Para estimar la incorporación de radioactividad en DNAseutilizó el siguiente protocolo de precipitación con ácido tricloroacético:

-Agregar en un tubo de 5m]:

100 u] de HZO10 ugr de RNA"carrier" (10 mg/ml)1 ul de la muestra radioactiva3m] de TCA-Pi-PPi (TCA 10%,Fosfato de Na 1*, Pirofosfato

de Na la ).

-Dejar 15 min a 0“C y filtrar utilizando filtros de vidrio(GF-C Whatman).Enjuagar el tubo y el filtro con dos volumenesde solución de TCA-Pi-PPi y un volumen de EtOH 90%. Dejar secarlos filtros y contar en contador de centelleo liquido con solucionde Toluenomomnifluor.

111.10 ul RIDIZACION DE AQIDOS NUCLEICOS

lll.10.1 Hibridizacin en colonias

Se han desarrollado distintos protocolos para la hibridizacionde acidos nucleicos unidos a un soporte solido. Estos metodosdifieren en los siguientes aspectos:

-el solvente y la temperatura usada (68°C en solucion acuosao 42°C en 50% de formamida).

—el volumen del solvente y el periodo de incubación (grandes

-81­

volumenes yr 3 dias de incubacion r) volumenes nunimos y cortostiempos).

«la concentración y actividad especifica de la sonda radiac­tiva.

-las condiciones de lavado ("stringency").

En general la elección de las condiciones de hibridación dependeen gran medida de una elección personal. A continuación sepresenta las condiciones utilizadas en este trabajo.

III.10.2 Absorciónde las colonias a los filtros

«Poner un papel de filtro Whatmanntipo 531 (marcado adecuada­mente con tinta para poder posicionarlo respectC) a la caja depetri) sobre la superficie del agar donde han crecido las colonias(las cajas deben estar previamente a 37°C al menos 30 ner).Tener cuidado de que no queden burbujas de aire entre'el papely el agar.

-Dejar 15 min. a temperatura ambiente. Marcar la caja depetri respecto de las marcas del filtro.

Ill.10.3 Ruptura de las bacterias y desgaturalizacion del

-Preparar recipientes con las siguientes soluciones:

i) SDS 10% (papel Whatmann embebido en ella).

ii) Solución desnaturalizante: 0,5H NaOH,1,5M NaCl.

iii) Solución neutralizante: 0.5MTristlH (pH=7.4). 1,5MNac}.

lV’ SSC 2:: 0.03M citrato de sodio (pH=7.0). 0.3M Nac}.

—Tomarlos filtros con una pinza y ponerlos, de uno por vez,sobre el papel embebido con la. solución (i). Dejarlos 5 Inin..Esta operacion limita la difusión del plásmido durante ladesnaturalización y renaturalización.

-Pasar los filtros al recipiente que contiene la solución(ii) y colocar el conjunto sobre un recipiente con agua hirviente.Incubar 5 min. a una temperatura de aproximadamente 80°C.

—Poner en solución (iii) y dejar 5 min. a temperaturaambiente.

-Pasarlos a la solución (iv). Dejar alli hasta que todoslos filtro hayan sido tratados.

—Pasar a EtOH 95% durante 1 min.. Dejar secar a aire.

Ill.10.4 Prehibridación

-HumedeCer los papeles de filtro en SSC 2! de a uno por vez.

—Colocarlus dentro de una bolsa plástica y agregar el bufferde-hibridación. Eliminar las burbujas y sellar la bolsa por calor.

guffer de hibridacng

50k formamida deionizada0,5% Nonidet P-AOSSC av

100 ugr/ml RNA"carrier"

—Incubar una hora a ¿2°C.

Ill.]U.5 Hibridización

-83­

-lncubar el "probe" por 2 min. a 100°C para desnaturalizarloy enfriarlo rapidamente en hielo.

—lnyectarlo dentro de la bolsa de hibridización utilizandouna jeringa hipodermica (cuidar de no introducir burbujas deaire en la bolsa). Sellar nuevamente la bolsa por calor.

-Incubar toda la noche (12 a 16 horas) a 37-42°C.

lIl.10.6 Lavado del "probe" no hibridizadg

—Sacar el buffer de hibridización haciendo, un corte en unaesquina de la bolsa. Abrir completamentey retirar los filtros.

—Poneren un recipiente con 200 ml de buffer de lavado. lncu­bar 20 min. a temperatura ambiente (con agitación), haciendo

un cambio de buffer a los 10 min. Cambiar nuevamente de buffere incubar a 50-65”C por 20 min.(con agitación], repetir estaincubación 3 veces mas.

Buffer de_ngagg:SSC 1x (0,015M Citrato de sodio pH=7,0 , 0,15M NaCl)SDS 0,1%

—Sacar los filtros y dejar secar a temperatura 'ambiente.

-Ubicar los filtros sobre un carton o soporte similar,rea1izarmarcas radiactivas sobre el carton para poder posicionar la placaautorradlografica y exponera película autorradiografica.

Nota 1: los filtros asi obtenidos pueden ser rehibridizados,con el mismou otro "probe" comenzandoa partir de punto llI.10.4.

Nota 2: se utilizó pelicula autorradiografica Kodak x-0matARvs, y el revelador fotografico utilizado fue PQ-6 (Rommek).

111-11 EEEIEÉL&_QE_QQEA

En el verano de 1970, Baltimore193 y Temin y Mizutanilgápublicaron el hallazgo de una actividad DNA polimerasa RNA­dependiente en los viriones de virus tumorales Esto resultómuy sorprendente ya que invalidaba uno de los dogmas centralesde la Biologia Molecular, aquel de que el flujo de informaciónes unidireccional de DNAa proteinas pasando por RNA.Sin embargoa la luz de este descubrimiento el flujo de información puedeser bidireccional al menos en parte del camino.

'En los últimos años se ha demostrado que ciertos Inecanismosde inserción y transposición estan mediados por una enzima muysimilar, lo cual hace pensar que el fenomeno de transcripcioninversa < de RNAa DNA). es mas general y no limidado a ciertos

. 195Virus.

Actualmente esa actividad DNA polimerasa es denominadaTranscriptasa Inversa y ha resultado una enzima muy util enBiología Molecular, en cuanto que ha permitido construir moleculasde DNA copiadas de determinados RNAs (mRNAs.RNA viralesgenomicos,etc), para su ulterior clonado.

Lo que sigue es el protocolo que en nuestras. manos, rindioel mejor CDNA. es decir mayor rendimiento en masa, mayorlongitud de cadenas. etc (ver Iv.4).

lll.11.1 Sintesis de la primer cadena de cDNA

III.11.1.1 Pretratamiento con CHngOH

-6 pl de RNAVFA (lugr)

-0.6 ul de lOOmMCHBHQOH(fresco)-Incubar 10 min a temperatura ambiente.—0.8 ul de B-Mercaptoetanol 0.7M (fresco)

-0.6 ul de HZO10 min. a temperatura ambiente

Ill.11.1.2 Reacción de Lranscrigcifig_ggggL;g

8,0 ul del RNApretratado con CHqHQOH-10 ul de FSM 2K

-2,4 ul de una solución conteniendo: dATP, dGTP, dTTP y dCTP(todos a una concentración de 5mm)

-1,0 ul de Transcriptasa inversa ( 8,0 U/ul)

E511 2‘

100mmTris-ClH pH=8,3 (el pH debe ser a3us¡ado a A2°C>

lómfl MgCl2lóomM KC]

200 ugr/ml de ISAoligo dT ("primer") 60 pgr/mlActinomicina D 25 ug/ml

-Incubar 90-120 min. a AZ°C

-Agregar 80 ¡u de HZO si extraer con fenol-CIBCH, dos vecesCun eter y precipitar con EtOH 3 veces. Se lava con 70%

ErOH y finalmente se resuspende en cierto volumen de HZOque depende del protocolo de segunda cadena ha seguir.

III.11.2 Sintesis de la segunda cadena de cDNA

III 11.2.1 Método de Nucleasa Sl (Fig. 11.2.1)

III.11.2.1.1 Hidrolisis alcalina del RNé

-5 ul de CDNA

-Agregar 50 ul de buffer alcalino. Incubar 150 min a 37°C.

-86­

Buffer alcalino0.3M OHNa

SmM EDTA

-Neutralizar con 50 u] de 1MTris-acetico (pH=5,8)—Precipitar con EtOH-NaAco y lavar con 70% de EtOH.

lll.11.2.1.2 Sintesis de la segunda cadena de cDNA

-Resuspender el cDNAen 20 ul de HOO-Agregar 20 ul de SSM 5x—20 ul de la primer cadena de CDNA"1 u] de dATP, dCTP. dTTP y dGTP (SmM de cada uno).

—56,5 ul H O2 32

—2 ul de dGTPu P

—0,5 ul de enzima de "Klenow" (4 uxul)

fiéfl_é:SOmMTris.Cl (pH=7,5)

25mM MgC12ZSmM de DTT

-lncubar por 8-12 horas a 16°C‘o 60 min. a 37°C

-Extraer dos veces con fenol-CIBCH—Pasar por columna de Sepharosa CL-hB (ver 111.9.2).—Precipitar con EtOH el pico de cDNA.

111.11.2.1.3 Digestión del "loqpf con Nucleasa s1

-Resuspender el cDNAen 550 ul de HOO

«Agregar 50 pl de Buffer S1 10‘

Buffer Sl_¿g¿2M NaCl

0,5M Acetato de sodi0(pH=a,5)

lOmM de ZnCl25%glicerol

-Tomar 5 ul de la solucion para hacer una curva de

concentración optima de Nucleasa S1 (ver Resultados, V.21.«Las incubaciones se realizan a 37°C por 30 min.«Para el analisis se corre en gel alcalino de agarosa 1.0%

(ver electroforesis en gel, 111.6.3).—Una vez determinada la cantidad Optima de nucleasa se

realiza la digestión del resto del cDNA.

—Extraer con fenol una vez y fenol-CIBCH dos veces—Correr una columna de Sepharosa CL-áB en Buffer de TdT (ver

Adición de Homopolimeros. Il].12.1l.

lll.11.2.2 Metodo de la RNasa H

En este protocolo se basa en la construccion de la segundacadena por un procedimiento similar a la "nick translaticnf' yfue descripto por primera vez por Okayama y Berglgó. En el mismose construye la primer cadena de la misma manera que antes, perom1 vez de hidrolizar totalmente el RNAcon alcali, se realizauna digestion parcial con RNasa H (enzima que tiene actividadde endoribonucleasa cuando el RNA se encuentra formando unheteroduplexl. Cuando se ha hidrolizado el RNA losoligoribonucleotidos permanecen aún unidos a la primer cadenapor lo cual pueden actuar como iniciadores ("primers") para laaccción de la DNApolimérasa de E.coli. Por lo tanto la sintesisde la segunda cadena comienza en distintos puntos a lo largode toda la molécula, lo cua] para templados largos es una granventaja pues la DNA polimerasa no debe recorrer toda lamolecula,sino que remplaza, en cortos Lrechus. oligonucleotidosde RNA por los correspondientes de DNA, esto aumenta laposibilidad de obtener la sintesis de la segunda cadena

197completa.Luego de esta reacción. una de las dos cadenas del cDNAposeo

"nicks" productos de la sistesis, por ello es necesario reparalosutilizando DNAligasa de E coli.

-88­

ErotocoLg (ver esquemaFig.ll.2.1)

"Agregar a un tubo Eppendorf:-50 ul de RMixSS 2‘

BMixSS_;¿

20mMTris-CIH (pH=7,5)

¿mM MgCl2

lOmM (NHA)ZSOlOOmM KC]

50 ugfml BSA

150uM de B-NAD

A

-2 ul de dATP, dTTP. dGTP y dCTP (SmM C/u).)—38 ul del hibrido cDNA-RNA«5 ul de dATPaazP-1 ul de RNasa H (0.9 U/ul)"1 ul de Ligasa de E.coli (NADdependiente)—3,0 ul de DNApolimerasa (A u/ul)

-Incubar a 16°C por una hora y 21°C por una hora.—Fenolizardos veces, y extraer con eter 3 veces y precipitrar

con EtOH-NaACO.

—Cromatografiar en columna de Sepharosa CL-AB (ver marcaciónde DNA, 111.9.2).

111.12 ADICION DE HOMOPOLIMEROSEN EL EXTREMO3'("TAILING")

La enzima deoxinucleotidi] transferasa terminal de timo deternero cataliza la adición de deoxinucleótidos en el extremo3'OH de moleculas de DNA(doble o simple cadena).198 Originalmentese penso que era necesario contar con extremos 3'0H protruyentes.

-89­

Actualmente se sabe que esto no es necesario si se utiliza comocation divalente Co“.199

Los primeros experimentos de clonado usando “tailing” parael ensamblado de moleculas de DNA se realizaron agregandohomopolimero de dA en el vector y el complementerio de dT enel DNA a insertar (generalmente CDNA).200'201 sin embargo laescision y recuperación del inserto se vuelve ciertamentedificultosa. Es por ello que actualmente se utilizan colas dedG-dC. En este caso es posible adicionar homopolimeros de dGen el sitio Pst I del plasmido y colas de dC en el DNAa clonar.Una vez ensamblados y transformados los plasmidos recombinantesportan el inserto facilmente recuperable ya que el sitio PstIse ha regenerado (ver esquema III .2. l ) .

I Pn l IcuGACG'I'El

[CHECA GJG AB GTC

—_CCC‘———‘l

ECTGWGGGG GJG

\___HCUCGTC CCC——'

N l

G CCC “GWGTC

CCC

Esguema 111.12.12 regeneración del sitio PstI luego dela adición de dG.

Se ha determinado que el número de residuos de dA-dT y de dG“dC que brinadan mayor eficiencia de transformacion es de 100y 20 nucleotidos respectivamente; debiendo ser numero de residuosen el plasmido y en el DNAaproximadamente igual. Una observacionimportante es que homopollmeros de dG-dC de mas de 30 nucleotidoshacen altamente inestable al plasmido que lo porta (ver

9 . . . . .IV.5.1).20“ Es necesarlo menc10nar que la ef1c1enc1a de

-90­

transformacion depende en gran medida de 1a cepa bacteriana;una cepa de géggli RecA—puede presentar una eficiencia 10 vecesmenor que una RecA', posiblemente debido a que la reparacionde la doble cadena en la zona del "tail" este mediada por elsistema RecA.

Generalmente se hace necesario determinar empíricamente eltiempo de incubación requerido para obtener homopolímeros dela longitud deseada (ver Iv.5.1).

llI.12.1 ag'ción gg_homog ime'

—75 ul de buffer de TdT 5A

1Mcacodilato de potasio125mMTris ClH <pH=9.0)

2.5mM de CoCl9500 ug/ml seroalbnmina bovina (BSA)

-300 ul del DNAo plasnido.-O,9 u] de DTT ¿OmM

-l.3 ul de dCTP 1,25mM—2u] de TdT (27 u/ul)mlncubar a 37°C por un tiempo determinado empiricamente-Hacer extracción fenólica y precipitar con EtOH.

III.12.2 Ensamlado de DNAinserto con el vector

-Las moléculas de cDNAde VFAFueron consideradas en promediode 3000 pares de bases. mientras que el vector posee 4361 ph.Para lograr concentraciones equimolares se utilizo 0.0a ugr depBR322 con homopolimeros de dG s: 0,029 ugr de CDNAcon colasde dC.

Agregar 10 ul de buffer NET 10x

-91­

m 1th0,15M NaCllOmMTris-ClH lpH=7,6)1.0mM EDTA

-Llevar con HQOa 100 nl el volumen final de la reaccion—lncubar por 7 horas o más desde 68°C hasta llegar a la

temperatura ambiente (ver IV.5.2).

II1.13 QECUENCIAQLQN_QEDNA

Los metodos de secuenciaciOn de DNAse basan en la posibilidadde generar poblaciones de olgonucleotidos a partir de un fragmentode DNA, el cual posee un extremo fijo, y el otro variableinterrumpiendose especificamente en una o dos de las cuatro bases.Contando con métodos de separacion de oligonucletidos de altaresolucion. es posible separar un oligonucleótido que difierede otro en una base 3' como cada población termina en una baseespecifica es posible deducir la secuencia nucleotidica de lainterpretación del electroforetograma (placa autoradiografica).

Como se explicó en la introduccion actualmente existe dosmétodos de secuenciación que son los más usados: i)Degradación

181; il) Dideoxiterminadores de cadena.180quimica específica

por el tipo de problema que se nos presentaba el metodo elegidofue el de degradación quimica especifica o metodo de MaxannyGilbert.

Para este metodo el Fragmento de DNAse obtiene generalmentecomoproducto de corte con enzimas de restricción, posteriormenteeste es marcado enzimaticamente en sus extremos según se describiopreviamente y IUego es tratado por diferentes metodos (recorte

Con una segunda enzima de restricion. separación de Padenas,etc.) para obtener una sola cadena marcada ("un extremo fijo").

Luego de obtener el fragmento así marcado se realizan lasdegradaciones químicas especificas de las bases y finalmenteun tiatamiento con piperidina termina por romper el esqueletodel DNAen los lugares donde se encuentra debilitado por laruptura de la base. De esta manera se obtiene las poblacionesde oligonucleótidos los cuafes pueden ser corridos en el gelde poliacrilamida de alta resolución.

lll.13.1 Marcado del DNA

La obtención de] fragmento de DNAmarcado se realizó generandolos fragmentos adecuados por digestibn con 18(3) enzima(s)adecuada(s) y posteriormente se marcaron los extremos utilizando"fill-in" o fosforilación con PNK(ver puntos 111.9.3 y lll.9.A>.

lll.13.2 Obtención del fragmento marcado en un solo exrtremo

Una vez que el fragmento ha sido marcado existen dosposibilidades para separarlo marcado en un solo extremo:

Ill.13.2.1 Recorte con una segunda enzima de restriccion:

-Calentar a 70°C por 10 min. para inactivar la enzima demarcado (Klenow>.

—Agregar 1 pl (5 unidades) de la segunda enzima lncubar60 min. a la temperatura adecuada.

Nota: en general es posible utilizar una segunda enzima queutilice el mismo buffer de corte que la primer enzima y la enzimade Klenow (buffer"core"), si esto no fuese posible se deberaprecipitar con EtOH-NaAcOy resuspender en el buffer adecuado.

lll.13.2.2 Purificación de la banda marcada en un extremo

93­

-Preparar un gel de poliacrilamida (nativo) de 4 a 6%idependiendo del tamano de la banda a separar).

