Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

LIC. JULIO DE LARA ISASSI Coord. Sistemas Escolares P r e s e n t e .

Por medio de la presente se hace constar que el alumno, cuyos datos se describen a continuación, concluyó su Servic’io Social.

NOMBRE: VELAZQUEZ MANZANARES MIGUEL

MATRICULA: 86238224

LICENCIATURA: BiologIa Experimental

Estudio espectypopic?+de los lazo 111 con. C a , M g y Mn en condiciones ácidas para utiliza.rlo en el diagnóstico biofisicoquimico de -- cuerpos de agua alterados.

om le’os de antipiri- f+ p J PROYECTO:

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan a los tres días del m e s de marzo de mil novecientos noventa y dos.

“CASA ABIERT AL TIEMPO” (--le e -

JRP/msb

UNIDAD IZTAPALAPA Av Miclioacán y La Purisiiiia. Col Vicentina, Irtapalapa. D F. C P 09340 Te1 686-03-7i

- /---

mi \ UNIDAD IZTAPALAPA 1

Casa abierta al tieiripo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA 11 de febrero de 1992

M. en C. Beatrlz A. Silva Torres Secretaria Académica División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Mtra. Silva Torres:

Por este conducto nos permitimos hacer de su conocimiento que, con fecha del 26 de enero de los corrientes, el alumno Miguel Velázquez Manzanares (86238224) ha concluido satisfactoriamente con las actividades correspondientes al Servicio Social requerido para obtener el título de Biólogo Experimental que otorga nuestra H. Casa de Estudios.

El alumno Velázquez Manzanares realizó del 26 de julio de 1991 al 26 de enero de 1992, de manera excepcional, sus labores de investigación del DiasnÓstico biofisicoauimico en el proyecto Modelo B i o f i s i c o q u í m i c o d e l Efecto d e l’a Acidez d e l M e d i o en Trucha (Salmo a a i r d n e r i ) . Su C o r r e l a c i ó n con l a Producc ión en e l Centro P i s c í c o l a “ E l Zarco” dentro de los laboratorios de Bioquimica y Biofisica, del Depto. de Ciencias de la Salud, de la U.A.M.I., y en las instalaciones del Centro piscícola “El Zarco”, D.F., bajo la asesoría de l o s profesores Raúl Alva (Garcia y Blanca Estela Rivera Bermeo, del Depto. de Ciencias de la Salud.

Los resultados obtenidos, así como las metas alcanzadas durante el trabajo desarrollado por el alumno Velázquez Manzanares se detallan en el Reporte de Investigación titulado ESTUDIO ESPECTROSCOPICO DE LOS COMPLEJOS DE ANTIPIRILAZO I11 CON Ca2+,, Mg2+ Y Mn2+ EN CONDICIONES ACIDAS, PARA UTILIZARLO EN EL DIAGNOSTICO BIOFISICOQUIMICO DE CUERPOS DE AGUA ALTERADOS, revisado y aprobado por los que suscriben, asesores del Proyecto.

Sin más por el momento, agradezco su atención a la presente y aprovecho para enviarle un cordial saludo,

A t e n t a m e n t e ,

M. en C. R García Profesor Ashciado D, TC

Bi Pr ociado D, TC

UNIDAD IZTA PA LAPA Av Michoacán y La Piirísiii ia. Col Vicentiiia. Ir tapalapa. O F C F’ 09340 Te1 686-01-21!

Casa abierta al tiempo

U NIVERSIDAD AUTO NO MA METROPOLITANA ALUMNO: Velázquez Manzanares Miguel.

MATRICULA: 86238224.

TELEFONO: 7-02-40-55.

CLAVE :

LUGAR DE TRABAJO: Laboratorios de Bioquimica y Biofísica ( S - 251 y 5-253) del Area de Investigación Básica del Depto. de Ciencias de la Salud de l<a Div. de C. B. S. y en las instalaciones del Centro piscícola "El Zarcott, D. F.

FECHA DE INICIO: 26 de Julio de 1991.

FECHA DE TERMINACION: 26 de enero de 1992.

UNIDAD: Iztapalapa

DIVISION: Ciencias Biológicas y de la Salud

LICENCIATURA: Biología Experimental

NOMBRE DEL PROYECTO: vtMODELO BIOFISICOQUIMICO DEL EFECTO DE LA ACIDEZ DEL MEDIO EN TRUCHA (Salmo sairdneri). SU CORRELACION CON LA PRODUCCION EN EL CENTRO PISCICOLA "EL ZARCO".

ASESOR: M. EN C. Raúl Alva Garcia, Profr. Asociado D, TC y Biol. Blanca E. Rivera Bermeo, Profr. Asociado D, TC, Departamento de Ciencias de la Salud

HORAS SEMANA: 20.

TITULO: "ESTUDIO ESPECT OSCOPICO DE $ y S COMPLEJOS DE EN CONDICIONES ANTIPIRILAZO I11 CON Ca , Mg2+ Y Mn

ACIDAS, PARA UTILIZARLO EN EL DIAGNOSTICO BIOFISICOQUIMICO DE CUERPOS DE AGUA ALTERADOS".

9+

SESOR

UN1 DAD IZTA PA LA PA Av Michoacán y La Purisi i i ia. Col Vicei i t i i ia, Irtapalapa, U F C P 09340 Te¡ 686-03 2 2

PRESXNTACION.

