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João Diogo Encarnação Bastos de Miranda

Carbon Dots: Nanopartículas de carbono fluorescentes

para marcação e visualização de células

Licenciado em Ciências de Engenharia Biomédica

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre

em Engenharia Biomédica

Orientador: Jorge Carvalho e Silva, Professor Auxiliar, FCT-UNL

Co-orientador: António Jorge Dias Parola, Professor Associado, FCT-UNL

Júri:

Presidente: Prof. Doutora Carla Maria Quintão Pereira

Arguente: Prof. Doutor João Carlos dos Santos Silva e Pereira de Lima

Vogal: Prof. Doutor Jorge Alexandre Monteiro de Carvalho e Silva

Dezembro, 2014

João Diogo Encarnação Bastos de Miranda



Licenciado em Ciências de Engenharia Biomédica

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre

em Engenharia Biomédica

Orientador: Jorge Carvalho e Silva, CEFITEC, Professor Auxiliar, Departamento de Física

da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

Co-orientador: António Jorge Dias Parola, REQUIMTE, Professor Associado, Departamento

de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

Membros do Júri:

Presidente: Prof. Doutora Carla Maria Quintão Pereira

Arguente: Prof. Doutor João Carlos dos Santos Silva e Pereira de Lima

Vogal: Prof. Doutor Jorge Alexandre Monteiro de Carvalho e Silva



Copyright © 2014 – Todos os direitos reservados. João Diogo Encarnação Bastos de Miranda,

Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa.

A Faculdade de Ciências e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa têm o direito, perpétuo e

sem limites geográficos, de arquivar e publicar esta dissertação através de exemplares impressos

reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a

ser inventado, e de a divulgar através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e

distribuição com objectivos educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado

crédito ao autor e editor.

Carbon Dots: Nanopartículas de carbono fluorescentes para marcação e visualização de células

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Agradecimentos

Quero começar por agradecer à minha família, em especial aos meus pais, avós e irmão, por

todo o apoio incondicional, paciência e confiança que me transmitiram em todas as fases da minha

vida. Todo o apoio que me deram foi fundamental para que me tornasse na pessoa que sou hoje e

tudo o que alcancei foi possível graças a eles.

Quero agradecer ao professor Jorge Carvalho e Silva e ao professor António Jorge Parola,

respectivamente, meu orientador e co-orientador desta tese de mestrado, pela oportunidade de

trabalhar num tema muito contemporâneo e verdadeiramente fascinante. Todo o apoio e

conhecimento que me facultaram foram de importância capital no decorrer deste trabalho. Ambos

sempre se mostraram disponíveis para ajudar a encontrar soluções para qualquer dificuldade

surgisse, formulando críticas válidas e sugestões essenciais para as ultrapassar. Quero mostrar o meu

profundo agradecimento pela oportunidade de trabalhar no GREAT e pela oportunidade de trabalhar

juntamente com o grupo de fotoquímica. Quero ainda agradecer a oportunidade de participação na

conferência IC3EM.

Ao grupo de fotoquímica – Artur Moro, João Avó, Raquel Gavara, Noémi Jordão, João

Lima, Luís Cabrita, César Laia, Sandra Gago, Ana Diniz, Alexandra Costa, Fernando Pina, Maria

João Melo, Nuno Trindade, Nuno Basílio, Andreia Forte e Hugo – um muito obrigado por me terem

acolhido no seu grupo e por me darem a oportunidade de trabalhar num ambiente que prima pelo

profissionalismo, rigor e também pela boa disposição. Todos os conselhos, motivação e

ensinamentos de práticas laboratoriais essenciais no desenrolar deste trabalho. Um obrigado especial

ao Artur, João Avó, César, Noémi e Nuno Basílio pela disponibilidade, prontidão, paciência e tempo

dispendido comigo no laboratório. Quero também agradecer ao Alfonso e à Alicia, que trabalharam

com o grupo de fotoquímica, pelo companheirismo e boa disposição.

Quero agradecer ao professor João Sotomayor por me autorizar a usar a mufla do seu

laboratório e às raparigas do laboratório 415 – Ana, Catarina, Nélia e Mariana – pela grande

simpatia que sempre me mostraram.

Agradeço ao pessoal do GREAT – Nuno, Constança, Ana Carolina e Tânia – pelo excelente

ambiente e companheirismo durante o decorrer deste projecto.

Quero mostrar a minha gratidão para com o professor João Paulo Borges e à doutoranda Ana

Baptista pela simpatia e por me permitirem utilizar a mufla do laboratório de biomateriais. Agradeço

à investigadora Luísa Maia e à investigadora Ana Teresa Lopes do laboratório 407 por me

disponibilizarem a centrífuga, os tubos de centrífuga e membrana de diálise.

Agradeço aos meus amigos mais chegados – Cedric, Luís, Nuno e João – pela grande

amizade.

A todos os meus amigos de curso e faculdade que se tornaram parte da minha vida ao longo

deste percurso e que transformaram a minha vivência académica numa experiência incrível de valor

inestimável.

Para finalizar quero deixar um grande obrigado à Ana Luísa pela inabalável confiança,

apoio, motivação e amor que me transmite há já quase 5 anos. A sua presença foi crucial para

reendireitar a minha vida académica na direcção certa.

A todos vós, muito obrigado.


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Resumo

A imagiologia por fluorescência é uma técnica extremamente útil em investigação

biomédica. Actualmente existe uma vasta gama de fluoróforos disponíveis para marcação por

fluorescência. Contudo estes marcadores possuem limitações que condicionam a sua aplicação em

sistemas biológicos. As nanopartículas de carbono fluorescentes (CNPs) constituem uma recente

classe de marcadores fluorescentes com elevada biocompatibilidade. O objectivo deste trabalho

consistiu em produzir de CNPs através de métodos simples, a sua caracterização e aplicação como

marcadores celulares para visualização de células em microscopia de fluorescência.

Inicialmente foram produzidas nanopartículas (NPs) seguindo métodos mencionados na

literatura. Seguidamente foram produzidas CNPs a partir de PAA, por via hidrotérmica, e a partir da

carbonização de grãos de cortiça para as quais foi feito um estudo do efeito da variável temperatura

de carbonização. Das amostras produzidas, nove foram devidamente estudadas.

A espectroscopia de absorção no UV-Vis revelou perfis de absorção característicos para este

tipo de NPs. A emissão de fluorescência das CNPs caracterizadada por espectroscopia de

fluorescência evidenciou comportamentos emissivos típicos destas NPs tais como dependência do

máximo de emissão com o comprimento de onda de excitação. A intensidade da fluorescência das

CNPs sintetizadas por via hidrotérmica é, em geral, maior com rendimentos quânticos de

fluorescência a variar entre 4 e 11%. Os rendimentos quânticos das CNPs produzidas por

carbonização variam entre 2 e 5%.

As imagens de microscopia electrónica demonstram que as CNPs possuíam formas esféricas.

Os tamanhos determinados por SEM, TEM e DLS revelaram que as dimensões das NPs caem entre

os 2 e 150nm. Por DRX constatou-se que as CNPs possuem uma estrutura atómica desorganizada.

A análise FTIR mostrou que as amostras de CNPs produzidas a partir de macromoléculas

pelo método hidrotérmico possuíam uma grande quantidade de precursor não degradado. Para as

restantes CNPs foi verificada a presença de grupos funcionais polares que lhes conferem

solubilidade em meio aquoso. Com 1H-RMN verificou-se uma diminuição de grupos alifáticos e

aumento de grupos aromáticos nas CNPs de cortiça carbonizada, com o aumento da temperatura de

carbonização. O potencial ζ da amostra obtida com maior temperatura de carbonização foi -25,7mV.

Nos estudos in vitro realizados apenas as NPs produzidas a partir de ácido cítrico e

etilenodiamina por via hidrotérmica marcaram eficazmente as linhas celulares de osteoblastos e de

fibroblastos. A eficiência da marcação aparenta ser dependente do tempo de incubação com CNPs.

Palavras chave: fluorescência, nanopartículas de carbono fluorescentes, cortiça, marcadores

fluorescentes, marcadores celulares, microscopia de fluorescência.


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Abstract

Fluorescence imaging is widely used in biomedical research. Although there are many

fluorophores currently available, most of these markers are unsuitable for biological applications.

Fluorescent carbon nanoparticles (CNPs) are an emergent class of highly biocompatible fluorescent

labels with great potential for bioimaging. The purpose of this work was the production CNPs

through simple routes, their characterization and their application as cell labels for fluorescence

microscopy imaging.

In a first phase, nanoparticles (NPs) were produced through existing procedures. After these

syntheses, CNPs were produced from PAA, through a hydrothermal procedure, and through the

carbonization of cork grain where the influence of the carbonization temperature was investigated.

A total of nine CNPs samples were thoroughly studied.

UV-Vis absorption spectroscopy showed the characteristic absorption profiles for this type

of NPs. Fluorescence behavior was studied by fluorescence spectroscopy and revealed the typical

fluorescence emission behavior expected for these NPs such as excitation wavelength dependent

emission maxima. Calculation of fluorescence quantum yields revealed that CNPs synthesized

through hydrothermal procedures are more emissive, with fluorescence quantum yields ranging

between 4 and 11%. Fluorescence quantum yield of CNPs produced from dry carbonization of

biomass vary from 2 to 5%.

The images obtained by electron microscopy techniques showed that most CNPs have

spherical shapes. Most sizes, determined by SEM, TEM and DLS, range between 2 and 150nm.

XRD analysis revealed an amorphous nature for the synthesized CNPs.

The chemical structure of all CNPs samples was investigated with FTIR. The analysis

showed that CNPs samples produced from macromolecules via hydrothermal procedure retain a

great deal of non-degraded precursor. For the remaining CNPs, polar functional groups were

distinguished. These groups are responsible for CNPs water solubility. Furthermore, for CNPs

obtained from the carbonization of cork, structural analysis performed by 1H-RMN showed a likely

decrease in aliphatic groups and an increase in aromatic groups. Of these samples, the CNPs

synthesized with the highest temperature had a ζ potential of -25,7mV.

The in vitro studies performed showed that only CNPs produced from citric acid and

ethylenediamine through hydrothermal procedure were efficient cell labels for fibroblasts and

osteoblasts cell lines. The labeling efficiency seems to be time-dependent.

Key-words: fluorescence, fluorescent carbon nanoparticles, fluorescent labels, cork, cell labels,

fluorescence microscopy.


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Índice de matérias

Agradecimentos ................................................................................................................................ v

Resumo............................................................................................................................................vii

Abstract ............................................................................................................................................ ix

Índice de figuras ............................................................................................................................. xv

Índice de tabelas ............................................................................................................................ xix

Lista de abreviaturas e símbolos .................................................................................................. xxi

Capítulo I – Enquadramento teórico .............................................................................................. 1

I.1 Introdução ao tema ................................................................................................................... 1

I.2 Fluorescência ........................................................................................................................... 1

I.2.1 Conceito ............................................................................................................................ 1

I.2.2 Princípio físico .................................................................................................................. 2

I.2.2.1 Absorção e excitação electrónica ................................................................................ 2

I.2.2.2 Relaxação electrónica e emissão de fluorescência ...................................................... 3

I.3 O microscópio de fluorescência ............................................................................................... 4

I.3.1 Contextualização ............................................................................................................... 4

I.3.2 Fundamentos de microscopia de epifluorescência ............................................................. 5

I.4 Marcadores fluorescentes ......................................................................................................... 6

I.4.1 Fluoróforos orgânicos........................................................................................................ 6

I.4.2 Proteínas e péptidos fluorescentes ..................................................................................... 7

I.4.3 Nanopartículas fluorescentes ............................................................................................. 7

I.4.3.1 Quantum Dots............................................................................................................. 8

I.4.3.2 Nanopartículas metálicas fluorescentes ...................................................................... 9

I.4.3.3 Nanocristais de Silício ................................................................................................ 9

I.4.4 Propriedades espectroscópicas e físico-químicas ............................................................... 9

I.5 Nanopartículas de carbono ..................................................................................................... 10

I.5.1 Introdução ........................................................................................................................ 10

I.5.2 Métodos de síntese de nanopartículas de carbono ............................................................. 11

I.5.3 Mecanismo de fluorescência das nanopartículas de carbono ............................................ 12

I.5.4 Propriedades das nanopartículas de carbono ..................................................................... 12

I.5.4.1 Propriedades físico-químicas ..................................................................................... 13

I.5.4.2 Propriedades espectroscópicas ................................................................................... 13

I.5.5 Aplicações das nanopartículas de carbono ........................................................................ 14


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I.5.5.1 Bioimagiologia .......................................................................................................... 15

I.5.5.2 Aplicações bioanalíticas ............................................................................................ 16

Capítulo II – Parte experimental................................................................................................... 17

II.1 Síntese .................................................................................................................................. 17

II.1.1 Preâmbulo ....................................................................................................................... 17

II.1.2 Reagentes usados em síntese ........................................................................................... 17

II.1.3 Materiais usados em síntese ............................................................................................ 18

II.1.4 Equipamentos usados em síntese ..................................................................................... 18

II.1.5 Procedimentos ................................................................................................................. 18

II.1.5.1 Síntese hidrotérmica ................................................................................................. 18

II.1.5.2 Carbonização simples ............................................................................................... 19

II.2 Caracterização ...................................................................................................................... 20

II.2.1 Espectroscopia de absorção ............................................................................................. 20

II.2.2 Espectroscopia de fluorescência ...................................................................................... 21

II.2.2.1. Medição de rendimentos quânticos de fluorescência ............................................... 22

II.2.3 Microscopia electrónica de transmissão .......................................................................... 22

