ciclo celular - iib.unsam.edu.ar · el ciclo celularconsiste en la repetición de una secuencia de...
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CICLO CELULAR
Burke & Ellenberger, Nature Rev. MCB 2002
El ciclo celular consiste en la repetición de una secuencia de eventos o fases: G1, S, G2 y M
Existe un límite en la capacidad proliferativa de las células (“Hayflick limit”). El arresto permanente
del ciclo celular inducido por el acortamiento telomérico se denomina senecencia replicativa.
El período comprendido por las fases G1, S y G2 se conoce como interfase y es en el cual la célula
adquiere el estado para distribuir el material genético y citoplasmático, que ocurre durante la mitosis.
Las células pueden detener el ciclo
celular temporalmente (quiescencia),
o permanentemente (p. ej. neuronas y
células del cristalino) en un estado
dentro de la fase G1 denominado G0.
G1 G2
S
M
En levaduras se demostró que el ciclo celular es regulado por factores externos que promueven el crecimiento
Si el ciclo celular ocurriera en tiempos prefijados e invariables, y no estuviera coordinado con el crecimiento de la célula (panel
A), se esperaría que en ausencia o restricción de nutrientes el tamaño de las células disminuyera en cada división. Sin
embargo, esto no se observa, las células mantienen su tamaño a lo largo de las generaciones (panel B) debido a su capacidad
de modular la duración del ciclo celular. Esto revela que los procesos de crecimiento y división celular están acoplados.
Alberts et al., BMC 2002
La restricción de nutrientes o factores de crecimiento inducen el arresto del ciclo celular en G1.
En los organismos pluricelulares la proliferación celulares un proceso estrictamente regulado
Beachy et al., Nature 2004
En epitelios, las células madre (stem cells) permanecen en un estado de quiescencia en G0 (a, en rojo). La ruptura del epitelio
estimula la proliferación de las células madre (b, en verde). Las células nuevas se diferencian en diversos tipos celulares y
reparan el daño (c), restaurando un nuevo estado estacionario del epitelio (a). Los daños permanentes o crónicos de los
epitelios promueven la activación persistente de las células madre y aumentan la probabilidad de aparicióon de mutaciones
oncogénicas que auto-perpetuen la proliferación y la formación de tumores (d y e).
b d,e
Diversas señales extracelulares regulan la proliferación y apoptosisen los tejidos.
Hormonas (ej. prolactina), factores paracrinos (ej. HGF, Wnt, TGFβ, etc) y
la matriz extracelular controlan la proliferación y diferenciación en la
glándula mamaria durante la pubertad, embarazo y la lactancia. Cuando la
lactancia finaliza, el epitelio alveolar involuciona por apoptosis de las células
secretoras. El TGFb, p.ej, inhibe tubulogénesis y promueve la apoptosis.
Secciones de glándula mamaria de ratones
en el período de lactancia. En marrón se
visualiza la expresión de TGFb. A: normal;
B y C: animal donde se previene la succión.
Las flechas en C indican células apoptóticas.
La prolactina es una hormona que activa la vía de JAKSTATs. Las STATs inducen
la transcripción del gen de b-caseína, una de las principales proteínas de la leche.
A
B
C
prolactina,
Wnts, EGF,
HGF, etc
oxitocina
Las células madre poseen un potencial replicativo ilimitado y son una fuente de renovación celular en los tejidos adultos
Skin epithelium
Las células madre (stem cells) localizadas en el epitelio se dividen y originan células de tránsito que mientras se desplazan
lateralmente se dividen activamente y amplifican la población. En la epidermis, cuando llegan a la base de las papilas, estas
células se disocian del estrato basal, y migran hacia estratos superficiales a la vez que se diferencian en diferentes células.
En el epitelio intestinal, las células de tránsito se diferencian durante su desplazamiento hacia el ápice de las vellosidades.
stem cells
Paneth cells
transit
amplyfing cells
Goblet cells
enteroendocrine
cells
enterocyte
control knock out del gen de β1
La bromodeoxiuridina (BrdU) es un análogo de timina que se incorpora en el DNA cuando las células entran en fase S.
En la figura se muestran secciones de folículos pilosos de ratones control (A) y knock out (B) para b1-integrinas teñidos con
anti-BrdU. Note que los folículos normales presentan mayor cantidad de núcleos marcados (puntos en marrón) que los
del ratón deficiente en beta 1 integrinas (asteriscos y flechas en B).
El nivel de proliferación celular de un tejido puede estudiarse determinando la incorporación de BrdU
La capacidad replicativa de las células epiteliales epidérmicas
correlaciona directamente con la expresión de b1 integrinas.
La incorporación de 3H-timidina y la citometría de flujo son otras técnicas experimentales para evaluar la proliferación celular
La incorporación de 3H-timidina ocurre en las células que están en
fase S (flecha). (A) Autoradiografía. La determinación de la radioactividad
incorporada permite cuantificar las células en estado proliferativo (B).
La citometría de flujo revela el
contenido de DNA de una población
celular y permite calcular el porcentaje
de células en fase G1, S y G2/M.
