Ciencia y Medio Ambiente - CCMA-CSIC 2002195

Fijación biológica de nitrógeno: factores limitantes

Mercedes Fernández-Pascual,Nuria de María y María Rosario de Felipe

Resumen

La Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN)representa una alternativa a la fertilizaciónnitrogenada ya que puede paliar muchos de losefectos negativos que dicha fertilización producetanto a nivel medioambiental, como a nivelsanitario. La FBN está relegada a organismosprocariontes que son capaces de reducir elnitrógeno molecular a amoniaco tanto en vida librecomo en simbiosis. La mayor parte del nitrógenofijado en los ecosistemas terrestres se realizamediante la asociación simbiótica de bacterias delos géneros Rhizobium, Bradyrhizobhim,Sinorhizobinm, Azorhizobhim y Mesorhizobium(Rhizobium para generalizar) con plantasleguminosas. Gran parte de estas asociacionessimbióticas tiene interés para la Agricultura. Sinembargo, aunque los rendimientos de la FBN sehan incrementado considerablemente en los últimosaños, al trasladar estos conocimientos a laAgricultura práctica, se detectan limitaciones a lafijación biológica en la simbiosis a nivelmedioambiental, biológico, metodológico y a nivelde producción. En este trabajo se analiza el efectode alguno de estos factores sobre la fijación denitrógeno y la producción final de grano, desde elpunto de vista fisiológico, bioquímico y estructuralen la simbiosis Rhizobinm-leguminosa.Palabras clave: Rhizobium, Simbiosis, Fijación denitrógeno, Factores limitantes, nitrato, salinidad,herbicidas.

Introducción

El nitrógeno, después del agua, es elprincipal factor limitante para el desarrollo de lasplantas. Precisamente por esta razón en el periodoentre 1950 y 1990 se incremento 10 veces el uso defertilizantes nitrogenados lo cual llevo a unaumento sin precedentes de la productividad en loscereales. Sin embargo, la aplicación de estosfertilizantes y otras acciones industriales yantrópicas han alterado las condiciones básicas delciclo natural del nitrógeno y han contribuido a lacontaminación por nitratos de los ecosistemas

terrestres y acuáticos con grave riesgo para la saludhumana. Los efectos sobre la salud han sido puestosde manifiesto en diversos estudios epidemiológicosy clínicos. Estos estudios ha demostrado que laingestión de nitratos con el agua de bebida o enalimentos conduce a la aparición demetahemoglobinemia e incluso se han relacionadocon la aparición de cáncer El nitrato se transformaen el organismo en nitrito que oxida el Fe2+ ferrosode la hemoglobina a Fe3+ férrico que es incapaz defijar el oxígeno y transportarlo a los tejidos; es loque se llama enfermedad azul de los lactantes. Otroproducto secundario de los nitratos son lasnitrosaminas, cuyo carácter cancerígeno fuedemostrado por Mirvish en 1981

La fijación Biológica de nitrógenorepresenta una alternativa a la fertilizaciónnitrogenada ya que puede paliar muchos de losefectos negativos tanto a nivel medioambientalcomo sanitario (Newton 2000).

El nitrógeno es el elemento más abundantede la atmósfera terrestre y sin embargo es unafuente nutritiva muy escasa. Esta paradoja se debe aque el nitrógeno atmosférico es inerte y no puedeser aprovechado por la mayoría de los seres vivos.El nitrógeno únicamente se incorpora a los sistemasbiológicos cuando ha sido fijado o combinado conciertos elementos como el hidrógeno o el oxígeno,es decir, en forma de nitrato o de amonio.

Dentro de la fijación de nitrógeno global,la FBN aporta la mayor parte del nitrógeno fijado alos ecosistemas terrestres. La FN global se estimaen unos 275 millones de toneladas de nitrógeno alaño. De esta cantidad 30 millones de toneladas sefijan por causas naturales como descargaseléctricas, erupciones volcánicas, etc. 70 millonesde toneladas se fijan mediante fijación industrial, esel proceso de Haber-Bosch en el cual se gasta grancantidad de energía procedente del petróleo y 175millones de toneladas se fijan mediante fijaciónbiológica. De estos 175 millones, 35 millones sefijan mediante fijación en vida libre y 140 millonesde toneladas se fijan mediante fijación simbiótica(Sevillano y Rodríguez-Barrueco 1987). De estos140 millones de toneladas, 105 millones son fijadospor especies de interés para la agricultura, como lasque figuran en la Tabla 1.