II.2.4 Microscopia electrónica de varrimento ........................................................................... 23

II.2.5 Dispersão dinâmica da luz............................................................................................... 23

II.2.6 Difracção por raios-X ...................................................................................................... 24

II.2.7 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier ........................................ 25

II.2.8 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão ........................................... 25

II.2.9 Potencial Zeta ................................................................................................................. 26

II.3 Culturas celulares e imagiologia celular ............................................................................... 27

II.3.1 Reagentes ........................................................................................................................ 27

II.3.2 Materiais ......................................................................................................................... 27

II.3.3 Equipamentos.................................................................................................................. 27

II.3.4 Culturas celulares e marcação ......................................................................................... 27

II.3.5 Visualização no microscópio de fluorescência ................................................................ 28

Capítulo III – Resultados e discussão ........................................................................................... 29

III.1 Sínteses ............................................................................................................................... 29

III.1.1 Síntese hidrotérmica ...................................................................................................... 29

III.1.2 Carbonização simples .................................................................................................... 30

III.2 Caracterização ..................................................................................................................... 31

III.2.1 Caracterização espectroscópica ...................................................................................... 32


xiii

III.2.1.1 Espectroscopia de absorção no ultravioleta e visível ............................................... 32

III.2.1.2 Espectroscopia de fluorescência .............................................................................. 34

III.2.2 Caracterização morfológica ........................................................................................... 42

III.2.2.1 Microscopia electrónica de transmissão .................................................................. 42

III.2.2.2 Microscopia electrónica de varrimento ................................................................... 44

III.2.2.3 Dispersão dinâmica da luz ...................................................................................... 46

III.2.2.4 Difracção por raios-X ............................................................................................. 48

III.2.3 Caracterização da estrutura química .............................................................................. 49

III.2.3.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier ............................... 49

III.2.3.2 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão ................................... 56

III.2.3.3 Potencial Zeta ......................................................................................................... 59

III.3 Marcações celulares ............................................................................................................ 59

III.3.1 Linhas celulares Saos-2 .............................................................................................. 59

III.3.2 Linhas celulares HFFF2 ............................................................................................. 61

Capítulo IV – Conclusões e perspectivas futuras ......................................................................... 67

Referências bibliográficas .............................................................................................................. 71

Apêndices ........................................................................................................................................ 77

Apêndice A – Análise estrutural de precursores moleculares e CNPs ......................................... 77

Apêndice B – Características da cortiça ...................................................................................... 82

Apêndice C – Preparação e caracterização espectroscópica da solução de sulfato de quinino ..... 84

Apêndice D – Culturas celulares ................................................................................................. 85

Apêndice E – Controlos de autofluorescência celular .................................................................. 87

Apêndice F – Tentativa de funcionalização com hidrocloreto de L-cisteína-etil-éster ................. 88


xiv


xv

Índice de figuras

Figura I.1 – Transição electrónica mais provável. Adaptado de [5]. .................................................. 3

Figura I.2 – Diagrama de Jablonski: excitação e mecanismos de relaxação electrónica. ................... 3

Figura I.3 – Células da aorta de ratinhos marcadas com fluoróforos orgânicos (A). Actina marcada

com Alexa Fluor 350 (azul), Tubulina marcada com Alexa Fluor 568 (vermelho) e DNA

marcado com SYTOX Green. Células HeLa marcadas com QDs (B). Tubulina marcada com

QDot525 (verde), complexo de Golgi marcado com QDot585 (amarelo) e histonas marcadas

com QDot655 (vermelho). Adaptado [2]. .................................................................................. 4

Figura I.4 – Espectro de emissão de lâmpada de mercúrio (A) e montagem do bloco óptico num

microscópio de epifluorescência (B). Adaptado de [2]. ............................................................. 5

Figura I.5 – Estrutura química da rodamina B (A), fluoresceína (B) e azul do nilo (C). Estruturas

desenhadas com o software ChemDraw. .................................................................................... 6

Figura I.6 – Soluções de QDs à luz UV. QDs com tamanhos mais pequenos correspondem a

deslocamento da emissão para o azul. Adaptado de [13]. .......................................................... 8

Figura I.7 – Ilustração de CNPs com superfície passivada com grupos oxigenados (esquerda) e com

superfície passivada com moléculas orgânicas (direita). Adaptado de [22]. ............................. 11

Figura I.8 – Marcação com CNPs produzidas por micro-ondas a partir de glicerol e 4,7,10-trioxa-

1,13-tridecanediamina em células HepG-2. Adaptado de [40]. ................................................. 15

Figura I.9 – Imagem in vivo de fluorescência de CNPs injectadas por via intravenosa em ratinhos: a)

imagem por contraste de fase; b) imagem de fluorescência; c) imagem de intensidade de

fluorescência codificada por cores. Adaptado de [42]............................................................... 15

Figura II.1 – Reactor de teflon com capacidade para cerca de 150ml (esquerda) e respectiva camâra

de aço inoxidável (direita). ....................................................................................................... 18

Figura II.2 – Esquema de funcionamento de um espectrofluorímetro de duplo monocromador.

Adaptado de [50]. ..................................................................................................................... 21

Figura II.3– Esquema da distribuição de cargas devido a uma partícula carregada. Adaptado

de [51]. ..................................................................................................................................... 26

Figura III.1 – Cortiça em pó (A), carbonizada: a 180ºC (B), 220ºC (C), 260ºC (D) e 300ºC (E). ..... 30

Figura III.2 – Espectro de absorção de CNPs PVP. .......................................................................... 32

Figura III.3 – Espectro de absorção de CNPs AC E. ........................................................................ 32

Figura III.4 – Espectro de absorção de CNPs PAA. ......................................................................... 33


xvi

Figura III.5 – Espectro de absorção de CNPs G. .............................................................................. 33

Figura III.6 – Espectro de absorção de CNPs CL. ............................................................................ 33

Figura III.7 – Espectros de absorção de CNPs 180. .......................................................................... 33

Figura III.8 – Espectro de absorção de CNPs 220. ........................................................................... 33

Figura III.9 – Espectro de absorção de CNPs 260. ........................................................................... 33

Figura III.10 – Espectro de absorção de CNPs 300. ......................................................................... 34

Figura III.11 Espectros de fluorescência de CNPs PVP (A) e respectivos espectros

normalizados (B). ..................................................................................................................... 35

Figura III.12 – Espectros de fluorescência de CNPs AC E (A) e respectivos espectros

normalizados (B). ..................................................................................................................... 35

Figura III.13 – Espectros de fluorescência de CNPs PAA (A) e respectivos espectros

normalizados (B). ..................................................................................................................... 35

Figura III.14 – Espectros de fluorescência de CNPs G (A) e respectivos espectros

normalizados (B). ..................................................................................................................... 36

Figura III.15 – Espectros de fluorescência de CNPs CL (A) e respectivos espectros

normalizados (B). ..................................................................................................................... 36

Figura III.16 – Espectros de fluorescência de CNPs 180 (A) e respectivos espectros

normalizados (B). ..................................................................................................................... 36


normalizados (B). ..................................................................................................................... 37


normalizados (B). ..................................................................................................................... 37


normalizados (B). ..................................................................................................................... 37

Figura III.20 – Espectros de excitação de CNPs PVP. ...................................................................... 40

Figura III.21 – Espectros de excitação de CNPs AC E. .................................................................... 40

Figura III.22 – Espectros de excitação de CNPs PAA. ..................................................................... 40

Figura III.23 – Espectros de excitação de CNPs G. .......................................................................... 40

Figura III.24 – Espectros de excitação de CNPs CL. ........................................................................ 40

Figura III.25 – Espectros de excitação de CNPs 180. ....................................................................... 40


xvii




Figura III.29 – Imagem TEM de CNPs PVP. ................................................................................... 43

Figura III.30 – Imagem TEM de CNPs G. ........................................................................................ 43

Figura III.31 – Imagem TEM de CNPs 260. O filme fino formado enrolou em direcção ao cobre. .. 43

Figura III.32 – Imagem TEM de CNPs 300. ..................................................................................... 43

Figura III.33 – Imagem SEM de CNPs PVP..................................................................................... 44

Figura III.34 – Imagem SEM de CNPs CL. ...................................................................................... 44

Figura III.35 – Imagem SEM de CNPs 180. ..................................................................................... 44


Figura III.37 – Imagem SEM de CNPs AC E. .................................................................................. 45

Figura III.38 – Histograma de dimensões de CNPs AC E. ............................................................... 45

Figura III.39 – Imagem SEM de CNPs G. ........................................................................................ 45

Figura III.40 – Histograma de dimensões de CNPs G. ..................................................................... 45


Figura III.42 – Histograma de dimensões de CNPs 300. .................................................................. 45

Figura III.43 – Distribuição de tamanhos DLS de CNPs PVP (A), CNPs CL (B) e CNPs 300 (C). .. 47

Figura III.44 – Difractograma de CNPs PVP. .................................................................................. 48

Figura III.45 – Difractograma de CNPs AC E. ................................................................................. 48

Figura III.46 – Difractograma de CNPs PAA. .................................................................................. 48

Figura III.47 – Difractograma de CNPs G. ....................................................................................... 48

Figura III.48 – Difractograma de CNPs CL. ..................................................................................... 48

Figura III.49 – Difractogramas de CNPs 180, CNPs 220, CNPs 260 e CNPs 300. ........................... 48

Figura III.50- Espectro FTIR de CNPs PVP. .................................................................................... 50

Figura III.51 – Espectro FTIR de CNPs AC E. ................................................................................. 51


xviii

Figura III.52 – Espectro FTIR de CNPs CL. .................................................................................... 52

Figura III.53 – Espectro FTIR de CNPs 180. ................................................................................... 53

Figura III.54 – Espectro FTIR de CNPs 260. ................................................................................... 54

Figura III.55 – Espectro FITR de CNPs 300. ................................................................................... 55

Figura III.56 – Espectro 1H-RMN de CNPs 180. O inset exibe a região aromática ampliada. .......... 57

Figura III.57 – Espectro 1H-RMN de CNPs 220. O inset exibe a região aromática ampliada. .......... 57

Figura III.58 - Espectro 1H-RMN de CNPs 260. Em inset é exibida a região aromática ampliada. .. 58

Figura III.59 – Imagens de microscopia de epifluorescência de células Saos-2 marcadas com CNPs

AC E (concentração de CNPs em meio de incubação: 1mg/ml). As imagens A e C foram

obtidas com luz excitatória no UV próximo e as imagens B e D com luz azul. Ampliação: A e

B de 100× e C e D de 400×. As imagens foram adquiridas com tempos de exposição de 1s. ... 60

Figura III.60 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs AC

E com tempos de incubação de 24h. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (A) e

1mg/ml (B) com excitação no UV próximo e ampliação de 100×. CNPs internalizadas a

concentrações de 0,5mg/ml (C) e 1mg/ml (D) com excitação no azul e ampliação de 400×. As

imagens foram adquiridas com exposição de 1s. ...................................................................... 62

Figura III.61 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs CL

com tempos de incubação de 24h. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (A) e

1mg/ml (B) com excitação no UV próximo e ampliação de 100×. As imagens foram adquiridas

com tempos de exposição de 1s. ............................................................................................... 63

Figura III.62 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs AC

E com tempos de incubação de 72h. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (A, C e

E) e 1mg/ml (B, D e F) com excitação no UV próximo (A e B) azul (C e D) e verde (E e F) –

excitação no verde: 528 a 553nm. Ampliação de 400× em todas as imagens. Tempos de

exposição na aquisição: 0,5s (A, C e E) e 1s (B, D e F). ........................................................... 64

Figura III.63 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs

180 (A), CNPs 220 (B) e CNPs 300 (C). A alíquota usada em todas as marcações foi de 0,3mL.

