ciclo litico y lisogenico pdf (un poco en ingles)

8/18/2019 Ciclo Litico y Lisogenico PDF (Un Poco en Ingles)

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Crystal structure of the lambda repressor and a model forpairwise cooperative operator binding.

Stayrook, S.E. , Jaru-Ampornpan, P. , Ni, J. , Hochschild, A. , Lewis, M.

Journal: (2008) Nature 452: 1022-1025

N-Terminal CI DNA


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Inmunidad a la Superinfección

Durante la lisogenia:

. Represor CI Previene la transcripción de genes de por unión a los sitios operadores

Previene la re-infección por otro fago por unión a sus sitios operadores

. Bacteria Lisogénica Inmune a la superinfección conPuede ser infectada con otros fagos con sitiosoperadores diferentes (CI no puede unirse)

FAGOS

. Heteroinmunes Secuencias operadoras diferentes

. Homoinmunes Secuencias operadoras iguales

(Independientemente de la similitud o diferencia en el resto de los genes)


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Inducción del fago

. Profago ADN de la célula hospedadora sufre un daño severo por irradiación o químicosInducción del profago Ciclo Lítico

Proceso deReparación

Auto-


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Inducción del fago - Proteína Cro

. Temprano durante la Inducción Continua la síntesis del Represor CI:● Interfiere con el desarrollo lítico● Podría provocar el reestablecimiento de la lisogenia

. Cro previene la síntesis de CI

- Previene la represión por CI- Activa su propia síntesis

- Previene la unión de CI- = Operadores OL- p L no reprimido

Síntesis de Int y Xis

Affinity of oR for Cro: oR3 > oR2 = oR1


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Unión de la proteína Cro a la región operadora del ADN


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Inducción del fago – Escisión

. Represor sin acción Transcripción a partir de p L y p R Escisión del ADN del cromosoma

. Recombinación sitio específica Sitios híbridos attP-attB Int y Xis (luego de la Inducción)

Exonucleasa 3’-5’

No hay secuencia nutL

No se une N

- Transcripción conjunta

- Xis no es necesaria

- Provocaría la escisiónluego de la integración

Activaciónpor CII

. Int/Xis Escisión ADN

. O y P se transcriben ( p R)

. Replicación de ADN

. ADN dañado (min) Ciclo lítico

. Nivel CI

. Lisis celular 100 fagos (1h)(medio y temp)

Retro-regulaciónRegulación por secuenciasdownstream(mutaciones estabilizan el ARNm)

Regulaciónpostranscripcional


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Competición entre Ciclo Lítico y Lisogénico

No hay CI

Competencia entre elactivador CII y Cro(MOI – Estado metabólico de la célula

Medio de crecimiento – temp) (0,1%)

ARN antisentidoactivado por CII

Medio pobreProteasas

No se degrada CII

Medio ricoProteasas

Se degrada CII

DNA dilutes out the CI repressor


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Competición entre Ciclo Lítico y Lisogénico

Steps leading to lytic growth and lysogeny

Steps leading to lytic growth

1. Transcription from p L and p R2. N and Cro are made

3. N allows CII expression

4. CII degraded

5. Low CII concentration means

that little CI is made

6. Cro binds at OR3 and OL3,

blocking binding by any low

level of CI that is made7. Meanwhile, N allows O and P

replication gen transcription

8. A second antiterminator, Q, allows

late-gene transcription, and sophage particles are made

Steps leading to lysogeny

1. Same as for lytic growth 2. Same as for lytic growth

3. Same as for lytic growth

4. CII stable

5a. High CII concentration activates p I, and

so Int is made and DNA integrates

5b. High CII concentration activates p RE,

and so CI is made

6. CI outcompetes Cro, and so CI binding at

OR3 and OL3 both represses p L and p Rand positively autoregulates at pRM,

mantaining lysogeny

Table 8.3


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Transducción Especializada

. Transducción generalizada el fago porta y puede transducir DNA de la células hospedadora(cualquier región y solo ADN de la célula)

. Transducción especializada el fago porta solo genes cercanos a la región de attachment(transporta tanto genes de la célula como fágicos)

. Part. transductantes muy raras Potentes técnicas de selección

. Recipiente Gal - medios con Galactosa como única fuente de C

. Raras transductantes Gal + integrado el con genes gal

. Transductantes Gal + Aislado de colonia HFT lisate

. Fago helper wt


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Transducción Especializada

Di-lisógeno


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Otros fagos que forman lisógenos (P2, P4, Mu)


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Utilización de la forma lisogénica de fagos como vectores de clonado

. Fagos atemperados pueden multiplicarse como fagos grandes cantidades de ADN

. Se integra al cromosoma Estudios de complementación (2 copias del mismo gen)