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Tabla 1. Valores medios de fijación de nitrógeno de algunas leguminosas

LeguminosaAlfalfaAltramuzTrébol rojoMelilotoVezaGuisante

LentejaSojaGarbanzoJudía

Nitrógeno fijado kg/ha/año200-250150100-150100-125100-120100

10080-9060-8050

Especie de RhizobiumSinorhizobium melilotiBradyrhizobinm sp (Lupinus)R. Leguminosarum bv.trifoliSinorhizobium melilotiR. Leguminosarum bv. viciaeR.Legiiminosarum bv. viciae

R.Leguminosarum bv. viciaeBradyrhizobium japonicumR.Leguminosarum bv. viciaeR.Leguminosarum bv phaseoli

El proceso de fijación está relegado aorganismos procariontes, que son capaces dereducir el nitrógeno molecular a amonio tanto envida libre como en simbiosis con organismossuperiores. A continuación se presenta un resumende los principales grupos de microorganismosfijadores (Martínez-Molina y Velázquez 1991).

Bacterias fijadoras en vida libreBacterias anaerobias

• Quimiótrofas: Clostridmm,Desulfotomaculum, Desulfovibrio,Meihanosarcina

• Fotótrofas: Chromatium, Thiopedia,Ectothiorhodospira

Bacterias anaerobias facultativas.• Quimiótrofas: Klebsiella, Citrobacíer

enterobacter, Erwinia, Badilas,Propionibacterium.

• Fotótrofas: Rhodospirillunt yRhodopseudomonas

Bacterias aerobias o microaerófilas• Quimiótrofas: Azospirillum,

Aquaspirillum, Azotobacter Azomonas,Beijerinckia, Derxia, Rhizobium,Agrobacterium, Thiobacillus,Corynebacterium.

• Fotótrofas: Gloeocapsa, Anabaena,Calotrhix, Nostoc, Spirulina, Oscillatoria,Lyngbya.

Bacterias que forman asociaciones fijadorasRizocenosis

• Azospirillum y Azotobacter con raíces degramíneas. Beijerinckia con raices ce cañade azúcar

• Bacilhis con raices de gramíneas

Simbiosis asociativas• Anabaena con hojas de Azolla anabaenae.• Nostoc con raíces de musgos y hepáticas

• Calotrix con hongos (liqúenes)

Rizoendosimbiosis• Rhizobium, Bradyrhizobium y

Sinorhizobium en raíces de leguminosas• Azorhizobium en raíces y tallos de

Sesbania rostrata• Frattkia con raíces de Angiospermas no

leguminosas

Fisiología de la fijación de nitrógeno

Aunque existen grandes diferencias en lamorfología y fisiología de todos los organismosfijadores de nitrógeno, el proceso de fijación y elsistema enzimático que lo lleva a cabo es similar entodos los organismos. Este sistema se denominanitrogenasa y la reacción que se produce es lasiguiente:N2 + 8Ff + 16 ATP16ADP + 16 Pi

2NH, H2

El proceso de fijación lleva asociada unareducción de tT a H2 en todos los sistemas dondese ha probado, sin embargo, muchos de estossistemas tienen acoplado un sistema de reciclar elhidrógeno mediante la presencia del enzimahidrogenasa.

La reacción de reducción del nitrógeno esun proceso endergónico que requiere un mínimo deenergía de 960 kJ por mol de nitrógeno, por lo quedebe acoplarse a un sistema que produzca ATP deuna manera eficiente. El ATP necesario se producemediante el proceso de fosforilación oxidativaacoplado a la cadena transportadora de electronesque utiliza el oxígeno como aceptor final de losmismos.