A B
(B).Células estimuladas a dividirse con
insulina fueron incubadas en presencia de
un péptido inhibidor de la MAPK Erk o un
péptido control. Observe que la
incorporación de 3H-timidina disminuye
con la ccion del péptido inhibidor.
insulin IR Grb10 Erk Ciclinas D
Microscopía de una sección de epitelio
concentración
control
péptido inhibidor
PRINCIPIOS GENERALES
DEL CICLO CELULAR
unidireccionalidad (secuencia temporal unívoca de eventos encadenados)
adaptabilidad (ajustable a las condiciones ambientales)
robustez (mantiene la fidelidad del proceso aun en condiciones variables)
Mecanismos de control o “checkpoints” monitorean las condicionesrequeridas para la transición de una fase a la siguiente
Mecanismos irreversibles, de “switch”,
o de “todo o nada” controlan 3
transiciones críticas del ciclo:
1- G1/S ( duplicación del ADN)
2- G2/M (formación del huso mitótico)
3- Metafase-Anafase (distribución de
los cromosomas)
Complejos heterodiméricos formados por quinasas y ciclinascontrolan los principales eventos moleculares de cada fase
Lodish et al., MBC 2004
Whi5
Los niveles de expresión de las diferentes ciclinasvarían de manera periódica durante el ciclo celular
Experimentos pioneros con embriones de erizos de mar y almejas permitieron identificar las ciclinas mitóticas
Durante el desarrollo embrionario temprano de estos organismos las células se dividen sincrónica y
rápidamente alternando fases de S y M. El análisis en geles de poliacrilamida de extractos proteicos de
embriones, preparados a distintos tiempos, revela variaciones cíclicas en los niveles de ciclinas mitóticas
(ciclinas B), con un pico máximo al comenzar cada mitosis que correlaciona con la máxima actividad de MPF.
ribonucleótido
reductasa
ciclina B
Adaptado de Hunt et al, JCB 1992
La desaparición de las ciclinas al finalizar la mitosis ocurre por su degradación en proteosomas.
Alberts et al., BMC 2008
activating subunitEl complejo APC se activa por fosforilación y por la unión
de los cofactores Cdc20 y Cdh1 durante la mitosis.
Cdc20 y Cdh1 además determinan la especificidad de los
substratos. APC reconoce motivos específicos (degrones)
en las ciclinas de las fases S y M.
En contraste, el complejo SCF esta siempre activo y la
regulación ocurre a nivel de los substratos. SCF
reconoce a los substratos solo cuando son fosforilados
en secuencias específicas (fosfodegrones).
degrón
APC: Anaphase Promoting Complex
SCF: Skp1/Cullin/F-box protein)
Los complejos de ubiquitinación SCF y APC regulan transiciones entre fases del ciclo
Ubi ligase
Ubi
ligase
Reed, NRMCB 2003
SCF y APC, promueven la degradación de ciclinas e inhibidores del ciclo celular
inhibidores de G1 S (ej. p21, p27, Sic1 y ciclinas de G1 y G1/S son degradadas por SCF)
inhibidores de metafase anafase (ej. Wee es degradada via SCF; securina es degrada por APC-Cdc20)
inhibidores de anafase telofase/citokinesis (ej. ciclinas mitóticas (B) son degradadas por APC-Cdh1)
APC: Anaphase Promoting Complex
SCF: Skp1/Cullin/F-box protein)
ciclinas
de G1/S
Las Cdks se activan transitoriamente y promueven transiciones y el desarrollo de fases del ciclo.
Mientras que los niveles de expresion de las ciclinas oscilan durante el ciclo celular, los niveles de Cdk
son relativamente constantes. La expresión de ciclinas es regulada a nivel transcripcional y post-
traducción. Al final de la mitosis las ciclinas son degradadas en proteosomas.
SCF
activity
La actividad de CDK-ciclinas y APC/C se regulan mutuamente
Activity o
f C
DK
s
Cdk es una Ser/Thr quinasa que depende de la unión a una ciclina para activarse
(a) La Cdk no unida a ciclina está autoinhibida por un bucle flexible (T-loop=activation loop) y una hélice
alfa que bloquean el acceso del substrato al sitio activo unido al ATP. (b) La unión de la ciclina a la Cdk
induce cambios conformacionales que exponen el sitio activo al solvente y permite la unión del substrato.
Las ciclinas cumplen dos funciones básicas:
1) activan las Cdks
2) determinan la especificidad por los substratos
Lodish et al., MBC 2004
Lodish et al., MBC 2016
La fosforilación de Cdk constituye otro nivel de regulación de su actividad
La kinasa CAK fosforila la treonina 160 en el bucle flexible (T-loop) del dominio catalítico de
Cdk1 y Cdk2 lo cual incrementa su afinidad por el substrato y potencia ~ 150 veces su actividad.
(CAK)Cdk-Activating Kinasa
MPF (Mitosis Promoting Factor) = Cdk1-ciclinas B
CAK: Cdk-Activating Kinase
La fosforilación de sitios inhibidores bloquea la actividad de los complejos Cdk/ciclinas
s
Antes de comenzar la mitosis, las Cdk1 es fosforilada en un sitio activador (Thr160) por la kinasa CAK, y en uno o dos sitios
inhibidores (Thr14, Tyr15) por la kinasa Wee1. En este estado la Cdk tiene muy baja afinidad por el substrato y es inactiva. Al
final de la fase G2, Cdk1 es activada por la fosfatasa dual Cdc25 que remueve el fosfato del sitio inhibidor. Un mecanismo
similar regula a Cdk2.
Otro mecanismo que regula negativamentge la actividad de Cdks es la expresión de inhibidores
Cdk4/6
CKI: Cdk Kinase Inhibitors
Alberts et al., BMC 2002
Los inhibidores (CKI) se unen a la Cdk o al complejo CDK-ciclina y emplean diversos mecanismos para inhibir
la actividad de la Cdk: ej. bloqueo del acceso del dominio catalítico al substrato, cambios estructurales del
sitio activo de la Cdk, bloqueo de la interacción con la ciclina, etc. Hay inhibidores que actúan sobre diferentes
Cdks (ej. p16, p21, p27, p57, Sic1) y otros que son específicos (ej. p16/INK4a inhibe Cdk4 y 6 en G1).