¿Cómo saber algo acerca de las moléculas cuando estas

son muy pequeñas y que no pueden verse ni aún con los más

poderosos microscopios?. La respuesta a dicha interrogante

proviene de investigaciones espectroscópicas (Tinoco y col . ,

1 9 8 0 ) .

La luz y los fenómenos relacionados con ella han

desempeñado, entre otros caisos, un papel fundamental en la

evolución y el desarrollo) tecnológico de la humanidad.

Dificil seria imaginar un mundo envuelto en la eterna

obscuridad; lo que si es claro es que seria diferente del

mundo en que vivimos y muclno menos interesante. Con la luz

podemos distinguir en cada objeto un color determinado.

El color, es el gran ingrediente de la luz que

contribuye a la riqueza visual de la naturaleza (Cetto,

1 9 8 7 ) . Por as€ decirlo, el color verde de las hojas se debe

a la absorción de la clorofila, el anaranjado de la

remolacha o del tomate se debe a los carotenos y el rojo de

la sangre se debe a la hemoglobina. El color es

caracteristico del espectro electromagnético (en la región

visible) de luz transmitida por la sustancia cuando golpea

sobre ella luz blanca (luz solar), o cuando la luz es

reflejada desde ella. Sin embargo, el color de la luz no

siempre se puede definir a simple vista, por lo cual, se

utilizan herramientas que permitan hacer un análisis más

1

detallado del paso de luz a través de una sustancia; una de

esas herramientas es la espectroscopía (Cetto, 1987).

Tradicionalmente se entiende por espectroscopia la

interacción de la luz con la materia. La luz visible es una

parte muy pequeña del espectro electromagnético, por su

longitud de onda, frecuencia o por la energía (Tabla 1).

Tabla 1. Regiones del espectro electromagnético según

su longitud de onda.

LONGITUD DE ONDA NOMBRE DE LA RADIACION RANGO

Rayos gama

Rayos-X

ültravioleta Lejano

ültavioleta

Visible

infrarrojo cercano

infrarrojo

infrarrojo lejano

Micronda

Radar

Muy alta Frecuencia

Ultra alta Frecuencia

Radio onda

0.003-0.3 A 0.3-100 A 100-2000 A 200-400 nm

400-800 nm

0.8-2.5 pM

2.5-15 pM

15-200 pM

0.2-7.0 iíim

7-100 iíim

10-1000 cm

10-100 m

10-10,000 m

2

En la región del visible (VIS) y el ultravioleta ( W )

se mide la longitud de onda en nanómetros. En la región de

micro-ondas y radio-ondas, se usa comúnmente la frecuencia.

Una de las aplicaciones más generales de la espectroscopia

es la determinación de la. concentración de una especie

quimica en solución (Tinoco y col . , 1980) .

LA ESPECTROSCOPIA W-VIS.

La técnica desarrollada a lo largo de éste trabajo es

la espectroscopia ultravioleta-visible, por lo que a

continuación describiremos brevemente los fundamentos.

Cuando un átomo o molílcula absorbe energia, pasa a un

estado excitado. A cada estado excitado puede asignbrsele un

nivel de energía definido, y todos los estados posibles son

caracteristicos de cada átomo o molécula (Figura 1).

Figura 1. Diagrama de niveles de energía: E+, nivel

energético más bajo; E*, nivel energético más alto.

3

Las transiciones electrónicas en moléculas orgánicas

casi siempre implican transiciones de electrones n, O- y T .

LOS electrones se 1ocaiiza.n en los enlaces fl ; el ejemplo

típico es el enlace de Valencia simple entre dos átomos de

carbono de un hidrocarburo saturado; éstos se encuentran

fuertemente retenidos y la energía de las regiones W o VIS

no es suficiente para vencer dicha atracción.

Los electrones n son electrones no enlazantes que se

encuentran en átomos como nitrógeno, oxígeno, halógenos o

azufre; están retenidos con menor fuerza que los Q- y la

energía de las regiones W o VIS es suficiente para que sean

excitados. Los electrones n pueden sufrir dos tipos de

transiciones:

n 4% Y n Tic

en donde, los electrones n son inducidos a pasar a un estado

excitado (T”o la absorc:ión se origina por debajo de 200

nm, sin embargo, hay absorciones a longitudes mayores que

presentan algunos hidrocarburos saturados. Los éteres,

tioéteres, haluros de a1qui:Lo y aminas alquilicas disueltas,

tienen electrones n; por eso son transparentes en el UV.

Las dos caracteristicas más importante que presenta una

molécula orgánica cuando alssorbe en las regiones W o VIS

son la posición de la banda de absorción (longitud de onda

máxima) y su intensidad ( ¿: ) . La longitud de onda máxima,

4

además de su interés cualitativo, proporciona una medida de

la energía necesaria para l a . transición. Por otra parte,

depende en gran medida de la polaridad del estado excitado

y de la probabilidad de que ocurra la transición, es útil en

determinaciones cuantitativas.

Los grupos orgánicos que sufren las dos transiciones

anteriores se conocen como cromofóricos o cromóforos; son

los grupos responsables del color de una sustancia,

llamándose cromógeno a la :molécula que presenta uno o más

grupos cromóforos (Pietrzyk y Frank, 1983).

LOS INDICADORES METALOCROMICOS.