Estructura de la nitrogenasa

La nitrogenasa se separa en doscomponentes, el componente 1. Mo-Fe proteina y el

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componente II. Fe-proteína. El componente I es untetrámero 0^2 de aproximadamente 220 kDa. Tiene24 átomos de hierro y 2 átomos de molibdeno. Elcomponente II es un dímero con dos subunidadesidénticas de 32 kDa cada una. La secuencia deaminoácidos de esta proteína está altamenteconservada entre las de diversas especies deprocariontes fijadores.

Los electrones procedentes de los glúcidosson donados primero al componente II y luego alcomponente I en donde ocurre la verdaderareducción de nitrógeno. Para que la transferenciatenga lugar es necesario que la Fe-proteína se una aun MgATP en dos lugares de enlace. Esto produceuna alteración de la conformación de la proteína,una disminución de su potencial redox y unaumento de la sensibilidad al oxigeno. Latransferencia de electrones es concomitante con lahidrólisis de Mg-ATP La Fe-Proteína esextremadamente sensible al oxígeno de manera queel exceso de este gas produce un cambioconformacional en el sistema que le incapacita paraaceptar electrones.

Además de estos dos componentesfundamentales de la nitrogenasa existen losdenominados centros P y el cofactor Fe molibdeno:FeMoco. Los centros P son centros redoxinvolucrados en la acumulación intramolecular deelectrones hacia el lugar de reducción del sustrato.El FeMoco es un pequeño centro metálico aniónicoque no contiene aminoácidos, pero si homocitrato.

Asimilación del nitrógeno fijado

La asimilación del nitrógeno fijado varíadependiendo del organismo fijador

En los apartados siguientes se distingueentre microorganismos fijadores en vida libre y ensimbiosis. En cada apartado se hará mención a laasimilación de los productos de la fijación.

Fijación de nitrógeno en vida libre

Entre los microorganismos fijadores denitrógeno en vida libre existen anaerobios estrictos,anaerobios facultativos y aerobios. Dentro de cadauno de estos grupos existen géneros capaces detomar la energía de sustancias químicas(Quimiotrofos) o de tomarla de la luz (Fototrofos).

Estrategias de protección contra el oxígeno

Como se ha dicho anteriormente, uno delos principales factores limitantes de la fijación denitrógeno es el oxigeno. La pérdida de actividad dela nitrogenasa en presencia de oxigeno y los altosrequerimientos de ATP por parte de este enzimahan llevado a los organismos fijadores a desarrollaruna serie de estrategias para protegerse de este gasy tener los niveles mínimos requeridos para lafosforilación oxidativa. Entre estas estrategias cabedestacar Microaerofilia, protección respiratoria,protección conformacional, inhibición reversible,

síntesis de la nitrogenasa, separación espacial de lanitrogenasa y barreras de difiísión (Lluch y Ligero,1992).Asimilación de amonio en vida libreAunque el primer producto de la nitrogenasa es elNH3 este es rápidamente protonado para formarNH/ Este amonio se une al ácido glutámico paradar glutamato en presencia de ATP y la Glutaminasintetasa (GS). El ácido glutámico puede volver aglutamina en presencia de otra enzima denominadaglutamina-2-oxoglutarato-ammo-transferasa(GOGAT). El coste de la ruta GS/GOGAT es unATP por Glutamato formado, produciéndose unarápida asimilación de amonio evitando laacumulación de este compuesto que enconcentraciones altas inhibiría la síntesis de lanitrogenasa. La relación exacta entre GS/GOGATpuede variar con las especies libres o en simbiosis.Parte de la glutamina formada es un producto netode la fijación, que puede pasar a distintosaminoácidos por transaminaciones y otra parte seutiliza para mantener el suplemento de sustrato paranuevas incorporaciones de amonio.

Fijación de nitrógeno en simbiosis

Como se ha dicho anteriormente, existen 3formas de asociaciones fijadoras: Rizocenosis,Simbiosis asociativas y Rizoendosimbiosis.