-Agregar BPBa la muestra y senbrar. Correr la electroforesishasta que el BPB llega 3/4 del largo total del gel, cortar lacorrida. Separar los vidrios envolver en polietileno. Exponerhaciendo marcas asimetricas en la placa para luego del reveladopoder posicionar la autorradigrafia respecto al gel. Exponer20 min. y revelar.

"Hacer una ventanita en la placa autorradiografica en lazona que corresponde a Ha banda. Ubicar la placa sobre el gelen la misma posicion en que se encontraba originalmente (hacercoincidir las marcas hechas anteriormente). Cortar con un bisturío similar la zona del gel que queda visible a través de la ventanade la placa.

-Sacar cuidadosamente la porción de gel y sumergirla en¿00 pl de buffer de elución.

Buffer de elución0.3M NaAcO pH=5.2 (no debe ser más ácido pues produce

depurinizacion)

-lncubar a 37°C toda la noche (12 a 16 hs.).

-Sacar la porcion de gel o transferir a otro tubo el sobrenadante

lll.13.2.3 Separación de cadenas

Frecuentemente es posible separar las cadenas complementariasÜ .de una molecuha de DNApor electroforesis en agarosa nativa“O3

. . . 181 .o en geles de poliacrilamlda . El motivo por el cua] las cadenascomplementarias de muchos fragmentos de DNAtienen una migracion

-94­

electroforetica diferente es algo que aún no esta aclarado. sinembargo parece que el plegamiento de las cadenas complementariaspuede ser distinto en función del apareamiento interno de lasbases. En muchos casos la estructura secundaria puede conferirmobilidad electrforetica diferente. Lamentablemente no esimposible predecir cual será e] comportamiento electroforeticode las cadenas coplementarias y es necesario relizar elexperimento aún con un resultado incierto.

-Preparar el gel de separación de cadenas como e] descriptoen III.6.5

—Precipitar el DNAmarcado con EtOH-NaAcOy lavar el preci­pitado dos veces con EtOH70%para remover las sales.

-Redisolver el DNAen 40 ul de:30* de DMSO

ImM EDTA

0,05% xilen cianol0.05% azul de bromofenol

—Calentar a 90°C por 2 min.. Enfriar rapidamente en hielo.

-Sembrar inmediatamente la muestra y correr la electroforesis¿a 8 V/cm hasta que la forma doble cadena del fragmento lleguea la mitad del gel (determinar empíricamente previamente).

—Realizar la exposicion del gel y elución de la banda comoesta descripto en el punto anterior.

III.13.3 BeactLyos

a)Q;gg: 50mMcacodilato de sodio

lOmM MgCl2ImM EDTA

b)G-SLQQ:

C)H;LÉLQ2:

d)Q;A;QQI

e)u;:

fi5M NaCl:

gg;g_hacer gsge gufler megglggz1MCacodilato de Na pH=8,0 0.5 m1

1M MgCl2 0.] ml0.5M EDTA 20H]

Hüo c.s.p. 10ml

1,5M NaAcO pH=7.0

1MB-Mercaptoetanol40 ug/ml de DNA"carríer"

QQLQ_QQQEL.92LS_Q!1ÁQL_EQZQLQEÍ

3M NaACO 2.5 ml

B-mercaptoetanol 0.35 mlHS DNA Smg/m] 20 ul

H20 2.11 ml

0,3M NaAco H2=h1drazlna0.1M EDTA

10 ug/ml HS DNA("carrier")

gara hager gste buffigr me¿g¿gg:3M NaAcb 1.o ml

0.5M EpTA 2 mlHS DNA Smg/ml

HZO 6.980 ml

'20 ul

90% ácido fórmico (HCOOH)

DNAde esperma de arenque (1 mg/ml)

cloruro de sodio 5M

Acetato de sodio 0,3 M pH=%.2

-96_

h)0 6M NaACO: Acetato de sodio 0.6M pH=5.2

i >B_N_A“.ceuie_r‘"r

RNAtotal de levadura (fenolizado 3' precipitadovarias veces con EtOH-NaAcO)

j)2fl5: dimetilsulfato

k)fl;: hidrazina

1)Pip: piperidina 1M(comercialmente se obtiene 10M)

m)Tintura de formamida:80% formamida1K buffer TBE

0,1% azul de bromo fenol0,1% xilen cyanol

Nota: todo e] material contaminado con DNSdebe ser tratado

con NaOH 10N y el contaminado con HZ con FeClg. antes de lavaro descartar.

III.13.A Reacciones Químicas

-Agregar a los 400 ul del eluido conteniendo ei DNA, 30 ulde RNA "carrier" (3 mg/ml> y J.|n] de EtOH. Dejar a "70°C por15 min.y centrifugar 10 min..

-Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado con 70%de EtOH. Resuspender en 20 u] de HOO.

-Reaiizar las siguientes operaciones:1. zoul de HOOa tubos de C4T2. 20 ul de ÑaCi 5M a los tubos de C3. 200 ul de Gago a tubos G

A.

5.

Reacciones de

10.11.12.

Reacciones de C+T

10.11.12.

Comuna todas las

A+G2

-97­

A ul de HS a todos los tubos(G,G*A,C+T,C)5 ul de DNAmarcado a cada tuboPoner todo en hielo

0,5 ul o menos de DMS6 min. a 17°CPoner en hielo50 ul de G-stop (frío)6 ul de RNA"carrier"750 ul de EtOH

25 ul de G+A—go7 min. a 17°CPoner en hielo200 ul de HZ-stop(frío)6 ul de RNA

750 pl de EtOH

"carrier"

y C:

20 ul de HZa 17°C

Poner en hielo300 ul de HZ-sLop (frío)6 ul de RNA

625 pl de EtOH

9 min.

"carrier"

reacciones:

Incubar a -70°C 15 min.Centrífugar 10 min y descartar sobrenadanteResuspender en 300 ul de 0.3 NaAcoAgregar 750 ul de EtOH, 15 min. a -70°CCentrífugar 10 min. descartar sobrenadante

wge­

(recentrifugar para eliminar el EtOHde las paredes del tubo).18. Resuspender en 25 ul de Pip. incubar 30

min a qo’C19. Agregar 25 ul de NaAcO 0,6M20. Agregar 125 ul de EtOH, dejar a -70°C 15

min.centrifugar 15 min.y descartar el sobrenadante21. Resuspender en 10-15 ul de tintura de

formamida.

Se corre gel de secuenciación como lo descripto en la seccion111.6.6

¡11.14 ALMACENAMIENTO Y MANIPULAC10N_DE SECUENCIAS DE DNA_

EQR COfiEUTACION

La importancia de la computación comoherramienta del secuencia­dor de DNAha crecido juntamente con el desarrollo de los métodosde secuenciación. Durante la secuenciación del DNAdel fago Phix174 resulto obvia la necesidad de utilizar programas decomputación para almacenar y analizar las secuencias. Cuando

se secuenció el bacteriofago G4 (un virus Inuy similar al Phixlïáila comparación de las secuencia tambien se realizo mediantecomputación.

Con el advenimiento del metodo de "shotgun" la computaciónasumió un rol central en la estrategia de secuenciación.

La siguiente lista contiene algunas de las operaciones ycalculos que pueden realizarse con programas simples decomputación:

a)guardar y editar la scuencia.biproducir copias en papel (print) de una secuencia. por

-99­

ejemplo copias como simple o doble cadena.c)Traducir la secuencia en todas los marcos de lectura.d)Buscar en la secuencia total determinadas secuencias tales

comositios de reconocimiento para enzimas de restricción.e)Comparar una secuencia con otra y busqueda de homologias.F)Buscar estructuras secundarias tales como"hairpin loops".

Los programas de computación con los que nosotros cotabamosfueron desarrollados por Rodger Staden en los laboratorios delDr. Fred Sanger en Cambridge.204

Seria muy extenso comentar en detalle las caracteristicas delos programas empleados y por otro lado existe un manual detalladode manejo que acompaña los programas, por esto es quc simplementedefiniremos brevemente los programas mas usados.

SEQEDT:utilizado para la introducción de datos de secuencialos cuales quedan almacenados en archivos creados automaticamentepor este programa.

¿EQLSTzpermite ver por pantalla el contenido de un archivocon secuencias de DNAo proteínas. Posee distintas formas demostrar la secuencia ( simple o doble cadena, espacios entre105 renglones, largo d? ESÍOS. etc.)

gggFlT__Y DBCOME:compara secuencias entre si, evidencialos lugares de homología entre ellas.

gyTSIT y SEARCH: ambos programas analizan una secuenciadeterminada buscando los sitios (k3 reconocimiento para en¿imasde restriccion.

TRANMTY TRANDK: estos programas traducen una secuenciade DNAa la secuencia de aminoácidos correspondiente, utilizandoel codigo genético clasico o uno particular. Es posible analizar

—100n

todas Fases de lectura posible.

JWCALC:determina el peso molecular de una proteina deducidaa partir de la secuencia de nucleotidos de su gen.

flïgROPLOT:analilza una secuencia de aminoácidos en cuantoa posihles Zonashidorfilicas e hidrofóbicas.

[11.15. HLEJMUDUCCION

Se denomina miniMuducción al proceso por e] cual se inducela trasnposición y empaquetamiento de un fago miniMu. tn general,se utiliza un mutante de Muque posee una mutación termosensiblpen el gen que codifica para ei represor (pioLoina u), estafacilita el proceso ya que la inducción se produce po: un simple"Shock" de calor.

A continuación se describe el procedimiento utilizado tantoen la inducción como en la infección. este proceso esta de acuer­

f7do con lo descripto por Pascal Ratet.“05

111.15.1 Cepas bacterianas:

M10‘: reCAl, endA], gyrA96, thi, nsti7, suthh, relAi,delta(lac,proA.B).

M882: F', aiaD139. delLa(ara,leu)7697, (proAB. arq. lacIPOZYA’XIII, strA.

¿¿_98Mucts: JMIOB Mu gtsGZ

Ill.15.2 Inducción v Lisis:

—Crecer la cepa conteniendo ai min1Muy al Nu "helper" (celula

-10]­

dadora) en medio LBdurante toda la noche a 30°C con agitación.

Nota en nuestras manos si no se crece con agitación lasbacterias se lisan.

-Agregar 20 ul del cultivo a 2 ml de LB fresco, crecer por2 horas a 30°C con agitación.

-Incubar 15 min. a a5°C y luego crecer 2 horas más a 37°Ccon agitación (la lisis es evidentemente mayor con buenaaeración).

-Agregar unas gotas de CIBCHy agitar unos segundos en vortex,dejar 15 min a temperatura ambiente.

—Centr1fugar 10 min a 2000 rpm y tomar el sobrenadante comofuente de virus.

Nota: Las particulas de Mu son altamente inGSfahies y nopueden guardarse de un dia para otro.

IIl.15.3 Infección

—Célulareceptora: cultivo de la cepa receptora durante todala noche a 37°C con o sin agitación. Las celulas se centrifugana 5000 rpm y! se resuspenden en 1/4 del volumen del cultivo en

++buffer de Ca

Buffer de Cal;ro mM CaCl2

10 mM M9012

-Mezclar 200 ul de célula receptora con 400 ul de sobrenadan­te de virus.

Incubar 15 min a temperatura ambiente y entonces agregar2 ml de LB.

-Incubar 2 horas a 30°C con agitación.—Plaquear por rastrilleo en medio LB conteniendo los

antibioticos adecuados para seleccionar las fusiones (ver v.5>

-102­

111.16 :lNMUNOSCREENING"

Comoya explicó en la introducción una de las posibles formasde aislar el clon recombinante deseado es utilizar anticuerposque detecten el producto codificado en el gen buscado. La técnicase basa en la capacidad de ciertos soportes (como lanitrocelulosa) de retener proteinas, producidas por el clonbuscado, las cuales eventualmente pueden actuar como antígenofrente a anticuerpos especificos, por lo tanto la zona del filtroque contenga la proteina en cuestión retendra anticuerpos y estosfinalmente pueden ser detectados por incubación con proetía A125I, todo este proceso permite identificar la zona donde seeuncuentra el clon productor en la "master plate“.

lll.16.1 Sueros

-Los llamados "anticuerpos" son sueros hiperinmunes producidos

en cobayos inmunizados con VFAcepa O1 Campos. Cuyo titulo esde 1/5000.

—Adsorción: los sueros fueron previamente adsorbidos concelulas de E.col¿. Para ello se tomó un cultivo de bacteriascrecidas a saturación se centrifugó a 2000 rpm. resuspendio enbuffer TBS 3/ se le agrego los anticuerpos en IM] volumen finalde 50 ml. Se incubó a 10°C toda la noche. Entonces se centrifugóa 10000 rpm y se descartó el precipitado, el sobrenadante fueconservado alicuotado a -20°C con el agregado de azida sódicapara SU preservación .

III.16.2 Badioinmunoseleccion:

:Adsorber las colonias al filtro de rútrocelulosa como fuedescripto en la sección lIl.10.2.

—Retirar los filtros y lavarlos con TBS durantes 5 min.con agitación suave.

-103­

_B_50 mMTris-CIH (pH=7,5).

150 mM NaCl

—1ncubar los filtros por 30 min con TBS con 5% de leche enpolvo descremada (P/V) a temperatura ambiente.

—Eliminar la solución anterior y agregar los anticuerpos(dilución 1/500) en la misma solución. lncubar por 60 min atemperatura ambiente.

—Lavar tres veces con TBS. 5% leche y 0,05 5k de Twen 20.Hacer lavados a temperatura ambiente por 10 min cada lavado.

91’51 (106cpm, act.específica=5-106)—Agregar la proteína Aen la misma solucion que los anticuerpos incubar por 60 min.a temperatura ambiente.

—Lavarde la misma manera que antes.—DeJarsecar los filtros a temperatura ambiente y exponer

a una pelicula autorradiografica comodescripto en Ill 10.6

-1o¿.»

OPTIMIZACION DE TECNICAS

-1(J5­

E] objetivo de esta sección es Comentar ciertos experimentosque se realizaron con el fin de poner a punto determinadastecnicas imprescindibles para e] clonado molecular y de loscuales no se contaba con suficiente experiencia en ellaboratorio.

Si bien estos experimentos no son originales se consideraronimportantes ya que la mayoria de las ¡netodologias empleadasson relativamente empíricas Parece entonces convenientedeterminar las condiciones Optimas a pesar de contar con algunosdatos publicados por otros autores.

lV.1 TRANSFORMACION“BACTEBAANA

La posibilidad de hallar el clon buscado esta en relacióndirecta con el numero de clones analizados, por ello cobrauna importancia radical contar con un metodo transformaciónde alta eficiencia.

159Comodemuestra Hanahan algunos de los factores que afectanla eficiencia de transformación son:

i)Tipo de cepa bacteriana empleada.ii)Estado metabólico de la misma (ubicación en la curva

de crecimiento).iii)Composición de las soluciónes empleadas para lograr

el estado de competencia de las celulas.

Respecto a este último punto, hemos respetado las condionespropuestas por Hanahan. pero es necesario mencionar que lacalidad de las drogas empleadas para preparar dichas solucionestienen una importancia radical, pudiendo representar diferenciasde uno o dos ordenes de magnitud.

4 -106—

IV.1.1 Cepas bacterianas:

En la figura IV.1.1 se presenta el histograma de barrasobtenido al probar tres cepas de E.col¿ diferentes.

U.F.C.(pg)

HbIOI om MCIOGI

Figura IVL¿¿;: Histograma de barras representando laeficiencia de transformación (U.F.C./ngr de pBR322)paradistintas cepas de E.Coli

Comoes posible observar la cepa DHl presenta 1a 'mayor efinciencia de transformación, le sigue la MClOól con una pequenadiferencia y por último la Hb101. Estos datos fueron observadosconsistentemente.

Dado que la cepa DHI posee ciertas caracteristicas de paredque la convierten en un recipiente inestable y que la eficienciade transformación no fue muy diferente a 1a observada paraMC1061se decidio trabajar con esta última cepa 1a cual esmuchomás resistente a la manipulacion y a] guardado.

-107­

lv.1.2 grecimientgnx_transformación:

Como ya se ¡El mencionado el estado metabOlico celular asicomo las caracteristicas de la membrana y pared determinanque la competencia sea un Fenomeno transitorio. Es por elloque la determinación del punto óptimo en relacion a la curvade crecimiento fue una tarea ineludible.

Se utilizo la cepa MC1061y en sucesivos puntos de la curvade crecimiento (DO fueron tomadas alicuotas del cultivo550”y proCesadas inmediatamente (tratamiento con CaClz) según lodescripto en Materiales y Metodos (IV.A.1>.

Posteriormente las alicuotas representativas de cada "puntofueron transfomadas con pBR322(i ngr.) y se determinó el númerode colonias resistentes a ampicilina (1V.4.2)

Comoes posible ver en la figura IV-1.2 se detectó un picocuyo maximo corresponde a 0,5 de DO Es de destacar que550"el rango de DO de mayor eficiencia es ciertamente angosto.550puesto que diferencias de 0.1-de DO respecto a dicho maximo,550implican una caida de la eficiencia de alrededor de medio ordende magnitud.

A partir de estos experimentos todas las transformacionesfueron llevadas cabo con celulas competentes obtenidas en estascondiciones óptimas.

- 108­

6-407 _

6.406 _UFC/pg

l l l l

0,1 6,3 0,5 0,7

Damm

F'gura IV=1.2: eficiencia de transformación (U.F.C./ugrde pBR322>en función del punto de la curva de crecimientoen que se cosechan las bacterias pare el tratamientocon Laklz.

IV.2 ELECTROFORESISÚEE_QEL

Iv.2.1 Geles de agacggg

largo de este trabajo probablemente la tecnica que masA lo

se utilizó fue la electroforesis en gel nativo de agarosa.

En la mayoria de {os casos se usó porcentajes entre 0,0%1V ñ 1.1 puede verse un ge] de agarosax‘ 1.2% En la figura ._.

“109­

de 1,0 % en el cual se han separado fragmentos de DNAcorrespondientes a los genomas del fago Lamnda y la formareplicativa del fago Phi X-17ú. digeridos con Hind III y HaeIll respectivamente; estos fragmentos de DNAposeen un ampliorango de pesos moleculares (23.5 a 0.075 kpb.)y por lalinealidad de la curva en cierta zona (figura VI.2.1.1> esposible utilizarlos comomarcadores de peso molecular.