Os espécimes foram excitados com luz azul. A magnificação usada é de 100×. Os tempos de

exposição para adquirir as imagens foram de 3s (A e C) e 2s (B). ............................................ 65


xix

Índice de tabelas

Tabela I.1 – Comparação de características entre marcadores. Adaptado de [5]. .............................. 10

Tabela I.2 – Aplicações de CNPs em detecção de sais inorgânicos. Adaptado de [43]. .................... 16

Tabela I.3 – Aplicações de CNPs para detectar moléculas biológicas e orgânicas. Adaptado

de [43]. ..................................................................................................................................... 16

Tabela II.1 – Tabela dos reagentes usados em síntese. ..................................................................... 17

Tabela II.2 – Condições em sínteses hidrotérmicas. ......................................................................... 19

Tabela II.3 – Parâmetros na produção de CNPs a partir da carbonização de cortiça. ........................ 20

Tabela II.4 – Concentrações usadas em espectroscopia de absorção e espectroscopia de

fluorescência. ........................................................................................................................... 21

Tabela III.1 – Resultados de reacções hidrotérmicas. ....................................................................... 29

Tabela III.2 – Resultados das carbonizações. (a)

Calculado com base na massa medida depois da

secagem de uma alíquota de 5ml. ............................................................................................. 30

Tabela III.3 – Concentrações aparentes das soluções de CNPs obtidas por carbonização de

cortiça. ...................................................................................................................................... 31

Tabela III.4 – Técnicas de caracterização utilizadas (FS=Espectroscopia de fluorescência; S=Sim;

N = Não; S.S. = Sem Sinal). ..................................................................................................... 32

Tabela III.5 – Parâmetros espectroscópicos de emissão das CNPs obtidas por síntese

hidrotérmica. ............................................................................................................................ 38

Tabela III.6 – Parâmetros espectroscópicos de emissão das CNPs obtidas por carbonização

simples. .................................................................................................................................... 39

Tabela III.7 – Tamanhos de CNPs PVP............................................................................................ 43

Tabela III.8 – Tamanhos de CNPs G. ............................................................................................... 43

Tabela III.9 – Tamanhos de CNPs 260. ............................................................................................ 43

Tabela III.10 – Tamanhos de CNPs 300. .......................................................................................... 43

Tabela III.11 – Tamanhos de CNPs PVP. ......................................................................................... 44

Tabela III.12 – Tamanhos de CNPs CL. ........................................................................................... 44



xx


Tabela III.15 – Medições obtidas por DLS. ...................................................................................... 47

Tabela III.16 – Atribuição de picos a CNPs PVP. ............................................................................ 50

Tabela III.17 – Atribuição de picos a CNPs AC E............................................................................ 51

Tabela III.18 – Atribuição de picos a CNPs CL. .............................................................................. 52

Tabela III.19 – Atribuição de picos a CNPs 180. ............................................................................. 53

Tabela III.20 – Atribuição de picos a CNPs 260. ............................................................................. 54

Tabela III.21– Atribuição de picos a CNPs 300. .............................................................................. 55


xxi

Lista de abreviaturas e símbolos

1H-RMN Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão

CDO Comprimento de onda

CNPs Nanopartículas de carbono (do inglês, Carbon Nanoparticles)

DLS Dispersão dinâmica da luz (do inglês, Dynamic Light Scattering)

DRX Difracção por raios-X

Rendimento

FQY Rendimento quântico de fluorescência (do inglês, Fluorescence Quantum Yield)

FTIR Espectroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier (do inglês, Fourier

Transform Infrared spectroscopy)

FWHM Largura a meia altura (do ingles, Full Width at Half Maximum)

GFP Proteína fluorescente verde (do inglês, Green Fluorescent Protein)

IV Infravermelho

λem Comprimento de onda de emissão

λex Comprimento de onda de excitação

MF Microscopia de fluorescência

NP Nanopartícula

NDO Número de onda

PBS Phosphate Buffered Saline

QDs Pontos quânticos (do inglês, Quantum Dots)

Rh Raio hidrodinâmico

S0 Estado electrónico fundamental

S1 Primeiro estado electrónico excitado

SEM Microscopia electrónica de varrimento (do inglês, Scanning Electron Microscopy)


xxii

TEM Microscopia electrónica de transmissão (do inglês, Transmission Electron

Microscopy)

u.a. Unidades de absorvância

UV Ultravioleta

UV-Vis Ultravioleta-Visível

Capítulo I – Enquadramento teórico

1


I.1 Introdução ao tema

Actualmente a técnica de microscopia de fluorescência (MF) é amplamente usada em

investigação clínica e biomédica. O propósito da imagiologia por fluorescência é evidenciar células,

estruturas celulares ou biomoléculas que, de outra forma, não seriam detectáveis por serem

translúcidas ou de dimensões para lá do limite da difracção da luz. Por intermédio da MF é possível

obter imagens de elevado contraste e desta forma estudar estruturas e processos bioquímicos. A MF

requer o uso de marcadores fluorescentes e, actualmente, existe um vasto leque de marcadores

disponíveis. Muitos destes são específicos a estruturas celulares ou biomoléculas funcionais.

Os fluoróforos orgânicos são o actual estado da arte para marcação por fluorescência mas

apresentam limitações, especialmente ao nível da sua foto-estabilidade, toxicidade e por serem

dispendiosos. As nanopartículas (NPs) fluorescentes são uma classe de marcadores bastante recente

e fascinante. NPs como os quantum dots (QDs) apresentam propriedades ópticas extraordinárias:

são extremamente emissivas e foto-estáveis. No entanto, por possuírem metais pesados no seu

núcleo, nomeadamente cádmio, apresentam o risco da toxicidade inerente a estes metais.

As nanopartículas de carbono (CNPs) são uma das mais recentes classes de NPs

fluorescentes. Estas NPs rapidamente geraram interesse devido à semelhança das suas propriedades

ópticas com as dos QDs, com vantagem de anular a toxicidade dos metais pesados. Com efeito estas

NPs apresentam-se como marcadores biocompatíveis de elevada solubilidade em meio aquoso. Essa

solubilidade confere-lhes a oportunidade de aplicação em meio fisiológico. A possibilidade de

utilização de métodos de síntese simples e moléculas precursoras de baixo custo na produção destas

NPs pode torná-las candidatas ideais para a marcação celular e para aplicações biossensoriais.

O desenvolvimento de métodos simples e económicos de síntese de marcadores

fluorescentes é de todo o interesse em ciências biomédicas. O objectivo desta tese é a síntese de

CNPs por métodos simples, a sua caracterização espectroscópica, morfológica e estrutural, a sua

aplicação in vitro para marcação celular e visualização com um microscópio de epifluorescência.

I.2 Fluorescência

I.2.1 Conceito

A luminescência é um fenómeno óptico que ocorre quando um átomo, molécula ou

nanoestrutura emite luz num comprimento de onda (CDO) característico após ter sido promovido a

um estado electrónico excitado [1]. A transição para um estado electrónico de maior energia requer

absorção de energia proveniente de uma fonte externa por parte da matéria [2]. Geralmente a

transição para estados electrónicos mais elevados é fruto da absorção de fotões incidentes na matéria


2

mas existem outras vias de excitação electrónica tais como transições consequentes de reacções

químicas, bombardeamento com electrões, etc. A emissão de luz por fluorescência é a transição

radiativa resultante da relaxação electrónica para um nível de menor energia com a mesma

multiplicidade que é mais estável.

A relaxação electrónica pode dar-se por fluorescência e por outros processos concorrentes.

A fluorescência, fosforescência e fluorescência retardada são transições radiativas de relaxação.

Adicionalmente a relaxação pode dar-se por transições não radiativas tais como conversão interna,

transferência electrónica, transferência protónica, alterações conformacionais, transferências de

cargas intramoleculares, transferência de energia para moléculas do meio, entre outras [3]. A

fluorescência é um fenómeno probabilístico (tal como as outras vias de de-excitação electrónica) e,

portanto, está dependente de diversos parâmetros ambientais e da molécula ou estrutura em questão.

I.2.2 Princípio físico

Para compreender a fluorescência é necessário compreender dois fenómenos físicos

distintos: a absorção de energia pela matéria e consequente relaxação. Vamos examinar apenas o

caso em que fotões são a fonte de energia externa, ou seja, a excitação por absorção de luz.

I.2.2.1 Absorção e excitação electrónica

A matéria pode ser excitada para um estado electrónico de energia superior ao absorver

fotões. A excitação electrónica só acontece se o quantum de energia do fotão, ou seja, se a energia

associada ao seu CDO for igual à diferença de energia entre os dois estados, uma vez que os níveis

de energia são quantizados. A absorção é um processo extremamente rápido (ordem do

femtossegundo) e, como resultado, ocorre a transição radiativa entre o nível electrónico inicial e

final [3] [4]. Também podem ocorrer transições vibrónicas como resultado da absorção de fotões.

À temperatura ambiente a grande maioria das moléculas encontra-se no estado vibracional

de energia mais baixa do estado electrónico fundamental (S0). As populações de moléculas nos

diferentes estados vibracionais seguem uma distribuição de Boltzmann [3]:

Equação I.1

em que e correspondem à população de moléculas no estados vibracional fundamental e n-

ésimo estado vibracional excitado respectivamente, é a diferença de energia entre estados,

corresponde à constante de Boltzmann e à temperatura.

Como consequência a probabilidade de ser excitada uma molécula no estado vibracional

fundamental como resultado da absorção de luz é maior que a de excitar uma molécula que se

encontre num estado vibracional excitado. A maioria das transições electrónicas que resultam da

absorção de fotões ocorrem do estado fundamental vibracional de S0 para um estado electrónico

excitado final (o estado final depende do quantum de energia associado ao fotão). Na grande maioria

das moléculas, a transição electrónica decorrente da absorção mais relevante para a fluorescência é

aquela que ocorre entre S0 e o primeiro estado electrónico excitado (S1). Existem excepções, como o


3

caso do azuleno em que a emissão de luz por

fluorescência se dá a partir do primeiro e segundo

estados electrónicos excitados simultaneamente [3].

A transição radiativa de S0 para S1 segue o

princípio de Franck-Condon: durante a transição

electrónica os núcleos das moléculas permanecem

estacionários uma vez que a transição é muito mais

rápida que as vibrações nucleares. O electrão é

promovido a S1 no nível vibracional cuja função de

onda mais se assemelhe àquela que possuía no

estado fundamental, ou seja, em que exista maior

sobreposição entre as funções de onda inicial e final.

De forma geral o nível vibracional final é um nível

vibracional excitado. Só após a transição electrónica há o reajuste das posições nucleares [2] [3] [5].

Na figura I.1 está ilustrada uma transição electrónica em que a energia potencial molecular é

aproximada por uma função potencial de Morse (uma aproximação adequada para muitos casos).

I.2.2.2 Relaxação electrónica e emissão de fluorescência

Uma molécula no estado S1 tem tendência a relaxar para S0 para que o sistema adopte uma

configuração de menor energia e mais estável. A fluorescência acontece quando a relaxação de S1

para S0 é uma transição radiativa [3] em que os tempos de vida dos estados excitados são curtos. A

de-excitação via fluorescência ocorre na ordem do nanossegundo. A relaxação para S0 é

caracterizada por um decaimento exponencial, semelhante ao decaimento radioactivo, e possui uma

constante de tempo τ respeitante ao tempo de vida do estado electrónico excitado [3].

Evidentemente, num cromóforo altamente fluorescente, a relaxação por emissão espontânea de um

fotão é o mecanismo dominante [5].

O diagrama de Jablonski, representado na figura

I.2, permite uma fácil compreensão das transições

electrónicas envolvidas nos processos de excitação e

relaxação. Facilmente se percebe que a fosforescência

se distingue da fluorescência por haver cruzamento

intersistemas (intersystem-crossing) para um estado

tripleto e a relaxação ocorrer a partir deste estado. Estas

relaxações são muito mais lentas e por isso são

caracterizadas por tempos de vida bem mais longos.

A fluorescência mais intensa ocorre a partir do

estado vibracional mais baixo de S1. Este princípio é

conhecido como regra de Kasha: como os estados

vibracionais de S1 têm energias próximas, ocorre

relaxação para o estado vibracional de mais baixa

energia de S1 por conversão interna [4]. Este fenómeno de conversão interna é extremamente rápido

(da ordem do femtossegundo) e precede, na maioria dos casos, a emissão de fluorescência daí a que

se observe o deslocamento para o vermelho da emissão relativamente à excitação na maioria das

Figura I.2 – Diagrama de Jablonski: excitação

e mecanismos de relaxação electrónica.

Figura I.1 – Transição electrónica mais

provável. Adaptado de [5].


4

moléculas. Em espectroscopia de fluorescência este deslocamento é designado por deslocamento de

Stokes. Na prática a detecção de espécies fluorescentes é mais simples quanto maior for o

deslocamento de Stokes [3]. Existem compostos em o CDO de emissão coincide com o de

excitação. Nestes casos a transição é electrónica pura [3].

I.3 O microscópio de fluorescência

I.3.1 Contextualização

A invenção do microscópio óptico foi um passo fundamental para a compreensão do mundo

microscópico na medida em que possibilita a visualização de detalhes em estruturas que não são

visíveis a olho nu. Como tal o microscópio tornou-se uma ferramenta chave em investigação clínica,

ciências da vida, engenharia e noutras áreas. Graças à microscopia consegue-se estudar e

compreender diversos fenómenos biológicos, bioquímicos e ambientais. A técnica de contraste de

fase revolucionou a microscopia óptica por possibilitar a aquisição imagens ricas em contraste, onde

é possível a visualização de estruturas translúcidas que são típicas em investigação biomédica [5].

Uma das ferramentas mais importantes em biociências é a MF sendo actualmente a técnica de

microscopia de contraste mais utilizada. As imagens de MF têm propriedades únicas que outras

técnicas de contraste não são capazes de exibir [5] [6].

As grandes vantagens que a MF tem sobre outras técnicas de microscopia são o excelente

contraste de imagem, grande sensibilidade, especificidade e selectividade. Nesta técnica, marcadores

fluorescentes são excitados por uma fonte de luz, relaxam e emitem luz no seu CDO característico.

As regiões da amostra onde os marcadores estão ligados sobressaem contra um plano de fundo

escuro com imenso contraste, o que possibilita a visualização de estruturas que, de outra forma não

seriam perceptíveis. Ao mesmo tempo, é possível estudar a funcionalidade de biomoléculas,

reacções enzimáticas, entre outras [2]. Esta é sem dúvida uma das grandes atracções desta técnica: é

exequível estudar o sinal de fluorescência em função dos parâmetros do meio in vitro ou in vivo em

tempo real [5]. As técnicas de MF de última geração são extremamente sensíveis e permitem

monitorizar biomoléculas individuais se estas estiverem marcadas adequadamente [7].

Figura I.3 – Células da aorta de ratinhos marcadas com fluoróforos orgânicos (A). Actina marcada com Alexa

Fluor 350 (azul), Tubulina marcada com Alexa Fluor 568 (vermelho) e DNA marcado com SYTOX Green.

Células HeLa marcadas com QDs (B). Tubulina marcada com QDot525 (verde), complexo de Golgi marcado

com QDot585 (amarelo) e histonas marcadas com QDot655 (vermelho). Adaptado [2].

A B


5

Os marcadores mais utilizados para obter imagens por fluorescência em MF são fluoróforos

orgânicos. Estes constituem o estado da arte na marcação mas existem outros disponíveis tais como

os QDs, nanopartículas de metais nobres, nanocristais de sílicio, entre outros [5] [6]. A figura I.3 é

ilustrativa da alta especificidade na marcação celular com fluoróforos orgânicos e QDs.