La rizocenosis consisten en la interacciónentre microorganismos del suelo con los génerosAzoíobacter Azospirillum y Beijerinckia, los cualescolonizan el suelo rizosférico y las raíces de lasplantas en respuesta a una indudable ventajaecológica establecida por la alta relación C/N queen estos hábitats se establece. La mayoría de lostrabajos de investigación en bacterias diazotrofas,asociadas a raíces de plantas de interés agrícola sehan concentrado en dos géneros bacterianos:Azoíobacter y Azospirillum, que, aunque similaresen algunos aspectos morfológicos se encuentranclaramente diferenciados desde el punto de vistafilogenético. Estos diazotrofos son quizás los que seaislan e identifican de una forma más constante concereales.

Los tres géneros que forman las simbiosisasociativas, Anabaena, Nostoc y Calothrix, sonorganismos fototrofos, con una distribución dehábitats muy amplia y que pueden formarheterocistos donde se localiza la nitrogenasa.

Simbiosis Rhizobium LeguminosaComo se indicaba al principio del tema este tipo deasociación es la que proporciona mayor cantidad denitrógeno en los ecosistemas terrestres, teniendoademás un gran impacto a nivel agronómico yecológico. En esta asociación la reducción delnitrógeno se lleva a cabo en unas estructurasmorfológicamente definidas denominadas nodulosque se forman por la asociación demicroorganismos de los géneros Rhizobium,

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Brodyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium yMesorhizobhtm en raices de leguminosas.

La asociación entre el microsimbionte, laespecie de Rhizobium, y la leguminosa es específicay sólo se establece cuando en el suelo existe elrizobio o rizobios característicos de la planta.

En general el rizobio infecta a laleguminosa a través de un pelo radicular. Elproceso se lleva a cabo en una serie de etapas quese inician con el reconocimiento, sigue con lainfección, el desarrollo del nodulo y la fijación denitrógeno propiamente dicha (Fernández-Pascual,1984). A nivel molecular el reconocimiento seestablece mediante un dialogo molecular entre laplanta que exuda flavonoides e isoflavonoides queson capaces de inducir los genes de nodulación delrizobio. Los productos de los genes nod son losdenominados factores nod los cuales son capaces deinducir la curvatura del pelo radicular (primer signode infección de un rizobio a la raíz de laleguminosa) y la división de las células radicularessubepidérmicas que darán lugar al meristemoprimario del nodulo, el cual induce ladiferenciación del pelo radicular que se encuentrapor encima y que llegará a ser el sitio de infección.Además el meristemo primario induce la formacióndel meristemo secundario. Mientras tanto el rizobiose une específicamente al pelo radicular, se formael canal de infección desde el punto donde se hainiciado la infección hacia la base del peloradicular En el foco de infección los rizobios sonliberados endocíticamente a partir del canal deinfección. Alcanzado este punto se producen unaserie de modificaciones vasculares y la variedad detipos celulares necesarios para el funcionamientodel nodulo. Las bacterias se transforman enbacteroides los cuales son capaces de fijar elnitrógeno atmosférico.

Las etapas descritas anteriormentecorresponden a fenotipos determinados por genesde las bacterias y de la planta que interactúandurante el proceso de infección.

La variedad de tipos celulares dan lugar ados zonas bien diferenciadas en los nodulos: lacorteza o parénquima nodular y la zona infectadadonde se encuentran los bacteroides, que son losencargados de fijar el nitrógeno molecular Lacorteza está formado por células de estructurasemejante a las células radiculares. Se distinguendiferentes tipos de células y diferente ordenacióndependiendo del nodulo de que se trate. Además, enesta zona del nodulo, se encuentran los hacesconductores por donde se va a realizar elintercambio de productos entre los dos simbiontes,es decir, los esqueletos carbonados y las fuentes depoder reductor por parte de la planta y el nitrógenofijado por parte de los bacteroides. En la zonainfectada se encuentran las células vegetalesrepletas de bacteroides los cuales están rodeados deuna membrana de origen vegetal denominadamembrana peribacteroidal. El conjunto demembrana peribacteroidal y bacteroides recibe elnombre de simbiosoma. El número de bacteroides

dentro de un simbiosoma varía dependiendo de laprocedencia del nodulo. Entre los simbiosomas seencuentra la proteína mayoritaria del nodulo que esla leghemoglobina y que como veremos másadelante está encargada del transporte y regulaciónde la concentración de oxígeno en las cercanías delos bacteroides (Vivo y col. 1989).