_.

hU‘O‘NIWO

ÏÏIII

(Kpb)

h)Ï

NI

logPM

O NI

||I-rÏÏ

l l l l l" l J

l 2 3 L 5 6 7

Distancia (Cm)WL­

F'gura IV¿;;¿;;: curva del log del PM(kpb> de fragmentosde restricción (ver texto), en función de la distanciarecorrida en una electroforesis en gel de agarosa nativodel 1,0% (buffer de corrida TAE 1x). En la esquina supe»superior derecha puede verse una fotografia de dichogel teñido con BrEt.

Cuando las muestras de DNAno son fragmentos lineales. esnecesario tener en cuenta que el calculo del peso moleculardebe hacerse con marcadores que posean el mismo tipo de

-110­

estructura molecular. Ejemplo de esto es la estimación de tamanorealizada en plásmidos circulares covalentemente cerrados.los cuales poseen superenrrollamiento y su migración difieresuscancialmente de fragmentos lineales de igual peso molecular.En estos casos se debe utilizar un tipo de graficación diferente(log PH vs. log de la distancia) cual es lo mostrado en 1afigura IV.2. 1 con estos considerandos nosotros hemosdeterminado pesos moleculares de plásmidos recombinantes.

3,7 —

3,1. —

N0‘Ï

No I

logPM(MdM)

1,8 F

l J l l l I lL 5 6 7 8 910

log. distancia

EigureújjggáLgr la curva representa el 10g del PM(Ndal)de los plásmidos naturales de la cepa de ,ngu \"-517en función del log (le su movilidad electroforeUCH enun ge] de aga-¡rosa 0,82;. En la esquina superior derechapuede verse una Foto de dicho gel teñido con BrEt.

Es importante destacar que la estimación de la longitud deun inSerto determinado es más exact a. aunque más labori osa,cuando se realiza sobre el fragmento escindido del plásmidovector.

m111­

lv.2.2 Geles de poliacrilgmida

Para fragmentos de longitudes entre 20 y 600 nucleótidoses preferible apelar al uso de geles de poliacrilamida. Comopuede verse en la figura lV.2.2.un gel de 6% permite separarel producto de digestión del plásmido pATlSB-PvuIl/S con Hinfl.la curva muestra cierta linealidad en la zona de fragmentosde 517 a 75 nucleotidos de longitud lo cual permite apelara esta tecnica para estimar peso moleculares de fragmentospequenos.

800- —" 4" _ "

600

500

400

300

PM(pb)

200

L l

HD 15 20¡OO

Distancia (cm)

ElgyggL Iv.g.;: la curva representa el log del PM (ph)de los fragmentos generados por digestión de pATlSB»

PvuII/B con Hinfl en funcion ue la movilidad obtenidaen una electroforesis en gel de pollacrilamida 6% (buffer

de corrida THE 1x).

-112­

IV.3 LIGADO DE FRAGMENTOS DE DN

Iv.3.1 Preparación del vector de clonado (Desfosforilación)

Como ya se explicó. un requerimiento importante cuando seusa DNA ligasa como forma de construir la quimaera, esdesfosforilar e] vector de clonado.

En el siguiente experimento se preparó el plásmido pAT153­PvulI/S segun se detalla en 111.5.3 y se realizo el siguienteexperimento:

—EL plásmido intacto (pAT.CCC) fue digerido con PvuIIobteniendo de esta forma e] vector linealizado con extremos"blunt ends" (pAT.lin) (ver 111.7).

—E] vector linearizado fue tratado con CIP como fuedescripto en 111.8.1. Asi se obtuvó e] vector lineaiizado ydesfosforilado (pAT.Pasa).

—Utilizando los plasmidos descriptos en los parrafosanteriores y fragmentos obtenidos por digestión con AluI deDNAdel fago Lamnda (inserto) se realizaron una serie dereacciones de ligado que permitieron confeccionar la Tabla1V.3.]

Notazla reacción de ligado fue realizada como fue descriptaen 111.8.2 utilizando 50 ngr de DNAde Lamnda/Alul.IMPLASMDOS LIGASA INSERTO N°CLONES<ugr de

plasmidoipAT.CCC 2.5110pAT.lin 0 5pAT.iin 0,9110pAT.Pasa 0 apAT.Pasa 0,5&10‘pAT.Pasa 0 ,pAT.Pasa 1,240"

-113­

Como se deduce de este experimento existe una estimulaciónde mas de 20 veces cuando al vector desfosforilado se lo ligaen presencia fragmentos de Lamnda/Alul respecto a cuando lareaccion es en ausencia de dichos fragmentos, con lo cual sededuce que el 95% de los clones obtenidos en e] primer casodeben ser recombinantes.

Es importante destaca: que cuando se usa vectordesfosforilado se obtuvieron alrededor de un millon de clonespor ugr de plasmido que es dos ordenes de magnitud mayor alo obtenido con vector pAT.Pasa más inserto. Si se supone queno ha habido perdida o daño del vector durante la

(XOdesfosforilación‘ este resultado indica que solamente el 1Ode los clones portarian inserto cuando se usa un vector n

deansforilado. Esto muesrra claramente la importancia de ladesfasforiiacion.

Por ntro lado Fue importante estimar que cantidad de vectorera la óptima como para ligar 50 ngr de fragmentos de "bluntends“ Lamnda/Alul(los cuales simulan cuantitativa y cualitati­vamente el CDNAsintetizado de VFA. ver Resultados V.3.i ).En la figura IV.3.1 puede observarse el histograma de barrasobtenido al estimar (por transformación) la eficiencia de ligadoen función de varias diluciones de pAT.Pasa. Del resultadoobservado en este último experimento estimamos convenienteutilizar esta preparación de plásmido en una dilución de 1/10.

T«114»

100“

"al. 1’32 '46 "a 1/1. 1¡2

Figura IV.3¿¿¿ histograma de barras representando laeficiencia (k2 tranformación de Inezclas de ligado conteniendodiferentes diluciones de vector (pATlssmpvuII/SdesfosForilado>.

IV.A SINTESIS DE LA PRIMER CADENA DE CDNA

Existen C105puntos fundamentales a tener en cuenta en laoptimización de la sintesis de CDNA:

a)Rendimiento de la sintesis (ugr de cDNAsintetizado)b)Calidad del cDNA(longitud de la primera cádena).

IV.4.1 Rendimiento de CDNA

Los factores que afectan el rendimiento de la sintesis son:

i)calidad del RNA.

-115"

ii)calidad de la Transcriptasa Inversa.iiiitemperatura y tiempo de incubación.y iv>medio de incubación.

La inrluencia de algunos de estos factores fue estudiadaen nuestro sistema.

Considerabamos que la calidad del RNAera suficientementebuena ya que el metodo de extracción y purificación se efectuósegun un metodo clasico que ha dado buenos resultados en otroslaboratorios.

Luegode probar enzimas de distintos origenes los experimentossiguientes fueron confeccunmdos con aquellas que dieron losmejores resultados (datos no mostrados). Por ejemplo latranscriptasa inversa más utilizada fue la comercializada porLife Science Laboratory.

La cantidad de enzima necesaria para obtener el mayorrendimiento en la sintesis fue de 10 unidades. Es interesantedestacar que cantidades mayores a 30 unidades provocan unadisminución en la incorporación, probablemente por la existenciade actividades nucleoiiticas presentes en la preparacionenzimática (figura IV.4.1.1). Los experimentos de rendimientofueron realizados tomando radioactividad precipitada con TCAcomo medida de la sintesis (expresado como k de incorporaciónrespecto a la radioactividad total agregada).

-116­

I l I6- ­5_ 0/ \._

C‘9g 4- ­8 3- ­5.“s’ 2- ­

g 1_ o ­

S G l l 410 10 30 50

Unidades de RT

F'gura Iv.4.1: curva de rendimiento de la sintesis decDNA(a de incorporación) en función de la cantidad de enzimaempleada (unidades de R.T.).

En la figura XV.A.1.2 se muestra un gráfico de deincorporación vs. el tiempo de incubación. La reaccion fuellevada a cabo a dos temperaturas diferentes (37°C y 42°C).Comopuede verse a 42°C la incorporacion es sensiblemente mayor;mientras que con respecto a} tiempo de incubación. aparentementela sintesis ocurre en los primeros 30 min., sin embargo elegimospara nuestras condicones tiempos de incubación mayores a aomin..

-117­

Il

IflCOprfOClOfl

VC

01650 50150 ¿o 60"] 96Tiempo (min)

Figura _IV.A¿g: curvas de rendimienLo de la sintesisde cDNA ("4 de incorporación) en función del tiempo deincubación. Además puede verse curvas para dos temperaturasdistintas, 42°C.(a) y q7°c f0).

Otros dos factores ensayados fueron la concentración Óptimade KC] y de deoxinucleótidos requeridos. Se halló que unaconcentración de 80-100 mM de KC] (A) y de 0,5 nm de dNTPs(B) permiten el mayor rendimiento (figura IV.¿;.1.3)

I

°/oincorporacion

I l I I I I I l I I

7- A __ B _

6 .. -.. ­O

5- -- _O

4 _ -I- .1

3- - _ _4’ L ­

G L l l L J 1 i l l #1 L0 50 100 ISO 200 0,1 0,3 0,5 1

[KCl] [dNTPs]

Figura IV.42¿Lg:curvas de rendimiento de sintesis decDNA(2 incorporación) en función de la concentración de KCl(A, mM) y de la de deoxinucleótidos agregados al medity deincubación (B, mM).

lv.h.2 Longitud de la grimer cadena cDNA

Algunos de los factores que afectan este parametro son:

i)existencia de nucleasas (Fundamentalmente RNasaS).ii)estructura secundaria del RNA

Nuestro objetivo Fue encontrar condiciones que disminuyeranestos efectos. En la tigura IV.4.2 puede verse elautoforetógrama obtenido de un gel de agarosa alcalina de 0.8%(ver 111.6.3), donde fueron corridos cDNAssintetizados condiferentes agregados. Comose puede ver el pretratamiento con

OHHgCHq(ver Iïl.11.1.l) genera un aumento de tamaño eu elCDNAobtenido. llegandose a o bservar una banda superior de

de 8000 nucleótidos que coincide con el tamanoalrededor

-ll9­

esperado para una molécula de CDNAque represente una coplacompleta del RNAde VFA. Por otro lado puede verse en la mismafigure que la inclusión de inhibidores de RNasas (como elRNasin. inhihldnr placentdxiol permiten obtener copias de mayorIÜIHJÍIUG

OH HgCH3 RNasmO

l 2 3 4 S 6

8000­

4000­

“ V:¿ g: electroforesis en gel de agarosa alcallno1 0%. Cal e lzsín tratamiento con OHHgCH; calle 2 contratamiento ron OHHgCHq:calle 5: mas RNasin; Calle 6: menosRNasin. “

Es interesante destacar le: presencia (hr bandas (fragmentosdiscretos en tamaño: qua se conservan con 105 distintostratamientos, que corresponderian los puntos naturalesde delenríón de la Transcriptasa Inversa ("stOp points").

—120­

IV.5 ADICION DE HOMOPOLIMEROS Y ENSAMBLADO

ï\1'.5.1 ¿gigjpnge homopolimeros:

Nosotros utilizamos homopolímeros de (JG/dc para ensamblar enel sitio Pstl de pBR322. ya que Como se explicó en la secc iOn111.12 el sitio de Pstl se restablece y el inserto puede serrecuperado por simple digestión con dicha enzima.

De acuerdo a lo ya indicado anteriormente. la incorporaciónde dG en los extremos 3' posee un limite maximo de alrededorde 25 nucleótidos. En la figura 1v.5.1.1 puede observarse unacurva de dicha incorporamon en función del tiempo de incubación,realizada en el sitio PSLI del plásmido pBRBZZ.Las condicionesutilizadas fueron las descriptas en “1.12.1

l I I l Í T

SO - ­

g LO — ­v825 30- ° .o I--­g ',.'v""' o:9 _,.

20- '.-" ­.. g _."Oé ,—a’ng _ ¡"Í "o. lz 'l,

e 1 4L 1 l ÑJ__J_.( 10 20 30 ¿o SO 60

‘hempo (mm)

F' gura IV.5.1 .1: curva de incorporación de nucleótidos(N° de nucleótidos adici onadus, dG o o dC o o en funcióndel tiempo de incubacion ron TdT.

Por otro lado se midio la incorporacion de dC en los extremos3' de Fragmentos obtenidos por digestión con Alu] del DNAdelfago Lamnda (estos fragmentos simulan moléculas de CDNA). como

se destaca en la figura IV.5.1.1 la incorporaciún de dC es casilineal con el tiempo de incubación. Es necesario destacar quelos fragmentos de Lamnda/Alul fueron utilizados en losexperimentos que se describen a continuacion, pero la curva deincorporacion de la figura IV.5.1.1 fue asimismo repetida Cone) cDNA de VFA para encontrar las cond1c10nes óptimas deincubación (tiempo. ver V.2.2).

Comose explico antes la longitud de las colas de homepolimeroses un factor esencial para obtener una buena eficiencia de trans­formacion. Ya que este punto es tan hnportante se reali2n elsiguiente experimento: se adicionaron colas de distinta longituden los fragmentos de Lamnda/Alul y se ensamblaron en lascondiciones (iescriptas tu. lll.12.2 con pBR322 portador‘ de polidG (25 residu03). Con el produuro de esta incubación setransformaron a celulas MC1061.En la figura 1V.5.1.2 puede versela curva resultante de graficar número de Colonias obtenidaspor ngr de plasmido (UFC/ngr) en función del número de residuosde dC de las colas de los fragmentos Lamnda/Alul. De esta curvapuede deducirse claramente que a longitudes menores a 20nucleotidos se reduce casi 5 veces la eficiencia de transformaciOn(inestabilidad del hibridO); por otro lado se confirma lainestabilidad de plásmidos portadores de colas de mas denucleótidos.202

Con los resultados explicados anteriormente nosotros decidimosutilizar colas de 25 residuos de dc, que fueron adicionados enalrededor de 15«20 min. en la mayoria de los experimentos conCDNA.

l I l l I l.‘I ‘s

500- ; 1I’ X

ll ‘\

Il ‘\

a 300 — ; x ­C ,' \‘s l \u o |‘u.D _ ‘\\ _‘ _

.’— s‘s\

O

01'0 2'0 3'0 1.o so 60

Longitud de las colas

Figura IV.5.1.2:en función de] N°de

eficiencia de transforslción (U.F.C./ngr\de nucleótidos (dC) adicionados a los extremos

los fragmentos de DNAde Lamnda. generados por digestión conAluI y utilizados en el ensamblaje con pBR322/ poli-dG.

IV.5.2 _nsamblaje (annealing):

Comose explicó en III.12.2 el ensamblaje se realizódesde

incubandocierta temperatura inicial hasta alcanzar Ja temperatura

ambiente (25°C) en un determinado tiempo.

Por lo tanto, la eficiencia de ensamblaje es afectadaprincipalmente por dos factores

i)tiempo de incubacióny ii)temperatura inicial

En la figura IV.5.2 pueden verse las curvas que representan

I

'/.detransformamon

el porciento de transformacióny la temperatura

100

OD CD

Oi CD

¿N C)

NJ CD

inicial.en función del tiempo de ¿[HWJDHCÍ(H1

Í I l I I l T I l

p lx ¡ro - E; 0"__'O “

[/An_ o __ °

_ 0 o O

D -I. o —

O

1' 1 l l U3 l J l L47 l60 120 180 240 7h. 37 1.7 57 67 77

Tiempo de ensamblado 9C

Eiggra L!¿5.2: eficiencia de tranformación en función do(A) distintos tiempos de incubación y (B) distintas temperaturasiniciales de incubación en el ensamblado.

A partir de estoslos siguientes;de incubación hasta alcanzar

experimentos68°C como temperatura de partida y

se eligieron comomás de

la temperatura ambiente.=J

parametroshoras

_-124­

mmm;

-125­

V.1 OBTENCION DEL RNA VIRAL

Como se explico en 111.1.1 el virus aftoso (cepa UICampos>fue producido en celulas BHK-Zlclon 13. Es interesante destacarque esta cepa de VFA.a diferencia de otras, se encuentra adaptadaal sistema celular empleado lo cual se traduce en un buencrecimiento y por lo tanto es factible obtener una gran masaviral.

El virus fue purificado en gradiente de sacarosa. 15-302.(ver 111.1.4 ). Como puede verse en la figura V.1.1 el perfilde sedimentación muestra un pico de 1A05 correspondiente a lasparticulas virales; en la purificación correspondiente a la figuraV.1.1 la masa viral obtenida fue de 250 ngr.

1rdnos í0.0.

260

'Botgyp’ “Top”N’de fraccuones

Purificación viral. Perfil de sedimentaciónFigura V.L¿¿: _ i'-- las distintas fracc10nesobtenido al determinar la DO-260nmdede un gradiente de sacarosa 15-30%.

r —126­

Para verificar la pureza de la muestra se realizo una micro­fotografia electrónica (figura V.1.2). comprobandode este modoque el pico obtenido correspondía a virus aftoso alLamente puri­ficadu.

Figura V.1.2: Microfotografía electrónica de las partículasvirales purificadas.

sin embargoes necesarlo admitir que existe cierta probabilidadque las cápsides virales puedan ser portadoras de acidos nucleicoscontaminantes adsorbidos en su superficie. Dado que en losprimeros experimentos de clonado no contabamos con "probes"específicos para selecionar clones que contuviesen cDNAde VFA,fue necesario realizar un paso últerior de purificación del RNAgenomico, es decir un gradiente discontinuo de sacarosa (ver111.1.5). asegurando de este modo que mas del 95% del acidonucleico obtenido corresponde a RNAviral. En la figura V.1.3puede verse el perfil de sedimentación (detectado por absorbanciaa 260 nm), obtenido en una de las preparaciones.

0.0.260

pool03 ­

0,2 —

0,1P'Top" FondoN' de fraccnones

Figura V.1.3: Perfil de sedimentación de ¡un gradiente dcsacarosa discontinuo 15-30% del RNAextraido de los virinnes

Puede observarse un pico de 35 s correspondiente al RNAgenomico.

Es de destacar que si bien considerabamos que el RNA\i."alera puro, esto fue en contra de la calidad del mismo ya que lamanipulación adicional realizada aumentó el riesgo de degradación.De todos modos en esta etapa considerabamos mas importante lapureza del RNAque su integridad (ver V.2.J y v.2.3!.

