clase 01 biotecnologia - ingeniería genética

BIOTECNOLOGÍA Fernando Salcedo Biólogo, M.Sc. e-mail: [email protected]

Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

1. INFORMACIÓN DEL DOCENTE: Edgar Fernando Salcedo Ramírez Biólogo, M.Sc. en Biotecnología e-mail: [email protected] Estudios realizados: Pregrado: Biología (Universidad Industrial de Santander – UIS) Postgrado: Magíster en Biotecnología (CINVESTAV-IPN – México) Experiencia laboral: Cenicafé (Centro Nacional de Investigación del Café). Colombia LANBEGIO (Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad). México LGE – Unicamp (Laboratório de Genômica e Expressão). Brasil Kommit – Biommit. USA

Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

E. Fernando Salcedo, M.Sc

INGENIERÍA GENÉTICA

Y BIOTECNOLOGÍA

Biotecnología Es la utilización de seres vivos o parte de ellos, con el fin de obtener productos de interés para las personas.

Historia 1919: Karl Ereky, ingeniero húngaro, utiliza por primera vez la palabra

biotecnología. 1965: El biólogo norteamericano R. W. Holley «leyó» por primera vez la

información total de un gen de la levadura compuesta por 77 bases, lo que le valió el Premio Nobel.

1970: El científico estadounidense Har Khorana consiguió reconstruir en el laboratorio todo un gen.

1973: Se desarrolla la tecnología de recombinación del ADN por Stanley Cohen, y Herbert Boyer.

1976: Har Khorana sintetiza una molécula de ácido nucleico compuesta por 206 bases.

1976: Robert Swanson y Dr. Herbert Boyer crean Genentech, la primera compañía de biotecnología.

1982: Se produce insulina para humanos, la primera droga derivada de la biotecnología.

1983: Se aprueban los alimentos transgénicos producidos por Calgene. Es la primera vez que se autorizan alimentos transgénicos en Estados Unidos.

2003: Cincuenta años después del descubrimiento de la estructura del ADN, se completa la secuencia del genoma humano.

•  La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

•  Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.


La ingeniería genética es la biotecnología de la manipulación y transferencia de ADN de un organismo a otro, esto permite: •  Crear nuevas especies. •  La corrección de defectos genéticos. •  La fabricación de numerosos compuestos.


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Herramientas en Ingeniería Genética ENZIMAS DE

RESTRICCIÓN

Las enzimas de restricción son ENDONUCLEASAS (tijeras moleculares). Cortan el ADN: •  Cada enzima reconoce una

secuencia de nucleótidos y corta en ese punto cada cadena de ADN.

•  Los extremos libres son pegajosos porque pueden unirse a otros fragmentos cortados por las mismas enzimas de restricción

VECTORES DE CLONACIÓN

Plásmidos Vectores bacteriófagos

BAC: Cromosomas artificiales

bacterianos

Herramientas en Ingeniería Genética

Vectores bacteriófagos

- Bacteriófago. - Cósmido.


BAC


Ø ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Ø VECTOR DE CLONACIÓN

Ø ADN LIGASAS


PROYECTO DE INGENIERÍA GENÉTICA Ø Pasos: 1- Localización y aislamiento del gen que se desea transferir. 2- Selección del Vector. 3- Unión del ADN elegido al ADN del Vector. 4- Inserción del vector en el gen transferido en la Célula Hospedadora.

- Transformación: Plásmidos. - Transducción: Bacteriófagos y Cósmidos.

5- Multiplicación del Organismo Transgénico.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:

1.  la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

2.  La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

3.  la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.


TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA

A) TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE: permite aislar un fragmento de ADN de un organismo (transgén) e insertarlo en el ADN de otro organismo que puede ser de otra especie.

•  Esta técnica permite la obtención de transgénicos: organismos que portan genes de otra especie

Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

Extremos cohesivos

Es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

Nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes.

La síntesis de insulina humana a partir de bacterias o levaduras, para ello se incorpora a estos microorganismos el gen humano que codifica la síntesis de esta proteína.

B) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA, TÉCNICA PCR •  Permite obtener grandes cantidades de ADN a partir de una muestra muy pequeña Aplicaciones: •  Obtención de cantidad suficiente de ADN para su secuenciación (leer el orden de las

bases nitrogenadas) y poder determinar si existe alguna mutación o simplemente conocer la disposición normal de las bases (se utiliza en el estudio de los genomas)

•  Análisis de ADN fósil •  Estudios de parentesco evolutivo: el grado de similitud en el ADN permite establecer

relaciones de parentesco entre especies. •  Identificación de especies •  Determinación de huellas genéticas, permite obtener suficiente cantidad de ADN a

partir de muestras pequeñas (gotas de sangre, semen, bulbo de cabello, restos de piel) para poder realizar estudios comparativos (investigaciones policiales, medicina forense, pruebas de paternidad).