Los indicadores metalocrómicos, como el Antipirilazo

I11 (APIII), el Arsenazo III, y el Muréxido, son moléculas

orgánicas (Figura 2), con grupos cromóforos que cambian sus

propiedades espectrales en presencia de metales en solución;

las diferencias en el espectro de absorción electrónica,

entre el indicador libre y el complejo indicador-metal,

dependen de la concentración del ion metálico, por lo que

pueden ser usados para determinar cuantitativamente su

concentración en el medio (Scarpa, 1972; Scarpa y col.,

1978; Dorogi, 1984). Estos indicadores, no atraviesan las

membranas biológicas; son suficientemente sensibles a

concentraciones pequeñas de calcio que van del orden

milimolar al orden micromol-ar. La rapidez con que el calcio

se une a estos indicadores crea una respuesta más rápida

5

que la que producen los electrodos ion-selectivos. Así, la

adición del indicador a unai suspensión celular o fracción

celular produce una medicióln cuantitativa más precisa del

transporte neto de calcio bajo una amplia variedad de

condiciones experimentales ((Scarpa y col8 1 9 7 8 ) . Gracias a

esto, los indicadores metal.ocrÓmicos han sido usados para

medir la cinética de los flujos de calcio en diversos

sistemas biológicos como células de músculo esquelético

( O h n i s h i y EbaShi, 1 9 6 3 ) , , tejido cardiac0 ( F a b i a t o y

F a b i a t o , 1 9 7 9 ) , partículas subcelulares -reticulo

sarcoplásmico ( F a b i a t o y F a b i a t o , 1 9 7 9 ) , mitocondrias (Brown

y col . , 1975; Madeira, 1975; Mela y Chance8 1968; Toro,

1 9 8 0 ) ,etc.-

a)

H 5 6

3 H 3

3

b) Figura 2. Estructura .,;T química de O los indicadores

metalocrómicos a) APIII y b) Muréxido (Scarpa y col8 1 9 7 8 ) .

6

Por otro lado, a pesar de su uso extensivo en sistemas

biológicos, los indicadores; metalocrómicos han sido poco

empleados para la determinaición de calcio y algunos otros

iones divalentes en sistemas biológicos o artificiales bajo

condiciones experimentales dle pH ácido. Dado el objetivo del

presente proyecto surge la necesidad de estudiar el

comportamiento de el indicador APIII en medios a pH ácido en

presencia de cationes divalentes.

LA IMPORTANCIA DE LOS IONES.,

Los iones juegan un papel importante dentro de la

economía celular. Un ejemplo de esto es el calcio (Ca2+); se

encuentra formando parte de la maquinaria enzimática como

cofactor; es importante en las transmisiones sinápticas,

pues su entrada a la membrana presináptica permite la

liberación del neurotransmisor al espacio sináptico. Por su

parte, el magnesio (Mg2+) se encuentra integrado a la

molécula de clorofila; además funciona como cofactor

necesario en algunas reacciones enzimáticas (Preston, 1990).

Mientras tanto, el manga.neso (Mn2+) funciona como un

elemento esencial; su papel bioquimico es poco conocido; Sin

embargo, los excesos de manganeso causan una serie de

desórdenes neurológicos en mamíferos (Gavin y co l . , 1991).

El transporte de Mn2+ a través de las membranas biológicas,

es de interés especialmente en los campos de la toxicologia,

neurociencias, etc (Gavin y co l . , 1991).

7

En vista de lo anterior, en el presente trabajo

estudiamos el comportamiento del espectro de absorción

electrónica VIS del indicador APIII en presencia del ion

Ca2+ a p H 7, 4 y 3, con la finalidad de utilizarlo como una

herramienta para cuantificar concentraciones micromolares de

Ca2+ y algunos otros iones divalentes en forma libre.

8

OBJETIVO GENERAL.

Estudiar el comportamiento del espectro de absorción

electrónica en el visible de1 complejo APIII con Ca2+, Mn2+

y Mg2+ en medios de pH 7, 4 y 3, para utilizarlo en el

diagnóstico biofisicoquímico de cuerpos de agua alterados.

Objetivos particulares.

a) Estudiar los espectxos absolutos de los complejos

del APIII con los cationes divalentes Ca2+, Mn2+ y Mg2+, en

las condiciones de p H antes mencionadas, para caracterizar

las diferencias e interferencias entre ellos.

b) Estudiar los espectros diferenciales para cada uno

de los complejos de APIII con los cationes divalentes Ca2+,

Mn2+ y Mg2+, en las condiciones experimentales de pH arriba

citadas, para cuantificar dichos iones en muestras de

cuerpos de agua del Centro I?isclcola "El Zarcoll.

9

MATERIAL Y METODOS.

Se prepararon soluciones madre de APIII, sal de sodio,

(ICN) grado reactivo a una concentración de 100 pM y se

guardaron en frascos ámbar para evitar su descomposición por

efecto de la luz. Las sol~uciones madre de los cationes

divalentes se prepararon a una concentración de 0.1 M en

forma de cloruros; cloruro de calcio (CaC12) grado reactivo

(Merck), cloruro de manganeiso (MnC12 4 H20) y cloruro de

magnesio (MgCL2 6 H20) grado reactivo (Baker). El pH de

las soluciones se ajustó c:on ácido clorhídrico (HCL) y/o

trietanolamina (TEA) (Merc:k) grado reactivo. El pH se

registró con un electrodo de vidrio (A.H. Thomas 4094-510) y

un potenciómetro (Orión modelo 611) con agitación constante.