El RNAobtenido de] pico de 37s del gradiente discontinuo dosacarosa fue precipitado con EtOH y resuspendido en Hüo. Unaalícuota fue corrida en un gel de agarosa 0.7 2 ( un presencia

de 10 mM OHHgCH3(desnaturalizante). En la tigura v.1.4 puedeverse 1a fotografia obtenida de dicho gel; si bien se obsurxauna banda de alredor de 8000 nucleótidos, es notable la existenciade una gran cantidad de productos de degradación.

-128­

RNA VFA

Figura V.1.4: Gel de agarosa 0,7(OHHgCHB)(111.6).

V.2 OBTENCION DE LOS PRIMEROS CLQEES DE CDNA

v.2.1 Sintesis de_cDN¿

En la figura V.2.1.1 se muestra un esquemapasos de sintesis de CDNA,es decirz'

—transcripción inversa.—hidrolisis del RNAmolde.-puríf1cación de la primer cadena de CDNA.

%

Se utilizó como ¡nolde 1 ugr de RNA de VFA

desnaturalizante

de los primeros

(figura V.1.4) y

-129­

para iniciar la sintesis se empleó como "primer" oligo dqu ls4'." A

valiendonos de la presencia de poliA en el extremo 3' del RNAQGDÓMÍCO.

‘oligo dl-8000pbWMA

TTT

iranscriplasainversa

-2000pb. 4 n .AAAA

250 ’ TTT

Hidrolisus

H zoo ‘Alcalina9 ISO 1° aCl 0M' cDNA T"E 100ao Columna Sepharosa

so CL LB

3 Esquema dela síntesis deNtdehacciones la l° cadena de cDNA

Figura _V.2.1.]: Sintesis de la primer cadena de cDNA. Seindica esquematicamente los pasos seguidos en la sintesis dela primer cadena de cDNA(III.11.1 y IVA). Tambien se muestrael perfil de elución obtenido al cromatografiar en columna deSepharosa CL ABe] producto de la reacción (III.9.2). Finalmentese presenta la autoradiografla obtenida de la exposición de ungel de agarosa alcalina 1.0 Ss ((11.6.3). donde se ha corridoparte del CDNApurificado (se uso como marcadores DNAdel fagolamnda/Hindlll).

La transcripción inversa se llevo a cabo como se describioen 111.1 1.1 _v en IVA Luego de esta reacción se procedio aeliminar el RNAmediante hidrólisis alcalina (ver III.11.2.1.1>.

-130—

La primer cadena de CDNAfue separada de oligonucleotidos deRNA,nucleótidos y otros componentes, incluido el buffer de reac­cion, mediante una cromatografla en columna de sepharosa CL ¿B(figura \.2.1.1). El rendimiento de la sintesis fue de 0,2 “gr.calculado en base a la radioactividad incorporada a una fracciónque precipita con TCA(ver lI¡.9.5).

Para comprobar la calidad de la cadena sintetizada una alícuotadel pico de CDNAfue corrida en un gel de agarosa alcalina 1,0%(figura v.2.1.1). Según la autorradiografia obtenida de dichogel la mayor parte del CDNAera de 6500 a 2000 nucleOtidos delongitud.

Al proceder a la sintesxs de la segunda cadena se eligió. enestos experimentos. el metodo que utiliza el extremo 3' de laprimer cadena como "primer" para comenzar la segunda. Como seve en la figura V.2.1.2 luego de la incubación con el fragmentogrande de la DNA polimerasa (“Klenow">. se purifico el cDNAdoble cadena en columna de Sepharosa CL hB, el perfil de elucionde dicha columna indica que la sintesis rindió 0,38 por (figurav.2.1.2). El gel de agarosa alcalina (0,7%) demostro que el cDNAdoble cadena migraba según un peso molecular de cerca de los13 kpb, es decir el doble del peso molecular calculado para laprimer cadena (Fig.V.2.1.2). Esto esta de acuerdo con las rela­ciones de peso moleculares esperada. debido a la existencia dela horquilla ("hairpin") que une covalentementel a la prime: ysegunda cadena.

Futuna

a: IJOOOpb

‘00- zm*“—1rrDNA Pol‘Illrnuwl

.6 z 6500ph’ "M'c::::::r"T. um...E ¡oo crewñv

Cmmaloquh:¡oo (ola-maSoberana"

e (Ma deminas deN. de "¡canes F cadena ú (DNA

Figura V.2.1Lg: Sintesis de la segunda cadena de CDNA.Se puede observar la representación esquemática del procedimientoseguido para sintetizar la segunda cadena y el perfil de elucibnobtenido al pasar el producto de reacción por columna de SepharosaCL-áB (111.9.2). Tambien se puede ver la imagen autorradiograficade un gel de agarosa alcalina (0,7 %>, donde se ha separado elproducto de sintesis de la primera y segunda cadena.

El proximo paso fue eliminar dicha horquilla mediante la utili­zación de la nucleasa Sl. Dado que dicha nucleasa puede. en cieretas concentraciones degradar DNAdoble cadena. Por lo tanto paraencontrar las condiciones óptimas de la en¿ima se digirieiunalicuotas de CDNA con cantidades crecientes de la misma(lll.11.2.1.3). Los productos de digestión fueron analizadosen un gel de agarosa alcalina 1.0% (fig.v.2.1.3), asi se comprubuque la cantidad necesaria para eliminar la horquilla. sinhidrolizar la doble cadena de cDNA.era de 0.39 a 3.9 unidades.Dado este resultado se decidió utilizar 200 unidades de uucleasapara digerir el resto del cDNA,ya que cada alícuota representannel 1.0% del total.

-132­

r12 a 4 ss.-. . r Ae ' quin «Ich.¡”MA c::::“"

. _ Hull-u Sp23,l2— ‘(hwmm cunu- '

6.3- . . ‘DNAm (mu-«1u- í, ____, , ‘ -:a".:...-—

CIOIAIOGIAFIAu "lun-u IM" lul'mg)

Esquema de digestion del ’Hanrpin2).. LODP2.0­

L Ge!de Aqarosa Alcalmo (1,0%)

l: 0,0039 L:2:0,039U3: 0,39U

c 4:3,9U056- 5=39U

6: Sm enzima

Figugg_y.2.1.3: Hidrolisis de la horquilla (digestión connucleasa s ). Se muestra una representación esquematica de estepaso. Tamblen se puede ver la imagen autorradiografica obtenidaal exponer un ge] de agarosa alcalina (1,0 %) donde se separaronlos productos de digestión con distintas concentraciones de dichanucleasa.

V.2.2 Clonado del cDNA

Como vector de clonado se eligió e] plásmido pBR322 (esquemaV.2.2.1), e] cual fue digeridó con Pstl y se adicionaron homopoli­meros de dG en los extremos 3' (ver III.12.1 y IV.5.1).

-133—

pBR 322(4362 b p)

Esggema_ V.2.;A¿: Vector de clonado. Se representa elplásmido pBR322, indicandose su tamano la pOSiCiOn relativa delos genes de resistencia a antibióticos (Tc y Amp) y algunossitios de» restricción. Enzimas de restricción: E, EcoR]; H,HindIII; B, BamHI; P. PstI.

Comose mencionó en IV.5.1 la longitud de las colas de dc cons­tituyen un factor fundamental para obtener una buena eficienciade clonado, por lo tanto se determinó el tiempo de incorporacionnecesario para obtener, en promedio, 25 nucleótidos en los extre­mos del cDNA. En la figura V.2.2.1 se ve que la incorporaciones lineal con el tiempo (al menos.hasta los A0 min.) y que eltiempo requerido es de 15 min.

Una vez obtenido el cDNAxpoliCeste fue ensamblado con el vectorde clonado (esquema V.2i2.1). sigiendo el procedimiento descriptoen III.12.2 y IV.5.2 . Finalmente se procedió a l‘ansformai E.coliMC1061 (ver 111.4), seleccionando los clon:: resistentes a

ltetraciclina (Tc). La tabla V.2.2.1 muestxi el número detransformantes obtenido en tres experimentos de transformacionindependientes. Es evidente que comoresultado Wedicho ensamblajese produjo un incremento del número de trans ormantes, lo cuál

constituyó un fuerte indicio de haber obtenido plásmidosrecombinantes.

P BR 322 C DNA2:1-,:r;-,/, mP ORi Tc P

dew; 32:22:23“ ldCTPo

8 / cE ¿o_ . Ï mc____.__.cc2 -/gw- /á 20__ 0/ Ensamblado-.: / (68°C,Ghs)8 o75’ m" o]Zí “Transformación_._L_L__|__L__L_1_._1_

5 1015 202530 40Tümpo(mm)

Esquema de “Tailing"y ensamblado

F'gura _y¿gég¿¿: Adición de homopolimeros de dC en losextremos del cDNA. Puede verse una represntación esquemáticade los ultimos pasos del clonado molecular ("tailing", ensambladoy transformación). Tambien se presenta la curva obtenida deincorporación de nucleótidos en los extremos 3' del CDNA(IX.5).

TabL' v.2.2.1: Transformación con el producto de ensamblajeentre e] cDNA/dCy el vector de clonado KpBRBZZ/GG).

VECTOR CDNA/dC N“ DE TRANSFORMANTES

0.04 ugr - 2— 0,029 ugr 0

0,014 ugï‘ 0,029 pg!“ 15

-135­

v.2.3 Seleccion de clones portadores qe_cDNAde VFA

La selecion de clones que portaban cDNAde VFA se realizo me"diante hibridizaciún en colonias. En la figura V.2.3 se esquematlza el proceso utilizado para seleccionar los clones recombinantes.El tratamiento realizado en cada paso de hibridlzacion fue detaullado en 111.10

El "probe" utilizado fue RNAde VFAmarcado por fosforilacioncon pulinucleótido quinasa y ATP32P (ver 111.0.á). Es importantedestacar que según las caracterizaciones realizadas al RNAdeVFApurificado. este parece ser altamente puro xmayor al 95?).por lo tanto aun admitiendo la existencia de algun contaminanteel "probe" estará'constituido fundamentalmentepor oligonucleoti­dos de RNA de VFA.

El proceso de selección implicó tres ciclos de hibridaciónpara finalmente seleccionar 9 clones, los cuales fueron sometidosa una caracterización ulterior.

Nota 1: Las hibridizaciones fueronllevadas a cabo en condi­ciones que permiten una asociación entre moléculas de ácidosnucleicos con un 85x de homologla.

Nota 2: El procedimiento antes descripto fue utilizado entodos los experimentos de hibridización en colonia reali¿adosen este trabajo, obviamente con el consecuente cambio de "probe'

-1'36­

O mmrow-suAQE»V

A coloniasabsorbidas

z»dosnalvuliueio'nmv nliuflón A

¿37‘ apprcha'briduión

'probe'u Nihflduión

'toompickhg‘

OXFOSOCIOI!i SII-vadoy.

Figura V.2.3: Esquemade hibridización en colonias. Se indicael procedimiento seguido en un experimento de seleccion porhibridizacíon en colonias. A partir de la caja de petri dondese ha sembrado el producto de transformación (III.4.2>, se obtieneuna "impronta" sobre un filtro de papel (w-541), adecuadamentemarcado. Las bacterias adsorbidas al filtro son sometidas adistintos tratamientos (ruptura, desnaturalizacion, etc.) parafinalmente obtener una imagen autorradiografica donde se observanmarcas que indican la hibridización positiva en determinadaszonas del filtro. Estas marcas coinciden con zonas de la placade petri que contiene parte de 1a colonia origina]. De estaszonas se toman bacterias 3/ se estrian sobre una nueva caja depetri. Las estrías generadas de esta manera son nuevamentehibridizadas y así se obtiene un enrriquecimiento de los clonesrecombinantes los cuales son estriados en otra placa. Coloniasaisladas de estas estrías son "toothpicked"en dos placas, unade ellas es analiZada por medio de una nueva hibridizaciónrescatando finalmente el clon puro de la otra placa (placamaestra). Este último paso se realiza para evitar que ladistorción de las colonias producida al poner el filtro sobrela superficie del agar contamine el clon seleccionado con unovecino. '

—137­

v.2.4 Caracterizacion de los clones seleccionados

Los plasmidos contenidos en los clones selecionados fueronextraídos y purificados utilizando los metodos descriptns en111.5 y posteriormente sometidos a una electroforesis en gelde agarosa 0,8%. Se estimó e] peso molecular de los plásmidosrecombinantes a partir de dicha corrida electroforetica y enla tabla de la figura v.2.4.1 se describe el tamaño estimadopara cada plasmido y su inserto. Los tamaños de inserto obtenidoresultaron de alrededor de 0,19 a 2,18 kpb.

(LUN TAMAÑO l Kbp)PLASMHJO INSERTO

9011 5.64 1,31.

poI 1 5,48 ua

90‘! 5,91 un

90,L 6,48 me

po‘s wi 039

90‘6 ¿.97 0.67

90‘7 sic 2,10

pc‘s LJO ago

;a,9 5.41 LH

Ejgura V.2.4.1: Corrida electroforetica de los plásmidosrecomhinantes obtenidos en gel de agarosa 0,8%. Los PM indicadosfueron estimados utilizando plasmidos marcadores de la cepa V­517 (IV.2.1).

Dado que la transcriptasa inversa y la DNApol I (Klenow) puedenterminar la poiimerización antes de llegar a1 extremo de 1a mole­cula molde, era necesario determinar que zona del genoma de VFArepresentaban estos clones. Para contar con información en estesentido se construyo un mapa de restricción de los clonesobtenidos.

A modo de ejemplo se muestra en la figura V.2.4.2 el gel deagarosa 3' el mapa obtenido para uno de los clones (po -7). Ya

. .206 . , .que se conoc1a el mapa de la cepa 01K se lnLenro ublcar 105clones en base a los mapas de restricción obtenidos.

BH-E

O,56—

p E}4 B ' P P H B P

| ¡EE L ' ' WwwTcl’ L.___l

1Kpb

Figura V.2.4.2: Elaboración del mapa de restrÍCCIÜn parael p01—7. Se presenta la fotografía del ge] de agarosa (0,8 2)en el que se han corrido los productos de digestión con y, BamHI;H,HíndIIl y E,Ec0RI del plásmido p01-7. Tambien se ¡nuestra elpatrón electroforetico seguido por el plásmido intacto (w). Enla parte inferior se indica el mapa de restricción deducido parae] pOl-7, la barra indica el inserto, la linea representa elvector. Los sitios de resrricción P.PstI fueron determinadosen un experimento no mostrado.

En la figura V.2.4.3 puede verse un esquema de la posiciónque tendrian 5 de los 9 clones. Si bien los 010nes ubicados cu«brirían gran parte del extremo 3’ del RNA (alrededor de ¿000nucleútidos), no se contaba aún con pruebas irrefutables de quedicha ubicación fuera 1a correcta. En este sentido la diferencia

de una base entre la cepa 01K 3' la OIC podrian determinar la

-139­

aparicion o desaparición de los sitios de restricción tomadosTomoreferencia. Por otro lado es de destacar que con los datosobtenidos del mapa elaborado con estas a enzimas, fue impesihledeterminar la ubicacion los a clones restantes.

poly C

Í. fl Hm‘ ÏVP‘Ï V92 I vn: | Vpl I m I Pal. LPM no. I P56 J'o ¡0'00 20'00 30'00 ¿0'00 50'00 60'00 1000 W" “

¿ï é á 2‘. á 4

Po¡"—l_lpO¡-2;__¡ J

pqa_¿________s

pQ-¿L I n . .

,ch__¿_¿_________d

¿Laura V;g¿4.3: Posición de algunos insertos de cDNArespecto a] RNAgenomico. La barra superior representa ei RNAviral; indicandose los diferentes "genes". La linea inmediatamenteinferior muestra ei mapa fisico publicado por Kurtz et al (¿06).Por debajo se muestra la posición de 5 insertos de CDNA,pertenecientes a otros tantos plasmidos recombinantes, cuyadenominación se indica a 1a izquierda de cada uno de ellos.

Para resolver estas anhigüedades se resolvio obtener la secuen­cia de pequeños sectores de los insertos para contar de estemodocon datos mas precisos que permitiecen ubicarlos definitiva­mente. En la Figura v.2.4.4 se puede apreciar la estrategiaseguida para obtener la secuencia de cuatros clones, los cualesresultaron ser los más interesantes (ver mas adelante). Losplasmidos fueron digeridos con diferentes enzimas de restricción(dichas enzimas generan extremos protruyentes en 5'). Los

-140­

fragmentos de DNA fueron marcados con la enzima "Klenow" (verIII.9.3>, re digeridos con PstI y separados en gel depolíacrilamida 6%. Finalmente los fragmentos marcados en un soloextremo se eluyeron según III.13.2.2 . Las reacciones dedegradación especifica fueron realizadas tal como se detallaen I]I.13.3 . En la Figura V.2.A.4 se presenta el gel de

secuenciaciOn obtenido para uno de los Clones secuenciados (pol­75.

KlenowdXTP'

P51 l

Get Acn|ormdo 5V.

MaKam y Gilber!

‘ I.

‘ “secuenciaciónpor—

I

,

' 2

¡ Ü ¿:Ï’N fW

06

3no’u‘.‘ln¡Quan

,¡wfI

‘WOH?!

E¿gura.wy.2.4.4: Esquema del proceso seguido para obtenerparte de la secuencia de los distintos clones.

-14]­

En base a la smcuencia obtenida para cada uno de los clonesse pudo encontrar' la posición exacta de estos -reSpecto al RNAgenomico (figura v.2.4.5).

SEQFIT y

Para la comparacionde

se usó el programade computación la secuencia referencia uitlizadafue la indicada más arriba.17

poin polyl­

ï r] [ïgizo¡ IVpAI Vp2 l Vp3 l Vp1 I P12 ] 934 lPiL vaq PZOb I 955 47] f| i I ‘Ï I lo ¡ooo 2000 3000 ¿ooo 5000 -eooo 7ooo ;;%o

HE e HX xl . l l i l i f 7 T ‘Ï

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¡7h!

los 4clonespequeños fragmentos.

insertos dedede iosnucleótidosFiguggm_v.2.4.5: Posición

en base a la secuencia deSe indica el sector del CDNAsecuenciado y la secuencia obtenidacomparada con la de referencia (01K). Los asteriscos indicancoincidencia en ese punto.