Así se realiza la técnica PCR

Enfriamiento

Enfriamiento

Calentamiento

Calentamiento

ADN polimerasa

Nucleótidos

Nucleótidos

ADN polimerasa

El fragmento de ADN que se desea amplificar se calienta para que las dos hebras se separen.

Las hebras separadas se enfrían y se tratan con ADN polimerasa y nucleótidos para formar las cadenas complementarias de cada hebra de ADN.

Se inicia un nuevo ciclo en el que los fragmentos de partida son los dos fragmentos de ADN formados en el ciclo.

Se forman las cadenas complementarias de ADN de las hebras separadas. Después de 20 ciclos de este proceso, se logra

disponer de más de un millón de copias de la molécula.

C) SECUENCIACIÓN •  Consiste en poder determinar la secuencia de nucleótidos (de bases

nitrogenadas) de un fragmento de ADN •  Permite identificar posibles mutaciones diagnosticar enfermedades

asociadas a estas mutaciones: DIAGNÓSTICO MOLECULAR •  El diagnóstico molecular permite diagnosticar la enfermedad antes de

que se manifieste clínicamente lo cual puede permitir un mejor control de la misma.

•  Se utiliza en el diagnóstico prenatal, en el consejo genético y en la selección de embriones para evitar enfermedades hereditarias

•  En investigación forense, por ejemplo, identificación de individuos o en pruebas de paternidad.

•  En medio ambiente, por ejemplo, para la identificación de especies animales y vegetales, la conservación de recursos genéticos animales, la identificación de organismos genéticamente modificados, la identificación de especies bacterianas.

Secuenciación de ADN: método Sanger 1. Este método utiliza didesoxirribonucleótidos, cuya incorporación a la secuencia de ADN provoca la terminación de la cadena, ya que no se puede añadir ningún ribonucleótido más al extremo en el que se incorporan. 2. Como primer requisito se necesita un gran cantidad de la muestra, por lo que es necesario clonar el fragmento de ADN seleccionado. A continuación, se desnaturaliza el ADN y se obtienen cadenas simples que se incuban en un tubo de ensayo junto con el resto del material. 3. Se inicia la síntesis de nuevas cadenas de ADN que utilizan como molde el ADN que se quiere secuenciar. Las cadenas incorporan un desoxirribonucleótido por azar e interrumpen su síntesis. Al realizar miles de copias se obtienen múltiples cadenas de longitud variable, que se diferencian en un nucleótido.

Al identificar los desoxirribonucleótidos terminales de las cadenas se puede “leer” la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN analizado.

Clonación reproductiva: Dolly El equipo de Ian Wilmut, del Instituto Roslin de Edimburgo

comunicó en 1997 que habían logrado una oveja por clonación a partir de una célula diferenciada de un adulto.

Esencialmente el método (que aún presenta una alta tasa de

fracasos) consiste en obtener un óvulo de oveja, eliminarle su núcleo, sustituirlo por un núcleo de célula de oveja adulta (en este caso, de las mamas), e implantarlo en una tercera oveja que sirve como “madre de alquiler” para llevar el embarazo.

Así pues, Dolly carece de padre y es el producto de tres

"madres": la donadora del óvulo contribuye con el citoplasma (que contiene, además mitocondrias que llevan un poco de material genético), la donadora del núcleo (que es la que aporta la inmensa mayoría del ADN), y la que parió, que genéticamente no aporta nada.

1.  Los invest igadores tomar células de la glándula mamaria de una oveja adulta.

2.  Tomar óvulos no fertilizados de otra oveja y les extrajeron en núcleo.

3.  Insertaron 277 núcleos de la células adultas en otros tantos óvulos. Sólo 29 sobrevivieron.

4.  Los 29 óvulos se implantaron en el útero de 13 ovejas nodrizas. Sólo una quedo preñada y parió a Dolly

Dolly (1997-2003), la primera oveja obtenida por clonación a

partir de células adultas

Un laboratorio de Texas clona al primer animal doméstico "Copycat" es el primer gatito nacido mediante clonación"

El experimento abre las puertas de la clonación masiva de animales domésticos, un fin sin explorar cuya sola posibilidad había desencadenado ya el almacenamiento de células de mascotas por parte de sus ricos propietarios

En España se clona al primer toro de lidia

Obtención de medicamentos por ingeniería genética

Plásmido con gen

insertado

Células embrionarias

Vaca receptora Vaca transgénica Vaca transgénica

El gen del factor VIII, procedente de células humanas, se inserta en un plásmido.

El plásmido se inserta en células embrionarias de una vaca.

Los embriones se implantan en una vaca receptora.