Cdk
Las Cdk integran señalización de varias vías (“inputs”),
que regulan de manera positiva y negativa la actividad.
Alberts et al, MBC 2015
Los complejos Cdk-ciclinas fosforilan proteínas que controlan eventos específicos de las fases del
ciclo celular. Por ej. durante la fase M, Cdk1-ciclinas M fosforilan substratos requeridos para la
condensación de la cromatina, ruptura de la membrana nuclear, ensamble del huso mitótico, etc.
EXPERIMENTOS QUE
PERMITIERON IDENTIFICAR
REGULADORES CLAVES
DEL CICLO CELULAR
Experimentos de fusión de células revelaron la existencia de factores difusibles que controlan el ciclo celular
El citoplasma de células en fase S induce a núcleos en
G1 (A) y no de G2 (B) a iniciar la replicación del DNA.
(C) El núcleo en G2 no se modifica y el núcleo de G1
entra en fase S de acuerdo a su propio ritmo.
La fusión de una célula en fase M con otra en fase G1 induce eventos
en el núcleo de G1 característicos de las primeras fases de la mitosis.
Experimentos que revelan la actividad
de las Cdk de fase S Experimento que revela la actividad de las Cdks de fase M
Experimentos en Xenopus permitieron aislar un factor que promueve la maduración de ovocitos (MPF, Maturation Promoting Factor)
La microinyección del citoplasma de huevos maduros en ovocitos arrestados en G2 induce la mitosis y la
maduración a huevo sin necesidad de progesterona (b). El factor fue aislado y se denominó “Maturation Promoting
Factor” o MPF. Cuando el MPF es inyectado en células somáticas en interfase promueve la mitosis (c).
El MPF identificado en Xenopus es el equivalente molecular al complejo de CDK-ciclinas M
mitosis
Ovocito arrested
en G2
mitosis
(b) microinyección
de citoplasma
mitosis
célula en
interfase
Ovocito arrestado
en G2
release from the ovary
(ovulation)
Lodish et al, MBC2004
bajos niveles de
actividad MPF
altos niveles de
actividad MPF
Huevo
arrestado
en meiosis II
(c) microinyección de MPF
La actividad del MPF es máxima durante la profase y metafase de cada división
ovocito
huevo
Lodish et al, MBC2004
Perfil de actividad del MPF durante la maduración de oocitos de Xenopus, la fertilización y las
etapas iniciales del desarrollo embrionario.
↑Wee1,
↓Cdc25,↓Wee1,
↑Cdc25,
primer
arresto
segundo
arresto
tiempo
APC
↑Ca 2+
↑APC
cytostatic factor
Los factores que controlan el ciclo celular pueden identificarsemediante el análisis genético en levaduras
La levadura S. cerevisiae (budding yeast) es unicelular, tienen un genoma relativamente
pequeño, tiempo de duplicación corto (~90 min) y posee un estado de reproducción haploide.
Los genes cuyas mutaciones arrestan el ciclo celular se denominan “cell division cycle” genes
o cdc genes. Solo las mutaciones condicionales permiten la propagación de las células.
Las mutaciones sensibles a la temperatura resultan típicamente de cambios “missense” (cambio de aminoácido).
Usualmente mantienen la función normal de la proteína a una temperatura baja o permisiva. En esta condición las
células se pueden propagar. El fenotipo de la mutación se manifiesta restringiendo el crecimiento de la levadura a
una cierta temperatura denominada no permisiva o restrictiva.
Cdc gene mutant
Estudios genéticos en S. pombe permitieron identificar la única Cdk de estas levaduras: Cdc2
Las células de S. pombe se dividen por fisión del citoplasma (A). Las mutantes recesivas para el gen cdc2
(cdc2-) no se dividen y se alargan (B). En contraste, mutantes de ganancia de función (cdcD, dominantes)
entran prematuramente a la mitosis, sin crecer lo suficiente (C).
cepa salvaje,
tamaño normal
Lodish et al, MBC2004
Cdc2 de S. pombe es equivalente a Cdc28 de S. cerevisiae
Sergio Moreno
mutante dominante
mutante
recesiva
B
A
C
cdc2-
cdc2D
cdc2+
Estudios genéticos en S. pombe también permitieron identificar genes reguladores de la actividad de Cdc2: Wee1 y Cdc25
Fenotipos mutantes en S. pombe
Lodish et al, MBC2004
inhibidor activador
modelo de
interpretación de
los resultados (cdc2-ciclB)
Modelo de acción de los principales reguladores de la actividad del MPF en S. pombe
* La treonina Thr161 de Cdc2 es homóloga a la Thr160 de la Cdk1 de vertebrados.
Estudios genéticos permitieron identificar 4 proteínas reguladoras de Cdc2: la ciclina mitótica Cdc13,
equivalente a la ciclina B de vertebrados; la quinasa Wee1, que fosforila el sitio inhibidor (Y15) en Cdc2; la
kinasa CAK, que fosforila el sitio activador T161; y la fosfatasa Cdc25, que defosforila Y15 y activa el
complejo Cdc2-Cdc13 .
Lodish et al, MBC2004
(Cdc13)
(Cdc2)sitio
inhibidorsitio
activador
defosforilación del
sitio inhibidor
EVENTOS DE LA FASE G1
- Reconocimiento del origen de replicación (OR). Los complejos ORC se
unen a los ORs y marcan los sitios de inicio de la duplicación del ADN.
- Licenciamiento del origen. Los adaptadores Cdc6 y Cdt1 son requeridos
para reclutar la helicasa Mcm al complejo ORC, formando el complejo de pre-
replicación que habilita al origen a iniciar la duplicación del ADN. Este proceso
solo ocurre en G1 y es bloqueado en el resto de las fases.
