citometría de flujo: clínica, investigación ... · -iiv-madura: cd1a y cd3mb ... ch3-c-o cl o...

Citometría de Flujo: Clínica, Investigación,

Gastroenterología y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.

Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Concepción, Noviembre de 2003

Citometría de Flujo

Clínica Investigación

Cáncer

Gastroenterología

Flow Cytometry Publications/year

YEARS

00

300300

600600

0 13 28 79113

223

480611

811940

2,332

1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1991 19921989 1990 1993 1994

(*) Data taken from Medline search using the keywords: “flow Cytometry”(November 09th: 22:30 hrs)

1995 1996

3,483

3,479

1999: 4.2561998: 3.8891997: 3.613

2002: 5.3232001: 5.0252000: 4.771

2003: 3.974 (*)3345

2899

Papers 2,713

2,4452700

2400

21002100 1,855

180018001,494

15001500 1,232

1,07812001200

900900

¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??

La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición simultánea de

múltiples características físicas y químicas de células en

suspensión”

¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA

CELULA?

1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad

interna.3.- Evaluación de características químicas:

• Fluorocromos

• Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

Relative Sizes of Biologicals

AmoebaLymphocyte

S.aureus5-8 µm

1 µm

15-30 µm

Flow Cell

Injector Tip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

Focused laserFocused laserbeambeam

Sheathfluid

PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

Laser

1

2

3

4

Flow Cytometry OpticsFlow Cytometry Optics

Flow cell

ANTICUERPOS MONOCLONALES

• Gran disponibilidad comercial

• Gran variedad de fluorocromos

• Precios accesibles• Pedidos vía Internet• Gran Calidad

FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS

Fluorescein (FITC)EmissonExcitation

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Wavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Rel

ativ

e In

tens

ity

Protein

Phycoerytherin (PE)Excitation Emisson

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Protein

Propidium IodideEmissonExcitation

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Rel

ativ

e In

tens

ity

DNA

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO

PREPARACIONDE LA MUESTRA

OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOPREPARACION DE LA MUESTRA

Procedimiento St.:• 100 µL de sangre total • 10 µL del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT • Añade el lisador • Leer en un citómetro de flujo

PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA

• CALIBRACION• ADQUISICION• ANALISIS

FITC Fluorescence

Mo1

CD4 CD8

CD8

CD45

leu11a

CD20 Tube

ID

FORMA DE PRESENTACION DE DATOS

• Histograma• Gráfico de Puntos (Dot Plot)• Gráfico de Contorno (Countour

Plot)• Gráfico Isométrico (3D)• Gráfico de Densidad (Density Plot)

Citometría de flujo: mediciones

“GATE”

LM

G

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

Density Dot Plot Contour Plot

Color of dots can give indication Identify subpopulationsof frequency of events with proper contour lines

HISTOGRAMA(Un Parámetro)

coun

ts

Autofluorescenciay/o

control isotipo

M1

0 FL1

One parameter frequency histogram

# of events forparticular parameter

establish regions and calculate coefficient of variation (cv)cv = stdev/mean of half peak

ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

Autofluorescenciay/o

control isotipo

FL2

0 FL1

ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

+,-

4

+,+

2

-,+

1FL

2

-,-

3

0 FL1

CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES

• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . .

• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología

EVOLUCION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Inmunología Celular

Aplicaciones enPatología

AnticuerposMonoclonales

Citometría deFlujo

CITOMETRIA CLINICA

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

• Linfocitos T totales :CD3(+)• Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)• Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)• Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)• Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)

• Relación Linfocitos T CD4/CD8

Infección VIH-SIDA

File: 111.003Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12430Total Events: 15000

Quad Events % Gated % TotalUL 20 0.16 0.13UR 1496 12.04 9.97LL 2028 16.32 13.52LR 8886 71.49 59.24

RELACION CD4/CD8 = 0.17File: 111.004Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12512Total Events: 15000

Quad Events % Gated % TotalUL 600 4.80 4.00UR 8866 70.86 59.11LL 1499 11.98 9.99LR 1547 12.36 10.31