Todas estas soluciones se prepararon en agua desionizada

(Millipore Milli-Q) y se utjLlizaron frescas.

Se corrieron espectros absolutos del APIII y del

complejo APIII-Metal, colocando en una celda (Pyrex de 3 ml

con 1 cm de paso de luz) 50 pM de APIII y añadiendo el

catión correspondiente (100 pM de Ca2+, 50 pM de Mn2+ y 300

pM de Mg2+); todos l o s espectros se corrieron a cada pH. Los

espectros diferenciales se corrieron como APIII versus

APIII-Metal; cada celda contenía 50 pM de APIII y se

titularon con el cloruro del catión. Los experimentos se

realizaron en un espectrofotómetro de doble rayo W-VIS con

agitación (Aminco DW.2a) a una temperatura de 25 OC.

10

Las muestras de agua de la estanquería del centro

piscfcola "El Zarcomt se tomaron -a nivel de superficie- sin

burbujear en botellas de polietileno de alta densidad (HDPE)

de 250 ml (Nalgene); se filtraron (millipore 0.65 pm) para

eliminar sólidos que pudieran interferir con las lecturas

espectrofotométricas. Para la detectar la presencia de

cationes se tomaron 1.5 ml. de APIII 100 pM y 1.5 ml de

muestra, se colocaron en la. celda y se corrieron espectros

diferenciales. La concentración de Ca2+ en cada muestra se

determinó midiendo su absorbencia a 660 nm, en un

colorímetro CARL ZEISS PM6 (Tabla 2). Se midió el pH de cada

muestra in situ (Tabla 3) con un pHmetro portátil (CORNING).

RESULTADOS.

Los espectros absolutos obtenidos de APIII a pH 7.0,

tanto del complejo con Ca2+ como del indicador solo, se

presentan en la Figura 3a. El espectro absoluto del APIII,

muestra una absorbencia máxima a 550 nm, mientras que en el

espectro del complejo con :LOO pM de Ca2+ el coeficiente de

extinción a esa misma longitud disminuye (Scarpa y col,

1978). Se presentan los tres puntos isosbésticos conocidos.

Los espectros diferenciales a pH 7.0 (Figura 3b), con

distintas concentraciones de Ca2+ presentan tres puntos

isosbésticos a 430 nm, 494 nm y 613 nm. La banda en la que

podemos realizar una curva de calibración se encuentra a 660

nm, donde mejor se ajusta a la ley de Lambert y Beer.

11

El espectro absoluto del APIII a pH 4.0 presenta un

máximo a 550 nm, mientras que el del complejo con Ca2+ lo

presenta en 600 nm (Figura 4a); también se presentan tres

puntos de cruce. En los espectros diferenciales se presentan

tres puntos isosbésticos: 4:20 nm, 490 nm y 600 nm (Figura

4b). La absorción también es lineal a 660 nm, donde podemos

realizar la cuantif icación del ion Ca2+ (Velbzquez-

Manzanares y col., 1991a).

El espectro absoluto del APIII a p H 3.0 presenta un

máximo a 590 nm mientras el complejo con Ca2+ presenta una

disminución en el coeficiente de extinción a esa misma

longitud de onda (Figura 5a). Los espectros diferenciales

también presentan puntos isosbésticos: 420 nm, 496 nm y 622

nm (Figura 5b); se presenta una linearidad a 650 nm y 710 nm

con extinciones menores, esto comparado con los espectros a

pH 7.0 y 4.0; sin embargo, la técnica sigue siendo

resolutiva bajo estas cond.iciones (Velázquez-Manzanares y

col., 1991b). . Por otro lado, el espectro absoluto del complejo de

APIII-Mg2+ con una concentración de 300 pM del catión a p H

7.0 (Figura 6a), presenta un corrimiento a longitudes de

ondas más pequeñas, con una banda más fina respecto al

espectro del APIII sin el catión y un pico máximo de

absorbencia a 530 nm; este espectro presenta sólo dos puntos

de cruce. Los espectros diferenciales del APIII a varias

concentraciones de Mg2+ a p H 7.0 (Figura 6b) presentan tres

puntos isosbésticos en 458 nm, 550 nm y en 660 nm. Las

12

longitudes de onda en que se puede realizar la

cuantificación del ion Mg2+ son 491 nm, 517 nm y 598 nm, ya

que son éstas las que mejor se ajustan a la ley de Lambert y

Beer. (Scarpa y col, 1 9 7 8 ) .

Respecto al complejo de APIII con 60 pM de Mn2+ a pH

7.0 (Figura 7a), el espectro absoluto presenta un

corrimiento hacia el violeta1 con un pico máximo en 520 nm y

tres puntos de cruce, lo anterior comparado con el espectro

del APIII solo. En cuanto a los espectros diferenciales

(Figura 7b), éstos presentan tres puntos isosbésticos en las

longitudes de ondas siguientes: 460 nm, 538 nm y 651 nm, con

una linearidad en 491 nm y 600 nm, donde se puede realizar

la cuantificación del Mn2+.

En los medios a pH 4.0 y 3.0, el APIII con Mg2+ y Mn2+

no presenta bandas de absorción dentro del intervalo

estudiado y por lo tanto 1 1 0 se pueden cuantificar dichos

cationes en estas condiciones. Aparentemente, el indicador

comienza a mostrar bandas de absorbencia características a

pH 6.0 con dichos cationes (resultados no mostrados).