El poder reductor y los electronesnecesarios para la reducción de N2 a NHj procedede los fotosintatos producidos por la fotosíntesis.Los fotosintatos son unos de los principales factoreslimitantes de la fijación de nitrógeno. Losesqueletos carbonados procedentes del ciclo deRrebs ceden electrones a la ferredoxina yflavodoxina que a su vez los ceden a la nitrogenasa.

Asimilación en simbiosis

La primera reacción dentro de los nodulosradiculares es igual que la utilizada por fijadoreslibres, pero después estos productos se tienen queexportar a través del xilema impulsados por lacorriente transpiratoria de la planta, a la parte aérea(hojas) donde serán utilizados como donadores denitrógeno reducido para la síntesis de aminoácidos,proteínas y otros compuestos necesarios para elcrecimiento de la planta. Según el tipo decompuesto que se exporte por el xilema las plantassimbióticas se clasifican en dos grandes grupos: losque exportan amidas, asparragina, glutamina o 4-metilenglutamina y los exportadores de ureidos,que transportan alantoina y ácido alantoico ocitrulina. Las leguminosas pertenecientes a lastribus Viciae. Genisteae y Trifoliae, originarias delas zonas templadas, y que incluyen cultivos tanconocidos como el guisante, altramuz, habas yalfalfa son exportadores de amidas. Las leguminosade origen tropical, como las pertenecientes a lastribus Phaseoleae y cuyos representantes másconocidos son Phaseolus vulgaris y Glycine Maxson exportadores de ureidos.

Estrategias de protección contra el oxígeno ensimbiosis.

Como ya se ha dicho anteriormente eloxígeno es imprescindible para aportar la energíanecesaria para la fijación de nitrógeno y unaelevada cantidad de oxígeno inhibe el componenteII de la nitrogenasa. Para proteger a la nitrogenasaen los nodulos de leguminosas se han desarrollado3 mecanismos: la barrera de resistencia a ladifusión de oxígeno (BRDO), la leghemoglobina yla respiración de los bacteroides de la cual yahemos hablado para los fijadores en vida libre.

La BRDO es variable y es capaz demodificar su espesor dependiendo de lascondiciones ambientales. Está situada en la cortezainterna y formada por una o varias capas de célulascuyos espacios intercelulares están rellenos de aguay glicoproteínas (De Lorenzo y col. 1993). Estabarrera responde a situaciones de estrés comosequía, encharcamiento, oscuridad, presencia denitrato o sales (Fernández-Pascual y col, 1996),

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bajas temperaturas, etc. Ante tales situaciones deestrés se pone en marcha el funcionamiento de labarrera, incrementando la cantidad deglicoproteínas en los espacios intercelulares lo quetrae consigo un incremento de la Resistencia a ladifusión de oxigeno hacia los bacteroides yconsecuentemente el descenso de la actividadnitrogenasa. Puesto que la desaparición del estréslleva aparejada la recuperación del normalfuncionamiento de la barrera, se considera que lacapacidad de ajuste de la misma representa unmecanismo biológico de protección de lanitrogenasa.

Superada la BRDO, el transporte deoxígeno hasta los bacteroides, dentro de las célulasinfectadas, se lleva a cabo mediante difusiónfacilitada. Esta función es resuelta por lasleghemoglobinas (Lbs), proteína monoméricas quecontienen un grupo hemo y que pueden captar unamolécula de oxigeno. La concentración de estashemoproteína en nodulos se aproxima a 3mM y suafinidad por el oxígeno es extremadamente alta.

Para que la leghemoglobina pueda actuarcomo transportador de oxígeno necesita mantenersu estado de oxidación como ferroleghemoglobina(Lb2+), habiéndose calculado que el 80 % de las Lbsdel nodulo se encuentran como Lb2^ y sólo el 20%como Lb2+.02 (oxiferroleghemoglobina).

Comparación de la fijación de nitrógeno ensistemas libres y simbióticos

Aunque las nitrogenasa de ambos sistemasfuncionan de forma parecida, existen algunasdiferencias que merecen la pena ser destacadas. Lasdiferencias conciernen a.