Comopuede apreciarse (fig V.2.A.5) tres de los clones cubríane] extremo 3’ coincidiendo con lo deducido a partir del mapade restricc1ón. Sin embargo sorprendentemente uno de los ú clonesno posicionados inicialmente (polfi) fue ubicado cerca del extremo5' de] RNA, en la zona que contiene los codones de iniciaciónde la traducción. Comose verá más adelante este clon constituyóuna valiosa herramienta para la selección de nuevos clones.

V.3 "CAMINATA" SOBRE EL RNA VIRAL

EJ termino "caminata" ("walking") sobre el RNAse refiere ala estrategia seguida para obtener clones que representen todoel RNA gEnÓmÍCO. El procedimiento consiste en utilizar como"probe" un fragmento de DNAubicado en el extremo de un insertode CDNA. extremo que es el más cercano a la porcion de genomabuscada. Este fragmento es utilizado para selecionar nuevos clonesque se superpongan con el clon antes mencionado pero que seprolongen cubriendo la zona buscada. En el esquema V.3 se puede

apreciar los Clones utilizados para iniciar la "caminata" ( pol»3 y polrói y las flechas en lineas discontinuas representan ladirección de la "caminata".

¡'0in poiyA

l' n “mecha vpz 1 vo: I Vpl F12 L PJL Fu. W no» I P56 J?á 10:30 zo'oo 3800 1.0100 geo so'oo 1ooo aooo

90,4%.: 901-]

.I.4..........-—-......-..._.- . ....._....--.-..

¿Lguggujggz Esquema de ha estrategia de "caminata" sobreel RNA. Se muestra un esquema de] RNAviral y los insertos decDNA utilizados para iniciar la "caminata". Las flechasrepresentan el sentido de la misma.

-143­

v.3.1 sintesis de cDNA(metodo de RNasa H)

Para estos experimentos de clonado se realizó una nueva sintesisde CDNAutilizando el "metodo de la RNasa H". dado que este ofrecela ventaja de que la segunda cadena de cDNAposee una longitudmayor y por lo tanto aumenta la posibilidad de obtener insertosde CDNAque cubran porciones de genoma no obtenidas por el otroprocedimiento (ver Ill.11.2.2).

En la figura V.3.1.1 se presenta un esquema de los pasos «jesintesis seguidos En la parte a) de la misma figura se muestrael perfil de elucion obtenido luego de separar el cDNAdoblecadena de los componentes del medio de incubación. Puedendiferenciarse dos componentes que conforman el pico de (DNA("pool"). Es destacable que no hemos ¡mdido explicar ¡a que sedebe tal conportamiento dado que el analisis mediante geles deagarosa de esos componentes no reveló diferencias significaLivasentre ellos ( datos no mostrados).

Una electroforesis en gel alcalino de agarosa 1,0% de los pro­ductos obtenidos de ha sintesis de la puimera 3/ segunda cadenademuestra la excelente calidad del CDNAobtenido (Fig V.3.'.1>

Es necesario hacer notar que dado que ios radioisótopos fueronadicionados exclusivamente en la reacción de sintesis de lasegunda cadena, la imagen observada en gel de la figura V.3_1.l(2da cadena) corresponde exclusivamente a] cDNAde doble cadena.teoricamente clonable.

"144­

1°Cadena2°Cadena

(-l (0')- WWW ‘m" ‘“ (Kpb) (Kpb)

o .

¡oo¡- ‘úáïïéïim .V I I

90- MAvn 23D_ « _23

80" ‘Ruuo H 910- _95,3- .p —6,3_ nn... nn..- 192"- -— —4,27° ____.:::

60- ‘DNApon 2'3_ :23ñ -- - —_ _ 2'o_ - 2,0

9 sob cadenaI ‘ligulE¿o smash” a» -0,56aU 30 '.

Filiracionen

20 Sepharosa ¿B

w

Electroforesis en Agarosa Alcalma0%)

N’ de fracciones

Figura v.3.¿;¿; Sintesis (ha CDNA(metodo de RNasa li). Serepresenta en el cuadrante superior derecho un esquema delprotocolo segido. Se muestra tambien el perfil de elución obtenidoal pasar el producto de sintesis por una columna de SepharosaCL AB, se indica el conjunto de fracciones reunidas como cDNA("pool"). En la parte inferior se muestran las auto radiografíasobtenidas al exponer geles de >agarosa alcalina 1.0% (111.6.3)donde se corrieron los productos de la sintesis de la primery segundq cadena de CDNA, indicandose la posición de losmarcadores de PM.

El CDNAobtenido de la forma explicada en los parrafos anterio­res fue ligado al vector pAT153erull/8 (esquema V.3.1>, digeridocon PvuII (Ill.7.1>, desfosforilado (111.8.1J. teniendo en cuentalos detalles experimentales explicados en los puntos 111.8.2y IV.3 . Notese que clonando en el sitio PvuII del pAT153quuII/8es posible escindir el inserto por digestión con ECORJo Hindllly BamHl.

—145—

pAT153-PvuIl/8

Esquema V.3.1: Esquema del vector de clonado «pAT153»PvuII/B). Se indican el sitio de clonado (Pvull) y los sitiosflanqueanLes que permiien la recuperación de] inserto; tambiénse muestra la ubicación del gen de Bnlactamasa (Amp > y el origende replicación (ColEi)

En la figura V.3.1.2 se esquematiza la reacción de ligado(blunt-end). El diagrama de barras de la misma figura representael nivel de transformación obtenido en experimentos paralelosen los cuales se utilizó cantidades cretientes de CUNAligadoal vector en las condiciones descriptas anteriormente (III.8y Iv.3). Utilizando 6,5 ui de CDNAen cada ieaCiOn para ligarel resto del CDNAse obtuvo alrededor de 15000 clones los cualesfueron examinados con diferentes "probes" (ver mas adelante).

8 Vector EHP cDNAP P

L Amp

600 ‘fosfatasc ‘50°“ Ï'zzïTLMALigasa

É; 400­¿i

É 300­2 zoo­U)C

g 100­% C»

0,15 0,65 1,5 5.5 TransformacionVolumen de cDNA

AFiguri_.V.3.1.2: Ligado "blunt-end" del cDNAal vector declonado. En el cuadrante superior derecho se presenta un esquemadel proceso seguido en el ligado. El diagrama de barras resumeel resultado obtenido en la transformación utilizando mezclasde ligado con distintas cantidades de cDNA(pueba piloto).

v.3.2 Selección y caracterización de clones representativosdelfragmento "L" del RNAgenómíco

Comose explicó en los puntos precedentes, la "caminata" sobre

el RNAse efectuó a partir "pr'obes" contenidos en los insertosde los clones pol-3 y pol-6 (ver esquema V.3 ).

v.3.2.1 Seleción aspartir del p01;;

La figura V.3.2.1.1 muestra la porción del genoma de VFA que

conLiene al clon pol-3. E] esquema muestra los sitios derestricción empleados para generar el fragmento de CDNAutilizadocomo "probe" (xnol y HindIIl). La obtención del "probe" se esquematiza tambien en la misma figura. El plasmido fue digerido conXhol y Hindlll y los fragmentos fueron marcados por "fill-in"y el fragmento "probe" se purificó mediante una electroforesisen ge] de poliacrilamida 6%(Fig.v.3.2.1.1).

La barra inferior de la figura representa el inserto del clonpol-53 e] cual se superpone con el pol-3 pero se extiende hacialos extremos 5‘ 3/ 3'del RNA. La exarLa posicion de este Clnnfue obtenida a partir de ia comparación de la secuencia de]

extremo del inserto con la secuencia de la cepa 01K (ve: parteinferior de la figura).

El clon pol-53 fue utilizado para continuar con la "caminata"hacia el 5' de] RNA.En la figura V.3.2.1 2 se presenta un esquema

de la ubicacion del clon pol-53 , asi como los sitios derestricción utilizados para obtener el "probe" (BamHly HindIII‘.la forma como se generó el "probe"<restricción y marCado) y laantorradiografia del gel de purificación del mismo. Por últimose esquematiza el inserto del clon pol-37 (su longitud yposición). En el recuadro inferior se indica la secuencia obtenidapara el extremo del inserto , dato utilizado para otorqarle unaposición exacta respecto al RNAgenOmico.

- 148­

5.o­

M c'o'n del probe L J I l á 3O Oh I Vp3 Vpl P12 P34 914 P2 b

í I J l J. Mel I o up 2000 3000 4000 5000 6000

lhol

HGMIl Gehl 6.]. H xx “nmónpolucnlamida po-3—u—.—_____l

H ¡Full ml 1 Ip lo N *probe ­

N?

o pormï MH fi 1 E Efíf’í

Plot!"—"" / \n7zxmgluszYCVOSÉ’KCCOIVWZAWVvvgleTYYVOACÉ’H;CYCWmnano-on 000......0 ooooncnlionocancun...mvvnwcqucuvm musa: 2:33:23?3:22:33:

’ ll l Jl ll Slfl 34' 307 M M7

Elgggg“_y.3.2.1.1: "Caminata" a partir de po —3. La barrasuperior esquematiza la porción del RNA genomico involucradoen este experimento (los números por debajo corresponden al númerode nucleotidos respecto al RNAcompleto), indicandose los "genes"contenidos en esta zona. Por debajo de 1a barra superior seesquematiza con una linea el inserto del clon empleado paraobtener el "probe". mostrandose los sitios de restricciónempleados para generar el fragmento (se indica el fragmento"probe" y los asteriscos indican la posicion de la marca, P-32).En el cuadrante de la izquierda se puede observar el protocolosegido para obtener el "probe" radioactivo y la autorradiografiadel gel de poliacrilamida empleado para su purificación. La lineainferior indica el inserto del Clon seleccionado, su mapa derestricción y su denominación. Por debajo se muestra lacomparacion de secuencias entre una pequeña porción del insertode] Clon y la sequencia de nucleotidos compíeta de la cepao K.(17>. En ese recuadro se indica la hilera de nucleotidosque corresponde a 01K y a (HC, Lxusasteriscos entre elias indicanconicidenria de nucleotido.

Obtencnon del Probe

“149­

3robe‘——--­

«r ] Vp3 I Vp1. l P12| l P31. 1P“. J ] PZOb1 Ï Ï

gmc Si] 3000 ¿000 5000 6000am Gel 67a

. Poluacnlamma B HM c on¡Éïfiïn'p p 01'53 L 1 J

,, 3k“probebaak

BF SFHXFX FX FEFFFXpO1-37L Jl 1 1 ¡111 11 l 11111

‘

2339 29.8 2535(Y VC‘.YLÁC1ÏV GACATGVCÏY ÏCCCÁÜCAM.Ivhnocooh ¡o .ooac-u ¡Da-0090.. ooo-.0. ¡o

Lp’, A! A'JCCÏCCY 1CÏVLMVY‘ iAtAVCÏCYT TCOCAOCCM" 3] il ’Í29-- 257. Mim ¡ave :eoe rom

“AAAYCVCA AAC

¡31332: 22vll 7]

Eigura_y¿3.2.1.2: "Caminata" a partir de] po -3 . En estecaso utilizando un fragmento del clon pol-53 como "probe".<paraotras referencias ver fig.v.3.2.1.1)

Es necesario destacar que este clon cubre la zona que codificapara la proteína P20b que no había sido clonada aún (ver esquemaV.2.A.5). y por otro es portador de] "gen" de Vpl completo yparte de Vp3. Este clon fue utilizado en los experimentos deexpresión realizados en este trabajo y que se describiranulteriormente.

V.3.2.2 Selección a partir del p01¿é

El clon pol-6 se encuentra ubicado en la zona del genoma quecodifica para P20a/16 (región amino-terminal de la poliproteína).La figura V.3.2.2 muestra la posición relativa del p01—6, lossitios de restrlccion empleados en la generación del "probe"kHindIII y ECORI), un esquema mostrando la estrategia de cortado

FJ

\

fill

-150m

y marcado del "probe" y la autoradiografia del gel de poliacri­lamida 6%utilizado para su purificación.

obtencuon del probe polyCO

5 r] Jl P20aIVpLI sz l Vp3 l Vpl puEcoRl I

"Ind!" Ge! 67. O 1000 2000 3000Marcano" acnhmnda(Full mi H E

Ir! p0r6L¿_L4'h­- \‘pr°be"*—*

probes“»- E FuFFj p01638.V /\

HH F H 4.:igual-inca¡{Fauna-¿22€

- / \ ":t‘32:37:::zzzïcgysamzzg¡- ‘ w un un rw

,(-'LAG| V!V hi ' ¿VCCY‘C(CMCG'AM AGWW'M‘CCMWCV#’&WC°WC"9...... "A"... . .......... .n un" «unn» 0.0.000“.:‘x“cun¡:1icrcr.cácuccunnmuuna cuencchmean:| .

lh‘l ¡7' ID; la

Figura V.3.2.2: "Caminata" a partir de po —6. Otrasreferencias en la figura V.3.2.1.1. En este experimentolse utilizóel fragmento HindIII-ECORI del p01—6como "probe".

Las barras inferióres esquematizan los insertos de los clones

po «6(a) y pol-638 los cuales cubren zonas del RNAhacia el 5'IDHy 1 3' respectivamente, respecto al pol-6

Los recuadros inferiores muestran 3a secuencias obtenidas paralos extremos de los insertos de los clones p01»6(4) y p0,—63B,J.

comparados con la secuencia de la cepa de VFA01K; estos datosFueron empleados, como en los casos anteriores, para ubicar losclones respecto al RNA.

El inserto del clon p01—6(4) cubre 1a porción del RNAque vadesde e] extremo 3‘ del polic hasta los rmimeros codones de lapoliproteína. El inserto de] pol-638 cubre desde p20a hasta sz.

F

v.3.2.3 Selección por doble hibridización

Contando cnn los Clones descripios en los parrafos anterioresse disponía de insertos que representaban casi toda la región3' respecto al poliC (fragmento "L”>, excepto una zona faltante("gap") correspondiente a una porción de alrededor de 450nucleutidos (ver figura V.3.2.3>. Para obtener dicha porciónse realizó un experimento de hibridización con dos "probes",

uno de ellos perteneciente al inserto del clon pol-638 y el otroal pol-37, clones que flanquean dicha zona ("nan"). Nuestrorazonamiento fue que una colonia que hibridizara con ambos"probes" deberia Contener la zona buscada.

obtención de los “proba”

llmalvv‘l l l l mlImÍ i

a. _ ¡ooo 2000 30'00 4000

H

B

nal (ñnMi

pH

90163

FwI m ración 09W“ Marcación pofigg. u¡ ¡ por”; ¡,3lhunlGas . Gfl6%n

¡»Marulanda poiucn lamuda

d * *'probes’ I.._¡ L—.—_J

‘pmm'- -- 3K

UXFF FP015AP1M

.'«:- “¿o ¡.36 au“°2n. ALAZA:unc'" Art-vence vorxncn 2a ....- u. .....--... ..o....ncc atlanta-.- .un _.:cn atunu'ut “(AVCMCC1:°CKIV(AV.Ïz H m

Figura V.3.2.3: Doble Hibridización. Se indican ios "probes"utilizados spertenecienLe a‘ po —638 y a po «378 y e] inserLodel Clon obtenido: pol-GAP(1). 0.ras referencias ver fig.V.3.2.1.1

En la Figura V.3.2.3 se presenta un esquema representando la

porción de RNAbuscada (unión entre sz y Vpai; se muestran ademas

los insertos de los clones pol-638 y pol-37 y los sitios derestricción utilizados para generar los "probes" a5] como unesquema del protocolo seguido para cortar y marcar los "probes"y las autoradigrafias de los geles empleadospara purificarlos.Notese que el sitio HindII] empleado para escindir ambosfragmentos pertenece al vector.

El inserto del clon pOIGAP-J (el cual hibridizo con ambos"probes"> se encuentra ubicado respecto al RNAde La] forma quecubre la porción faltante (barra inferior). Por ultimo elresultado de secuenciamiento indicado en el recuadro inferior,confirma la posición de este clon.

A modo de resumen se presenta la figura V.3.2.ú. En ella semuestra un esquema del RNAgenómico sobre e] que se indica laubicación relativa de los distintos "genes". La linea inferiorresume el mapa de restricción deducido para el Fragmento "L"

de la cepa O1 Campos. en el cual se incluyen los sitios derestricción para 7 enzimas diferentes (EcoRI, HindiIl. BamHl.PvuII. Xhol. Smal y Hinfl).

-n. m n‘) nlMr7 ‘r ' l ’ ï '

2' ñ" WL»! l I ImI m Tu Hm-Iy u l 1 I af I0 u ¡0- ” un son ¡no no. hosts

F ll E ¡0.! F IF I F 0| F'.'. .1 “EL . HL“?! .1 HHH 'thÏ/‘ij

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“o. _ ,1:- ¡.cumuuu-ul"fl” W— aus-ulUn'wlll-l’hnlSus-lF-HIRFI'.'I|l

Elgg;g_1¿g¿g;g: Mapa físico del genoma de kFA , ¡m31cjunde los distintos clones de cDNA. La parte suporlor muestra elmapa flsjco y genético del RNA de VFA. En Ea Segunda linea Seindica el mapa de restrtción obtenido para la cepa o Campos.Las distintas lineas inferiores indican los insertos de 105distintos clones selecionados. Debajo de algunos de los insertosse muestran pequeñas lineas más gruesas que representan losdistintos "probes" empleados en el proceso de selección.

Las lineas ubicadas por debajo del mapade restricción represen­tan los insertos de los clones mas importantes. A la derechade cada linea se encuentra la nominación utilizada para designarcada clon.

Como puede apreciarse en este esquema el caujunln de estusclones representan el fragmento "L" Cumplero «alrededor de 8000nucleotidos). es decir la ¡una del genoma que codifica para lapoliproteina y regiones flanqueantes.

-15A­

V.A SECUENCIACIQN DEL "QEN" DE VQ]

v.4.1 Secuenciación de CDNA

La Secuenciación fue llevada a cabo utili2ando el metodo deMaxamy Gilbert. con las particularidades detaliadeas en 111.13

E1 maicado de los fragmentos se realizó utilizando los métodosde marcado de extremos de DNAespecificado en 111.9.b y III.9.cdependiendo con que enzima de restricción se digirio el DNAparagenerar los fragmentos “secuenciables”.