EXAMEN RESULTADO RANGO REF ERENCIA

LEUCOCITOS TOTALES 8.500 x m m 3

LINFOCITOS ABS OLUTOS 2.295 x m m 3

LINFOCITOS T (CD 3) 1.91683.50

x m m 3

% 59.4 - 84.6 %

LINFOCITOS B (CD 19) x m m 3

% 6.4 - 22.6 %

LINFOCITOS T (CD 4) 12.04276

%x m m 3

28.5 - 60.5 %

LINFOCITOS T CIT/S UP (CD 8) 70.861.626

%x m m 3

11.1 - 38.3 %

RELACION T CD 4 / CD 8 0.17 1.2 - 2.1

CELULAS LINFOIDES NK(NATURAL KILLER)

x m m 3

%

INFECCION VIH SIDA

ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38

• El aumento en la expresión de moléculas CD38 en LT CD8 es un fuerte indicador pronóstico de progresión hacia SIDA y muerte.

• Superior a:• Rto. LT CD4• Marcadores solubles• Combinación HLA-DR+ CD38+

J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997Cytometry 26:1-7, 1996Cytometry 33:115-122, 1998

INFECCION VIH SIDA

GIORGI et al.

• Carcaterizaron el número de moléculas CD38 en LT CD8:

1.- < 2.470 =======> PROGRESOR LENTO2.- 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO3.- 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO4.- > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO

• Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3 años

Cytometry 33:123-132, 1998J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997

Copyright Dennis Kunkel

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías

resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos

celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”

HEMATOPOYESISSTEM CELL

CFU-MLCFU-GEMM

LINFOCITO B LINFOCITO TCFU

ERITROIDEMEGACARIOCITO

CFUBASOFILO

CFUEOSINOFILO

CFU-GM

ERITROCITO BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO

CFU-L

PLAQUETAS MONOCITO

RETENCION DE ANTIGENOS

• Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados

CD19 CD19

Transformación

MalignaCELULA

PRE-B NORMALCELULA

LEUCEMICA

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA : -LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

Características normales

• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda

Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II:Común)

• Paciente sexo femenino• 78 años• Sangre periférica • WBC:169.000.

Sugerente de una Leucemia Promielocítica Hipogranular M3 HLA-DR (-)

Cellular Function

• Phagocytosis• Killing index of phagocytes• Intracellular cytokines• Calcium flux• Oxidative burst• Membrane potential

Phagosome

O2

O2-

H2O2

NADPH + H+

NADP+

HMP

NADPHOxidase

GSSG

GSHGR GP

H2O2SOD

O2-

H+

H2O

Catalase

H2O + O2

PCB

SOD

PCB(Reduced GSH level)

PKC(PMA)

?

?+

O2-

OH.

Lipid Peroxidation

Phospolipase A2 activityLeukotrienes

H2O2

Human Neutrophil

Stimulant

PCB

DCFH-DA DCFH DCFDCF

COOHH

Cl

O

O-C-CH3

OCH3-C-O

Cl

O

COOHH

Cl

OHHO

Cl

O

COOHH

Cl

OHO

Cl

O

Fluorescent

Hydrolysis

Oxidation

2’,7’-dichlorofluorescin

2’,7’-dichlorofluorescin diacetate

2’,7’-dichlorofluoresceinCellular Esterases

H2O2

DCFH-DA

DCFHDCFH--DADA

DCFHDCFH

DCF

H OH O2 22 2Lymphocytes

Monocytes

Neutrophils

log FITC Fluorescence.1

1000100101

0

20

40

60

coun

ts

PMA-stimulated PMNControl

80

• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :

25.86 %76.98 %

Estallido respiratorio en Granulocitos

No estimulado

Estimulado

Estallido respiratorioCaso clínico:

• Paciente de sexo femenino• 8 años• Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus.• Granulomas fríos en cara y piernas• Déficit parcial de IgA.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos.

• Inicio de terapia antibiótica con claritromicina 250 mg/12 hrs por 30 días.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos, post terapia.

DCFA DCFADespués de terapia antibiótica

Estallido respiratorio en Granulocitos

No estimulado: 33.35 %

Estimulado: 42.66 %


Estimulado: 57.48 %

DCFA DCFA

DCFA DCFA

DCFA

Estallido respiratorio en Monocitos


Estimulado: 57.06 %


Estimulado: 76.81 %

Después de terapia antibiótica

DCFA


• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,


Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo.