- Expresión de ciclinas de fase G1
- Expresión de ciclinas G1/S
- Inhibición de los complejos Cdk-S
El complejo de pre-replicación se ensambla en el origen y en G1, una sola vez por ciclo
Lodish et al, MBC 2004; Sclafani & Holzen, ARG 2007
Complejos Cdk-M,
Geminina
↑APC/Cdh1Cdt1
Cdt1
OR: Origin of Replication
ORC: Origin Recognition Complex (formado por 6 proteínas, ORC1-6).
Mcm: Mini chromosome maintenance (formado por 7 proteínas, Mcm1-7).
ORC es un complejo hexamérico que se asocia al OR. Posteriormente los factores Cdc6 y Cdt1 se unen al ORC y reclutan a la
helicasa Mcm formando el complejo de pre-replicación o pre-RC que habilita o “licencia” a los OR para iniciar la duplicación en
la fase S. Dos mecanismos inhiben el licenciamiento en el resto de las fase: 1) Geminina es un inhibidor de Cdt1 que bloquea el
reclutamiento de Mcm; 2) los complejos Cdk-M y Cdk-S fosforilan e inactivan a Cdc6 y Cdt1. Al final de la mitosis y al comienzo
de la fase G1, el complejo APC/Cdh1 degrada a Cdk-M y Cdk-S y a la proteína geminina permitiendo el ensamble del pre-RC.
Mcm
Cdc6
Klein & Assoian, JCS 2008
La expresión de ciclinas D es regulada por una red complejade factores de transcripción
Lasa ciclinas D son las principales ciclinas de G1 en vertebrados. Diversos factores extracelulares activan vías de señalización
que regulan la expresión/función de factores de transcripción que interaccionan con el promotor. del gen de ciclina D.
ej. c-fos gene
La vía ras MAPK induce la expresión de factores de transcripción que luego inducen la expresión de la ciclina D
ERK TCF c-Fos↑
ECM integrins JNK c-Jun↑c-Jun/c-Fos (AP-1) ciclina D ↑Cdk 4/6
cdk inhibitors
ej. c-fos y c-jun genes
ej. cyclin D
En respuesta a la estimulación de
la vía de ras-Erk ocurre la
expresión de una primera oleada
de genes denominados de
expresión temprana, que incluyen a
los factores de transcripción c-fos-
c-Jun y ATF. Estos regulan la
expresión de genes de expresión
tardía, como por ej. ciclina D.
TRANSICIÓN G1 S
Esta transición requiere de la inactivación de inhibidores de Cdk-ciclinas
de fase G1/S y pasaje del punto “Start” o “Restriction point”
Cdc28-Ciclinas B5/6 en S. cerevisiae
Cdk2-ciclinas E/A en vertebradosCdk-ciclinas de fase S
Sic1 Cdc28-Clb5/6 (S. cerevisiae)
rb E2Fs ciclinas E (vertebrados)
p21/p27 Cdk2-E/A (vertebrados)
Whi5 SBF (S. cerevisiae)
Mecanismos de retroalimentacion positiva promueven una transición abrupta de G1 S
De estudios realizados
en S. cerevisiae
Sic1 es un inhibidor de complejos
Cdk-S. La fosforilación de Sic1 en
9 sitios por complejos Cdk-G1 es
necesaria para ser reconocidos y
ubiquitinados por el complejo
SCF, y posteriormente
degradados en proteosomas.
Como consecuencia, los
complejos de Cdk-ciclinas S
acumulados durante G1 se
desbloquean abruptamente y
simultaneamente disparan la
masiva duplicación del DNA.
Whi5 es un represor
transcripcional que inhibe a los
factores de transcripción SBF.
SBF induce la transcripción de
ciclinas de G1/S. Los complejos
Cdk-G1 fosforilan e inactivan
Whi5.
La transición abrupta de G1 S depende de mecanismos de retroalimentacion positiva o doble negativa
Red de circuitos que regulan la transición G1S en levaduras.
SBF: Swi4-Swi6 cell cycle box Binding Factor
Las ciclinas de G1 son resistentes a la degradación mediada por el complejo APC-Cdh1, el cual es activo en G1.
La síntesis de ciclinas D en vertebrados activa un mecanismo de feedback positivo que promueve la transición G1S
Experimento que muestra el requerimiento de ciclinas D
para inducir la fase S. Células fueron estimuladas con
factores mitogénicos. A distintos tiempos post-estímulo,
fueron microinyectadas con anti-ciclina D (barras rojas) o
con IgG control (barras celestes) e incubadas con
bromodeoxiuridina (BrdU) para detectar las células que
están en la fase S. Note que el anti-ciclina D bloquea la
fase S cuando es inyectado antes de las 14 h pero pierde
su efecto para las 16 h, indicando que el sitio de no
retorno ya se superó.
Las células estimuladas con factores de crecimiento progresan en G1 hasta superar un estado o
punto de no retorno o “restriction point”, a partir del cual adquieren la capacidad para duplicar el
DNA, y a partir del cual ya no son necesarias la ciclinas D.