• La fase de crecimiento de losmicroorganismos durante la cual tienelugar la fijación de nitrógeno.

• La cantidad de nitrógeno fijado por gramode material celular

• La eficiencia de la fijación de nitrógeno.• El destino del nitrógeno fijado.

Factores limitantes de la fijación de nitrógeno

Los rendimientos potenciales de la FBN enla simbiosis Rhizobmm-Legwúnosa., se hanincrementado en un 34 % con los conocimientosque disponemos en la actualidad. Sin embargo, sedebe tender a alcanzar el 100 % mediante lamanipulación genética y el manejo del ambiente(Lluch, 1998).

Como se ha dicho anteriormente, a nivelde funcionamiento de la nitrogenasa los principalesfactores limitantes son los fotosintatos procedentesde la fotosíntesis y el oxígeno, ya que ambosfactores son imprescindibles para la obtención deenergía por pane de la nitrogenasa.

Aunque hoy se conocen los genessimbióticos fix y nif que codifican la nitrogenasa,así como la regulación de estos genes y los avances

en los últimos años han sido notables, al trasladarestos conocimientos a la agricultura práctica sedetectan las limitaciones de la fijación biológica enla simbiosis en a) medioambientes con acidez desuelo, deficiencia o toxicidad de P, Ca, Mo y Al,salinidad, falta o exceso de agua, xenobioticos,presencia de nitrógeno combinado, el clima,herbicidas, temperatura y humedad del suelo(especialmente en suelos tropicales Andrade et al.,2001), b) a nivel biológico, es lógico que estosfactores influyan en la supervivencia,competitividad y establecimiento de la simbiosis, c)a nivel metodológico con la preparación deinoculantes con cepas seleccionada y competitivas,con la formulación, preparación y uso de losinóculos y d) a nivel de producción.

Dentro de los factores limitantesanteriormente citados en nuestro departamentohemos trabajado con nitrógeno combinado,salinidad y herbicidas,. El estudio de estos factoresse ha llevado a cabo de forma integral, teniendo encuanta aspectos fisiológicos, bioquímicos yestructurales.

Nitrógeno combinado

El nitrato inhibe la nodulación y la fijación denitrógeno. Aunque no esta totalmente demostrado,parece que la inhibición de la nodulación se debe aque el nitrato se une a algún receptor específico delRhizobium sobre la raíz de la leguminosaimpidiendo la nodulación.

Los mecanismos de inhibición de laactividad nitrogenasa por nitrato han sidoestudiados en nuestro Departamento con plantas deLupinus. La aplicación de nitrato 20 mM provocauna disminución de al actividad nitrogenasa y de larespiración del sistema radicular, así como unincremento de la resistencia a la difusión deoxígeno. Además, la aplicación de nitrato producealteraciones en la morfología de la corteza nodular,la más evidente de las cuales es la oclusión de losespacios de la corteza media por una sustancia denaturaleza glicosidica, posteriormente identificadacomo una glicoproteína (de Lorenzo et al., 1993).Estos datos permitieron llevar a cabo lavisualización de la barrera de resistencia a ladifusión de oxígeno (de Lorenzo et al., 1993 ylannetta et al 1993), que hasta entonces había sidopuesta de manifiesto por métodos fisiológicos ymatemáticos.

El aumento de la concentración deglicoproteína está relacionado con el incremento dela resistencia a la difusión de oxígeno, por lo que elmecanismo de inhibición de la actividadnitrogenasa está relacionado con la falta de oxigenode los bacteroides para mantener simultáneamentelas actividades respiratoria y nitrogenasa.

El mecanismo de operación de la barreralleva consigo la disminución del tamaño de losespacios intercelulares mediante la expansión de lascélulas que forman la corteza media y la oclusiónde los espacios intercelulares con la glicoproteína

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aumentando el tamaño de la barrera donde en elcaso de los nodulos sometidos a situaciones deestrés la limitación de oxigeno es también para loshaces vasculares.