En la figura V.A.1 se esquematiza la estrategia de secuenciacióneiegida. como puede verse se utilizaron dos de los plasmidos

recomhinates obtenidos, e] pol-37 y el pol-53, los sitios derestricción empleados como extremo marcado se representan enla figura como [H1punto. Cada fragmento nos permitio leer cercade 200 bases Como puede verse en la misma figura la secuenciade Vpl fue deducida a partir de la lectura de ambas cadenas deCDNA.lo cual redunda en su calidad.

i Vpa J Vp1 l P|2 I PÏíAJl l

30'00 g ¿ooo

a; a + 4 .. : H 2F ¡a F ¿F H xr x

90r37‘ 3 Í -—

l ' Lé: I

5 persa-zE o;———oi

figura !¿3¿¿: Estrategia de secuenciación. Puede observarseia zona del genoma de VFA que codifica para la proteina Vp].Tambien se lepresenta los fragmentos de los clones prl-37 yp01-53> utilizados para obtener la secuencia nucleotidica. Lasflerhas representan la extención y dirección de cada experimento

De esta manera se obtuvó la secuencia nucleotídiCa completadel "gen" de Vpl y zonas flanceantes. La cual fue almacenaday procesada por computación (ver 111.14). En la figura III.L.2se presenta la secuencia obtenida para el "gen" de Vpl y parte

de los "genes" contiguos (Vp3 y P12) de la cepa OICampos. Tambiense muestra en la misma figura la secuencia aminoacídica deducidaa partir de la nucleotídica.

V93 V91

s L R L P V L' * ' “G t ÉcAlnÉr' ‘ 15A "C621c:TcgcAÉCGÉCAÉTCgïcemzcTEC:chGgCOEMghcgoA'g’chomn caccoaw:M' ' T GAC*ÍC—"GÏGC '¿fi u k-' -.-'1?,k-A; 'Ï GC ’ ACWCTAAC? ¡“CGC G o ‘ m, 4o so ¿o 7o ao 90 ¡oo no 120

T D V s F 1 n o n r: .r a v * = J n c. 1 N 1 L D L n a x P s H T L v o A L L R A sacccnccvc chr'rcm c mccacncnn c1 ¿mmm CA: A; :¿41AAAACc AAATr AACATTTTOGACCTCATOCAOATTCCATCACACACTTTOGTOMCOCTCCTACOCOCOTCC¡no ¡.20 1rw ¡oo :7: 1no no no 220 230 240200 2

yyvrsnx.E1A.'uh-'¡-_:,L¡IuVPNCAPEKALDNYTNPTAYHAACTTACTACTTCTCTGACr 7GGAGATACá‘A-‘IYLAAA'Ïu :n 2; gn "a: c 7c AC: chcTTCCAAMGGMCGCCTOAAAAOOCOTTOOACAACACCACCMCCCMCYOCTTACCACMC2:0 25€. :wu 230 2'90 300 310 320 330 340 390 sao

A P L Y R L a. '. r v 1 A P H = v L A ï v v N G E C R Y S R N A v P N v R G D L oOCACCAC‘ICACCCGG;T7cccc 1 e; CI: mc A: : GCCCCCCN: cc 1GTCTTGGCAACCGTGTACAACOCTCACTCCAGOTACAOCAOMAYOCTGTOCCCMCGTWOCTGACCTTCM37o 35:3 :z'm 400 410 42o 430 «o 450 460 ‘70 oso

v L A O K v A P 7 :_ P Ï S F I: ‘v (- A ] K A T R V T E L L Y R H K R A E T Y C F ROTOTÏGGCTCAAAAGGTGCCACGGI‘CGC1 GCCTACCTCCYTLAACVACGGTGCCATCAAAGCOACCCCWTCACCGAOTTOCTTTACCOCATWCCWCAYACTCTCCMGC

490 503 510 520 530 540 550 560 570 550 590 600Vpï P12pLLAIHP'rEARHKov.XVAPVKGTLNFDLLKLACDVESNPC

cccTTCCTCGCAATCCACCC AACTGAAGCCAGACACAAACAGAAAATI CTGGCACCGGTGAAACACACTTT ATTÏTOACCTTCTCMG TTOOCAOGAGACCTTWTCCMCCCTOCC610 520 1:30 64O e 50 660 670 680 690 700 710 720

P F F F S D V n s N F s K C#GG'YGCEAAECA'{'C02'"Cgcá?OCROGEM2CA?OTgMgWKczccgoczïcgcrfirmu cgcrLucgc1 rr nncr A GTTAG"1CGAACTTCTCCAAA . ­CCCTc 750 G 9/40 ' 750 no 77o, 730 79o aoo exo 320 eso

F 1 rI s P A y q.WHBER G. X 9 3 l 8. '15 23. 224 lO. 0¡EIC 589 2150 1018 94. 1784 697 1457. 2325. 1564. ¡632. 0.PERC BY NunBER 1, BB e c¡11' 4 23 1. 41 8 45 3, 76 7. 04 10.80 10.33 4. a? 0.00PERC. BY NEXCHT P cs 9 P5 4 :9 1, 66 7 :1 2A‘73 ó 13 9. 79 6. aa 6. 87 0.00

H o N K D E C w R c ­msn 7 IC‘ ¡c- 10 B XO 2, ' 1. 15. 9. o“Elan? veo 1:61 1141 x282 921. 1291 206, 186 2343 51:3 ousas s: 1122125?3 2 233 222 sas 262 3°; 7-“ °.°°, - ’.‘ . 4

TOTAL "u g 2375: B O. 7B 9. 86 2. ¡6 0 OOPOLARITY mou = A?

Figuras V.q¿g: Secuencia de Vpl de la cepa O Campos. Sepresenta la secuencia de nucleótidos (fila inferior d” cada ren­glón) y la aminoacídica (fila superior de cada renglón). Se indicael comienzo y final de la secuencia de Vpl y los "genes" colin­dantes. La numeración corresponde al número de nucleótidos.Tambien se muestra el analisis de los aminoácidos de Vpl. elpeso molecular esperado para esta proteína y e] indice depolaridad .

-156­

Tambien se muestra el resultado a partir" del analisis de lasecuencia mediante el programa MWCALC,esre indica para cadaaminoácido, el numero de veces que se lo eHCuentrn en la proteina,la contribución en el peso molecular, el porcentaje respectoal numero de residuos si en cuanto al peso molecular totalde la proteina. Tambien se indica el peso molecular total y elindice de polaridad que posee Vpl en esta cepa oe VFA.

v 4.2 Analisis de la secuencia de Vpl

Comose explico en la introduccion (1.5), la variabilidad inmu­nológica del VFA encuentra su fundamento molecular en el grannumero de mutaciones que se provocan como consecuenc1a de unde la ausencia de un sistema reparador. Obviamente, dadn que¡­ a proteina inmunogenica es la xmn cambios en la secuencia desu "gen" podrian representar una ventaja adaptativa 3' po: elloser seleccionada positivamente determinando la aparicion de lHlnuevo tipo o subtipo (ver 1.3.2). Por todo esto concideramosinteresante comparar la secuencia obtenida con otras re-portadas

17,209,210por OLT‘OSautores.

En la figura V.4.3 puede verse el resultado de esa comparacioncon secuencias de nucleótidos correspondientes a tres cepas dife­

rentes: OIK, Cl y A10. Es interesante destacar la alta homologiaencontrada entre has secuencias pertenecientes a CH(: 01K. Sinembargo cuando se compara con C1 o con A10 se observa una qrandivergencia de secuencias. determinandose ciertos sectores dehomologia y otros de divergencia. Un hecho sobresaliente es lagran homología observada inmediatamente despues del ultimo codondel "gen" de Vpl, lo cual confirma que mutaciones en este último"gen" son conservadas.

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la secuencia

la fila inferior co­rresponde a 01C. Los asteriscos indican homología en ese punto.

—158­

En la figura V.4.4 se ha incluido la comparación entre la se»

cuencias aminoacídicas de las 4 cepas virales (OIC versus 01K,C1 y A10). Coincidentemente con lo observado a nivel nucleoiidico,

es apreciable la alta homologia entre OIC y 01K y la divergenciarespecto a CJ y A10. Notese que existen tres zonas de alta diver­gencia (residuos 41-60. 134-160 y 196-213), zonas que se encuen»tran enmaracadas en la figura. Dichas zonas coinciden con las

9reportadas por otros autores.“10

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Figura V.4.4: Comparación de la secuencia aminoacidicade la proteína Vpl de OIC con la secuencia de Vpl de las cepas01K, C1 y A10. Se indica a que cepa corresponde cada fila deaminoácidos, los asteriscos indican coincidencia entreaminoácidos. Las zonas consideradas de alta variabilidad seencuentran enmarcadas.

Estas zonas de divergencias podrían corresponder a los epitopesinmunogénicos. Para corroborar esta presunción era necesariodeterminar SÍ estas zonas se encuentran expuestas en 1a proteina.

-159­

Como se. aclaró en la introducción (1.6.3), una aproximacióna la determinación de la estructura espacial de las proteinaspuede realizarse a partir del analisismatematico de los dominiosnidrofilicos e hidrofóbicos. En la figura v.¿..5 se presenta elresultado obtenido al analizar la secuencia aminoacídica de Vp1

de OIC mediante un programa de computación (HYDROPLOT).el cualdetermina dominios de hidrofilicidad. Comopuede observarse doszonas hidrofiiicas coinciden con regiones de alta variabilidad(134-160 y 196-213). Por otro lado, péptidos sintéticoscorrespondientes a estas zonas poseen capacidad de generaranticuerpos neutralizantes. lo cual confirma la presunción quese trataría de los epítopes inmunogenicos.

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DE VARIABILIDAD

ELgura V.4.5: Grafico de Hidrofilicidad. Se indica gradode hidrofilicidad en función de] N‘ de residuo aminoacidico (HY­DROPLOT. "ODD SPAM LENGHT=13"). Tambien se muestran las regionesde alta variabilidad.

Es importante destacar que la región ¿1-60 considerada como,­altamente variable<figura \¡.¿‘.Ó), aparece en la figura \'..'.._).

-160­

como lfll dominio hidrofóbico, por otro lado péptidos sintéticosde esta zona no poseen la capacidad de generar anticuerpos neutra­lizanïes, todo esto lleva a la conclución de que no se tratade un tercer cpitope. Sin embargo la xariabilidad de esta zonapodria representar un evento biologicamente importante ya quesi los cambios en esta zona se tradujesen en la superficie «Jela proteina como cambios conformachumles de los epitopes (verdiscusión).

V.5 EXPRESION DE VDl EN E.coli

De acuerdo a lo explicado en la introduccion sl.6.fl.ii>. lautilización de antigenes obtenidos por expresion de Vp} ensistemas bacterianos no ha dado los resultados esperados. Esasi que Vpi expresada como proteína de fusion con los primeros15 aminoácidos de la proteina "leader" del operón triptofano(LE'—Vpi)o bien utilizando el promotor izquierdo del fago Lamnda(pL), si bien poseen ia capacidad de generar anticuerposnuetralizantes, estos no inducen una proteción adecuada enbovinos. utilizando cantidades de antígeno similares a lOs

. . . 10e . . .empleados con Virus inactivado (1.6.2). J Sin embargo ev1denc1asmuyrecientes indican que se ha conseguidoobtener buena proteccioncon dosis de 250 ugr de antígeno expresado cn bacterias. Talprotección que se prolonga por al menos durante ll meses, pareceser significativamente mayor que la obtenida anteriormente (unmes 5' medio). Sin embargo este constituye por ahora el unicoindicio sobre la factibilidad de este enfoque y por ello esnecesario indagar mas extensamente este punto para poder contarcon conclusiones mas firmes.

Ademases importante destacar que cuando se comparan las curvasde anticuerpos neutralizantes obtenidas de animales convalecientesde fiebre aftosa con aquellas obtenidas de animales vacunadoscon virus inactivados se observa que la curva se prolonga en

<161­

el tiempo por alrededor de 36 meses en el primer caso, mientrasque en el segundo despues de 8 a 12 meses ha caido a nivel espor debajo de lo necesario para protejer al animal. Esto Puedeexplicarse al menos de tres formas

ilEn el caso de la infección. el virus se mantiene expuestoal sistema inmunológico por mas tiempo que en el caso de lavacunación.

iiiEl virus infeccioso produce algún tipo de proteina.que no esta esta presente en la vacuna de virus inactivado (poreje: VIAA) la cual intervendrla en la inducción de la respuestainmune prolongada.

iiilLas proteinas lnmunogenicas poseen una exposición delos epitopes que es diferente en uno y otro tipo de inmunógeno,siendo mas favorable la adoptada por el virus vivo.

Respecto a estas tres posibilidades se puede descartar laprimera ya que utilizando adyuvantes oleosos en la inoculaciónno se ha encontrado prolongación significativa de la respuesta.Estos adyuvantes liberan lentamente los antígenos manteniendolosen el sistema circulatorio por mas tiempo. Por otro lado lahipotesis que sostiene la posibilidad de que proteinas ausentesen el antígeno vacunal sean las responzables del efecto observadono parece ser consistente con el hecho de que no han sidodetectadas proteinas que posean tal actividad, y ademas Vpi-esactualmente considerada como la única proteina capaz de induciranticuerpos neutralizantes.

Por todo esto parecería ser que la hipótesis mas probable esla tercera. Es deCir que Vpi tendria una conformación diferenteen el "irus vivo respecto al inactivado. La estructura cuaternariaen este último podria ser diferente debido al proceso deinactivación. Tampoco es «descartable la posibilidad de que Vpl

«162­

se exponga al sistema inmunológico en asociacion Con ummbranascelulares (comunicación personal de E.Domingo).

Lo expuesto anteriormente puede ser aplicado para explirnrla pobre respuesta inmunológica observada en la mayoria de lostrabajos de inmunización con antígenos vacunales sin intervenciondel agente infeccioso, y en particular en el caso de vol produ­cida en bacterias por metodos de DNArecombinante.

Teniendo en cuenta lo anterior se puede afirmar que laConformación que adopta Vp1 en solución es «jiferente a la queposee en la capside intacta. Es evidente que tal conformaciónesta determinada por el entorno de la proteina.

En los experimentos de expresión llevados a cabo en nuestiolaboratorio intentamos simular la conformacnón de la xui en lacapside insertando la proteina inmunogenica en la membranaexternade E.coli con distinto grado de inclusión. utilizando unaselección inmunológica ("immuno-screening"), con anticuerposobtenidos de sueros de animales convalecientes. De tal formase podría detectar el clon portador de la Vpl de "membrana" queposeería caracteristicas conformacionalessimilares a la proteinanativa (Vpl de la capside).

Por otro lado se reconoce generalmente que antígenos particu«lados poseen la propiedad (ha despertar una respuesta inmunolo­gica mayor que antígenos solubles. cosa que otorgaria una ventajaadicional al modelo propuesto.

Por otro lado se ha visto que la actividad proteolitica enel periplama es marcadamente menor que en citoplasma lo cualrepresenta otra ventaja en nuestro modelo.

-163­

V.5.1 Vector de exoresign

Para poder lograr la expresión de Vpi en E.col_i es necesariofusionar el "gen" de Vp] a otro gen que se exprese en dicho siste­ma bacteriano. en condiciones que este ultimo gen le otorge alprimero las señales de transcripción y traducción necesarias.Además dado que se quiere que el destino final de la Vpi seala membranaexterna, es necesario que la fusión, adicionalmente.permita a Vpl contar con las señales de exportacióncorrespondientes.

El plasmido pTá207 (Fig. V.5.1) es portador de lui grupo degenes pertenecientes al fago T4 que codifican para porteinasintegrales de la membranaexterna e interna de E.coli: estasproteinas son utilizadas por el fago en el proceso deensamblamiento de la capside.208 Todos estos genes se encuentranbajo el control de un promotor viral muy eficiente. Tomando encuenta esto, resulta que el "cluster" de genes posee las señalesde transcripcion, traducción y exportación necesarias para laexpresión en menbrana.

Para ello se decidió trabajar unicamente con los primeros genesde este grupo ( p25,p26.p27 ), ya que estos son los que mejor

_ 207se expresan .y BamHly se religo (figura V.5.1). eliminando de este modocerca

Para ello se digirió el plasmido pr con Bglll

de 4000 pares de bases.

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E ¡u B lll/Bom“!°° 25 26.........9. Pstl EcoRl

pÏLAÍ: B-lactamasu

Figura V.5.1: Esquema del vector de expresión. Se indicacon una barra llena el gen de B-lactamasa (resistencia aampicilina) y con una barra rayada la posición del "cluster"de genes del fago T y la ubicación que tendría e] promotor ('Pr.)de dicho grupo de genes. Tambien se indica el sitio de religadoobtenido luego de la deleción (BglII/BamHI)’.

V.5.2 Vector de fusión del "gen" de Vpl con los qenes del

¿3.9.0.14

Para obtener diferentes grados de exposición del los epítopesde Vpl se decidio utilizar como soporte la cadena aminoacidicade la proteinas integrales de membrana (p25, p26, etc.), porello era necesario fusionar la secuencia codificante de la Vpien distintas posiciones de los genes de Th. Para lograr estoexistían dos posibilidades:

-Digerir parcialmente con una exonucleasa (Bal '31 o

Exonucleasa III) los genes de T4 y entonces ligar la secuencia

-165­

de Vpl al extremo obtenido de esta manera.—oalternativamente insertar al azar la secuencia de Vpl

utilizando el Fenomenode transposición.

De las posibilidades enunciadas en los porrafos precedentesse elegio el de inserción por transposición, pues al ser unfenomeno que tiene lugar irl vivo" es más eficiente 3' permiteobtener un número de recombinates ilimitado. Ademas tecnicamentees mas sencillo y económico.

Comose comentó en la Introducción (11.8). los derivados delfago Mu uniniflu). que conservan los extremos del genoma viral(extremos "c" y "5"), pueden ser utilizados para movilizar unadeterminada secuencia. de un replicón a otro o bien de una regióna otra del mismo replicón.

La ¡nanera de seleccionar la inserción implica la litilizaciOnde marcadores genéticos tales como genes de resistencia aantibióticos. Por otro lado la enzimas catalizadoras de latransposición pueden estar codificadas en el mismovector o bienen un fago acompañante ("helper").