G1
Rb es funcionalmente equivalente a Whi5 de levaduras. Rb inhibe a los factores de transcripción E2Fs por dos
mecanismos diferentes: 1) interacción directa y bloqueo estérico de los factores E2Fs, 2) reclutamiento de la
histona deacetilasa HDAC al promotor de E2F inhibiendo su transcripción. Cdk4/6-ciclinas D de G1 fosforilan e
inactivan Rb, permitiendo pasar el punto de no retorno, en el cual se activan mecanismos de retroalimentación
positivos y doble negativos que aseguran la expresión y activación de los factores E2Fs, y las ciclinas A y E.
función inhibida,
promotor
inactivo
HDAC
HDAC
Mid G1 Late G1
retroalimentación
positiva
Punto de
restricción
superado
(independiente
de ciclinas D)gen activo
/A
Los factores de transcripción
E2F promueven la expresión de
genes involucrados en la fase S,
como ciclinas A y E. También
estimulan su propia expresión.
p27
La transición abrupta de G1 S en vertebrados depende de mecanismos de retroalimentacion positiva o doble negativa
Las ciclinas D son resistentes a la degradación mediada
por el complejo APC-Cdh1, el cual es activo en G1.
EVENTOS DE FASE S
Activación de complejos Cdk-S
Activación de OR y duplicación del ADN
Inactivación de factores de licenciamiento
- Apertura del ADN. Las quinasas de fase S, CDK y DDK, activan la helicasa Mcm y
comienza el desenrrollamiento del ADN. Este proceso solo ocurre en fase S.
- Copia del ADN. Ensamble del replisoma.(2, 3) La fase S se dispara cuando Cdk-ciclinas S y la kinasa
(DDK) fosforilan componentes del pre-RC, evento necesario
para reclutar el factor iniciador Cdc45. Los complejos Cdk-S
activos fosforilan e inactivan a Cdh1, causando la inhibición
de APC/Cdh1. Esto permite la acumulación de Geminina.
(3) Cdc45 activa la helicasa Mcm y recluta el replisoma,
formandose la burbuja de replicación. La fosforilación de Cdt1
y Cdc6 por Cdk-S induce su disociación del complejo.
Geminina se asocia Cdt1 y lo inhibe por el resto del ciclo.
(3, 4) Cdc45 recluta proteínas del replisoma (polimerasas,
primasas, ligasas, topoisomerasas, etc) y las proteínas Rpa
que protegen las hebras simples del DNA de la degradación
por nucleasas.
Cdk-S y Cdk-M fosforilan a los factores de iniciación Cdc6 y
Cdt1 impidiendo su re-asociación al ORC. Cdc6 y Cdt1
fosforilados son ubiquitinados por SCF y degradados o
exportados al citoplasma. Cdt1 es además inhibido por
Geminina. Estos mecanismos redundantes aseguran que
cada origen de replicación dispare la síntesis del DNA una
sola vez por ciclo.
La degradación de las ciclinas S/M y Geminina por APC-
Cdh1 al final de la mitosis y la actividad de fosfatasas
durante G1, permiten que los factores de iniciación de la
replicación ensamblen un nuevo pre-RC en el siguiente ciclo.
Fosforilación
ActivaciónGeminin
DDK: Dbf4-Dependent Kinase
Replisoma y duplicación bidireccional del ADN
E. coli tiene un solo OR para
duplicar el ADN (replicón). Los
cromosomas eucariotas
tienen varios ORC/replicones,
aproximadamente unos 300
en la levadura S. cerevisiae.
microscopía electrónica
El replisoma constituye un
complejo de proteínas
asociado a las horquillas de
replicación. Formado por
polimerasas (, , ),
adaptadores (RFC, PCNA,
GINS) y diferentes enzimas
y reguladores (GINS, Cdc45,
primasas, etc).
Lodish et al, MBC2004;
Leman & Noguchi, Genes 2013
Las cromátides duplicadas se mantienen unidas porcomplejos proteicos denominados cohesinas
Las cohesinas son complejos formados por 4 proteínas principales, dos subunidades, Smc1 y 3, pertenecen
a la familia de proteínas SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), se asocian por los extremos
formando una estructura con forma de abrazadera que envuelve las dos cromátides. Las proteínas Scc1 y 3
cierran y estabilizan la estructura. Scc1 y 3 son degradadas por APC-Cdc20 al comienzo a la Anafase.
Anafase
cohesinas
(bisagra)
Alberts et al, MBC 2015
TRANSICIÓN DE LA
FASE G2 M
Cdc28-Ciclinas B1-4 (S. cerevisiae)
Cdk1-ciclina B (vertebrados)
Activación de complejos Cdk-M
Cdc25 activa complejos Cdk-M al final de G2 y dispara la mitosis
La fosfatasa Cdc25 es activada por las quinasas Polo y Cdk-M generando un circuito de retroalimentación
positivo. Cdk-M además fosforila e inhibe a la quinasa inhibidora Wee1 (circuito de retroalimentación doble
negativo). Como consecuencia al final de G2 se produce un aumento abrupto de la actividad de Cdk-M.
Cdk1
~ Cdc28
~ Cdc2
CAK
P
Tyr
Thr
↑Polo kinase
MPF activo
ATM, ATR,
chk1 & 2
DNA no replicado
y/o dañado
inhibición,
ubiquitinación
y degradación
en proteosoma
ciclina
M
p38
(stress
signaling)
↑Polo kinase
incrementa expresión
en G2, activación
Retroalimentación positiva y doble negativa asegura la amplificación de la actividad de los complejos Cdk-M
EVENTOS CONTROLADOS
POR CDK-M EN MITOSIS
Cdk-M
eventos
nucleares
fosforilación de laminas desensamble de la lámina nuclear
fosforilación de nucleoporinas desensamble de poros nucleares
fosforilación de proteínas de anclaje de la cromatina a la membrana
desestabilización de la envoltura nuclear y de la cromatina
fosforilación de condensinas empaquetamiento de la cromatina
eventos
citoplasmáticos
fosforilación de MAPs incremento del dinamismo de los MTs
fosforilación de proteínas del RE y Golgi inhibición del tráfico
y fragmentación del Golgi y RE.