I.3.2 Fundamentos de microscopia de epifluorescência

Um MF tem de ser construído de maneira a permitir a separação efectiva da luz emitida por

fluorescência daquela que é emitida pela fonte. A luz emitida pela fonte é muito mais intensa que a

fluorescência que é emitida pela amostra e é por isso que a separação eficaz da luz da fonte da luz

de fluorescência é absolutamente necessária para a obtenção de imagens de elevado contraste [5].

Figura I.4 – Espectro de emissão de lâmpada de mercúrio (A) e montagem do bloco óptico num microscópio

de epifluorescência (B). Adaptado de [2].

Os MFs podem funcionar de acordo com o princípio de transmissão ou reflexão de luz (epi-

iluminação). As imagens formadas com base na epi-iluminação implicam menor perda de luz

excitatória e por isso, os MFs cujo arranjo óptico utiliza a luz reflectida são mais utilizados [2]. A

fonte de iluminação pode ser uma lâmpada de mercúrio ou lâmpadas de halogéneo muito intensas

[1] [5]. As lâmpadas de descarga de mercúrio emitem numa grande gama de CDOs (figura I.4 A) e

como são menos dispendiosas, são mais comuns. Existem outras fontes luminosas que são

adequadas para fluoróforos orgânicos específicos [2]. A epi-iluminação é conseguida graças ao

arranjo do espelho dicróico e dos filtros de excitação e emissão no bloco óptico (figura I.4 B) [2]. A

luz da fonte é filtrada pelo filtro de excitação para que apenas seja transmitida a banda de CDOs que

vão excitar o fluoróforo. O espelho dicróico está posicionado a 45° em relação ao feixe de luz

transmitida pelo filtro de excitação e reflecte o feixe na direcção da objectiva. As objectivas nos

microscópios de fluorescência têm elevada abertura numérica [5]. A luz reflectida excita a amostra

após passar a objectiva. Ao relaxar a amostra emite fluorescência. Os fotões emitidos atravessam a

objectiva e o espelho dicróico transmite a fluorescência. O filtro de emissão, por sua vez, impede a

passagem de qualquer luz excitatória residual [1] [2] [5]. A imagem de fluorescência é finalmente

formada na ocular. A emissão de fluorescência é quase sempre isotrópica, por isso apenas uma

pequena fracção de fluorescência chega à ocular. As imagens de epifluorescência possuem uma

percentagem considerável de fluorescência de fundo pois a eficácia dos filtros e do espelho dicróico

nunca é 100%. A deficiente preparação da amostra também poderá contribuir para a fluorescência

de fundo. A solução passa pelo uso de um conjunto de filtros adequados que eliminem ao máximo o

sinal de fluorescência de fundo [2].

A B


6

I.4 Marcadores fluorescentes

Células, organelos e biomoléculas podem possuir fluorescência intrínseca

(autofluorescência). Contudo, na grande maioria das estruturas de interesse em investigação clínica

e biomédica essa autofluorescência é não específica e fraca e são obtidas imagens com baixo

contraste. Actualmente existe uma vasta gama de marcadores fluorescentes de elevada

especificidade e selectividade no mercado. Graças a estes marcadores é possível estudar estruturas e

acompanhar fenómenos bioquímicos [5]. As propriedades ópticas e físico-químicas são

extremamente importantes no que diz respeito à escolha do marcador ideal para imagiologia ou

aplicações analíticas.

Os marcadores fluorescentes podem apresentar as mais variadas composições químicas e

estruturais. Podemos agrupá-los em três categorias distintas: fluoróforos orgânicos, NPs

fluorescentes e proteínas e péptidos fluorescentes.

I.4.1 Fluoróforos orgânicos

Os fluoróforos orgânicos são moléculas orgânicas geralmente constituídas por vários anéis

aromáticos (ver figura I.5). A massa molecular dos fluoróforos pode divergir bastante mas, em

geral, são moléculas de dimensões inferiores a 0,5nm [5]. Os fluoróforos actualmente disponíveis

cobrem uma vasta gama de CDOs, desde o ultravioleta (UV) próximo ao infravermelho (IV)

próximo. Podem formar ligações covalentes ou não-covalentes com o espécimen a analisar e podem

ainda ser conjugados com outros marcadores (outros fluoróforos, NPs ou proteínas fluorescentes) ou

com pequenas moléculas (aminoácidos, açucares) para formar complexos altamente específicos e

selectivos [8]. A formação destes complexos pode resultar numa maior estabilidade química, no

aumento de intensidade de fluorescência e/ou deslocamento do CDO de emissão [4] [5] [8].

Figura I.5 – Estrutura química da rodamina B (A), fluoresceína (B) e azul do

nilo (C). Estruturas desenhadas com o software ChemDraw.

Os fluoróforos orgânicos podem ser agrupados em famílias químicas: rodaminas, cianinas,

fluoresceínas, oxazinas, esquarinas, derivados de naftaleno, antraceno, heterocíclicos azotados,

sulfonados, oxigenados, etc. [8]. A possibilidade de usar mais do que um fluoróforo

simultaneamente permite adquirir imagens multicoloridas. Cada fluoróforo liga-se à molécula a que

tem afinidade e emite no seu CDO característico (ver figura I.3 A).

Apesar de constituírem o estado da arte em marcação fluorescente, os fluoróforos orgânicos

têm algumas limitações. Destas destacam-se a sua tendência para degradação com a luz

(photobleaching), baixa solubilidade em meio aquoso e frágil estabilidade química. O

desenvolvimento de fluoróforos orgânicos de CDOs de excitação no IV próximo com rendimentos

A B C


7

quânticos de fluorescência (FQY) elavados é ainda um desafio. A carência de marcadores com estas

características é uma lacuna bastante relevante já que estes são de extrema importância para

investigação in vivo [8].

I.4.2 Proteínas e péptidos fluorescentes

A descoberta de proteínas fluorescentes naturais, como a Green Fluorescent Protein (GFP),

foi um marco que impulsionou importantes progressos em MF e no desenvolvimento de técnicas de

correlação analíticas que são de importância capital no estudo de processos bioquímicos

intracelulares e em vários sinais biológicos complexos [2] [9]. Actualmente existe uma panóplia de

proteínas fluorescentes derivadas da GFP. A síntese de proteínas derivadas da GFP é exequível

graças a possibilidade de se alterar a codificação genética durante a replicação através de processos

mutagénicos. Ao alterar a sua sequência de aminoácidos é possível conjugar a proteína com

virtualmente qualquer biomolécula que se pretenda estudar. Isto confere a estas proteínas uma

enorme versatilidade. Além disso a modificação genética permite também alterar as propriedades

ópticas da proteína fluorescente, nomeadamente para manipulação dos seus CDOs máximos de

absorção e emissão.

Actualmente as proteínas fluorescentes abrangem uma vasta gama do espectro visível

possibilitando a obtenção de sinais multicor fazendo uso de mais que uma proteína na marcação [9]

[10]. Este tipo de proteínas pode ser expresso em praticamente todos os tipos de células [10]. Além

da GFP e das suas derivadas, existem outras proteínas fluorescentes expressas na natureza,

nomeadamente em organismos marinhos e respectivas proteínas derivadas da manipulação genética.

A estrutura molecular das proteínas fluorescentes é essencialmente a mesma: conformação

em barril β no interior do qual existe um cromóforo fortemente fluorescente formado através de

autocatálise, sem necessidade de quaisquer cofactores ou enzimas [10]. Como são moléculas

biológicas, são intrinsecamente biocompatíveis.

As principais aplicações destas proteínas incluem a determinação da expressão genética,

monitorização de proteínas, etiquetagem de compartimentos celulares, biossensores, monitorização

de funcionalidades bioquímicas em proteínas e marcação para visualização em microscopia de super

resolução [10]. No entanto as aplicações das proteínas fluorescentes estão condicionadas por

algumas limitações nomeadamente ao nível da foto-estabilidade, rendimentos quânticos de

fluorescência (FQY) relativamente baixos e fraca eficácia de emissão no vermelho [2].

I.4.3 Nanopartículas fluorescentes

Os avanços recentes na disciplina dos nanomateriais permitiram o design de nanoestruturas

para uma grande variedade de aplicações. Os materiais à escala nanométrica ostentam propriedades

ópticas, electrónicas, físicas e químicas completamente diferentes em relação a macroestruturas. As

NPs fluorescentes são NPs puramente sintéticas, geralmente de simetria esférica, e exibem

propriedades ópticas e químicas excepcionais. Na passada década foram alvo de investigação e

desenvolvimento intensivo. As NPs fluorescentes podem ter estruturas bastante diversas. Os

tradicionais nanocristais semi-conductores (QDs), NPs metálicas, nanocristais de silício são as NPs

fluorescentes mais conhecidas e estudadas e, também, com maior número de aplicações [11]. Face


8

aos fluoróforos orgânicos apresentam algumas vantagens essenciais como maior foto-estabilidade,

capacidade superior para congregar diferentes sinais (multiplexing), maior gama de absorção e

maior biocompatibilidade em relação a determinados fluoróforos orgânicos [11].

Aplicações em bioimagiologia, nanossensores e optoelectrónica demonstraram ser bem-

sucedidas mas apesar disso o potencial destas NPs permanece bastante inexplorado. Em seguida

apresenta-se uma breve revisão nos principais tipos de NPs fluorescentes com excepção das CNPs,

objecto de trabalho desta dissertação, cuja revisão é feita com maior detalhe no subcapítulo I.5.

I.4.3.1 Quantum Dots

Os QDs são nanocristais semi-conductores altamente fluorescentes. De forma genérica, a

estrutura dos QDs compreende um núcleo metálico nanocristalino semi-conductor, geralmente de

CdTe ou CdSe, revestido por uma camada semi-conductora, geralmente ZnO ou ZnS. O

revestimento permite o aperfeiçoamento das propriedades ópticas e da estabilidade coloidal dos

QDs. Adicionalmente o revestimento pode ser manipulado para funcionalizar a superfície das NPs

com vista ao aumento da estabilidade em solução aquosa, ou para conjugação com moléculas

específicas (ver figura I.3 B) [12]. Estas NPs apresentam tamanhos típicos de 1-10nm e possuem

uma grande resistência ao photobleaching [12] [13].

A emissão de fluorescência por parte dos QDs resulta de um efeito de confinamento

quântico. O efeito de confinamento quântico ocorre quando o diâmetro de um nanomaterial semi-

condutor é comparável ao CDO da função de onda electrónica. Quando tal acontece o espectro de

energia torna-se discreto e as diferenças de energia entre estados tornam-se dependentes do tamanho

das NPs [14]. O efeito de confinamento quântico dos QDs cobre todo o espectro visível. Graças a

este efeito é possível controlar o CDO de emissão através da manipulação dos parâmetros de síntese

de forma a controlar o tamanho dos QDs (ver figura I.6).

Figura I.6 – Soluções de QDs à luz UV. QDs com tamanhos mais pequenos

correspondem a deslocamento da emissão para o azul. Adaptado de [13].

O facto de os QDs terem bandas de emissão ajustáveis com o tamanho e de estas bandas

serem bastante simétricas e estreitas, acoplado à larga banda de absorção, confere-lhes uma

vantagem significativa face a outros marcadores fluorescentes. Além disso a funcionalização da

superfície dota os QDs de uma maior estabilidade química face aos fluoróforos orgânicos [15].

Contudo, por conterem na sua constituição metais pesados como o Cd, a aplicação de QDs em

sistemas biológicos está fortemente condicionada. Com efeito, a libertação de iões Cd2+

resulta na

elevada citotoxicidade associada a estas NPs [11].


9

I.4.3.2 Nanopartículas metálicas fluorescentes

Uma alternativa viável aos QDs são as NPs metálicas fluorescentes. São constituídas por

metais nobres como Au ou Ag, de baixa reactividade, e portanto não possuem o risco da toxicidade

que geralmente é associada a metais pesados [11]. A síntese destas NPs passa por um passo de

nucleação e por um passo de estabilização com um scaffold orgânico. Esta estabilização é essencial

para evitar a formação de grandes agregados e garantir a sua estabilidade coloidal [16].

A fluorescência das nanopartículas metálicas é resultado da relaxação de ressonâncias

plasmónicas em defeitos da superfície [5] [11].

As NPs metálicas fluorescentes exibem dimensões reduzidas e boa biocompatibilidade.

Como tal podem ser usadas para marcação de tecidos biológicos e devido ao seu comportamento

fotoquímico, estas NPs apresentam-se como boas candidatas para aplicações biossensoriais in vivo

[11]. A funcionalização da superfície destas NPs promove a sua especificidade de marcação. Ainda

assim subsistem alguns problemas ao nível da foto-estabilidade [5].

I.4.3.3 Nanocristais de Silício

O Silício (Si) é um material semi-conductor com banda de valência com um carácter

indirecto. Este material exibe uma performance óptica fraca. As NPs de Si só foram alvo de intensa

investigação quando foi descoberta a emissão de fluorescência no vermelho em silício poroso.

Os nanocristais de Si ostentam três bandas distintas de emissão: no IV, no vermelho e no

azul. A existência de radicais livres na banda de valência é responsável pela emissão no IV. Quanto

à emissão no vermelho e no azul é provável que a explicação resida num efeito de confinamento

quântico, semelhante ao dos QDs, e na recombinação radiativa em defeitos de superfície [17].

A morfologia da superfície dos nanocristais de Si afecta fortemente a fluorescência. A

fluorescência dos nanocristais de Si também é afectada pela composição molecular da superfície.