Salinidad

En nuestro departamento y en colaboración con elInstitute of Grassland and Environmental Researchse ha estudiado el efecto de diferentesconcentraciones de NaCl sobre el crecimiento y laactividad fijadora de nitrógeno en plantas deLupinus albus. La actividad nitrogenasa decrece,mientras que la resistencia a la difusión de oxígenoaumenta, a medida que aumenta la concentraciónde cloruro sódico de O a 150mM. (Fernández-Pascual et al., 1996). Sin embargo, estadisminución es menor que en otras leguminosas.Los parámetros de crecimiento, fotosíntesis y larespiración de la parte aérea no se afectaron conconcentraciones de 150 mM de NaCl aplicadasdurante 6 días. Estos datos indicaban que lasplantas de Lupinus eran más resistentes al estréssalino que otras leguminosas. El microanálisis derayos X, junto con la microscopía electrónica denos da la posible explicación de la resistencia alestrés salino: el bajo nivel de sodio que entra en lazona infectada y la sustitución de K por Na en lacorteza.

Herbicidas

En cuanto a los herbicidas se han llevado a caboexperimentos de laboratorio y campo paradeterminar la influencia de herbicidas comercialessobre la fijación de nitrógeno, el aparatofotosintético, el metabolismo proteico y laproducción en plantas de Lupinus albus (de Felipeet al., 1987). En los experimentos de campo seañadieron 3 kg por hectárea del producto comercial.Se midió la actividad nitrogenasa por el sistema dereducción de acetileno antes de la primera ysegunda floración. La actividad nitrogenasa decrececon la aplicación de herbicidas El descenso fuemenor en los tratamientos con simazina y semillasinoculadas. El efecto de la simazina sobre elaparato fotosintético fue más tóxico que el delLindex, reduciendo el tamaño del cloroplasto yafectando a la estructura del grana. No seobservaron cambios ultraestructurales en las célulasnodulares tratadas con Lindex. Por el contrario lasimazina altera las células nodulares causandoformación de vesículas, degeneración de bacterias ydescenso en el número de bacteroides fijadores. Laproducción final decrece con ambos herbicidas,siendo menor el descenso con plantas inoculadas(Tabla 2).

Tabla 2. Efecto de malas hierbas y dos herbicidas (Lindex y simacina) la producción final de grano (kg/ha) enplantas inoculadas y no inoculadas de Lupinus albus.

Tratamientos No inoculadas InoculadasControl sin malas hierbas 1252aControl con malas hierbas 443bLindex 807abSimacina 272b

1180a433b687ab481b

Los resultados sugieren que cada herbicidatiene un efecto diferente sobre la producción final,el aparato fotosintético y la producción final degrano, no existiendo diferencias significativas entrelos tratamientos con Lindex y el control. El hechode que los herbicidas aplicados sobre cultivos deBradyrhizobium no afectaran el crecimiento de estemicroorganismo, sugieren que los efectos adversosde estos herbicidas se deben a interacciones deestos compuestos con el aparato fotosintético lo

cual, lleva a una pérdida del aporte de energía a lanitrogenasa, disminuyendo la actividad fijadora denitrógeno y la producción.

A la vista de los resultados obtenidos en elcampo con el herbicida Lindex nos parecióconveniente investigar el efecto que los doscomponentes del Lindex, la cianacina y el linuron,tenían sobre el desarrollo de las plantas, laultraestructura del mesófilo y de los nodulos, elmetabolismo proteico y la actividad nitrogenasa

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(Fernández-Pascual et al., 1988). Tanto la cíanacinacomo el linuron producen un descenso en el peso deraíces y parte aérea. Con respecto a la actividadnitrogenasa, y a la estructura del aparatofotosintético y del nodulo, la cianacina resulto mástóxica que el linuron. También con estos herbicidasse comprobó que los efectos adversos causados enla actividad nitrogenasa fueron debidos a la acciónsobre el aparato fotosintético, ya que el herbicidano afecto al microsimbionte en cultivo in vitro. Elmetabolismo proteico también fue alterado. Cuandola concentración aplicada fue de 20 uM decianacina y 80 (oM de linuron apareció un nuevopolipeptido de 17 kDa, el cual no fue encontrado enlas plantas control. Estos herbicidas tambiénafectan al metabolismo del carbono, ya que laconcentración de la subunidad grande de laRibulosal, 5-biphosphato carboxylasa disminuye amedida que aumenta la concentración de cianacinay linuron. (Fernández-Pascual et al., 1988).En relación con la aparición de nuevas proteínas enplantas tratadas con herbicidas, recientemente ennuestro laboratorio, se ha detectado la aparición dedos nuevos polipeptidos de 45 y 21 kDa en elcitoplasma de bacteroides procedentes de nodulosde plantas de Lupimis tratadas con glifosato (deMaría et al., 1999). Actualmente estamosprocediendo a la caracterización de estospolipeptidos mediante secuenciación del N-terminal.