Fosforilación de las laminas y ruptura de la envoltura nuclear
Los complejos Cdk-M fosforilan las laminas A, B y C evento
que conduce a la depolimerización de los filamentos
intermedios y al desensamble de la lámina nuclear. La lamina
B fosforilada permanece anclada a la membrana nuclear
interna por un ácido graso. La fosforilación de nucleoporinas
provocan el desensamble parcial de los poros nucleares.
microscopía de barrido de la lámina nuclear
MPFCdk-M
complejo de
condensinas
Modelo de empaquetamiento de la cromátide
Alberts et al 6th Ed
Las condensinas son complejos multi-proteicos que
se asocian al DNA e inducen su empaquetamiento
dependiente de hidrólisis de ATP. Esta función es
promovida por la fosforilación de Cdk-M.
Activación de condensinas y empaquetamiento de la cromatina
Los complejos de condensinas/cohesinas se unen a regiones específicas del
DNA denominadas SARs/MARs (scaffold/matrix-attachment regions).
Modelo de condensación de la cromatina
fibra de 11 nm
(hilera de
nucleosomas)
fibra de
cromatina
de 30 nm
en un cromosoma de metafase (~2 mm de largo)
la doble hebra del DNA (~1,5 cm de largo) se
empaqueta por un factor de ~7.500
En estas imágenes de fluorescencia los cromosomas estan teñidos con
anticuerpos contra condensinas (rojo) y el DNA esta teñido con Hoescht (azul)
Visualización de condensinas en cromosomas en metafase
Cdk-M promueve el incremento en el dinamismo de los microtúbulos de metafase
Cdk-M fosforila catastrofinas y otras MAPs efecto que
incrementa la inestabilidad dinámica de los microtúbulos.
Las catastrofinas se unen a los extremos (+) de los microtúbulos provocando la disociación de
monómeros e incrementando la frecuencia de catástrofes (transición de elongación acortamiento).
La vida media de microtúbulos
de interfase es ~ 5-10 min y
disminuye a < 1 min en mitosis.
El Cdk-M y otras quinasas, ej Polo y Aurora, fosforilan componentes de centrosomas y kinesinas, promoviendo el ensamble del aparato mitótico
La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad
coordinada y combinatorial de diferentes motores.
Alberts et al 6th Ed
Cdk-M regula varios aspectos de mitosis: 1) duplicación y separación de centrosomas, 2) posicionamiento
y alineamiento del huso, 3) condensación y cohesión de los cromosomas, 4) orientación y función de los
cinetocoros, 5) elongación del huso y ensamble de la zona media en anafase.
Enserink & Kolodner, Cell Division 2010
5
1
2
34
El complejo Cdk-M fosforila e inactiva
a proteínas que estabilizan las
cisternas del Golgi, promoviendo la
desintegración del RE y Golgi.
Magnus et al MBC2004, Yeong, BioEssays 2013
Fragmentación del Golgi durante la mitosis y su re-ensamble al final de la misma.
Se visualiza la distribución de GFP-GalNac-T2, una glicosil transferasa del Golgi.
El tráfico anterógrado vesicular es inhibido durante la mitosis
TRANSICIÓN DE
METAFASE ANAFASE
Fosforilación y activación de APC por complejos Cdk-M
Unión del cofactor Cdc20 a APC
Degradación de securinas y ciclinas mitóticas.
APC ubiquitina y promueve la degradación de proteínas que inhiben la transición Metafase/Anafase y también eventos de telofase y citoquinesis
Cdc20
fosforilación
(securinas)
activo
inactivo
Cdh1
Anafase tardía
Metafase/Anafase
Cdk1-cicl B(vertebrados)
Anafase
cromátides duplicadas
Las proteínas Scc1 y 3 cierran el anillo formado por las proteínas Smc sobre las cromátides duplicadas. Scc1
y 3 son substratos de la proteasa separasa. Separasa es inhibida en fases previas a la anafase por la
proteína securina. La activación de APC-Cdc20 promueve la ubiquitinación y degradación de securina en
proteosomas. La separasa activa degrada Scc1/3, permitiendo la separación de las cromátides en la Anafase.
APC-Cdc20 también inicia la degradación de ciclinas S y M.
La destrucción de securina y cohesinas es requerida para iniciar la anafase
proteosoma
Scc1
Scc3 Smc3
Smc1
La destrucción total del MPF es requerida para finalizar la mitosis
En la anafase tardía la fosfatasa Cdc14
defosforila Cdh1, y permite su unión al
complejo APC. La unión del cofactor Cdh1 a
APC es requerida para la ubiquitinación y
degradación masiva de las ciclinas mitóticas,
de fase S, Polo kinase, etc.
Secuencia reconocida por APC en las ciclinas mitóticas
Lodish et al, MBC2004
Esta secuencia no está presente en las ciclinas de G1 y
G1/S, por lo tanto no son blanco de APC-Cdh1.
En la fase G1, la
fosforilación de Cdh1
por Cdk-ciclinas G1/S
inhibe su unión a APC y
permite la acumulación
de las ciclinas S y M.
Cdh1: Cdc20 homology-1. Fosforilado en G1 por Cdk-ciclinas G1/S.
La inactivación del MPF permite la descondensación de los cromosomas y la reformación del núcleo
La inactivación del MPF permite la activación demiosina y el desarrollo de la citoquinesis
La acción de fosfatasas es requerida para la inactivación de Cdk-M y la inducción de la citoquinesis
La fosfatasa Cdc14 defosforila substratos
necesarios para la formación de un
complejo multiproteico en la zona media,
que estabiliza microtúbulos polares anti-
paralelos (en verde), y que marca el sitio
donde ocurrirá la citoquinesis.