Além disso estas NPs apresentam comportamentos de emissão dependente do tamanho do

nanocristal. Isto suporta a teoria da existência de dois mecanismos distintos de fluorescência nos

nanocristais de Si. O efeito de confinamento quântico é particularmente intenso quando as NPs são

de tamanho inferior a 4nm.

Os protocolos disponíveis para síntese de NPs de Si são numerosos e podem ser top-down

ou bottom-up [17]. Os procedimentos de síntese em solução permitem um bom controlo do tamanho

dos nanocristais e maior facilidade em manipular a superfície dos nanocristais [18]. A

funcionalização da superfície é de grande importância para garantir a estabilidade coloidal [19]. As

NPs de Si têm dimensões, geralmente, inferiores a 10nm [18] [19]. A elevada biocompatibilidade

que demonstram [5] permite a sua aplicação em áreas como a medicina e biologia mas também

podem ser utilizadas em optoelectrónica e fotónica [19].

I.4.4 Propriedades espectroscópicas e físico-químicas

As diferentes categorias de marcadores fluorescentes exibem algumas propriedades

espectroscópicas, físicas e químicas distintas. Além disso certas propriedades podem variar bastante


10

dentro da própria categoria. A tabela I.1 permite a comparação de algumas destas propriedades entre

os marcadores fluorescentes mais comuns.

Tabela I.1 – Comparação de características entre marcadores. Adaptado de [5].

Propriedade Fluoróforos orgânicos Quantum Dots Proteínas

fluorescentes

Espectro de absorção Bandas discretas Contínuo (UV-Vis) Bandas discretas

Absortividade molar

(M-1

cm-1

) 10

4 – 10

5 10

5 – 10

6 10

4 – 10

5

Espectro de emissão Assimétrico com extensão

para IV Simétrico e estreito

Assimétrico com

extensão para IV

Pico de emissão UV – IV próximo Visível – IV próximo Visível

Stokes shift (nm) Menor que 50 Até 100 10 – 50

Rendimento quântico

de fluorescência (%)

50 – 100 (visível)

5 – 25 (IV próximo)

10 – 80 (visível)

20 – 70 (IV próximo) 5 – 80 (visível)

Foto-estabilidade ++ +++++ ++

Tempos de vida (ns) 1 – 10 10 – 100 1 – 10

Condicionantes pH, polaridade - pH, solvente

Solubilidade em água Dependente de grupos

funcionais

Requer modificação

da superfície Sim

Dimensões (nm) Dimensões moleculares

(Rh≈0,5) 2 - 60 ≈ 3

Ligação biomolecular Conjugação química Conjugação química Fusão

Citotoxicidade ++/+++++ +++++ +

I.5 Nanopartículas de carbono

I.5.1 Introdução

O carbono é vulgarmente conhecido como um material negro e até há pouco tempo era

inconcebível considera-lo um material luminescente e solúvel em água. No entanto, estas

considerações são válidas apenas à escala macroscópica, já que à escala nano, as estruturas de

carbono apresentam propriedades consideravelmente diferentes. As CNPs são uma nova classe de

NPs fluorescentes descobertas por acaso aquando da purificação de nanotubos de carbono por

electroforese em 2004 [20] [21].

A família dos nanocarbonos é constituída pelos fulerenos, nanotubos de carbono, nanofibras

de carbono, nanodiamantes, grafeno e, mais recentemente, pelas CNPs. As CNPs têm gerado muito

interesse devido às suas notáveis propriedades ópticas, excelente solubilidade aquosa, estabilidade

química, baixa toxicidade e facilidade de funcionalização da superfície. Enquanto a composição de

outras nanoestruturas de carbono é quase exclusivamente carbono, a composição química das CNPs

é maioritariamente carbono, mas a percentagem em carbono pode variar bastante [21] [22].


11

O carbono é um elemento não tóxico por excelência. A resposta não tóxica do carbono

aliada às interessantes propriedades ópticas e elevada solubilidade das CNPs, motivaram o estudo de

diversas vias para a sua síntese. Embora as aplicações das CNPs ainda sejam reduzidas, o potencial

destas NPs fluorescentes é imenso e aplicações em bioimagiologia, nanossensores, optoelectrónica e

foto-catálise já foram demonstradas [11] [21] [22]. Neste subcapítulo é feita a revisão para CNPs

que são solúveis em água e adequadas para estudo de sistemas vivos.

I.5.2 Métodos de síntese de nanopartículas de carbono

As estratégias de síntese de CNPs podem ser divididas em dois tipos: métodos top-down e

métodos bottom-up. Procedimentos top-down são actualmente o estado da arte na produção de CNPs

[23]. Os procedimentos top-down consistem em produzir CNPs através da quebra de estruturas de

carbono de grandes dimensões [22]. Entre estes métodos destacam-se a ablação a laser [24] [25],

oxidação electroquímica [26], oxidação química [27] e descarga eléctrica [20]. Com métodos

bottom-up, as CNPs são criadas a partir de precursores com alto teor em carbono. Os procedimentos

de síntese bottom-up consistem em carbonizações [28], métodos solvotérmicos (hidrotérmicos ou

com solventes orgânicos) [29] [30], irradiação com micro-ondas [23] e síntese por ultrassons [31].

Os métodos top-down necessitam de condições de produção complexas e materiais

dispendiosos. Por esse motivo os procedimentos bottom-up, mais simples e económicos, têm vindo a

ser alvo de crescente interesse e têm apresentado resultados muito promissores. Os procedimentos

são complementados com métodos de purificação tais como, filtração, centrifugação, diálise e

electroforese [22].

Algumas CNPs produzidas por métodos top-down possuem fraca fluorescência e fraca

estabilidade coloidal. Nestes casos há necessidade de efectuar um procedimento de passivação da

superfície das NPs. A passivação pode ser feita mediante oxidação química com agentes altamente

oxidantes, como ácido nítrico, para criar grupos hidroxilo, carboxilo e carbonilo à superfície, ou por

fixação de polímeros orgânicos à superfície (figura I.7), como o polietilenoglicol (PEG) [21] [22]. O

procedimento de passivação não só melhora a intensidade de fluorescência como, diminuindo a

agregação, aumenta a estabilidade das NPs em solução [32]. Em procedimentos bottom-up, as CNPs

não precisam de qualquer passo de passivação adicional pois o próprio processo de síntese induz a

passivação da superfície com grupos funcionais [22]. No entanto o passo de passivação não é bem

compreendido. A necessidade de passivação parece depender do método de síntese usado [22].

Figura I.7 – Ilustração de CNPs com superfície passivada com grupos oxigenados (esquerda) e

com superfície passivada com moléculas orgânicas (direita). Adaptado de [22].


12

As CNPs passivadas podem ser sujeitas à funcionalização da sua superfície para as dotar de

especificidade em ligação química. A funcionalização pode ser feita com pequenas moléculas

orgânicas como péptidos e pequenos oligómeros ou macromoléculas como polímeros ou proteínas

de forma a permitir a conjugação das CNPs com biomoléculas específicas. Genericamente os

procedimentos de passivação e funcionalização das CNPs são simples e directos [33] [34].

I.5.3 Mecanismo de fluorescência das nanopartículas de carbono

O mecanismo responsável pela fluorescência das CNPs não está ainda devidamente

compreendido. Como tal foram propostas algumas teorias para explicar a fluorescência destas NPs.

Alguns autores propõem uma abordagem ao mecanismo de fluorescência com base em fenómenos

de confinamento quântico e recombinação radiativa de excitões1. O efeito de confinamento quântico

é o mecanismo dominante na fluorescência dos QDs. A fluorescência das NPs de Si é atribuída a

uma combinação de confinamento quântico e recombinação radiativa. Estas teorias aplicadas às

CNPs assentam no facto das CNPs possuírem emissão dependente do tamanho [22] [35].

No entanto, os mecanismos de confinamento quântico e recombinação radiativa de excitões

explicam a fluorescência em materiais semi-condutores. Nanoestruturas grafíticas tais como

nanotubos de carbono curtos e CNPs sintetizados a partir de grafite são fluorescentes. O carbono

grafítico é condutor eléctrico e não possui banda de valência como os semi-conductores. A

luminescência de nanoestruturas grafíticas não pode ser explicada por estas teorias [33].

Alternativamente foi sugerida uma teoria em que a luminescência assenta em defeitos de

superfície das NPs. A passivação com grupos funcionais à superfície suporta esta teoria uma vez que

a fluorescência de CNPs cuja superfície não está devidamente passivada, como as produzidas por

técnicas top-down, é claramente mais fraca [32]. A presença de grupos funcionais à superfície

parece ser uma condição necessária para a fluorescência das CNPs já que a fluorescência é

fortemente afectada pelo pH do meio. Por exemplo, a intensidade da fluorescência é condicionada

pela ionização dos grupos funcionais à superfície das NPs resultante de pH extremos [33].

Adicionalmente, as CNPs formam complexos estáveis entre os grupos funcionais da

superfície e iões metálicos. A formação destes complexos é evidência do duplo carácter receptor e

dador de electrões das CNPs. A criação destes complexos afecta expressivamente a intensidade da

fluorescência das NPs [33]. Esta dependência da fluorescência com a formação de complexos na

superfície também reforça a teoria baseada em defeitos de superfície.

I.5.4 Propriedades das nanopartículas de carbono

Existem algumas características partilhadas entre as CNPs e outras NPs. Contudo, para além

dessas características, as CNPs possuem outras propriedades que lhes são intrínsecas e que podem

ser vantagens determinantes sobre outros marcadores. Seguidamente apresenta-se uma breve revisão

das propriedades das CNPs.

1 Um excitão é uma quasi-partícula formada pelo estado ligado entre um electrão e o poço electrónico através

de interacção Coulombiana.


13

I.5.4.1 Propriedades físico-químicas

As CNPs apresentam uma solubilidade em meio aquoso superior à de outras NPs

fluorescentes. A presença de grupos carregados na superfície das NPs passivadas controla a

agregação e está na origem da solubilidade [22]. O armazenamento em solução durante um ano sem

formação de precipitados é prova da excelente solubilidade das CNPs [21]. A solubilidade em meio

aquoso permite a aplicação das CNPs em meio fisiológico [21] e os procedimentos de

funcionalização da superfície tornam possíveis conjugações com biomoléculas. Adicionalmente a

composição química na superfície das NPs é de grande importância para sua internalização através

de interacções com grupos carregados na membrana [36]. A solubilização das CNPs em diversos

solventes orgânicos também é possível, dotando estas NPs de grande versatilidade.

As CNPs são NPs de simetria esférica ou quase esférica. Tipicamente possuem dimensões

abaixo dos 10nm mas podem chegar até 100nm [22] [30]. A dimensão e forma são parâmetros

particularmente importantes no que toca à internalização celular. CNPs com diâmetros mais

pequenos e formas esféricas são mais facilmente internalizadas. Na literatura existem poucos

estudos referentes ao controlo do tamanho e forma destas NPs com as condições experimentais

apesar da importância destes parâmetros [21].

Relativamente à organização estrutural, as CNPs podem ser amorfas ou nanocristalinas. A

estrutura depende do precursor usado e da forma como ficam organizadas as estruturas aromáticas e

alifáticas após a síntese.

A baixa toxicidade manifestada pelas CNPs é uma das suas grandes valências. A reduzida

toxicidade está relacionada com a sua fraca reactividade química [21]. Apesar de existirem poucos

estudos referentes à citotoxicidade, as raras menções a decréscimos significativos na viabilidade

celular são apenas referentes a concentrações de CNPs extremamente elevadas. Em caso de

funcionalização da superfície das NPs a toxicidade passa a ser dependente da molécula usada [37].

A baixa citotoxicidade que as CNPs apresentam dotam estas NPs de excelente biocompatibilidade

sendo por isso candidatas ideais para utilização in vitro e in vivo.

I.5.4.2 Propriedades espectroscópicas

O perfil de absorção das CNPs é particularmente intenso no UV, decaindo gradualmente à

medida que se desloca para o vermelho. A absorção a maiores CDOs pode ser estendida através da

funcionalização da superfície [21]. Por vezes os espectros de absorção apresentam picos no UV e

ombros a CDOs mais longos. Os picos no UV são atribuídos a transições π-π* envolvendo ligações

aromáticas C=C. Ombros são originados por transições n-π* em ligações C=O [38].

Independentemente do mecanismo de fluorescência das CNPs não estar estabelecido, existe

unanimidade no reconhecimento de que os espectros de emissão de fluorescência são uma das suas

características mais fascinantes. Os espectros de emissão são consideravelmente largos e

assimétricos a alongar para o vermelho, contrariamente à elevada simetria e diminuta largura a meia

altura (FWHM) exibida nos espectros de emissão dos QDs. No entanto as CNPs partilham com os

QDs a fascinante característica de dependência da emissão com o CDO de excitação e tamanho das

NPs [21] [22] [33]. A elevada FWHM do espectro de fluorescência das CNPs pode ser explicada

pela heterogeneidade da superfície das NPs. A presença de estados electrónicos próximos do nível

de Fermi em defeitos de superfície nas NPs pode estar na origem da dependência dos picos de


14

emissão com o CDO de excitação [33]. Em relação à dependência da fluorescência com o tamanho

das NPs mencionada em algumas publicações não está estabelecida nenhuma teoria que explique o

fenómeno. A manipulação da estrutura química na superfície permite alterar propriedades

espectroscópicas das CNPs ao nível da intensidade da fluorescência e/ou do CDO de emissão [37].