Los herbicidas además de producirmodificaciones en la estructura del aparatofotosintético en las hojas y de la zona infectada enlos nodulos, producen alteraciones en la estructurade la corteza, modificando las capas celularesrelacionadas con la regulación de la barrera deresistencia a la difusión de oxigeno (Fernández-Pascual et al., 1992).

También a nivel de campo se ha estudiadoel efecto de ocho herbicidas pertenecientes a 5grupos químicos diferentes, sobre la fijación denitrógeno y la producción final de grano en plantasde Lupinas albus (Pozuelo et al., 1989). En estetrabajo se observo un efecto beneficioso de tresherbicidas, cianazina, trifluralina y simazina(usando la mitad de dosis que en el trabajo de feFelipe et al., 1987) sobre la actividad nitrogenasa yla producción final de grano, lo cual indica que ladosis de herbicida debe ser establecida para cadacultivo.

Con objeto de superar el efecto de losfactores limitantes de la fijación se están llevando acabo diferentes proyectos tanto a nivel delmicrosimbionte, como de la leguminosa y de lasdiferentes prácticas agrícolas en los cultivos.

Las líneas que mejoran la fijación denitrógeno en cuanto al microsimbionte son a)conseguir disminuir la especificidad de Rhizobium(rizobios que infecten más de una especie vegetal,b) aumentar la nodulación (infectividad) y laefectividad. Aumentar la competitividad y d)aumentar la eficiencia de la nitrogenasa reciclando

el hidrógeno perdido mediante la adquisición delfenotipo hup y resistencia a los factores adversos.Esto implica la utilización de organismosmanipulados genéticamente

En cuanto a las leguminosas se estatratando de potenciar la doble simbiosis que soncapaces de formar estas plantas (micorrizas yRhizobium) a través de la mejora genética clásica yel uso de plantas transgénicas que puedenincorporar genes de interés.

Las prácticas agrícolas que puedenconducir a la sostenibilidad del sistema cabedestacar, la rotación de cultivos, el controlbiológico de patógenos, la reducción defitosanitarios sintéticos y la utilización defertilizantes biológicos como los inóculos deRhizobium.

Conclusiones

La fijación de nitrógeno representa unaalternativa a la fertilización nitrogenada, sinembargo, existen una serie de factores limitantesentre los que se ha hecho especial hincapié en estetrabajo en el nitrato, la salinidad en experimentosde laboratorio y la utilización de herbicidas enexperimentos de campo, en plantas de Lupinasalbus. Estos factores inhiben la actividadnitrogenasa y hemos estudiado los mecanismos porlos que se produce la inhibición. En el caso delnitrato y la sal se produce un aumento de laresistencia a la difusión de oxígeno producido porla oclusión de los espacios intercelulares de la zonacorrespondiente a la barrera de resistencia a ladifusión de oxígeno, lo cual hace que menosoxígeno quede disponible para los bacteroides.Merece la pena destacar que las plantas de Lupinusresultaron más resistentes que otras leguminosas aestos estreses. El efecto de los herbicidas sobre laactividad nitrogenasa depende del herbicidautilizado y de la dosis aplicada, habiendoencontrado herbicidas capaces de incrementar lafijación de nitrógeno y la producción final de grano.La inhibición de la actividad nitrogenasa por losherbicidas se debe a un efecto indirecto sobre elaparato fotosintético de la planta, que conlleva unapérdida del aporte de fotosintatos y energía para lanitrogenasa.

Referencias

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