. Facilita el mapeo genético y reemplazo de genes:- Fago sin sitio att con un fácil marcador de selección (ATB R)- Mapeo genético – genes sin fenotipo- Gen de interés clonado en el ADN del fago- Se introduce por empaquetamiento in vitro en infección o transfección- Recombinación


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Conversión Lisogénica y Patogénesis BacterianaComo los fagos pueden contribuir a la patogenicidad de bacterias

. Profagos pueden portar factores de virulencia o toxinas Patogenia de la bacteria lisogénica

. Morons (more DNA): Se pueden expresar a partir de su propio promotor aunque otros genesdel fago estén reprimidos

Ejemplos. E. coli y Disentería: Toxina Shiga (diarrea hemorrágica) 361 E. coli O157:H7

. Corynebacterium diphtheriae (difteria) Lisógeno de fago gen tox Enzima que mata la cél. eucariota

. Vibrio cholerae (cólera) STX fago filamentoso ssADN genes stx2A y stx2B

. Clostridium botulismo y tétanos


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Experimentos Genéticos con fago

Genética de la Lisogenia de

. Lisógeno placas “cloudy” Debido al crecimiento del lisógeno inmune a infección

. Fácil identificación de mutantes involucradas en la lisogenia Placas clarasMutantes de tipo C

. Test de Complementación Infección con 2 fagos mutantes (ambos forman placas claras) Plaqueo Monitoreo de formación de lisógeno

Inmunidad a la infección

. Identificación de mutantes: c I , c II , c III , Int (trans), vir ( oR y oL) (cis)

- CII y CIII necesarias para generar el lisógeno, pero no para mantenerlo

- CI estrictamente requerido para generar y mantener el lisógeno


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Genética del represor CI

. Proteína Modular (dominios con funciones separables)

. CI primer proteína identificada con dominios separables- C-term Unión a otro monómero dímero- N-term Unión al ADN

. Experimentos de Complementación Intragénica- Célula lisogénica con un profago con una mutación termosensible en c I

- Infectado con fagos con diferentes mutaciones termosensible en c I

- A TEMP. NO PERMISIVA Lisis Represor CI inactivado Lisógeno mutaciones complementarias

(sólo unas pocas bacterias)

. Mutaciones C-terminal Unión al ADN N-terminal Formación de dímero



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Experimentos Genéticos con fago Genética del represor CI


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Aislamiento y mapeo de mutantes nut

. Sitios nut Antiterminación N

. Mutantes previenen la unión N ARNm se despega la RNApol se frena la transcripción

. Mutantes nutL raras (genes gam y red , no esenciales)

. Mutantes nutR letales (genes O y P , esenciales)

. Mutantes raras Selección positiva:- Fagos con mutaciones nutL placas- Fagos wt no placas

E. coli lisógeno con fago P2 no pueden ser infectados con wt

Red y Gam ( ) Old (P2) Mata a la célula

. Mut nutL (previenen transcrip. gam y red ) placas

. wt no placas (mata la célula)

. Mut gam red placas


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Aislamiento y mapeo de mutantes nut

Plaqueo de millones de mutagenizados sobreEl lisógeno del fago P2

algunas placas mut nutL

. Doble mutantes No frecuentes

. Deleciones más frecuentes

. Mutágeno Provoca mutaciones puntuales

. Mapeo genético ( t L1

)


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Experimentos Genéticos con fago Experimentos Genéticos con fago

Aislamiento de mutantes nut – Mapeo Genético

. Colección pbio genes reemplazados porgenes de E. coli (bio)

. Mutantes ( gam red o nutL )

- Crecen en lisógenos P2 (fenotipo)- Cruza con fago donde los genesgam y red son sustituídos por bio

- Infección en E. coli RecA -

(no se forman concatemeros)

. Recombinantes Red + Gam + Placas enE. coli RecA -

. Mutantes en N (trans)

. Mutantes en nut (cis)


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Aislamiento de mutantes nus en el hospedador (Concepto de selección genética)

. Mutaciones nus afectan la anti-terminación por N (Prot. N no puede actuar sola)

. Mutaciones nus Raras Selección positiva: Célula con un profagoInducción de wt mata a la célulaInducción de mutantes en N la célula sobrevive (no Sint. de P)

Mutantes nus la célula sobreviveReducir la frecuencia de otro tipo de mutaciones más frecuentes

. E.coli lisogénica fago mutante en CI (termosensible):. Se induce por temp. Se cultiva a temp permisiva

. Mut nus. Pocas bacterias sobreviven forman colonias . Mut N en el profago

. Bacterias curadas del fago

. Mutantes en el fago por deleción mata a la célula pero no se escinde

. Lisógeno con dos copias del profago (frecuencia de una doble mutación menos probable)

. Mapeo por Hfr y trasducción mutantes en el cromosoma de E. coli y no en el profago

Identificación de nusA , nusB , etcTerminación de la transcripción y anti-terminacióndel hospedador no infectado

No hay anti-terminación

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