O FQY é um parâmetro de especial importância em imagiologia na medida que em afecta

profundamente o contraste de imagem. Os FQYs das CNPs podem variar bastante. Os métodos de

síntese e o precursores utilizados influenciam fortemente este parâmetro espectroscópico [21]. Na

grande maioria dos casos o FQY das CNPs é inferior a 15% [37]. A passivação da superfície das

CNPs, quer seja feita indirectamente no procedimento de síntese, quer seja obtida por um passo

adicional, aparenta ser um requisito necessário para a obtenção de NPs fluorescentes e, portanto,

está directamente relacionado com o FQY das CNPs. Relatos na literatura reportam FQYs destas

NPs tão elevados quanto 78% [37].

Os tempos de vida de estados excitados apresentam curvas de decaimento multi-exponencial,

característica partilhada com os QDs [11]. A existência de regiões emissivas distintas na superfície

das CNPs deverá estar na origem desta natureza multi-exponencial nas curvas de decaimento [21].

Os tempos de vida médios são da ordem do nanosegundo [21] [22].

As CNPs são dotadas de grande foto-estabilidade. Tal como os QDs, são extremamente

resistentes ao photobleaching e portanto claramente superiores aos fluoróforos orgânicos e às

proteínas fluorescentes neste aspecto. Mesmo quando são sujeitas a longos períodos de irradiação,

as perdas de intensidade de fluorescência são negligenciáveis [21] [30]. Além disso após longos

períodos de armazenamento em solução, as CNPs mantêm as suas propriedades luminescentes

inalteradas [22].

A possibilidade de up-conversion é uma característica óptica interessante que é atribuída às

CNPs em alguns trabalhos. Resumidamente, o mecanismo de up-conversion consiste na excitação

por dois fotões de CDO elevado, geralmente no IV próximo, e emissão de um fotão de maior

energia (dobro da frequência correspondente à frequência de excitação). A importância deste

mecanismo é imensa para aplicações biológicas já que os fotões de maior CDO não só penetram

mais profundamente nos tecidos, como também são menos prejudiciais por implicarem menor

deposição de energia nos tecidos [21]. No entanto, há alguma controvérsia acerca da veracidade da

existência deste fenómeno óptico nas CNPs. Recentemente, a up-conversion relatada foi atribuída à

difracção de segunda ordem gerada na rede de difracção do monocromador aquando da incidência

de luz [38]. Apesar disso o fenómeno de up-conversion parece ser notório em [39]. Neste trabalho

os autores estabelecem uma relação quadrática entre a intensidade de fluorescência com a

intensidade de excitação. Existem poucos estudos acerca do processo de up-conversion em CNPs e,

sem dúvida, é um fenómeno merecedor de maior atenção.

I.5.5 Aplicações das nanopartículas de carbono

Graças às extraordinárias propriedades ópticas que possuem, as CNPs são boas candidatas

para aplicações em diversas áreas tais como nanossensores, optoelectrónica, imagiologia para

investigação biomédica, foto-catálise, entre outras. Por serem uma descoberta recente, estudos que

envolvem aplicações concretas destas NPs ainda são bastante escassos. Apresenta-se em seguida

uma curta síntese de algumas aplicações bioanalíticas e de bioimagem.


15

I.5.5.1 Bioimagiologia

As extraordinárias propriedades ópticas e biocompatibilidade apresentadas pelas CNPs

fazem destas NPs fluorescentes promissoras candidatas para estudos biológicos in vitro e in vivo.

Apesar disso, estudos biológicos que fazem uso destas NPs fluorescentes ainda são reduzidos.

A marcação de células com CNPs já foi demonstrada para várias linhas de células

eucarióticas. A marcação com CNPs em bactérias Escherichia coli indicia também a possibilidade

de marcação de organismos procarióticos [33]. Pensa-se que a internalização das NPs ocorra por via

endocítica. Neste processo as CNPs são envolvidas por uma secção da membrana plasmática e

atravessam a membrana através da vesícula formada pela secção de membrana. Desta forma são

lançadas no meio intracelular. É um processo que pode ser mediado por uma proteína ou outra

biomolécula de função estrutural mas que carece de maior estudo [22]. Na vasta maioria da

literatura, as CNPs têm a superfície passivada e não funcionalizada, pelo que não são dotadas de

especificidade bioquímica e, portanto, as CNPs concentram-se preferencialmente no citoplasma

(figura I.8) [22] [33] [40]. Os testes de citotoxicidade mencionados na literatura relatam elevadas

taxas de viabilidade celular mesmo a concentrações elevadas [21]. Um estudo chega mesmo a referir

84% de viabilidade celular a 6mg/ml [41].

Até à data estudos in vivo que utilizam CNPs para entender sistemas biológicos são muito

raros. Num dos estudos mais completos é referida a aplicação das CNPs e nanocompósitos de

carbono e sulfureto de zinco em ratinhos DBA/1. As NPs foram introduzidas por via subcutânea,

intradérmica e intravenosa. A difusão das CNPs inseridas por injecção subcutânea no dorso foi

relativamente baixa, comparativamente com a difusão de QDs, possivelmente devido à passivação

da superfície com PEG1500N. Os nanocompósitos de carbono e sulfureto de zinco foram inseridos por

via intradérmica e migraram para os nodos axilares linfáticos e, graças à fluorescência, a sua

migração foi acompanhada em tempo real. Para o estudo do sistema circulatório, foi inserida uma

solução de CNPs por via intravenosa mas foram observadas apenas emissões na bexiga, onde as

CNPs se acumularam e foram posteriormente expelidas (figura I.9) [42]. O estudo demonstra o

enorme potencial para a utilização das CNPs como agentes de imagem para tecidos in vivo fazendo-

se valer da enorme biocompatibilidade e forte fluorescência destas NPs.

Figura I.9 – Imagem in vivo de fluorescência de CNPs injectadas

por via intravenosa em ratinhos: a) imagem por contraste de fase;

b) imagem de fluorescência; c) imagem de intensidade de

fluorescência codificada por cores. Adaptado de [42].

Figura I.8 – Marcação com CNPs

produzidas por micro-ondas a partir de

glicerol e 4,7,10-trioxa-1,13-

tridecanediamina em células HepG-2.

Adaptado de [40].


16

I.5.5.2 Aplicações bioanalíticas

Aplicações de CNPs como nanossensores encontram-se numa fase muito precoce de

investigação. O princípio de detecção destes nanossensores é variação da intensidade ou do CDO da

fluorescência em função de alterações nos parâmetros do meio tais como variações de pH,

polaridade, presença de sais inorgânicos, presença de biomoléculas, etc. Graças à excelente

fluorescência, elevada afinidade e sensibilidade a moléculas orgânicas, inorgânicas e biomoléculas

estas NPs demonstram grande potencial como nanossensores químicos, bioquímicos, biológicos e

ambientais [43]. As tabelas I.2 e I.3 exibem os resultados de alguns estudos realizados para detecção

de iões inorgânicos e moléculas biológicas ou orgânicas:

Tabela I.2 – Aplicações de CNPs em detecção de sais inorgânicos. Adaptado de [43].

Ião inorgânico Limiar de detecção Comportamento linear Aplicação real

Hg2+

0,23nM 0,5-10nM Água de lago

Cu2+

13nM 0,001-0,1mM Células vivas

Fe3+

0,32μM 0-20μM Água

Ag+

500pM - Água de lago

Pb2+

5,5μM 0-6,0mM Água de lago

Sn2+

0,36μM 0-4,0mM Água de lago

Co2+

0,67nM 1,0-1000nM Células HepG2

I-

430nM 0,5-20μM Urina

F-

31nM 0,1-10μM Pasta de dentes

Tabela I.3 – Aplicações de CNPs para detectar moléculas biológicas e orgânicas. Adaptado de [43].

Molécula Limiar de detecção Comportamento linear Aplicação real

Trombina 5nM 0-120nM -

DNA 1nM 3-80nM -

Fosfatos 0,51pM 0,4-15nM Águas artificiais

Nitritos 0,53pM 0,1-10nM Leite, água

Peróxido de hidrogénio 0,4μM 1-100μM -

Glucose 45μM 2-18mM Soro sanguíneo humano

Ácido úrico - 0,1-1,8mM Urina humana

Dopamina 11,2nM 0,1-30μM Solução para injecção

Óxido nítrico (NO) 3nM - Células vivas

Sulfeto de hidrogénio 10nM - Células vivas

A complexidade dos nanossensores varia consideravelmente conforme o objectivo da

aplicação. Os nanossensores podem ser simplesmente CNPs sem qualquer modificação ou podem

ser estruturas híbridas de CNPs com outros marcadores e utilizados como sensores raciométricos

[43] [44]. O princípio de funcionamento destes nanossensores pode ser meramente a inibição ou

incremento da fluorescência por interacção com o alvo ou, como no caso dos sensores

raciométricos, através do princípio de transferência de energia por ressonância de fluorescência

(FRET) alterando dramaticamente o espectro de emissão.

Capítulo II – Parte experimental

17


II.1 Síntese

II.1.1 Preâmbulo

No início deste trabalho começou-se por produzir CNPs usando de métodos simples

mencionados na literatura com algumas optimizações ao nível dos passos de purificação. O

objectivo deste primeiro passo era a validação destes métodos de produção e a familiarização com

algumas técnicas de caracterização como a espectroscopia de absorção no UV-Vis, espectroscopia

de fluorescência e dispersão dinâmica da luz (DLS). Cumprida esta etapa, foi decidido produzir

CNPs a partir de poli(ácido acrílico) (PAA) por via hidrotérmica manipulando a temperatura e

tempo de reacção, e produção de CNPs a partir da carbonização de grãos de cortiça. Contudo, logo

no início da produção de CNPs com PAA, constatou-se que este apresentava o risco de alguma

citotoxicidade [37]. A citotoxicidade está associada a fracções residuais de polímero que se obtêm

no produto final e à possível passivação da superfície das CNPs com PAA. Como o objectivo deste

trabalho é a síntese de CNPs biocompatíveis para internalização celular, abandonou-se a produção

de CNPs a partir de PAA. Apostou-se então na produção de NPs a partir de cortiça. Para fazer um

estudo do efeito da variável temperatura, foram previamente realizados alguns ensaios para

averiguar o tempo para o qual, à temperatura mais baixa de síntese, era obtida uma carbonização

homogénea em toda a amostra.

II.1.2 Reagentes usados em síntese

Os reagentes utilizados nos métodos de produção foram fornecidos pela Sigma-Aldrich, J. T.

Baker e Alfa Aesar. Todos os reagentes foram usados tal como foram recebidos sem qualquer

purificação adicional. Foi usada água desionizada como solvente em todas as sínteses. As cascas de

laranja foram obtidas de laranjas compradas num mercado local. A cortiça em pó foi fornecida pela

corticeira Amorim (ver características no apêndice B).

Tabela II.1 – Tabela dos reagentes usados em síntese.

Nome Fórmula Massa molar

(g/ mol)

Grau de

pureza (%) Marca

Poli(ácido acrílico) 1800 - Sigma-Aldrich

Gelatina de pele de

bovino, tipo B - - - Sigma-Aldrich

Ácido cítrico

monohidratado 210,14 99,8 J.T. Baker

Etilenodiamina 60,10 ≥99 Sigma-Aldrich

Hemi-sulfato de

quinino hidratado 391,47 ≥98 Sigma-Aldrich

Polivinilpirrolidona 55000 - Sigma-Aldrich

Cascas de laranja - - - Mercado

Cortiça - - - Corticeira Amorim


18

II.1.3 Materiais usados em síntese

As sínteses hidrotérmicas foram

efectuadas num reactor de politetrafluoretileno

(teflon) revestido por uma câmara de aço

inoxidável com capacidade para

aproximadamente 150ml (figura II.1). As

carbonizações foram feitas num copo de vidro

pyrex ou num cadinho cerâmico de fundição.

Os materiais usados na purificação das

CNPs foram os seguintes: nas filtrações, foram

usadas filtros de nylon da marca GVS, de 0,2μm

com 47mm de diâmetro e/ou filtros de papel de

43-48μm com diâmetro de 125mm da Filter-Lab.

Nas centrifugações, foram usados tubos de

centrífuga de 50ml de PPCO Nalgene e para a purificação por diálise usaram-se membranas de

celulose MEMBRA-CEL MD-25-14 com peso molecular de corte de 3000Da.

II.1.4 Equipamentos usados em síntese

Para a sintetização de CNPs foram usadas uma mufla eléctrica Césame MI7 e uma mufla

eléctrica Select-Horn da empresa J.P. SELECTA. A segunda mufla apenas foi usada para

carbonizações a seco de grãos de cortiça.

Para centrifugações usaram-se duas centrífugas consoante a necessidade de velocidade de

rotação. Para velocidades de rotação superiores (40000g) foi usada a centrífuga Avanti J-26 XPI da

Beckman Coulter com o rotor JA 25-50. A centrífuga Sigma 3K30 da B. Braun Biotech

International com rotor 12156 foi usada em centrifugações a velocidades mais baixas (≤ 23000g).

As nanopartículas que foram armazenadas a seco foram liofilizadas num liofilizador

CRYODOS – 50 da Telstar com 8 mangueiras.

II.1.5 Procedimentos

II.1.5.1 Síntese hidrotérmica

A síntese hidrotérmica é um método usado na preparação de nanoestruturas hidrofílicas. O

método de síntese utiliza como solvente a água. No processo os precursores sofrem diversas

reacções a temperaturas moderadas em água comprimida. As condições de temperaturas e pressão

geradas no interior do reactor permitem as interacções entre reagentes que, de outra forma, seriam

muito difíceis de reproduzir. É uma técnica simples, económica e bastante versátil [45]. Todas as

sínteses foram realizadas em condições de temperatura e pressão consideravelmente abaixo do ponto

crítico da água (374ºC a 218atm) para garantir a integridade do autoclave e também a segurança no

laboratório.