En la figura V.5.2 se presenta un esquema del vector de trans­Lmsición utilizado. Como puede verse este fago miniMu posee elgen de resistencha a cloranfenicol 3/ un secuencia que codificapara las enzimas del operon Lac la cual carece de señalespromotora y de iniciación de traducción comoasi tambien de sitiosde unión a ribosomas ("Shine-Dalgarno"). Por esto el operón Lac'en PR-13 es inactivo. Sin embargo si en el proceso detranSposición esta secuencia se ubica delante de un gen ("downstream") que posee tales señales, las enzimas del operón Lacse expresaran correctamente encontrandose ahora ¡majo el contro}de un nuevo promotor. Esta sistema ha sido utilizado para analizarlas propiedades de promotores que dirigen la sintesis deproteínas de dificil detección. Nótese ademas que el extremoe del fago ininIMu, se interpone entre las putativas señales

*166­

de transcripción 3' traducción y' los genes "Lac". Debidn ¿a ESLUdebe existir un marco de lectura abierto y continuo que ¡urluyaa los genes “Lac”. En la parte inferint de ¡a figura V.5.2 puedeverse la secuencia de nucleótidüs cerrespondienLe al extremo"s" y la secuencia de aminoácidos deducidas para los (res marcosde lectura posibles. Es destacable que existe un marco de lecturaabierto en uno de los "rvading frame" &fígura V.5.2>.

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figggg_ï¿g¿gz Esquema del plásmido pPRlB. Puede verse barrasrayadas que repreentan los extremos cm númiMu, tambien se indicala ubicación del operón Lac' y: ciertos sitios (ha restrlccion.En la parte inferior puede verse la Secuencia de nucieólidoscorrespondiente al extremo "s" y 3* la secuencia de aminoácidoscodificados en los tres marcos de lectura (los asteriscasrepresentan codones de terminación). Se indica Lambien laubicación del putativo promotor (Pr) y del gen a expresar (gen"x">

Ahora bien si se remplazara la seCUania. GH] operOn Lac porla de la \331 LU!experimentzn similar' al explicadc» anteriormente

-167—

permitiría activar ¡a expresión de Vpi por inserción del miniMudeiante de secuencias regulatorias. Mas aun dado que la inserciónen la transposición se lleva a cabo en sitios al azar se puedesuponer que la fusion ocurrirá en distintos puntos de los genesde membranas.

V.5.3 Subcionado de la secuencia de Vpl en el miniMu

Por lo explicado en e} punto anterior fue necesario rempla­zar la secuencia Lac' por 1a de Vpl. En la figura V.5.3 se presen»ta el esquema experimenta] empleado a La} fin. La linea superiorde ia figura representa el plásmido portador del miniMu y lasbarras rayadas esquematizan los extremos del miniMu ("5" y "c”>.Como puede verse la secuencia de Lac' esta flanqueada por lossitios de restricción para SaiI y BamHIlos cuales son unicosen el plasmido. El pPRiB fue digerido por elio con las enzimasBamHI y SaiI y el producto de digestión fue ligado a losfragmentos generados por digestión con BamHIy XhoI del plasmido

pol-37 (ver figura V.3.2. .2). Es importante recordar que lossitios de reconocimiento para XhoI y SaiI son compatibles y puedenser ligados entre si.

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Eigura V.5.3: Subclonado de la secuencia de Vpi dentrode los extremos del miniMu (PRIB). Se indica los sitios derestricción empleados, los genes de resistencha a antibioticos(barras llenaS). los extremos del miniMu (barras rayadas) y losgenes de Lac' y Vpl.

-]68—

La selección se realizó por hibridiZación en colonias utili­zando como "probe" el fragmento BamHI-HindIII de 300 pares de

bases del plásmido pol-53 (ver figura V.3.2.1.2>.

Cuando se analizó el mapa de restricción de uno de los clonesseleccionados, se obtuvo el mostrado en la figura v 5.3. el cualcoincidía con el esperado.

Dado que contabamos con la secuencia nucleotidíca del extremo,. 211n s predijimos teoricamente el producto de la fusión entre

el miniMu y la Vpl. En la figura V.5.3.2 puede verse lassetuencias nucleotídica y aminoacídica deducidas. Notese queel marco de lectura de Vpl se mantiene en fase con el marco delectura abierto ("open reading frame") de] extremo "s".

TRADUCCION E T D V L i T A F YEXTÉREHOHSH C D vg‘ V'- N R A S NE K E 5‘ E v H L"5"E "E ‘ Tq‘TAOCTYTCGCGCTTCAAATMAACAOATGTATTMTTACTGCTTTTTATÏCATTACATGOGGATCCTGT

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D L H a x P s H T L v I; ¡S C1116le CSCG‘GTÉC YTTXCTXCTq'CTÉTORETk'OOEOAg‘AcamgñógACZCGEGOgAGRCCtÏCNÉCTgcchCÉAAXT " C ¡”TTTGG'C'GN G A C á’ ’GGKCTcsggca‘E-IJÉÉTCACÁ A 27:. i v ¡280 29o “soc 310 320 330 340 350 360

IIIan .

G a P E ' A L D r' T T p T É Kc Hc {ocÉACÉ L ECCÉGC‘ÏTGÉCGEII’GCÉCTXCAÉ02062chcgccgcáoognzccgcrkgA «¿crm-carccncm 1- CAA acrca cTGGÁGCGggBMMAGGgggTGGC :avEL L Ñ coo 'uo 420 4:0 «o 450 neo 47o 480nvsnn.,..rvchDLax-LAGKVARTLPTsé’chA¡nar

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61 O 620 ¿»SG 650 650 660 67D 680 690 700 'l l O 720

la fusión entre Vpl y el extremo "s" de} PR13. Se indica lassecuencias pertenecientes al extremo "s" 3k a Vp1 3' el sentidode Ia traducción esperado cuando se produzca la activación porinserción del miniMu.

Eigura V.5.3.2: 'Secuencia nucleotídica y aminoacídica de

-169­

Por otro lado con el objeto de verificar la fidelidad delclonado se obtuvó la secuencia del fragmento Hinfi Alu} (ZUOph) de pmMVpique teoricamente contiene el sitio de unión BamHi.La figura V.5.3.1 muestra la comparacion de la secuencia obtenida(GEL) con la deducida Leoricamente (ST).

Nota: el sitio Hinfi corresponde al nucleótido N°314 de]

genoma de OIC y el AluI pertenece al extremo "s" del PRIB.

Extremo”s”54 ¿4 74_ 84 94

S.T. GCTTTCGCGC TTCAAATGAQ A..AGATGTAT TAATTACTGC TTTTTATTCA TTACATG G****** ******üüñü*ñwaiñi°u* iiiiüioail ii***41*4ü **9***#{ iGEL , YTCGCGCfiTTCAAATGAï'48'SAGATGTAT58AATFACTGC TTTTTA'TCA TTACATG G.J 70

; Vp1124 _i34 144 154 164S.T. :GTCAC ccccecrce‘ GAAAACTACG GTGGCGAAAC ACAGATCCAG AGGCGCCAAC***i9 ñiññfi‘üáñd ü!11í**ú9* ****}*#%*í 9****44**# **4ñ***i**GEL GTCAC CGCCACTGT’ GAAAACTACG GTGGCGAAAC ACAGATCCAG AGGCGCCAAC

90 :oo 110 120 130;74 184 194 204 .214 224

S.T. ACACGGACGT CTCGTTCA'C TGGACAGAT TTGTGAAAGT QACA 'ÏGCAA AACCAAATTA*******ñ*# ****i*»wov *Qá#9a9ñüd #ü***{&1** a*á*üw1**4 **9g*****aGEL ACACGGACGT CTCGTTCAÏ'L ATGÓACALAI TTGTGAAACT GACACZÉCAA AACCAAATTA

150 ¿60 O 180 1:0L50 7234 244 354 gba 274 284

S.T. ACA TTTTCG‘A CCTCATGC ALL49ü4&**494 ófiiACATTTTGGA CCT.

GEI-¿‘00 210 ¿520 23" 24o 250

figura“ V.5.;¿g¿ Comparación de las secuencias deducidasteoricamente (ST) y obtenida por secuenciamiento del fragmentoHinfl-Alul del pmMVpl(GEL). Los astericos indican coincidenciade nucleócido en ese punto. Se encuentra enmarca.o ei sitio derecono-cimiento para BamHi.

Como se ve en la figura V.5.3.3 el SÍEÏO BamHl se encuentraintacto lo que indica que nn ha habido "accidentes" de clonado.

v.5.4 Proceso de miniMu-duceión

Se denomina miniMu-ducción al proceso de inducción de la trans­

-17o­

posición y empaquetamiento del fago Mu. Como se explicó en la­lntroducción (11.8), para lograr la transposición yempaquetamiento de un miniMu es necesario que las proteinasespeCificas sean aportadas en "trans" por un Mu acompante("helper") y es este quien controla la inducción ya quegeneralmente se utiliza un fago mutante que posee una mutacióntermosensibie en la proteina represora "c" (ts g).

La figura v.5.a muestra esquematicamente el procedimientoseguidopara obtener la inserción de la secuencia de Vpl en el plasmido

pr delta. La cepa JM108::Mucts fue transformada (metodo de Ca".¡11.4) con el plasmido pmHVpl(fig.V.5.3) y los transformantesi’uerón seleccionados con cloranfenicol (Cm) y ampicilina (Amp).

El siglente paso fue inducir la transposición v empaquetamiento.ya que la bacteria posee un Mu"helper" los productos de inducciónfuerón capsides portadoras del DNAde Mu completo y otras conel plasmido pmMVpllinealizado. donde el miniMu se ha duplicadoy se ha fusionado a una porción de cromosoma (para detalle deminiMu-ducción ver Shapirozm).

El proximo paso consistió en obtener una bacteria que tuviera

el miniMu—Vpi. el Mu gts y el vector de expresión (pT¿delta)para provocar la transposición y la inserción de la secuenciade Vpi en el pTAdelta. Para esto fue necesario obtener unabacteria que tuviese insertado en su cromósoma tanto el miniMu­Vpl como el Mugts ,v que fuese Cmr y AmpS para poder seleccionar

la transformación del pTl‘delta con ampicilina. Con los dos tiposde virus obtenidos de la inducción descripta anteriormente serealizó unn infección de la cepa de 5_.coli HBIOI (recordar queesta cepa es Reef), donde la relación virus a bacterias fuede 10 a 1 ("super-infección”). Se seleccionó los clonesresistentes a Cm y sensibles a Amp. De esta manera se obtuvouna cepa que tenia en su cromósoma el Mu gts y el miniMu-Vpl.Dado que la cepa receptora (HBIOI) es RecA- el mecanismo de

M l N l MUDUCCION

Vp|CmF 39

‘Tonn-Jotmonon (JM‘OB Muzls)

VI

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‘lndutnon“rc;¡I ‘u

Vp|Mu Amp

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‘ Empoquelomnnlo

lnletnón n hoyomulhphccdod moon Rec A‘)

¡unu'noscncï mno

kEmigllgíflyéíggz Esquema del proceso de miniMuducción. 50

representan los distintos pasos empleados. para generar Ia cepacapaz de provocar la inserción del míniMu-—Vp]en el plasmar.de expresión (pTa delta). Para más detalles ver el texto.

—172—

conservacion empleado por el miniMu fue el de inserción en elcromosoma, utilizando las enzimas ofrecidas en "trans" por elfago Mugts en la co-infección.

El siguiente paso fue transformar esta cepa con e] vector deexpresión seleccionando por resistencia a Amp. De esta formase contaba con una bacteria que podia ser inducida a transponer

la secuencia de Vpl al pTá en sitios al azar.

Para generar la "biblioteca" de expresión simplemente Fue nece­sario inducnr a 42°C la transposicnon y empaquetamiento,infectara baja multiplicidad (1 a 10) la cepa MC1061(ReccA‘) y final"mente seleccionar los clones Ampr y Cmr (fig.v.5.4). En este

caso el miniMu insertado en pTádelta puede recircularizarse porrecombinacióu homologa.

v.5.5 lnmunoseelección

Los sueros (III.16.1> utilizados en la inmunoselección fueronadsorbidos con bacterias enteras MC1061transforamdas con el

pTádelta durante una noche a 4°C, seguido de la eliminación delas bacterias por centrifugación y agregado de azida sodica parala conservación de los mismos a —20“C.

Las colonias fueron adsorbidas sobre filtros de nitrocelulosay luego de un simple lavado. con TBS se realizo la incubación

con los sueros anti O1 Campos. Luego de un lavado, los filtrosfueron incubados con la proteina A-Ilzs. lavados y expuestosa pelicula autorradiografica (III.16.2). La figura V.5.5 muestrael esquema de selección inmunológica y la autorradiografiaobtenida para una de las cajas de petri analizadas.

Las colonias seleccionadas por este método fueron procesadasde acuerdo a un esquema similar al expuesto en la figura V.2.3.inesperadamente en cada paso de enriquecimiento lOs clones fueron

-173­

perdiendo su capacidad de expresión, esto se detectó a partirde la obsevación de que la propürción de clones que daban señalpositiva respecto al total era menor.luego de cada paso. Aúnmodificando las características osmOticas del medio de cultivoel efecto no pudo ser revertido.

IN MUNOSCREENING

lrnnslenmul

At.Ann0‘(ampfl

Prole‘ncA-lnvs1

.- FIIIIIDde null-celulosa

1- Ploco "de.pcln

Eigura V.Q¿j; Inmunoselección. Se indica los distintospasos seguidos en el proceso de detección de los clones queexpresan Vpl. Se‘ presenta la autorradiografia obtenida de laexposición de uno de los filtros.

Por otro lado cuando se analizarón algunos clones negativosse observó que si bien en algunos no se detectaba cambiosaparentes en otros se verificó la aparición de ciertos sitiosde restricción o la disminución del tamaño de determinadas bandas(deleciones), todos ellos relacionados directamente con lasecuencia de Vp]. En la figura V.5.6 se muestra el resultadoobtenido al digerir con BamHIy SmaI 6 plásmidos tomados al azarde entre los clones negativos del segundo "re-screening" (ver

y

MN,4‘4,,“

a

V.2.3). En los carriles 3,4 y 5 puede verse una banda de alrededorde 500 pares (ha bases (nue corresponde ¡al tamano esperado,- sinembargo los otros 3 plásmidos presentan bandas de diferentestamaño y además parece haberse generado un sitio de BamHI queoriginalmente no existia.

1 23 4545 6w:;7— bP

:3? Í?" ‘

"-500

Eigura V.5.6: Restricción de algunos clones que han dejadode expresar el péptido de fusión. Se purificarón plasmidos de6 clones tomados al azar. Estos fueron digeridos con Smal y BamHIy los productos de digestión fueron marcados por el procedimientode "fill-in" y sometidos a una electroforesis en gel depoliacrilamida 10%.

Esto no fue sorprendente a la213,214

luz de los resultados obtenidospor otros autores los cuales describierón la existencia

de un efecto letal de proteínas de fusión cuando estas sonexportadas a la membrana externa de E.coli. La razón de esteefecto sería que las proteinas quimerlcas se atascarían en elproseso de exportación impidiendo. por saturación del sistema,que proteínas bacterianas de membranaexterna sean transportadasnormalmente.

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VI.DISCUSION

V1.1 CLONADO DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA FIEBRE; AFTOSA

El hecho de contar con clones de CDNAque cubran el genoma delVFArepresenta un paso fundamental en el camino hacia la comprensiónde la biologia molecular del virus. Por ello el primer objetivoen este trabajo fue la obtención de dichos clones.

Dado que el RNA de VFA posee un tracto de poliA en el extremo3'. fue posible comenzar la síntesis de la primer cadena de cDNA

utilizando un oligonucleótido de deoxitimina (dT1q_18) como "primer"y trauscriptasa inversa como enzima polimerizante. Previamentefue necesario hallar las condiciones óptimas de este reacción (verI\’.¿a).

Es interesante destacar. como se ve en la figura IV.4.2. quela transcriptasa inversa encuentra, a lo largo del RNA. puntosde detención ("stop points"), que no corresponden a estructurassecundarias, dado que se conservan aún en presencia de un agentedesnaturalizante como el OHHgCH3.Estos "stop points" se evidenciantambien en la polimerización de la segunda cadena de cDNArealizadapor la DNApolimerasa (fragmento Klenow). Es importante destacarque los referidos "stop points" para una enzima no son los mismosnecesariamente que para la otra, por ello es que en la secuenciaciónde DNAmediante el metodo de Sanger, se utilizan ambas polimerasaspara superar ciertas ambigüedades producidas por estos fenómenos.

El cDNAde doble cadena fue tratado con la nucleasa S1 paraeliminar el "hairpin loop" (ver fig.v.2.1.3) y entonces se añadieroncolas de dC en los extremos 3' utilizando la enzima deoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT). Esta reacción es critica para obteneruna eficiencia de clonado alta y por ello fue oportunamenteoptimizada (ver lV.5.1>.

El vector utilizado en esta primera etapa fue el clasico pBR322,clonando en el sitio Pstl ubicado dentro del gen de resistencia

-l78­

a ampicilina (ver fig.v.2.2.1). Se utilizó este sitio por dosmotivos: a- La endonucleasa Pstl genera extremos 3' pwotruyentesy este tipo de extremos son mejor sustrato para la terminaltransferasa. y bh al añadir dG en el sitio Pstl este se regenera(ver fig.lll.12.1), permitiendose asi la escisión del inserto porsimple digestión con Pstl. Un inconveniente encontrado en el usode este vector fue que al ser los extremos del sitio Pstlprotruventes en 3'y al no existir otros sitios "comodos" dereconocimiento para enzimas (de restricción cercanos, no se puedemarcar los extremos por el procedimiento de "Fill-in", haciendosepor ello diiicil la caracterización del inserto (por ejemplosecuenciación del extremo). Actualmente existen vectores de clonado(por ejem.:pUC9). que son portadores de un "polylinker", siendoeste último un fragmento de DNAque contiene varios sitios paraenzimas de restricción. Esto permite clonar en Pstl y caracterizarel inserto utilizando los sitios de restricción ubicados en losflancos.

Una vez realizado el ensamblado entre el cDNAy el plasmido vectorse transformó las celulas de ggggLL (MC1061) mediante el metodo

de Caclo (ver [11.4 y IV.1). Es importante destacar que se empleóuna cepa bacteriana Rec A+, con su sistema de reparacion intacto.ya que la reparación de la unión entre el cDNAy el vector pareceríaestar mediado por este sistema.

Los clones obtenidos de esta manera fuerón analizados para detec­tar recombiuantes, mediante hibridización en colonias. Se utilizócomo "probe" RNAde VFA, altamente puro, marcado por fosforilaciónde sus extremos 5' con polinucleótido quinasa <PNK) y ATPÚ'BZP.