Cdc14
Cdk-M
citoquinesis
Cdc14
nucleolokinasas
(Cdc15)
Durante interfase y mitosis temprana Cdc14 es una
fosfatasa retenida inactiva en el nucleólo. Al final de
la anafase Cdc14 es liberada y defosforila al cofactor
Cdh1, permitiendo su unión y activación de APC.
Cdh-APC
Cdc14 PRC1, kinesin MTs del huso intermedio
PRC1, kinesins
normal
mutante de cdc14
PRC1: Protein Regulator of Cytokinesis, es una MAP que se une a microtúbulos anti-paralelos polares y estabiliza la zona media.
Green et al Annu Rev Cell Dev Biol 2012
Secuencia de eventos durante la citoquinesis en células animales
(a) Extremos (+) de microtúbulos
anti-paralelos polares se
superponen en la zona ecuatorial
del huso mitótico y son
estabilizados por Kinesins (KIF4)
y PRC1. Un complejo multi-
proteico define la zona media
donde se ensamblará el anillo
contráctil. El complejo recluta
activadores de RhoA a la
membrana.
(b) RhoA activa forminas y dirige el
ensamble de un anillo de actina y
miosina contráctil.
(c) Anillina y otras proteínas
“scaffold” anclan el complejo
contráctil a filamentos proteicos
de septinas asociados a la
membrana.
(d) (e) La fusión de las membranas
en el sitio de escisión requiere del
ensamble de filamentos de
proteínas ESCRT en las zonas
flanqueantes al cuerpo medio. La
escisión de las membranas
requiere de hidrólisis de ATP.
RhoA
Forminas
RhoK myosin
PRC1: Protein Regulator of Cytokinesis, PRC une a microtúbulos polares antiparalelos.
ESCRT: Endosomal Sorting Complexes Required for Transport
midbody
REGULADORES POSITIVOS Y
NEGATIVOS DEL CICLO CELULAR
EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Una red compleja de interacciones funcionales opera en G1 y determina el arresto o progreso de las células hacia la fase S
Johnson & Skotheim, 2013
p16β-catenin
cytokines
STATs
Tcf
ECMTGFβ
En vertebrados, 2 familias de inhibidores bloquean Cdks y arrestan el ciclo
- p21CIP
- p27KIP1
- p57KIP2
Cdk2-E/A
- INK4 Cdk4/6-ciclinas D
otro grupo de inhibidores de Cdks:
Cdk2-E
SCF-ubiquitina
caderinas
TGF-b
p53
integrinas
- CIP/KIP
(p16)
*cumplen una función similar
al inhibidor Sic1 en S. cerevisiae
*
(-)
(+)
Alberts et al., BMC 2008
Proteínas reguladoras del ciclo celular
Proteínas reguladoras del ciclo celular
Table 17-2. Summary of the Major Cell-cycle Regulatory Proteins
GENERAL
NAME
FUNCTIONS AND COMMENTS
Protein kinases and protein
phosphatases that modify Cdks
Cdk-activating
kinase (CAK)
phosphorylates an activating site in Cdks
Wee1 kinase phosphorylates inhibitory sites in Cdks; primarily involved in
controlling entry into mitosis
Cdc25
phosphatase
removes inhibitory phosphates from Cdks; three family members
(Cdc25A, B, C) in mammals; Cdc25C is the activator of Cdk1 at the
onset of mitosis
Cdk inhibitory proteins (CKIs)
Sic1 (budding
yeast)
suppresses Cdk activity in G1; phosphorylation by Cdk1 triggers its
destruction
p27 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities in G1; helps cells to withdraw
from cell cycle when they terminally differentiate; phosphorylation by
Cdk2 triggers its ubiquitylation by SCF
p21 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities following DNA damage in
G1; transcriptionally activated by p53
p16 (mammals) suppresses G1-Cdk activity in G1; frequently inactivated in cancer
Ubiquitin ligases and their activators
SCF catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved in G1 control,
including CKIs (Sic1 in budding yeast, p27 in mammals);
phosphorylation of target protein usually required for this activity
APC catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved primarily in exit
from mitosis, including Securin and M-cyclins; regulated by association
with activating subunits
Cdc20 APC-activating subunit in all cells; triggers initial activation of APC at
metaphase-to- anaphase transition; stimulated by M-Cdk activity
Hct1 maintains APC activity after anaphase and throughout G1; inhibited by
Cdk activity
Gene regulatory proteins
E2F promotes transcription of genes required for G1/S progression, including genes
encoding G1/S cyclins, S-cyclins, and proteins required for DNA synthesis;
stimulated when G1-Cdk phosphorylates Rb in response to extracellular mitogens
p53 promotes transcription of genes that induce cell cycle arrest (especially p21) or
apoptosis in response to DNA damage or other cell stress; regulated by association
with Mdm2, which promotes p53 degradation
/Cdh1
Whi5. Yeast transcriptional repressor that binds and
inhibits the yeast transcription factor SBF.
SBF and MBF. Yeast transcription factors that induces the
transcription of G1/S cyclins (Cln 1 y 2).
Rb. Mammal Retinoblastoma protein binds to and inhibits
E2F transcription factors. Functionally equivalent to Whi5.