Figura II.1 – Reactor de teflon com capacidade

para cerca de 150ml (esquerda) e respectiva

camâra de aço inoxidável (direita).


19

Nas sínteses hidrotérmicas foram sempre usadas moléculas e polímeros solúveis em água

como fonte de carbono. As CNPs mais interessantes e cujos resultados são apresentados nesta tese

foram sintetizadas a partir de polivinilpirrolidona (PVP), PAA, gelatina e ácido cítrico e

etilenodiamina.

Para sintetizar CNPs por via hidrotérmica, o procedimento geral era o seguinte: dissolução

de uma quantidade de reagente num dado volume de água, tipicamente cerca de 30mg/ml.

Transferência da solução para o reactor de teflon colocado numa câmara de aço inoxidável e a sua

introdução na mufla. Programação da mufla para a temperatura e tempo de reacção estipulados.

Após o tempo de reacção o reactor arrefecia à temperatura ambiente durante várias horas

(geralmente uma noite). Seguidamente procedia-se à centrifugação da solução obtida e filtração com

uma membrana de nylon numa placa de filtração. Depois a solução era posta a dialisar contra água

desionizada durante pelo menos 24h. Procedia-se a uma segunda filtração com uma membrana de

nylon após a diálise e era efectuada a secagem por liofilização durante 9h ou mais para posterior

armazenamento a seco. A tabela II.2 expõe as condições para a síntese hidrotérmica.

Tabela II.2 – Condições em sínteses hidrotérmicas.

CNPs Reagentes Quantidades Volume

de água Temperatura Tempo Centrifugação Referência

PVP Polivinilpirrolidona 1,994g 75ml 240ºC 7h 40000g

45min [46]

AC E Ácido cítrico

etilenodiamina

5,252g

1,675ml 50ml 250ºC 5h

40000g

45min [47]

G Gelatina 1,656g 79ml 200ºC 3h 16000rpm

30min [48]

PAA Poli(ácido acrílico) 2,527g 61ml 270ºC 6h 40000g

45min -

As diferentes NPs obtidas por síntese hidrotérmica serão mencionadas como CNPs PVP,

CNPs AC E, CNPs G e CNPs PAA, tal como está apresentado na tabela II.2.

II.1.5.2 Carbonização simples

A carbonização é uma reacção pirolítica que consiste na transformação de material orgânico

em estruturas carbonáceas. Nesta reacção o material sofre uma decomposição termoquímica na

presença de atmosfera ambiente, da qual resulta um aumento da sua composição em carbono [49] e

forte oxidação da superfície do material devido à presença de oxigénio durante a reacção.

Neste trabalho as CNPs sintetizadas por carbonização tiveram como materiais precursores

cascas de laranja e cortiça em grão (micrométrico). A carbonização, como via de síntese de CNPs,

está descrita em [28]. A síntese que validou este método usou cascas de laranja como matéria-prima

e foi inspirada no procedimento descrito. Brevemente, 97,7g de cascas de laranja foram pesadas

num copo de vidro pyrex e postas a carbonizar a 250ºC durante 4h. Após o arrefecimento (muito

rápido quando comparado com o da síntese hidrotérmica) o carbonizado foi suspenso em água

desionizada. A solução obtida, de tonalidade escura, foi separada dos grandes pedaços de

carbonizado através da filtração com papel de filtro. Após este passo, os procedimentos de

purificação e isolamento eram análogos aos descritos em II.1.5.1 para a síntese hidrotérmica.


20

Na produção de CNPs a partir da carbonização de grãos de cortiça fez-se variar a

temperatura de síntese para investigar o efeito que esta variável teria na estrutura química e nas

propriedades ópticas e morfológicas das CNPs. Antes das sínteses foram feitas carbonizações de

grãos de cortiça para determinar o tempo de reacção necessário para que fosse obtido um produto de

carbonização homogéneo em todo o volume (olho nú) à temperatura de síntese mais baixa. O tempo

de carbonização estabelecido foi de 24h. O procedimento genérico para a síntese destas CNPs era o

seguinte: uma quantidade de cortiça era pesada e transferida para o cadinho. O cadinho era posto no

forno e o tempo (24h) e temperatura de carbonização programados. Após o arrefecimento, o

carbonizado era suspenso em água desionizada durante uma noite. Para separar os grãos

carbonizados de micro e NPs, a mistura era filtrada com um papel de filtro. A solução obtida era

centrifugada duas vezes para separação entre micro e NPs e evitar contaminação da amostra com

pellet solto da primeira centrifugação. O sobrenadante era recolhido e filtrado com uma membrana

de nylon numa placa de filtração. Não foi feita diálise por haver muito pouca membrana disponível.

As soluções foram borbulhadas com azoto e mantidas sob atmosfera inerte. A tabela II.3 expõe os

parâmetros mais importantes na produção destas NPs.

Tabela II.3 – Parâmetros na produção de CNPs a partir da carbonização de cortiça.

CNPs Massa de

cortiça Temperatura Tempo 1ª centrifugação 2ª centrifgugação

300 3,035g 300ºC

24h 20000g, 45 min 40000g, 15 min 260 3,031g 260ºC

220 3,069g 220ºC

180 3,008g 180ºC

As CNPs obtidas a partir das diferentes temperaturas serão mencionadas como CNPs 300,

CNPs 260, CNPs 220 e CNPs 180. As NPs produzidas pela carbonização de cascas de laranja serão

referidas como CNPs CL.

II.2 Caracterização

II.2.1 Espectroscopia de absorção

A espectroscopia de absorção no ultravioleta-visível (UV-Vis) é uma ferramenta de química

analítica. É uma técnica amplamente utilizada para identificar ou quantificar moléculas ou estruturas

supra-moleculares que absorvem na gama do UV-Vis [50]. Adicionalmente a análise do espectro de

absorção UV-Vis permite inferir quanto ao sucesso do encapsulamento de fármacos,

funcionalização de nanopartículas, etc.[51].

Quando a radiação na gama do UV-Vis incide na matéria, pode ser absorvida provocando

transições electrónicas. Na gama de CDO em que ocorrem estas transições gera-se um perfil de

absorção pois parte da radiação incidente não chega ao detector por ser absorvida. A absorção num

CDO específico é quantificada pela lei de Lambert-Beer:

Equação II.1


21

onde e representam a intensidade de luz detectada e fornecida pela fonte respectivamente e

representam a absortividade molar, percurso óptico e concentração da amostra respetivamente. A

absorvância relaciona-se com a lei de Lambert-Beer através da relação:

Equação II.2

A instrumentação básica de um espectrofotómetro inclui uma fonte de luz com vasto

espectro de emissão, monocromadores, célula de análise e um detector para a luz transmitida.

Os espectros de absorção foram obtidos com um espectrofotómetro Cary 100 Bio. Os

espectros foram adquiridos na gama dos 200 aos 800nm, com velocidade de varrimento de

600nm/min e incremento de 1nm. Todos os espectros foram obtidos nas mesmas condições. Para os

ensaios foram usadas células de fluorescência de quartzo com percurso óptico de 10mm. As

concentrações das soluções foram ajustadas para 0,1 unidades de absorvância (u.a.) a 360nm. Na

tabela II.4 apresentam-se as concentrações usadas para adquirir espectros de absorção UV-Vis.

Tabela II.4 – Concentrações usadas em espectroscopia de absorção e espectroscopia de fluorescência.

CNPs PVP AC E PAA G CL 180 220 260 300

Concentração

(mg/mL) 0,0995 0,0005 0,1003 0,0990 0,0009 0,0048 0,0140 0,0198 0,0096

II.2.2 Espectroscopia de fluorescência

Em espectroscopia de fluorescência, a amostra é excitada por radiação na gama do UV-Vis

ou IV próximo e são analisadas as suas propriedades emissivas. Uma das características mais

impressionantes desta técnica é a sua enorme sensibilidade que pode ser superior até três ordens de

grandeza em relação à espectrofotometria de absorção possibilitando a detecção de apenas uma

unidade molecular [50].

Esta técnica espectroscópica é amplamente usada em cinéticas bioquímicas, no estudo de

equilíbrios químicos [52] e no estudo das propriedades fluorescentes de moléculas e materiais em

geral. Com a espectroscopia de fluorescência é possível obter diferentes tipos de informação, seja

Figura II.2 – Esquema de funcionamento de um espectrofluorímetro de duplo monocromador. Adaptado de [50].


22

em condições de estado estacionário seja com técnicas de resolução temporal, visto os tempos de

vida de estados excitados serem extremamente sensíveis a mudanças no meio.

Os sinais de fluorescência são medidos com um espectrofluorímetro. A instrumentação

inclui uma fonte de luz de alta potência, lentes e monocromadores, uma câmara para a amostra e um

fotodetector. O arranjo da instrumentação está ilustrado na figura II.2.

Os espectros de fluorescência e excitação foram adquiridos com um espectrofluorímetro

Fluorolog-3 Spectrofluorometer da HORIBA. A aquisição dos espectros foi feita em modo right

angle com as seguintes condições: slits de entrada com 2nm, slits de saída de 2nm, tempo de

integração de 0,1s e incremento em 1nm. Foram usadas redes de difracção nos monocromadores

com densidade de 1200g/mm. Estas condições foram usadas em todos os ensaios. Os espectros

fluorescência de cada amostra foram obtidos com as células de fluorescência de quartzo com que

foram adquiridos os espectros de absorção e com as respectivas soluções (tabela II.4).

II.2.2.1. Medição de rendimentos quânticos de fluorescência

O FQY, definido como a razão entre o número de fotões emitidos e o número de fotões

absorvidos, é geralmente determinado por comparação com uma referência de rendimento quântico

conhecido. Os FQYs foram determinados de acordo com a equação referida em [53]:

Equação II.3

Em que , e representam, respectivamente, a área do espectro de emissão, a absorvância

da amostra ao λex determinado e o índice de refracção do solvente. Os FQYs determinam a

eficiência do processo de fluorescência relativamente a outros processos de desactivação do estado

excitado, sendo um parâmetro muito importante na avaliação de uma sonda de fluorescência. Na

determinação de FQYs, é vantajoso usar referências cuja emissão se assemelhe à das nossas

amostras de forma a diminuir o erro de medição. Neste caso, usou-se como referência uma solução

de sulfato de quinino em H2SO4 a 0,1M de = 54% [53] (ver procedimentos no apêndice C). É

preciso ter em conta que a medição do FQY foi feita a 360nm e que a informação acerca da

intensidade de fluorescência é relativa a este CDO. Alternativamente os FQY poderiam ser

determinados numa esfera integradora acoplada ao espectrofluorímetro.

Por conveniência, estipulou-se que a absorção da solução de sulfato de quinino usada como

padrão para medir FQYs das CNPs a 360nm fosse 0,1u.a. de forma a minimizar o erro na medição

de FQYs (ver caracterização espectroscópica no apêndice C).

II.2.3 Microscopia electrónica de transmissão

A microscopia electrónica de transmissão (TEM) é uma técnica de imagem utilizada para

caracterizar a morfologia de materiais a escalas para lá do alcance da microcopia óptica. As imagens

TEM revelam a forma da amostra e também a sua dimensão. A elevada resolução das imagens

obtidas com TEM permitem a visualização de detalhes estruturais ultrafinos e obtenção de

informação estrutural à escala atómica, com resolução a poder atingir 0,1nm [1]. A alta resolução de

TEM resulta do CDO dos electrões que é muito inferior à dimensão atómica. Consequentemente a


23

resolução é dependente da tensão de aceleração dos electrões além de outros parâmetros tais como o

tipo e a espessura do material [51].

Em TEM os electrões emitidos pela fonte são focados num feixe fino por lentes

electromagnéticas numa coluna em vácuo e acelerados em direcção à amostra. Apenas os electrões

que são transmitidos pela amostra chegam ao detector. Os electrões que são dispersos pela amostra

não chegam ao detector. Devido à dispersão, são geradas as regiões escuras correspondentes [51].

O aparelho utilizado foi um H8100 da Hitachi. Para aquisição de imagens foi aplicada uma

tensão de 200kV ao filamento de Hexaboreto de Lantânio. Como suportes foram utilizadas grelhas

de cobre cobertas por um filme de carbono. A montagem de cada amostra resumiu-se à secagem de

uma gota de cada solução na grelha. As dimensões das CNPs nas imagens TEM foram obtidas com

o software ImageJ.

II.2.4 Microscopia electrónica de varrimento

A microscopia electrónica de varrimento (SEM) é uma técnica de microscopia que, tal como

a TEM, utiliza feixes de electrões de elevada energia para proporcionar ampliações muito maiores

que as obtidas pela microscopia óptica convencional. Com SEM é possível obter resoluções até 1nm

com uma grande profundidade de campo [54].

A SEM é primariamente uma ferramenta para obtenção de informação topográfica de uma

amostra mas permite também a aquisição de informação acerca da cristalinidade, composição

elementar e comportamento eléctrico da amostra através de diferentes modalidades de imagem [54].

O sistema óptico do SEM é constituído por uma fonte de electrões, lentes electromagnéticas

para focar o feixe, bobinas de deflexão para varrimento da área seleccionada e detectores de

diferentes fontes de sinal. Os electrões penetram na amostra e interagem com a matéria. O poder de

penetração dos electrões depende da sua energia, da espessura da amostra e do número atómico dos

elementos. Em SEM são gerados electrões secundários, retrodispersos e de Auger, bem como raios-

X. São estes electrões e fotões gerados pela interacção electrónica com a matéria que fornecem

vários tipos de sinais para a criação de imagens topográficas ou obtenção de informação de outros

tipos. A elevada resolução espacial é conseguida à custa da focagem do feixe de electrões primário e

pelo facto da energia depositada na amostra ser localizada no ponto de impacto do feixe. A detecção

de electrões secundários emitidos pelo feixe primário é maioritariamente responsável pela elevada

resolução espacial das imagens SEM [54].