La utilización del RNAcomo "probe" podria generar controversiasen cuanto a la autenticidad de los clones ya que el mismo fuetambien utilizado como templado en la sisntesis de CDNA.Sin embargoes necesario destacar el alto grado de pureza del RNAutilizadoque fue purificado a traves de dos gradientes de sacarosa (ver

111.1). Por otro lado las moleculas de DNApueden representar uncontaminante significativo en el proceso de clonado. es decir quepequeñas cantidades de DNAde doble cadena pueden traducirse enuna gran proporcion de clones portadores de dicho DNA ("clonesrecombinantes contaminantes"). Sin embargo un contaminate de estascaracteristicas seria un mal sustrato para la reacción defosforilación, pues no posee grupos OH libres en los extremos 5'(ver 111.9.4). Por el contrario, las moleculas de RNAcontaminatesserian un buen sustrato para la reaccimi de PNK, pero dado quee] mayor contaminante de RNAdeberia ser rRNAy este no posee poliA.no habria una buena sintesis de cDNA.Por otro lado, la poblaciónde mRNA, por ser heterogenea, no permite Contar con una altaproporción de "probe" especifico. impidiendo detectar seña] positivaen clon contaminantes originados en e] mRNA.

Por estas razones consideramos suficientemente confiable esteprocedimiento 5/ el analisis posterior de los clones demostró quetodos los clones seleccionados eran portadores exclusivamente CDNAde VFA.

Luego de caracterizar por tamano los plásmidos recombinantes(ver fig.v.2.4.1). Se construyó un mapa de restricción para cadauno de ellos. utlizando las enzimas EcoRl, BamHl, HindIIl y Pstl.Sobre esta base se adjudicó a cada inserto una posición respectoal RNA viral mediante la comparación del mapa de restricciónobtenido por nosotros y e] publicado por Kurtz y col.para la cepa

01K.206

Utilizando este enfoque se pudo asignar una cierta posición a5 clones, mientras que para los A restantes esto no fue posible.En este sentido es interesante recordar que el cambio de un simple

nucleótido entre la cepa 01K y la OIC, podria representar la apa­rición o desaparición de sitios de restricción tomadoscomoreferen­cia. Por ello se decidio obtener la secuencia de pequenos sectoresde cada inserto y utilizar este dato para asignarles una posicion

-18()—

definitiva. Para tal fin el metodo de Maxamy Gilbert resulta serel más adecuado ya que permite la secuenciación de un fragmentodefinido sin necesidad de subclonarlo (ver lll.13).

A partir de los datos de secuenciación se determinó la posicionrelativa al RNAgenómico de los clones seleccionados. De este modose contaba con 3 clones que cubren cerca de 4000 bases de la región3' del RNAy por otro lado un cuarto clon se encontraba cerca delos sitios de iniciación de la traduccion de la poliproteína. Laposición de este clon (pol 6) permite suponer que la sintesis dela segunda cadena. al igual que la de la primera, puede terminarantes del final del templado.

Esquemas similares al denominado "caminata sobre el RNAgenOmico"han sido muy empleados por otros autores. En nuestro caso. dichométodo permitió seleccionar nuevos clones que. sumados a losanteriormente obtenidos representan todo el fragmento "L" del genomade VFA(fig.v.3.2.4l. Es interesante destacar que los insertosde cDNA obtenidos en esta segunda pesquisa. fueron

significativamente mas largos, dado que el de p0137 posee cercade 4000 pb. Esto último posiblemente sea debido a la mayoreficiencia del metodo de RNasaH (ver III.11.2.2).

V1.2 SECUENCIA DE V21

El analisis del gen" de Vp1 mediante secuenciación, permitiocontar con algunos datos adicionales referidos al Fenomenodeinmunogenicidady variabilidad del virus.

En este sentido se observo, al comparar secuencias de OIC conlas correspondientes a otras cepas (A10, 01K y Cl), que la

-lBl­

secuencia nucleotidica y aminoacidica entre cepas del mismo tipo

(OIC y" 01K) posee un grado de homologia de 95%, mientras quepara los otros tipos. la homologia respecto a OIC disminuyeconsiderablemente (60-70%).

Es destacable el hecho que la homologia de la secuencia nucleo­

tidica entre OIC y A10. en el "gen" de P12, es mayor que en elde Vpi. Esta observacion esta relaciónada con el hecho de quela proteina inmunogenica Vpl, estaria sometida a una gran presiónde selección ejercida por el sistema inmunológico del animal.Este hecho a su vez determinaria la conservación de mutacionesproducidas en esta zona. Tampoco es descartable el hecho de queP12 posea una menor tolerancia a los combios mutacionales.

Por otro lado la comparación de las secuencias aminoacidicasde Vpi reveló tres zonas de alta variabilidad ubicadas a nivelde los aminoácidos 40-60. ISA-160 y 195-213. A la luz de loexplicado en los parrafos anteriores, esto hace pensar que dichaszonas corresponderian a los epitopes inmunogenicosde la proteina.Para que esta afirmación sea válida es necesario determinar siestas secuencias se encuentran expuestas en la superficie dela cápside viral1 Una aproximación a tal determinación puedeser llevada a cabo mediante el analisis y evaluación de losdominios hidrofilicos de la proteina. Al realizar dicho analisissobre la secuencia de Vpl en la cepa OIC se observo que dos delas zonas de alta variabilidad. las ubicadas entre las posicionesisa-160 (B) y 195-213 (C), correspondían a dominios hidrofilicos,mientras que la tercera. correspondiente a las posiciones ao­60(A). estaria contenida en un dominio hidrofóbico (verfig.V.4.5).

En base a estas determinaciones se podria afirmar que las

regiones B 5' C corresponderian a zonas expuestas de Vpl sobrela superficie, mientras que la region A, por sus caracteristicashidrofobicas deberia pertenecer al interior de la partícula.Suponiendo ciertas las premisas anteriores, es entonces posibleafirmar que las regiones B 3/ C pueden constituir los epitopesinmunngenicos de Vpl. en tantti que A ¡al no estar expuesta, notendria valor inmunogenico por si misma.

Estas afirmaciones se ven apoyadas por e] hecho de que lospéptidos sintéticos pertenecientes a las regiones B y (: generananticuerpos neutralizantes en cobayo. mientras que A no poseeesta capacidad.

De todos ¡nodos, siguiendo este razonamiento. la variabilidadobservada en la región A parece indicar que esta zona debe tenercierta importancia inmunológica. Una posible explicacion es queesta zona tenga una funcion de "resorte". es decir que mutacionesen la secuencia aminoacidica del dominio A determinarian cambiosconformacionales en la superficie de la proteina.

sin embargo. recientemente Hogle y col215 han determinado laestructura de la capside de poliovirus (tipo 1) mediantedifracción de rayos X. En este trabajo se demostro que lasuperficie de la proteina inmunogénicaVpl esta constituida tantopor dominios hidrofilicos comohidrofóbicos debido a la estructuraterciaria y cuaternaria de las proteinas estructurales. Másaún,todas las zonas con capacidad de unir anticuerpos neutralizantesse encuentran expuestas. A la luz de estos resultados pareceentonces mas probable que la region A de Vp1 de aftosa tambiense encuentre expuesta, constituyendo un tercer epitope. Por otrolado. una posible justificación para la incapacidad de generaranticuerpos observada en péptidos de dicha zona. podriaencontrarse en que las caracteristicas hidrofobicas de esta regionconferiria al péptido en solucion acuosa, propiedades anormalesen relacion al sistema inmunológico.

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Una interesante observación se desprende de la Comparacion

nucleotidica y aminoacidica entre OIC v 01K. El grado de homologiaentre estas cepas es muy alto (mayor al 95%) yr sin embargo lareacción inmunológica cruzada es pobre dado que un animalconvaleciente de la enfermedad con una cepa no se encuentraprotegido respectt) a la otra. Probablemente el cambio de a o5 aminoácidos. donde solo dos de ellos estan involucrados enuna zona hipervariable no seria suficiente para explicar elcomportamiento inmunológico de estas cepas. por lo tanto se hacenecesario pensar que otras proteínas estructurales pueden estarcomprometidas en la respuesta inmune. Más aun. a partir detrabajos de seleción de mutantes resistentes a neutralizacionpor anticuerpos monoclonales en aftosa216 y la determinacionde la estructura de la capside viral en polioviru5215 se hademostrado que Vp2 y Vp3 tambien tomarian parte de la estructurainmunogenica en picornavirus.

En resumen. se puede sospechar que si bien los epitopes"principales" estarian ubicados en las tres zonas de variabilidadobservadas en la secuencias de Vpl, otras proteínas de la capside,Vp2 y Vp3, tambien serian portadoras de sitios inmunogenicos,constituyendose de este modouna compleja estructura inmunogenicala cual es sumamente sensible a los cambios conformacionales.Un ejemplo de esto último lo constituye el escaso valorinmunogenico de los capsomeros (particulas 123).

Por otro lado, durante largo tiempo se ha discutido laexistencia de un receptor celular especifico en la interacciónvirus-celula. Actualmentepese a aceptarse su existencia a partirde evidencias indirectas, aun no ha sido pOSIhle aislar unaestructura con tales caracteristicas. En este sentido, pareceimportante mencionar que a partir de la comparación de aminoácidosde Vpl, pertenecientes a cerca de 15 cepas diferentes, ha sidoposible identificar una región de 4 aminoácidos que se conservansin alteraciones en todos los casos. Dicha region se encuentra

ubicada entre los aa 146 y 148. en la región hipervariable B.estando constituida por la secuencia Arg-GliAsp-Leu (RGDL). Llamala atencxón que dentro de una zona tan variable (134-160) existaun dominio constante, lo cual sugiere un posible papel relevantede esta region de Vp].

Por otro lado un péptido de igual secuencia fue identificadoen la proteina fibronectina como el sitio de interacción conla superficie celular.217 Esto nos permitió pensar en laposibilidad que sea esta región de Vpl la que interactue conla superficie celular a traves del receptor para fibronectina.sin embargo experimentos preliminares de inhibición de lainfeccnón por competencia con fibronectina o con el péptido

0sintetico especifico no mostraron un efecto significativo.“18

En terminos generales se puede decir que el fenomeno deneutralización puede llevarse a cabo de tre formas alternativas:

i interacción directa de los anticuerpos con un "sitiocritico" (por ejemplo: sitio de unión al receptor).

iiwAglutinación viral.iii-lmpedimiento fisico en la interacción ligando-receptor

por la unión del anticuerpo a algun(os) sitio<s> cercan0(s).

Ya que existen varios sitios de neutralización216 parece queel fenomeno de neutralización, en el caso de VFA, ocurre comoconsecuencia de las opciones ii 5' iii. Sin embargo. i pareceriaser la forma mas economica y eficiente. Podria entonces explicarseesta disyuntiva suponiendo que la supuesta mimetización del "sitiocritico" (posiblemente el péptido RGDL).con parte de una proteinacelular (fibronectina), haria cum!el sistema inmunológico se xmmimpedidode producir anticuerpos contra este "sitio crítico".

-185­

V1.3 EXPRESIOE

Por lo expuesto en los parrafos anteriores la estructura inmuno­genica resultaría ser mas compleja de lo que se creía hasta ahora,ya que Sl bien los epitopes principales parecen encontrarse enVpi, Vp2 si Vp3 son portadores cu? otros secundarios, mas [K1 porello de menor importancia en la neutralización.

Sin embargo, es evidente las ventajas que tendria la utilizaciónde inmunógenos producidos en bacterias en relación a las \mcunasclasicas (ver 1.6). Por ello seria ideal poder reconstruir estacompleja estructura a partir de polipeptidos producidos enbacterias. En este sentido una caracteristica fundamental de esaestructura seria una especial conformación terciaria de Vp1. Unaforma de reconocer dicha conformación. en una "library" de clonesproductores de Vpl con distinta conformación, podria ser mediantela utilización de anticuerpos dirijidos contra la capside viralintacta, obtenidos de animales convalec1entes de F.A. Estos¿unicuerpos deberian tener una afinidad mayor por un polipeptidode Vpl que exponga los epitopes correctamente.

La pregunta que nos hicimos fue: como generar las diferentesconformaciones?. Comose ha explicado anteriormente nuestro modelopropone que diferentes grados de inclusion de una determinada pro­teina en la membrana externa bacteriana puede generar el ambienteadecuado para modificar o influir en su conformación. Algunaconformación podria eventualmente semejarse a la estructura nativa.

Para comprobar esta hipótesis fue necesario producir fusionesentre Vpl y una proteína integral de membrana.en diferentes sitiosdel gen que codifica para esta última. En función de generar dichasfusiones utilizamos el fenomeno de miniMu-ducción, el cual se haempleado ampliamente para este tipo de experiencias y resulta serun sistema muyeficiente.

Los resultados encontrados muestran que si bien existe expresión

_.

de Vpl, esta ocurre en forma transitoria, basandonos en el hechoque el número de clones productores disminuye con los su-cesivosrepiques (vel V.5.5) y algunos de aquellos que han dejado deproducir parece mostrar mutaciones en el "gen" de Vp1 (verfig.V.5.6).

Estas observaciones tambien han sido realizadas por otros autores,quienes proponen que dicha expresion transitoria responde a quelos péptidos de fusión generados resultan toxicos para la bacteria,posiblemente por bloqueo de la exportación de otras proteínas bacte­rianas o bien por inestabilidad de la membrana.

En todo caso. es evidente que nuevos experimentos en este sentidodeben realizarse utilizando algún tipo de promotor inducible, pu­diendo controlar la expresión del péptido y por lo tanto su toxi­cidad.

EERSPECTIVAS DEL USO DE LAS TECNICAS DE DNA RECOMBINATE EN

EL CONTROL DE LA FIEBRE AFTOSA

Contar con la secuencia nucleotidica de Vpl y otras proteinasestructurales, constituye una herramienta fundamental para estudiarla variabilidad genética del virus y predecir la secuencia deaminoácidos que componen las estructuras inmunogenicas. Ahora bienes interesante mencionar que tanto el método de secuenciación delos fragmentos clonados cuanto el metodo directo de extencion del"primer" presentan ventajas y desventajas en cuanto a este objetivoparticular. Secuenciar a partir del CDNAimplica una tarea maslaboriosa ya que es necesario realizar la sintesis y clonado delDNAcopia. Por este metodo, se obtiene la secuencia de un clon.que no necesariamente representa lo que ocurre en la poblaciónviral, ya que como postula Domingo222 se debe considerar al VFAcomo una población geneticamente heterogenea. Sin embargo, estemetodo permite obtener los datos de secuencia de todas las proteinas

estructurales, si se cuenta con clones representativos de taleszonas .

El metodo de secuenciación directa-sobre el RNAes menos laboriosoy mas rapido. Además la secuencia obtenida es un promedio de todaslas secuencias encontradas en una determinada zona. lo cual repre—senta un dato mas real. Sin embargo dado que se requieren oligo­nuceótidos "primers" para comenzar la sintesis y que la resoluc10nmaxima de un gel de secuenciación es de alrededor de 300 nucleóti­dos, se necesitaria una bateria de oligonucleótidos suficiente“mente grande como para abarcar toda la zona de interes (proteinasestructurales).entre 7 y 8 "primers", sin contar con que dichos"primers" deberian conteplar la variabilidad de la zona.

De todos modosobtener las secuencias de las cepas argentinasaisladas hasta el presente, asi como de nuevos aislamientos seriade gran interes en vista a la utilizacion de péptidos sintéticoscomo antígenos vacunales o como "primers" inmunogenicos.

En cuanto a la utilización de dichos péptidos como inmunogenossi bien en cobayos se obtienen una respuesta adecuada, en ratóny en bovino dicha respuesta se ve reducida a nivelesinaceptables.¿lgDe todos modos, a la luz de los_resu]tados obtenidosen poliovirusloa, parece conveniente explorar la posibilidad deutilizar estos péptidos como "primers" de la respuesta inmune.en función de utilizar una menor cantidad de masa viral. con laconsecuente disminución del riesgo implicito en la manipulaciónde grandes cantidades de particulas infecciosas.

La utilización del polipeptido Vp] expresado en sistemas bacterianos a partir de cDNA,constituye una estrategia de control de laenfermedad que debe ser estudiada con mayor profundidad. sin embargoexisten ciertas dificultades, en contraposición a las ventajasenunciadas en la introducción (ver 1.6), relativas a la F.A. quedeben tenerse en cuenta.

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a-La estructura inmunogénica de la capside viral parece serconformacionalmente compleja, es decir las caracteristicasantígenicas parecen estar determinadas por la relación espacialde los componentes de los epitopes.

b-Los determinantes antigenicos estan compartidos por las 3proteinas estructurales superficiales (Vpi. Vp2y V03).216

c-Vpl aislada posee caracteristicas fuertemente hidrofúbicas.d-La diversidad antígenica observada en un mismo subtipo de

VFAno estaria contemplada al expresar los antígenos codificadosen un clon de cDNA,por supuesto esto es aún mas dramático tratando­se de cepas diferentes.

Por otro lado podria ser de gran ayuda obtener un clon de CDNAcon propiedades infectivas. tal como el obtenido por Racaniello

220. Esto haria posible realizar unay Baltimore para poliovirusserie de estudios relativos a la tnologia molecular del virus ypor otro lado, mutagenesis diriJida sobre el cDNA.Ello a su vez.permitiria contar con variantes atenuadas "estables" con delecionesde ciertos sectores C)bien con particulas virales no infecciosasintactas. sin embargo en este sentido la presencia del tracto depoliC podria dificultar la obtención de dicho clon debido a lainestabilidad manifestada por plasmidos conteniendo un homopolimerodC/dGmayor de 30 nucleótidos (ver IV.5.1).

Por otro lado la posibilidad de utilizar vacunas vivas del tipodel virus vaccinia ha comenzado a ser estudiada.221 Hasta el momentono existen datos inmunologicos utilizando este sistema. de todosmodos es interesante en cuanto a que. al reproducirse el vector(vaccinia; dentro del animal los antigenos de VFA permaneceranpor mas tiempo expuestos al sistema inmunológico. Sin embargo aúnquedan dudas en relacion a este sistema respecto a la respuestadel animal frente al virus vaccinia y. dado que este virus tieneun amplio rango de huesped. podrian suscitarse problemas de tipoecológicos.

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