En la Figura 8 y tabla 2 y 3, se observa la utilidad de

la presente técnica en muestras tomadas de cuerpos de agua

del centro piscícola el Zarco. La Figura 8a presenta el

espectro diferencial del APIII con una muestra de agua a pH

4.0, mostrando los tres puntos isosbésticos que se dan en el

espectro diferencial del coimplejo APIII-Ca2+ al mismo pH. En

la Figura 8b se observa el (espectro diferencial de APIII con

una muestra de agua del centro piscícola el Zarco a pH 6.6;

13

presenta una banda negativa !más fina en 580 nm que indica la

presencia del ion Mg2+ o Mri"; las bandas positiva que se

presentan a 640 nm y a 720 nm son propias de la presencia

del ion calcio.

14

a) A

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

C 1

APl l l 6OuM. OH 7.OiHCL

. L L . L _ I _ L L U _ L I _ J _ _ L I _ L I I _ I _ I _ I _ _ L ~

O 440 480 520 560 600 640 680 720

Longitud d e onda (nm).

480 5 2 0 500 600 640 680 720 440 - 0.3 I l . d - _ L l _ _ L I I i I I _ _ l . - I - L l L - L L - . L

400 Longitud de onda (nm)

Figura 3 . Espectros del A P I I I a p H 7.0; Espectro absoluto

diferencial a distintas [Ca"] (b). (a), Espectro 2+ del APIII (50 pM) solo y del APIII-C

15

a) A

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

(3 1

APllll lOuM pH 4.01HCL

O 440 460 520 560 600 640 680 720

Longitud d e onda (nm).

400 440 480 520 560 000 640 680 720

Longitud d e onda (nrn).

Figura 4. Espectros del AE'III a pH 4.0; Espectro absoluto del APIII (50 pM) solo y del APIII-Ca2+ (a), Espectro

16 diferencial a distintas [Ca2+] (b) .

a) __-____- A

API I I 60uM. pH 3.0l i iCL

1.6

1.4 - APl l l

1.2 -

1 -

0.8 -

0.4 -

0.2 -

I - 1 - L l _ _ l - . l i I i i I L I I l - L L o - ' I I I

0.06

0.04

0.02

O

- 0.0 2

-0.04

-0.06'

APll l 6 0 uM p i i 3.0

_ L I _ - L - L L 1 1 - 1 - l L J _ i I L L _ L _ L l - I - U _ L L I - ' I ' ' I

b) A

17

a) A

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

a

APl l l 60uM. pH 7.OIHCL

API I I -MpZ*

400 440 480 520 560 600 040 680 720

Longitud de onda (nm).

0.4

0.2

O

-0.2

- 0.4

. __

A P l l l 6 0 uM. pH 7 . 0

- 0.6 400 440 480 520 500 600 640 680 720

Longitud de onda (nrn).

Figura 6. Espectros del APIII a pH 7.0; Espectro absoluto del APIII (50 pM) so lo y del APIII-M$+ (a), Espectro

diferencial a distintas [Mg 3 (b).

18

a) A

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

O

APl l l 60uM. p n 7.OIHCL

APII I -MnZ*

400 440 480 520 580 600 640 680 7 2 0 Longitud de onda (nrn).

I M"*+

400 440 480 520 560 8 0 0 640 6 8 0 720

Longitud de onda (nrn).

Figura 7. Espectros del APIII a pH 7.0; Espectro absoluto del APIII (50 pM) s o l o y del APIII-Mn2+ (a), Espectro

diferencial a distintas [Mn2+] (b).

19

a) A

ol : I r o. 1

0.05

-0.05

-0.1

-0.15

APl l l 6 0 uM pn 4.0

hluestra de agua

-

O,

-

~-

u I. -1 -I- u- L 1 l L - U I I I I

400

0.15

o. 1

0.05

O

-0.05

-0.1

-0.15

b) A

-0.2 400

480 560 640 700 Longitud de onda (nm).

A P l l i 60 uM p n 6 .6

480 560 640 Loingitud de onda (nm)

720

Figura 8. Espectros diferenciales del APIII (50 pM) con muestras de agua del centro piscícola "El Zarco"; Muestra de

agua a p H 4 (a), Muestra de a pH 6.6 (b).

20

Tabla 2, Concentraciones de calcio (Ca++) mg/l Centro piscícola "El Zarco".

Tabla 3 . Valores de pH del Centro piscícola "El Zarco"

21

D18SCUSION.

Como se puede observai- en la Figura 2, la mol4cula de

Antipirilazo I11 presenta una gran densidad electrónica,

compuesta por enlaces 3 (grupos cromóforos), fácilmente

excitables a longitudes de onda que caen dentro del espectro

visible (Budesinsky, 1 9 7 4 ) .

El cambio en el espectro absoluto hace evidente la

modificación de la molécula de APIII en presencia del catión

metálico. L o s complejos APIII-Ca2+ a pH 7.0 reflejan un

cambio en la estructura electrónica de la molécula de APIII,

dada por la interacción del catión con los grupos

cromóforos. Esta interacciem provoca la disminución en el

coeficiente de extinción molar comparado con el espectro del

APIII sin calcio. El cambio en el espectro es prueba de la

formación del complejo.