Tras el desarrollo del embrión, nacerá una vaca transgénica que portará el gen del factor VIII en sus células.

Cuando la cría crezca, de su leche se podrá obtener el factor VIII.

Mansa (nació en 2002) Primera ternera clonada y transgénica. Produce la hormona de crecimiento humana en la leche

Terneros clonados y manipulados genéticamente (fábrica de anticuerpos humanos)

Clonan terneros en EE UU para producir anticuerpos humanos

Clonan cerdos destinados a trasplantar sus órganos a humanos

La empresa escocesa PPL Therapeutics logra retirar de los cerditos el gen que provoca el rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3 galactosil transferasa"

Un gen de un pez plano del Ártico que no interrumpe su crecimiento

en invierno

Otro gen del propio salmón modificado que no interrumpe la producción del hormona del crecimiento cuando el pez llega a la madurez

Animales transgénicos Salmón: Crece entre 6 y 8 veces más que un salmón normal. Se le han incorporado dos genes.

frankenfish

Terapia génica

Aplicaciones de la ingeniería genética Obtención de fármacos

Mejora en la producción agrícola y animal.

•  Insulina •  Proteínas de coagulación del suero sanguíneo. •  Vacunas

Carpas y salmones portadores del gen de la hormona del crecimiento

Maíz resistente al frío

Tratamiento de enfermedades humanas:

•  Diabetes •  Hemofilia •  Parkinson

Eliminación de metales pesados

Producción de sustancias terapéuticas

Insulina

Biorremediación

Producción de energía

Producción de alimentos

La genética de los animales tiene múltiples objetivos:

*Aumentar el rendimiento del ganado.

*Producir animales con enfermedades humanas para la investigación.

*Elaborar fármacos, etc.

Se está investigando la creación de nuevas razas de animales mediante técnicas de manipulación genética. Los primeros pasos se han dado obteniendo animales clónicos, Estas nuevas razas pueden ser más resistentes y rentables. Algunos de ellos llevan genes humanos que provocan cáncer.

En la actualidad, ya se emplean ratones transgénicos en los laboratorios de investigación.

•  La primera planta transgénica se desarrolló a partir de la planta del tabaco. Mediante ingeniería genética se han conseguido plantas resistentes a enfermedades producidas por virus, bacterias o insectos.

•  Las técnicas de ingeniería genética también permiten el desarrollo de plantas que den frutos de maduración muy lenta.

La gran ventaja de estas plantas es el ahorro económico.

La mejora de la calidad de las semillas también es un objetivo interesante.

Ø OMG: PLANTAS TRANSGÉNICAS

P e r m i t e d e s a r r o l l a r p l a n t a s transgénicas. Actualmente se han desarrollado plantas transgénicas de más de cuarenta especies. Mediante ingeniería genética se han conseguido plantas resistentes a virus, bacterias o insectos.

Las aplicaciones farmacéuticas son otro gran punto de interés.

Estas plantas son capaces de producir antibióticos, toxinas y otras sustancias que atacan a los microorganismos.

Son los seres vivos más utilizados en Ingeniería Genética. La más utilizada es la Escherichia coli. Se usa prácticamente en todos los procesos de I.G.

Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptación a diferentes condiciones ambientales.

Estas posibilidades se han visto incrementadas con el desarrollo de la ingeniería genética y la disponibilidad de técnicas de biología molecular.

La capacidad infecciosa de las bacterias radica en que poseen la información necesaria para colonizar los tejidos del huésped, invadirlos y producir la enfermedad.

Por otro lado, ha permitido usarlas para la prevención y t r a tam ien to de a lgunas enfermedades.

Biorremediación La naturaleza tiene una cierta capacidad de limpieza de los elementos contaminantes. Microorganismos como levaduras, hongos o bacterias degradan una gran cantidad de sustancias tóxicas, reduciendo su carácter nocivo o incluso volviéndolas inocuas para el medio ambiente y la salud humana.

La biorremediación consiste en acelerar este proceso natural para mitigar la contaminación ambiental.

Los expertos en ingeniería genética creen que la utilización de organismos modificados genéticamente traerá un mayor desarrollo de la biorremediación. Los ejemplos son muy variados: • La introducción de un gen en el organismo específico para el vertido. • El desarrol lo de cepas biosensoras luminiscentes, que permitirían monitorizar el proceso de degradación. • La creación de plantas transgénicas para limpiar suelos contaminados.