Bacterias: Uso de Microesferas (beads)

*

*+

Anti Ig humana conjugada

*

Ag

+bead

Suero paciente

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806Cytometry 1994;18:103-108

CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:

• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes

• Cáncer de Esófago• Linfoma

ζCD3 CHAINS EXPRESION IN PERIPHEREAL T LYMPHOCYTES OF PATIENTS WITH

ADENOMATOUS POLYPS OF THE COLON

(*) Castillo JL2, Kawaguchi F.1,2, Venegas O.1,2, Castillo M.1,2, Madariaga J.1,2, Ortiz C2 ,

Riquelme F.2, Yañez CG.2, Vega E.2,.

(1) Medicine Faculty, University of Concepción, Chile. (2) Flow Cytometry and Gastroenterology Unit,

Worker Hospital, Concepción, Chile.

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous

polyps of the colon

• Total T lymphocytes :CD3(+)

• T Helper lymphocytes :CD3(+)CD4(+)

• T citotoxic lymphocytes :CD3(+)CD8(+)

• B lymphocytes :CD3(-)CD19(+)

• Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)

• T CD4/CD8 ratio


ANTIGEN/MHCANTIGEN/MHC

CD4CD4

TCR/CD3TCR/CD3

ζ ζ CHAINSCHAINSLckLckPTK PTK SrcSrc

ZAPZAP--7070

ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon

• Low ζCD3 expression in:• Colon cancer • Prostate cancer • Renal cells cancer

• Related:• Disease stages • Prognosis• Death

• Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).• Healy C. et al . Cytometry 32:109-119 (1998).



• It has been proposed that the determination of ζCD3 expresion y tumoral and peripheral T lymphocytes, may be a neoplastic disease progresion marker.

Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).Healy C. et al . Cytometry 32:109-119 (1998).Nakagomi H. et al. Cancer Research 53, 5610-12,1993.



Objetive: Evaluate the expression of ζCD3 chains in periphereal T lymphocytes by flow cytometryin patients with colon polyps

Patients: 24 reference subjects 19 Patients with adenomatous polips of the colon (APC) 10 Patients with hiperplasic polyps (HP) 5 Patients with recurrent oral thrush (ROT)

Sample type: Periphereal blood



APCn = 19

HPn = 10

ROTn = 5

Controln = 24

19.558(P=0.000)

72.948(P=1.000)

88.640(p=1.000)

87.291% LT ζ(+)

77.726(p=1.000)

16.404(p=0.000)

88.814(p=1.000)

% LCD4 ζ(+) 87.019

17.903(p=0.000)

69.601(p=1.000)

90.601(p=1.000)

87.823% LCD8 ζ(+)

Percentage of ζCD3 expression in T lymphocytes. p<0.05



Conclusion:

1) The diminution of ζCD3 expression is related with the APC in patients without antecedents of any others neoplasia.

2) There are significant differences in ζCD3 expression between the APC and HP groups (p<0.05).

3) The diminution of ζCD3 in periphery may be suggestive of the APC in absence of any othersneoplasia.


ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINALEspectro de presentación.

Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa

Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

GranulomatosaCongestión ulcerativa

Cáncer

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):

• Células epiteliales C.P.A.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal InflamationFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal

• Antígenos luminales actúan como gatillantes• Epitelio intestinal:

• Permeabilidad aumentada• Secreción de citoquinas• Actúa como CPA

• Macrófagos de la lamina propia:• Perpetúan proceso inflamatorio

• Predisposición genética

ENFERMEDAD DE CROHN COLITIS ULCEROSA

Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon

Afecta a todo el tracto digestivo

Inflamación superficial de la mucosa

Proceso transmural y granulomatoso

Presencia de pseudopólipos

Compromiso de mucosa discontinuo

Colon normal

CrohnCrohn

C.U.

Macrófagos intestinales:

• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares

de la lamina propia. • Detección de su fenotipo:

• Inmunohistoquímica• Citometría de Flujo

• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos encontrados en mucosa de EII y en personas que no la presentan

Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44

Pacientes:

UNIVERSO (n=70)

SOSPECHA CLINICA (+)ENDOSCOPIA (+) (n = 52) GRUPO

TESTIGO(n = 18)

HISTOLOGIA NO ESPECIFICA

(n = 38)

EII POR BIOPSIA (n = 14)