Por su parte, a pH 4-10 el complejo del indicador con

calcio aumenta su coeficiente de extinción molar en 600 nm;

esto se debe al efecto del pH y la presencia del calcio en

la molécula. Es claro que el espectro absoluto del APIII sin

el catión sigue teniendo un comportamiento parecido al

realizado a pH 7.0. Es probable que la concentración de

protones no sea suficiente para ionizar los grupos

responsables de la señal espectral.

Por otro lado, a pH 3.0 las bandas de absorción del

APIII se hacen más finas en 600 nm. Se observa una

diferencia muy pequeña entre la absorbencia del espectro

22

absoluto del APIII solo y la del complejo APIII-Ca2+. Sin

embargo, por espectroscopla. diferencial es posible detectar

concentraciones micromolares de calcio bajo estas

condiciones.

Respecto a los espectros de los complejos APIII-Mg2+ y

APIII-Mn2+ a pH 7.0, estos presentan corrimientos y aumentos

en el coeficiente de extinción molar a longitudes de onda

más cortas. Estos corrimientos pueden estar en función de

las energias de ionización de dichos cationes, ya que sus

valores son similares (Pietrzyk, 1983). Los espectros

diferenciales de Mn2+ y Mg'!' son muy parecidos en la señal

espectral; se presenta una interferencia entre estos

espectros. Esta interferenc:ia impide la determinación de

los iones Mn2+ y Mg2+ en l o s cuerpos de agua del centro

pisclcola "El Zarco". Sin embargo, es posible determinar

calcio en longitudes de onda de 660 nm ya que en dicha

longitud no se presenta interferencia del magnesio ni del

manganeso.

La presencia de los puntos isosbésticos en los

espectros diferenciales sugiere que el APIII sufre

Únicamente cambios en su estructura electrónica y no en su

estructura química.

23

CONC!LUSIONES .

El presente trabajo demuestra que el Antipirilazo I11

es un indicador metalocrómico que permite cuantificar

concentraciones de Ca2+ del orden micromolar, aun en

condiciones extremas de pH ácido. Por lo tanto, el APIII se

presenta como una Útil herramienta para determinaciones de

calcio de manera diferencial, tanto en sistemas

experimentales modelo, como en tejidos biológicos no

ensayados previamente (por ejemplo: epitelios gástricos,

arqueobacterias, etc.).

Sin embargo, en las presentes condiciones la técnica no

es útil para cuantificar los iones Mg2+ y Mn2+, dado que

presentan interferencias espectrales mutuas.

Además, el indicador metalocrómico APIII presenta

amplias perspectivas para emplearse en las determinaciones

de calcio en epitelios branquiales de peces, para contribuir

a explicar la toxicidad, que a nivel membranal presentan

algunos iones metálicos, sobre organismos acuáticos

sometidos a la alteración de! su hábitat por factores como la

disminución del pH y la lixiviación de metales al cuerpo de

agua debidas a la precipitación ácida (Tam y Williams,

1986).

24

ACTIVIDADES REALIZADAS.

Para la realización del presente trabajo, dentro del

proyecto Modelo Biofisicoqufmico del Efecto de la Acidez del

Medio en Trucha (Salmo sairdneri). Su Correlación con la

Producción en el Centro Piscícola “El Zarco”, los muestreos

se llevaron a cabo en estanques seleccionados dentro de la

granja (Figura 9). La toma de muestras se hizo una vez por

semana durante el primer ines de desarrollo del proyecto.

Posterior a este periodo, se efectuó un muestre0 mensual,

hasta el mes de diciembre.

Los resultados que se obtuvieron durante la realización

del presente trabajo se publicaron, en su versión corta, en

diversas publicaciones especializadas, las que se enuncian a

continuación:

Velázquez-Manzanares M., Alva, R., Rivera, B.E. Los

indicadores Muréxido y Antipirilazo I11 a pH ácido. En

Memorias del V Simposio de Estudiantes de Posgrado en

Química ffFernando Romo1t, U. A. M. , México. En prensa.

Velázquez-Manzanares, M., Alva, R. y Rivera, B.E. 1991.

Comportamiento espectral de1 complejo Antipirilazo III-

Ca(I1) a pH Acido. Rev. Soc. Qu5m. Méx. 35, 295

25

Figura 9. Estanques del centro piscicola "El Zarco".

26

OBJETIV08 ALCANZADOS.

Cumpliendo con los objetivos planteados se logró

evidenciar l o s espectros absolutos del complejo APIII-

Catión, siendo característica la señal espectral para cada

uno de los complejos.

Por medio de espectroscopía diferencial se logró

ajustar una técnica capaz de determinar concentraciones

micromolares de calcio en f'orma libre aún en condiciones de

pH ácido.

Se demostró que la técnica es viable para su

utilización en la determinac:ión de calcio.

Además, se demostró que el APIII no forma complejos con

Mn2+ y Mg2+ en condiciones de pH 4 y 3 .

27

RECOMENDACIONES.

Dada la importancia del Mn2+ y Mg2+ en los seres vivos,

es recomendable estudiar m á s a profundidad los espectros del

complejo APIII-Mn2+ y APIII-Mg2+, para una evaluación m á s

precisa de estos iones en forma libre en cuerpos de agua.

Es importante profundizar aún más en estudios sobre la

formación de complejos de APIII con iones alcalinos y

algunos metales de transicih en condiciones extremas de pH,

para poder tener una comprensión más detallada del mecanismo

fino de la respuesta espectral.