Resumen de eventos en S. cerevisiae
G1
Cdc28-Cln3
Cdc28-Cln1
Cdc28-Cln2
S
Sic1
temprana tardía
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
inactivas
Sic1
fosforilación
G2 M
anafase
APC
activo
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
proteólisis
APC
inactivofosforilado e inactivo activación
fosforilación
Whi5 SBF,
↑transcripción
inactivación
inhibidor de
la fase S
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
activas
proteólisis
SCF Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
activas síntesis
del DNA
Cdc7=DDK4
kinasa
complejos activos
ensamblaje de complejos
de pre-replicación
inhibición del ensamblaje de nuevos
complejos de pre-replicación
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
activas
telofase
inhibidor de
la anafase
↑transcripción
Cdc20
fosforilación
Cdc25
Wee
CAK
Cdh1
Cdh1
La nomenclatura corresponde mayormente a reguladores identificados en levaduras (S.cerevisiae)
Whi5 es un represor transcripcional; SBF es un factor de transcrición
Nomenclatura comparada y eventos críticos
MPF ~ Cdc28-Clb ~ Cdc2-Cdc13 ~ Cdk1- cicl B
Xenopus S. cerevisiae S. pombe vertebrados
mid G1 Cln 3 Cdc28 D (1-4) Cdk4/6 ↑E2F, ↑SBF, ↓Whi5, ↓Rb
G1/S Cln 1, 2 Cdc28 E Cdk2 ↓APC, ↓Sic1, ↓Cdh1
S B 3-6 Cdc28 A Cdk2 ↑replicación del DNA
M B 1-4 Cdc28 B Cdk1 ↑APC, ↑huso mitótico, ↑división nuclear
ciclina Cdk ciclina Cdk función
S. cerevisiae vertebrados
CONTROL O "CHECKPOINTS"
EN EL CICLO CELULAR
señal sensor mediador o transductor efector
Lodish et al
Sistema de respuesta al ADN dañado(DNA Damage Response, DDR, system)
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM-Rad3-Related
Chk1/2: Checkpoint 1/2
Mecanismos de control o "checkpoints" aseguran la correcta duplicación,integridad y distribución del DNA a las células hijas
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM-Rad3-Related
Chk1/2: Checkpoint 1/2
(fosfatasa)
ATM y ATR son quinasas relacionadas a
PI3K; ATM sensa cortes de la doble hélice,
ATR sensa alteraciones que generan
cadenas simples (ej. horquillas de
replicación detenidas). ATM/ATR fosforilan y
activan a las Ser/Thr kinasas Chk1 y 2.
(fosfatasa)
Maréchal & Zou, CSHPB2013
Mecanismos de sensado y respuesta relacionados con alteraciones en la molécula de ADN
Sensores: PARP sensan cortes del DNA
y marcan el daño mediante la síntesis
de cadenas de poly-ADP-ribosa sobre
histonas próximas al daño. El complejo
MRN luego recluta y activa ATM.
Sensors
Transducers
Effectors
p53 es un efector clave de la respuesta al daño del ADN
“DNA Damage Response o DDR”
En condiciones normales, p53 es una proteína inestable,
ubiquitinada por la ubiquitina ligasa Mdm2 y degradada en
proteosomas. El daño del DNA activa quinasas (ATM, ATR,
Chk) que fosforilan a p53 y provocan su disociación de
Mdm2. De esta manera, p53 se acumula y activa la
transcripción de CKIs y factores de reparación del DNA.
Mecanismos transcripcionales y modificaciones post-traducción inducen el arresto del ciclo y la apoptosis
daño
del DNA
activación
de quinasas
Chk1 y Chk2
p53
estabilización
de p53
Pp21CIP Cdk2
inhibición de la actividad;
degradación en
proteosoma
↑ proteínas proapoptóticas:
Bax, receptores de Fas, etc
sensores &
transductores
G1/S
Cdc25 G2/MCdk1
Cdk4/6 Rb E2F
P
P
Una red de proteínas controla el anclaje de los microtúbulos polares al cinetocoro:
control “checkpoint” de metafase
MAD: Mitotic Arrest Deficient
BUB: Budding Uninhibited by Benzimidazole
El anclaje de los MTs a los cinetocoros de los
cromosomas duplicados genera tensión en los
cinetocoros. La actividad de quinasas como Aurora-B
en cinetocoros no ocupados o con baja tensión 1)
reclutan y activan proteínas de control que
secuestran al cofactor Cdc20, y 2) desestabilizan la
unión de microtúbulos. De este modo, Cdc20 no
puede activar a APC. La ocupación de los
cinetocoros por los microtúbulos y la generación de
tensión bloquean la activación de Mad/Bub, y Cdc20
puede activar a APC. APC-Cdc20 ubiquitina al
inhibidor de la anafase y dispara la anafase.
sensors
Bub, Mad
mediador Cdc20
efector APC
securina
Mussachio & Salmon NRNCB 2007
Mad
Bub
inactive
prometafase, baja tensión
Bub y Mad2 activados en el cinetocoro
MadBub
Cdc20active
Alberts et al 6th Ed
La correcta segregación de cromosomas en anafase depende de mecanismos que detectan anclajes aberrantes de los
microtúbulos del huso al cinetocoro. La tensión generada por dichos anclajes es detectada por la quinasa Aurora-B, localizada
en la placa interior del cinetocoro. Tensión insuficiente en el cinetocoro promueve la fosforilación e inactivación de componentes
externos del cinetocoro que anclan a los microtúbulos (ej. el complejo Ncd80), facilitando la disociación de los extremos (+) de
los MTs. En condiciones de tensión normal, la ineficiente fosforilación de los substratos del cinetocoro externo incrementa su
afinidad por los extremos de los MTs y promueve un anclaje fuerte de los MTs a los cinetocoros.
La tensión en los cinetocoros controla el anclaje de los MTs al cinetocoro“checkpoint” de metafase
Proteínas “scaffold” del cinetocoro reclutan a los componentes de señalización Bub y Mad en condiciones de baja tensión.