Método

Dgto. de EII: Clínico, endoscópico

e histológico Grupo de EII

Controles clínicos regulares Grupo testigo

Criterio de Exclusión

Consentimiento informado

Endoscopía

HLA-DRCD33

CD16CD33

Materiales y Métodos

Biopsia2 x 2 mm Disgregación

mecánica

30` oscuridad

FACSCalibur Software Cell-Questv.3.3

Mínimo de 10000 eventos

Pacientes según fenotipo HLA-DR en MI y diagnóstico de EII

Fenotipo MIEII-CH

100 (14)

0 (0)

100 (14)

p<0.001

Testigo

11.11 (2)

88.89 (16)

100 (18)

Total

65.71 (46)

34.29 (24)

100 (70)

HLA-DR(+)

HLA-DR(-)

Total

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.001

HNC

78.94 (30)

21.06 (8)

100 (38)

p<0.001

Subtotal

84.61 (44)

15.39 (8)

100 (52)

p<0.001

Sospecha Clínica

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica

Fenotipo MIEII-CH

85.71 (12)

14.29 (2)

100 (14)

P>0.05

Testigo

55.55 (10)

44.45 (8)

100 (18)

Total

74.28 (52)

25.72 (18)

100 (70)

CD16 (+)

CD16 (-)

Total

Pacientes según fenotipo CD16 en MI y diagnóstico de EII

HNC

78.94 (30)

21.06 (8)

100 (38)

p<0.05

Subtotal

80.76 (42)

19.24 (10)

100 (52)

p<0.05

Sospecha Clínica

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.05

Especificidad

88.9

88.9

88.9

VPN

66.7

66.6

100

VG

85.7

82.0

93.7

Sospechaclínica

HNC

EII-CH

Indices de validación para HLA-DR en EII

Sensibilidad

84.6

78.9

100

VPP

95.7

93.7

87.5

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global

Especificidad

44.4

44.4

44.4

VPN

44.4

50.0

80.0

VG

71.4

67.85

62.5

Sospechaclínica

HNC

EII-CH

Indices de validación para CD16 en EII

Sensibilidad

80.8

78.9

85.7

VPP

80.8

75.0

54.5

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global

ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

•Tejido fresco o congelado.

•Tejido fijado en formalina -desparafinado.

Concordancia : 90 %.


TEJIDO FRESCO

Ventajas :

- Células enteras ( ADN, Ags. de membrana y citoplasma ).- Menor debris ( mejor resolución del histograma ).

Desventajas :

- No es posible la localización histológica de áreasde interés.

- Proceso inmediato o congelación.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999


TEJIDO FIJADO EN FORMALINA Y DESPARAFINADO

Ventajas :

- Selección histológica de áreas de interés.- Permite estudio retrospectivo en individuos de curso clínico conocido.

Desventajas :

- Núcleos “desnudos”.- Fijación en formalina o microondas.- Mayor debris.


ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica.

• Se obtiene una estimación de las fases delciclo celular.

• Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt).

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 J.L.C.N.

CICLO CELULARCICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)

MITOSISM

1 hrG2(4n) G0 (2n)

9 hr

4 hrPost Síntesis DNA

10 hrs

Síntesis ADN S G1 (2n) Pre-síntesis ADN


4n2n

FASES G0G1

NU

ME

RO

DE

CE

LU

LA

S

HISTOGRAMA DE ADN OBSERVADO

FASE S FASES G2+M

CONTENIDO DE ADN


Histograma Diploide o “Normal”

Histograma Aneuploide

Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

La ploidía del ADN se expresa como Indice de ADN ( IA ):

IA = G0G1 población en estudioG0G1 población de referencia

Población de referencia : tejido normal del cual se origina el tumor en estudio.



IA = 1 ADN diploide.IA > 1 ADN aneuploide.



ANEUPLOIDIA

•Grado de malignidad

•Pronóstico

Invasión

Metástasis

Evolución natural

Respuesta a tratamiento



PROLIFERACION CELULAR

•Tiempo libre de enfermedad.

•Sobrevida.


Proliferación Celular :

Fracción Fase S tiene valor predictivo positivo

S+G2M no debería usarse.

Fracción Fase S específica de células tumoraleses el parámetro citométrico más relevante como

factor pronóstico independiente.


Métodos de estudio para Proliferación celular

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

• Estudio del comportamiento biológico de poblaciones celulares dentro de un tumor.

• Determinación de Fracción proliferativa (Fases S + G2M) de una población celular.

• Pronóstico y sobrevida de pacientes afectados de cáncer.