Es recomendable continuar estudios sobre la cinética de

unión entre el APIII y los cationes (calcio, magnesio y

manganeso), estudiar las constantes de formación y

disociación. Además, es conveniente hacer estudios en

sistemas biológicos para verificar si este indicador

interfiere en el metabolismo celular y así poder utilizarlo

con seguridad en las mediciones de cationes en condiciones

extremas de pH (ácidas y alcalinas).

Se deben evidenciar las características espectrales de

otros indicadores como el Miiréxido y el Arsenazo I11 en las

determinaciones espectroscópicas de cationes divalentes u

otros y realizarlos en condiciones no ensayadas previamente.

28

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1991b. En Memorias d e l V S i m p o s i o d e E s t u d i a n t e s

d e Posgrado en Química "Fernando Romo11, U.A.M. , México. En prensa..

AGRADECIMIENTOS.

Este trabajo fue apoyado parcialmente por CONACyT

P228CCOX891754, DGICSA C89-01-0216 y C90-01-0287.

32

295

%d d e 1385m. P e r f o r a d o e n 1973,des I carga desde e n t o n c e s una mezcla agua-- ';por d e a l t a e n t a l p i a , p resentando v a r i a 'dciones en e l i n d i c e N a / K (de 6 . 1 a 9 . 7 'únidades) y en l a e n t a l p i a (de 1410 a )060KJ/Kg), d u r a n t e s u d e s a r r o l l o y también a t r a v e s d e l t iempo, t e n i e n - do ac tua lmente 1 1 . 2 unidades N a / K y

,000 K J / K g de e n t a l p i a .

onectado a l a c e n t r a l desde 1973 con un f l u j o d e vapor separado de 45 tori /hr entrega a l a f e c h a 30 t o n / h r r e s u l t a n - do s e r un pozo d e l a r g a v i d a c o n u n buen lujo d e vapor .

El objetivo de est contr-bució' es mqstrar Lii ca acidad del indl @!or metalocrhiqo Anti lrilaz 11'1 APIII ara cu n I F 1 r concentraciones Ricrmof'are; f 8 O. A pesar d u uso extensi o

c i s emac b;ol&iic&. como cCfu?as de m3sciiro Ca(]if a pH 2 6

COMO REACTIVO PARA LA D E T E R M I N A C I O N ESPECTROFOTOMETRICA DE ITRIO Y TORIO.

Macías P. M. LÓpez J. J. A.*, Carrillo R. Ma. T. Instituto d e ~ n v e s t i g a c i o n e s Científicas. Universidad de Guanajuato, Lascurain de Retana # 5, C.P 3 6 0 0 0 . Guanajuato, Gto.

El Acido Carmínico forma complejos coloridos con Itrio a pH=5.7 (600nm) y con Torio a pH=3.7 (570nm) . Las condiciones Óptimas, curva de calibración y precisión del método han sido establecidas para Torio e Itrio. La estequiometria para el complejo de Torio es de 2:3, para Itrio se observa la f ormaci ón de diferentes complejos.

I I S . C L A S I F I C AC I ON DE DE RMATOF I TOS DEL GENERO TRICHOPHYTON POR Pli ér-. CROMATOGRAFTA DE GASES

__ OCTAVIO VA'LQUEZ A . , MARIA DE J E S U S GONZALEZ* Y MARIA DE LAS MERCEDES ROJAS* I N S T I T U T O NACIONAL DE I N V E S T I G A C I O N E S NUCLEARES APARTADO POSTAL 18-1027, C . P . 11801 MEXICO , D. F.

*FACULTAD DE QUIMICA, [J.A.E.M. TOLUCA, MEX . El material biológico fue identificado en base al análisis de los ácidos grasos como productos metabólicos. Las cepas de T. ru b u no producen los ácidos 2-hidroxidecanóico (2-OH Cloz0) y undecanóico (C,l,o), pero se o b t i e n e 18.40% más de ácido palmítico (C16:o) que en T. mentasrophvtes. El análisis cromatográfico permitió la

J 4 >UO.

! ~ T O ! C I L .

5'Bt9:Fhisk+ í9r1 'I&:

Fa iato A Fabiato 197p N ture 281 Me a, L: y ' d n e, E . ' l { b . Bioc¡?emictry 7 '8$9 Expe;imental, U.4.M. Iztapalape, exico D.F

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F.J. , an! Dubyék, 6 . 1978.

t

II

114. QUIMICA DEL ACID0

'Iiér. ACID0 CARMINIC0 CARMINIC0 (11). EL

V SIMPOSIO DE ES'TUDIANTES DE F'OSGRADO EN QUlMlCA

' ' F E R I\] A N D O ROMO ' I

LOS INDICADORES MUREXIDO Y ANTXPIRILAZO 111 A p H ACXDO.

'e Y z-5Laetiiz8ma@es@r Raúl Alva y Blanca Estela

Rivera.

Departamento de Ciencias de la Salud, U.A.M. Iztapalapa,

c J). 5 5 - 5 3 5 , 0 9 3 4 0

Y- /

El propósito

de los

Antipirilazo

micromolares I \.