Deinococcus radiodurans: De los microorganismos más resistentes a la radiación que se conocen, ha sido modificado genéticamente para que pueda consumir el tolueno y los iones de Mercurio de desperdicio nuclear altamente radiactivos

Biorremediación

OTRAS APLICACIONES EN LA BIOTECNOLOGÍA Producción de energía

Los alimentos transgénicos

Transgen

Organismo transgénico

Retraso en la maduración

Producción de sustancias

Mejora de la calidad

Los alimentos transgénicos

Tomate Flavr Svr

Café más aromático y con menos cafeína

Resistencia a herbicidas e insectos

Maíz resistente a insectos

Arroz que produce provitamina A

Soja resistente a herbicidas

Patatas que inmunizan contra enfermedades

Algunos tipos de plantas transgénicas

El abanico de estos cultivos es muy amplio

Tomates morados, con el gen de los arándanos, que les aporta propiedades anticancerígenas

Tomates azules, con vacunas

Golden rice con vitamina A

LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS

Riesgos de la biotecnología

Pérdida de diversidad genética

Pérdida de diversidad cultivada, invasión de ecosistemas naturales

Paso de genes transferidos a especies silvestres o tradicionales

Maleza resistente a herbicidas o bacterias resistentes a antibióticos

Efectos perjudiciales sobre la salud

Se han descrito problemas alérgicos. Hay gran desconocimiento

Aumento de la dependencia de países en desarrollo

Un notable logro de la Ciencia Descubrimiento del ADN cumple 50 años

El País. Madrid, 26 de Marzo de 2001.

Las multinacionales retiran los alimentos transgénicos del Estado español.

Joaquina Prades, Madrid.

Manipulación genética y controversia ética.

La Dignidad del Hombre en Juego

El Libro de la vida

Proyecto Genoma Humano

Domingo, 14 de abril de 2002 - 22:58

GMT Mapa del genoma humano en 2003

Con este mapa los científicos podrían trabajar en el descubrimiento de qué genes son responsables de enfermedades como el cáncer, la diabetes y la hipertensión

Proyecto genoma humano

•  El proyecto genoma humano fue un proyecto que tenía como objetivo la secuenciación de todo el ADN de un ser humano.

•  Secuenciar un genoma significa determinar el orden en que se disponen los cuatro nucleótidos que forman el ADN a lo largo de todas las moléculas que contiene cada célula.

•  El ADN humano contiene 3.000 millones de nucleótidos lo cual significaba una dura tarea.

•  1988. El doctor Watson es nombrado director de la Oficina de Investigación del Genoma Humano, organismo dependiente de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de EEUU. Afirma que el genoma podrá estar descodificado para el año 2005 y que le costará al Gobierno alrededor de 3.000 millones de dólares.

•  1990. El doctor Craig Venter, un investigador de los NIH, desarrolla un método más corto para encontrar fragmentos del genoma humano. Demuestra que, a partir de estos fragmentos, se puede identificar a los genes completos.

•  Mayo 1998. Venter se 'pasa' a una nueva compañía que pretende secuenciar el genoma humano en tres años, es decir, dos años antes de la fecha prevista por el proyecto estatal. La compañía se llamará Celera.

•  Junio 2000. En un día que el presidente Clinton califica de histórico, Venter y Collins aparcan sus diferencias y anuncian que se ha logrado el primer borrador del genoma humano secuenciado

•  12 de Febrero de 2001. La empresa Celera publica la secuenciación del genoma en la revista 'Science'. El consorcio público hace lo mismo en 'Nature'

El proyecto genoma humano ha permitido conocer muchas cosas:

•  Cuantos genes tenemos (30.000) •  Como son de grandes, unos 3.000 nucleótidos de

media. •  Qué proporción de nuestro ADN da lugar a proteínas

(2 %) •  Como se organizan los genes en nuestro ADN •  En que se diferencia nuestro ADN del de otras

especies. •  Que diferencias hay entre los distintos humanos, el

0’1 %.

•  Gracias al conocimiento del genoma humano será posible en el futuro conocer mejor algunas enfermedades y: 1.- Diagnosticar mejor 2.- Aplicar un tratamiento adecuado 3.- Prevenir la aparición de estas enfermedades.

Humanos 30,000 genes

Chimpancé 30,000 genes

A. thaliana 25,000 genes

Ratón 30,000 genes

C. elegans 19,000 genes

D. melanogaster 13,000 genes

98% idéntico

70% idéntico

20% idéntico

60% idéntico

De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila.

El genoma humano es 10 veces mas pequeño que el genoma de la salamandra Bolitoglossa subpalmata y 200 veces menor que el de la Ameba Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

• El 7 de marzo de 2010 fue publicad en la revista Nature, una de las revistas científicas más prestigiosas del mundo, una investigación del Cinvestav Irapuato en colaboración con científicos de Estados Unidos y Francia en la cual hallaron una proteína llamada argonauta 9 con la que se podría llegar a inducir la clonación natural de las plantas, esto tendría un fuerte impacto en la industria de semillas, y algunos dicen que podría revolucionar la producción agrícola internacional.