• Estudios de viabilidad.• Apoptosis.

Aplicaciones:


Determinación de parámetros de ciclo celular por Citometría de Flujo en pacientes con pólipos adenomatosos

de colon y en mucosa colónica normal.Resumen de las medias de fases de ciclo celular para grupo control y PAC

IDGrupo G0G1(%) G2M(%) Fase S(%) Fp

Control(n=21) 0.99 6.33 11.1188.88 4.77

PAC(n=60) 1.02 6.88 20.4679.53 13.58

0.0013 (*)p(<0.05) 0.0002 (*) 0.0027 (*) 0.0002 (*)0.0044 (*)

ID: Indice de ADN; FP = (Fase S +G2M)

File: C-A.001Source: COLONAnalysis type: Manual analysisPrep: Fresh/Frozen

DIPLOID: 100.00 %Dip G0-G1: 91.49 % at 51.25Dip G2-M: 1.69 % at 98.83Dip S: 6.82 % G2/G1: 1.93Dip %CV: 2.86

Total S-Phase: 6.82 %

Debris: 4.90 %Aggregates: 0.73 %Modeled Events: 20660RCS: 17.549

Channels150

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Num

ber

Mucosa colon normal

0

0 50 100 200 250

File: 102-A.001Source:ESTOMAGOCase: 7093Analysis type: Manual analysis

ANEUPLOID 1 : 72.38 %An1 G0-G1: 75.23 % at 83.39An1 G2-M: 3.27 % at 166.78An1 S: 21.51 % G2/G1: 2.00An1 % CV: 3.18An1 DI: 1.30

ANEUPLOID 2 : 27.62 %An2 G0-G1: 43.96 % at 101.50An2 G2-M: 5.69 % at 203.00 An2 S: 50.36 % G2/G1: 2.00 An2 % CV: 9.45

An2 DI: 2.01Total S-Phase: 29.47 %Modeled Events: 16036

Channels100 150

1200

900

Num

ber

600

300

0

0 50 200 250

MUESTRAS USADAS PARA ANALISIS DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR POR

CITOMETRIA DE FLUJO

I Suspensiones Celulares:• Líneas Celulares.• Sangre Periférica• Médula Osea• Fluídos con alta celularidad (Liq. ascítico,

peritoneal, etc.)II Tumores Sólidos:

• Tejido sólido• Aspirado Celular

III Tejidos Embebidos en Parafina


Citometría de flujo enel estudio pronóstico del

Cáncer Gástrico Avanzado

Oscar Lynch, Jaime Madariaga, Fernando Kawaguchi,Juan Luis Castillo, Gabriel Astete, y Cols.

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

Resultados en Cáncer Gástrico Avanzado :

PLOIDIA

FASE S


Fase Ses un factor pronóstico independiente

en Cáncer gástrico Avanzado


ESOFAGO

• Mucina 1• Ciclo celular• Ploidía de ADN• p53

Carcinoma superficial de

células escamosas

Marcadores pronósticos

• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Int J Cancer 1999;84(3):251-7• Cancer 1999:85(11):2322-8

ESOFAGO

Otros marcadores biológicos:

• Ciclina D1• Rb• PCNA• E-caderina• TGF-α

• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Dig Dis Sci 2000 (5):864-9• Hum Pathol 1999 (9): 1087-92• Br. J Cancer 2000;82(4):865-70

ESOFAGO DE BARRET

• Ploidía de ADN• Ciclo celular• p53• PCNA• Ciclina E• Mucinas (MUC-2)• Ki-67

• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Cancer 1999; 86(12):2597-601• Am J Gastroenterol 1999; 94(10):2829-33• World J Surg 2000; 24(1):72-7

LINFOMA

• Poblaciones Linfoides T• Poblaciones Linfoides B:

• Expresión de cadenas livianas tipo kappa• Expresión de cadenas livianas tipo lambda

• Ausencia de otros marcadores (CD5, CD10, CD34)

Helicobacter pyloriMALT

• Hematology 2001• BMC Gastroenterology 2 (WWW.biomedcentral.com/1471-230x/2/6)

Citometría de Flujo: Clínica, Investigación,

Gastroenterología y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.

Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Concepción, Noviembre de 2003

citometría de flujo: clínica, investigación ... · -iiv-madura: cd1a y cd3mb ... ch3-c-o cl o...

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