', ácido (4.0 y

Ex i s t en

cuantitativo

México 13,, D . F .

de la presente contribución es mostrar

indicadores metalocrómicos Muréxido

la

Y

I11 (APIII) para cuantificar concentraciones

de praseodimio (Pr3+) y de calcio (Ca2+) a pH

3.0) .- varios método:; descritos para el análisis

de iones metál.icos en sistemas biológicos y

artificiales. Los procedimientos más comunes son: el empleo

de electrodos ion-selectivos (Flora y col., 1980), la

espectroscopía de absorción atómica (Toro, 1980) y la

espectroscopía con indicadores flourescentes (Fabiato y

Fabiato, 1979) y metalocrómicos (Scarpa y col., 1978).

L o s indicadores metalocrómicos, como el Muréxido, el

Antipirilazo I11 y el Arsenazo 111, son moléculas orgánicas

(Fig. 1) con grupos cromóforos que cambian sus propiedades

espectrales en presencia de metales en solución. Las

diferencias en el espectro de absorción electr6nicaf entre

el indicador libre (Ind) y e:L complejo indicador-metal (Ind-

M), dependen de la concentración del ion metálico, por lo

q u e se pueden usar para determinar cuantitativamente la

concentración ionica en el medio (Scarpa, 1972; Scarpa y

1

col., 1978; Dorogi, 1984). Estos indicadores han sido

ampliamente usados para medir la cinética cle los flujos de

calcio en diversos sistemas biológicos (Mela y Chance, 1968;

Brown y col., 1975; Madeira, 1975; Toro, 1980).

Figura 1. Estructura química de los indicadores

metalocrómicos a) Muréxido y b) ApIII.

Por otro lado, a pesar de su u s o extensivo en sistemas

biológicos, como células de músculo esquelético (Ohnishi y

Ebashi, 1963), tejido cardiac0 (Fabiato y Fabiato, 1979),

p a r t í c u l a s subcelulares -rc:t iculo sarccplásmico (Fahiato y

Fabiato, 1 9 7 9 ) , mitocondr ias (Mela y Chance, 1968; Toro,

2

1980) , etc.-, los indicadores metalocrómicos han sido poco

empleados en sistemas biológicos o artificiales bajo

condiciones experimentales a pH ácido.

En vista de lo anterior, en el presente trabajo

estudiamos el comportamiento del espectro de absorción

electrónica, en el Visible (VIS), del indicador Muréxido en

presencia de Pr3+ a pH 7 'y 4, así como el espectro del

indicador APIII en presencia del ion Ca2+ a pH 7 y 3 .

Se prepararon soluciones de Muréxido 40 pM y de APIII

50 pM; se titularon con cloruro de praseodimio (PrC13) y

cloruro de calcio (CaC12) (Scarpa y col., 1 9 7 8 ) ,

respectivamente. El pi1 de las soluciones se ajustó con ácido

clorhídrico (HC1) y trietanolamina (TEA). Se corrieron l o s

espectros absolutos del Ind y de los complejos Ind-M a cada

pII en un espectrofotómetro UV-VIS Aminco DW 2a. Los

espectros diferenciales se corrieron como Ind vs Ind-M a

diferentes concentraciones de Pr3+ y de Ca2+.

En la figura 2a se observa el espectro absoluto d e l

Muréxido a pH 7.0; éste muestra una absorbencia máxima a 525

nm mientras el espectro del complejo con 100 pM de Pr3+

presenta un máximo a 4 8 5 nm. Los espectros diferenciales a

pH 7.0 (fig 2b) , a distj.ntas concentraciones de Pr3+,

presentan un punto isosbéctico a 510 nin. La b-?nda de

absorción que se ajusta a la ley de Lambert y Beer se

encuentra a 470 nm.

El espectro absoluto de Muréxido ri p!I :.O nuestra un

pico máximo a 525 nm mientras el complejo con Pr3+ lo

3

presenta a 485 nm (fig 2c). Los espectros diferenciales

muestran también un punto isosbéstico a 510 nm (fig.ad),

siguiendo un comportamiento lineal en 470 nm.

Por su parte, en la Figura 3a se observa que el

espectro absoluto de APIII a pH 7.0 muestra una absorbencia

máxima a 550 nm, mientras que en el espectro del complejo

con 100 pM de Ca2+ el coeficiente de extinción disminuye

(Scarpa y col., 1978). Los espectros diferenciales a pH 7

( F i g . 3 b ) , a clistintas concentraciones de Ca2+, presentan

puntos isosl *;ticos a 430, 500 y 610 nm. La banda de

absorción q u e se ajusta a la ley de Lambert y Beer se

encuentra a 647 nm.

El espectro absoluto del APIII a pH 3 . 0 presenta un

máximo a 530 niii mientras el complejo con Ca2+ presenta una

disminución en el coeficiente de extinción en esa misma

longitud de onda, (Fig. 3c). Los espectros diferenciales

también presentan puntos icosbésticos: 420, 496 y 622 nm

(F ig . 3d); se presenta una linearidad a 650 y 710 nm con

extinciones menores, comparados con los espectros a pH 7.0.

En conclusión, la presente contribución muestra que el

Murexido y el Antipirilazo I11 cpn indicadores

metalocrómicos que permiten cuantificar concentraciones de

Pr3+ y Ca2-+, del orden de 10 a 100 pM, aun en condiciones de

pH ác ido . Por lo tanto, el PIuréxido y e l APIII se presentan

como un par de herramientas útiles para la determinación de

estos cationes, tanto en sistemas experimentales modelo como

4

en tejidos biológicos no ensayados previamente, por ejemplo:

epitelios gástricos, arqueobacterias, etc.

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