O instrumento usado para obter imagens SEM foi um AURIGA CrossBeam (FIB-SEM) da

Carl Zeiss. A preparação de cada amostra consistiu na secagem de uma gota de cada solução filtrada

com um filtro de seringa de 0,45μm de acetato de celulose num pedaço de silício. Para a

visualização os pedaços de silício foram montados num suporte e este inserido no respectivo lugar

do equipamento. As dimensões das CNPs nas imagens SEM foram obtidas com o software ImageJ.

II.2.5 Dispersão dinâmica da luz

A DLS é uma técnica fiável, rápida, não destructiva e certificada para a caracterização do

tamanho de partículas em solução com aplicações em campos tão diversos como física, química,


24

biologia, ciências dos materiais entre outros [55]. Possui elevada sensibilidade e tem uma precisão

óptima a medir tamanhos entre 0,6nm e 6μm [56]. O princípio de acção assenta na luz dispersa por

partículas em movimento Browniano. As alterações de posição causam variações na intensidade de

luz que é dispersa pelas partículas quando estão a ser irradiadas. A dispersão de luz por parte de

partículas de dimensões inferiores ao CDO da luz é explicada pela teoria da dispersão de Rayleigh.

Para partículas de tamanho semelhante ou maior que o CDO aplica-se a teoria de Mie. O sinal de

DLS é uma curva de decaimento exponencial ou multi-exponencial. Para o caso mais simples, o

decaimento é caracterizado por uma constante de decaimento :

Equação II.4

onde e representam o coeficiente de difusão aparente e o vector de onda dispersa

respectivamente. A teoria cinética relaciona o coeficiente de difusão com o raio hidrodinâmico

das partículas através da equação de Einstein-Stokes:

Equação II.5

com a constante de Boltzmann, a temperatura e a viscosidade do solvente [56] [57]. Através

desta equação, a análise da dimensão da partícula torna-se simples e imediata. A técnica de DLS não

necessita do conhecimento da concentração da solução em estudo ainda que a concentração deva ser

optimizada para maximização de sinal.

As medições de tamanhos por DLS foram feitas com um SZ-100 Nanopartica da Horiba.

Nos ensaios utilizou-se um ângulo de dispersão a 90º. Utilizaram-se células descartáveis de plástico.

Na maioria das amostras não foi possível obter sinal. Naquelas em que foi possível, fizeram-se cinco

ensaios para várias concentrações. A medição de tamanhos por DLS requer a filtração da amostra.

Para tal usaram-se filtros de polietileno de 0,45μm.

II.2.6 Difracção por raios-X

A técnica de difracção por raios-X (DRX) é uma das ferramentas mais importantes para a

caracterização da matéria. Trata-se de uma ferramenta não invasiva de análise estrutural com

aplicações na mineralogia, engenharia, ciências farmacêuticas, etc. O conhecimento do modo como

os átomos se organizam em diferentes estruturas é fundamental para a compreensão das

propriedades do material e da própria estrutura macroscópica. Neste contexto, cada difractograma

actua como impressão digital única de cada material.

O fenómeno de difracção atende à lei de Bragg:

Equação II.6

em que é a distância interplanar atómica, o ângulo incidente, o CDO da onda incidente e um

escalar inteiro correspondente à ordem de difracção.

Numa experiência de difracção o CDO da onda incidente tem de ter a mesma ordem de

grandeza do espaçamento entre os átomos. A amostra é irradiada com raios-X e um detector móvel


25

vai adquirindo as intensidades das ondas difractadas pelo material a ângulos sucessivos. As ondas

difractadas que interferem constructivamente geram o padrão de difracção [58].

Os difractogramas foram adquiridos com um difractómetro X´Pert PRO MPD da

PANalytical equipado com um detector 1D X´Celerator. A preparação das amostras liofilizadas para

obter os difractogramas consistia na colocação de um pedaço de liofilizado num suporte de silício.

No caso das amostras em solução foi necessário secar uma pequena alíquota (cerca de 1ml) no

suporte de silício.

II.2.7 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier

Uma das técnicas analíticas mais usadas actualmente na caracterização de materiais é a

espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Esta ferramenta faculta

informação acerca da estrutura molecular do material [59]. Os materiais absorvem no IV, o que

resulta em estiramentos vibracionais e deformações moleculares a frequências características [51].

Num ensaio de FTIR a fonte de luz emite numa gama larga de CDOs. A luz incide num

interferómetro de Michelson. O feixe é separado no interferómetro devido a fenómenos de

interferência causados pelo interferómetro. Cada feixe possui uma modulação de sinal diferente o

que resulta em diferentes padrões de interferência. Estes feixes incidem na amostra e um detector

recebe a fracção de luz transmitida. O sinal resultante é relativo a cada padrão de interferência e

processado através da transformada de Fourier [1].

Os espectros de FTIR foram obtidos com um espectrómetro Thermo Nicolet 6700. Os dados

foram adquiridos em modo de reflectância total atenuada (ATR) em que a amostra no estado sólido

se encontra em contacto com um cristal de diamante. Os espectros foram obtidos numa gama de

NDOs de 650 a 4000cm-1

, com resolução de 4cm-1

.

II.2.8 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN) é uma técnica não

destrutiva usada para elucidar estruturas moleculares e processos dinâmicos em diversos tipos de

reacções. Esta técnica faz uso dos momentos magnéticos intrínsecos dos átomos de hidrogénio (ou

outros) mediante a aplicação de um forte campo magnético externo. Os níveis de energia associados

ao spin nuclear são separados e através da absorção de radiofrequências podem ocorrer transições

entre estes estados de spin. Estas transições são comparadas com um modelo estandardizado e

traduzidas em desvio químicos relativos ao modelo. Os desvios químicos obtidos no espectro

contêm informação acerca da localização dos vários protões nas estruturas dos compostos presentes

na amostra [51].

Foram obtidos espectros para as amostras de CNPs obtidas a partir da carbonização da

cortiça. Foi usado um espectrómetro de ressonância magnética nuclear AVANCE III da Bruker de

400MHz com uma sonda QNP de 5mm. Para preparar as amostras liofilizou-se 5ml de cada solução

e re-suspendeu-se o produto seco em 700μl de água deuterada. As soluções foram inseridas em

tubos de ressonância magnética nuclear e selados com tampa de polietileno.


26

II.2.9 Potencial Zeta

A medição do potencial ζ de uma dispersão

fornece informação acerca da sua estabilidade coloidal.

As partículas coloidais possuem geralmente uma carga de

superfície não nula. Esta carga afecta a distribuição iónica

da solução na vizinhança das partículas e é gerada uma

camada. A camada interna é composta por iões

fortemente adsorvidos à partícula e na camada externa a

temperatura e o balanço electroestático determinam a

distribuição iónica. O potencial electrocinético de

partículas em suspensão coloidal, ou potencial ζ, é o

potencial eléctrico medido na camada externa numa

fronteira designada por slipping plane (figura II.3)

relativa ao solvente [51].

O potencial ζ é medido mediante a aplicação de um campo

eléctrico que provoca o deslocamento das partículas:

Equação II.7

em que , e correspondem à velocidade de deslocamento, mobilidade electroforética e campo

eléctrico aplicado respectivamente. Da equação II.6 o potencial ζ é calculado pela equação de

Henry

Equação II.8

onde , e correspondem à viscosidade, constante dieléctrica e função de Henry

respectivamente [60].

Em termos experimentais, o potencial ζ pode ser medido por microelectroforese ou

electroforese por dispersão de luz. Esta segunda técnica é baseada no princípio da DLS.

Genericamente as medições de potencial ζ superiores em módulo a 25mV indicam estabilidade da

suspensão pois as cargas superficiais entre partículas causam repulsão electrostática. Potenciais ζ

inferiores a este valor apontam para instabilidade coloidal da dispersão com tendência a

precipitação, aglomeração e floculação. À medida que o potencial ζ se aproxima do potencial neutro

(0mV) maior é a instabilidade [51]. O potencial ζ é sensível a factores como pH, polaridade e

concentração da dispersão pois estes parâmetros alteram a distribuição iónica em solução.

Foram feitas medições de potencial ζ para amostras de CNPs 300, usando um SZ-100

Nanopartica da Horiba. Nos ensaios usou-se um ângulo de dispersão de 173º. Utilizaram-se células

com eléctrodos de grafite. Tal como na medição de tamanhos, a amostra foi previamente filtrada

com um filtro de polietileno de 0,45μm.

Figura II.3– Esquema da distribuição de

cargas devido a uma partícula carregada.

Adaptado de [51].


27

II.3 Culturas celulares e imagiologia celular

II.3.1 Reagentes

Meio de cultura Dulbecco´s Modified Eagle Medium sem vermelho de fenol da Gibco, meio

de cultura McCoy´s 5A (modified), tripsina comercial TrypLE Express sem vermelho de fenol, Azul

tripano a 0,4% da Gibco Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline (PBS) e Paraformaldeído (PFA) da

Panreac.

II.3.2 Materiais

Linhas celulares HFFF2 e Saos-2, microtubos, frascos de cultura T25 SARSTEDT, placas de

cultura com 24 poços SARSTEDT, tubos de 15ml e de 50ml SARSTEDT, hemocitómetro, lâminas e

lamelas.

II.3.3 Equipamentos

Banho termostático WNB 10 da Memmert, Centrífuga Centurion Scientific K3 Series,

incubadora MCO 19-AIC (UV) da Sanyo, câmara Labculture da ESCO, microscópio invertido de

contraste de fase Nikon Eclipse Ti-S com componentes extra de epifluorescência e máquina

fotográfica Nikon D610.

II.3.4 Culturas celulares e marcação

Neste trabalho cultivaram-se linhas celulares Saos-2 (osteoblastos) e HFFF2 (fibroblastos

humanos) para a internalização de CNPs in vitro. Os procedimentos para a cultura de ambas as

linhas foram análogos. Resumindo, o procedimento para a cultura celular iniciava-se com o

descongelamento das linhas celulares, incubação destas num T25 para proliferação e sementeira

numa placa de 24 poços com lamelas de vidro inseridas no fundo de cada poço. Os protocolos

utilizados para as culturas celulares encontram-se descritos pormenorizadamente no apêndice D.

Após a adesão das células às lamelas, era efectuada a marcação das células com CNPs.

Resumidamente, trocava-se o meio por outro onde estivessem CNPs dispersas. No caso das NPs

armazenadas a seco, estas eram dispersas em meio de cultura e as células, após aderirem à lamela,

incubavam em soluções de meio e CNPs com concentrações de 0,5 e 1mg/ml. Quanto às CNPs

armazenadas em solução foram usadas alíquotas de 150 e 300μl. Depois da adesão das células à

lamela, removia-se uma alíquota de meio equivalente àquela a adicionar. A alíquota de CNPs era

adicionada seguidamente e as células deixadas a incubar nesta solução.

Os tempos de incubação com NPs variaram com o tipo de linhas celulares usadas. Para as

linhas Saos-2 os tempos de incubação rondaram as 6h. As células HFFF2 incubaram em períodos de

6h, 10h, 24h e 72h.


28

II.3.5 Visualização no microscópio de fluorescência

Para a visualização de cada amostra, o meio do respectivo poço era removido com uma

micropipeta e as células lavadas com 1ml de PBS duas vezes. A cada poço foi adicionado 1ml de

solução de PFA a 3,7% para fixação das células. As células foram mantidas durante 10 minutos

nesta solução e seguidamente as soluções de PFA nos poços eram trocadas por 1ml de PBS. A

lamela era retirada do poço com uma pinça esterilizada e montada numa lâmina com a face onde

estavam aderidas as células voltada para a lâmina. Se fosse necessário adicionava-se uma gotinha de

PBS à lamela para evitar a secagem durante a visualização. A lâmina era montada no suporte do

microscópio e a amostra observada. As células marcadas foram fotografadas com a máquina

fotográfica acoplada ao microscópio.

Capítulo III – Resultados e discussão

29


III.1 Sínteses

III.1.1 Síntese hidrotérmica

A síntese de CNPs por via hidrotérmica foi feita sem aditivos (NaOH ou outros iões

inorgânicos) e demonstrou ser um processo bastante simples e directo na produção de NPs. As

reacções que ocorrem no interior do reactor não são controláveis pelo que não são conhecidos os

fenómenos que ocorrem ao certo. Provavelmente, partindo de macromoléculas, devem predominar

reacções de desidrogenação e hidrólise onde são quebradas ligações. Partindo de moléculas

orgânicas mais simples também podem ocorrer reacções de desidrogenação mas em menor escala

que em macromoléculas. Seguidamente dar-se-ão reacções de polimerização e condensação de que

resultam estruturas poliméricas. Finalmente com o aumento de temperatura dar-se-ão reacções de

carbonização e aromatização e ocorre nucleação destas estruturas carbonáceas [47] [61] [62]. Em

todos os casos foram obtidas CNPs hidrofílicas. A tabela III.1 apresenta os resultados experimentais

destas sínteses.

Tabela III.1 – Resultados de reacções hidrotérmicas.

Amostra Quantidade

de reagente

Aspecto da

solução Isolamento

Dispersão em água

após isolamento

Quantidade

de produto

CNPs PVP 1,994g Amarela Liofilizado Muito boa 1,294g 65%

CNPs AC E 5,252g

1,675ml2

Preta Liofilizado Muito boa 0,075g 1,1%

CNPs PAA 2,527g Amarela

clara Liofilizado Muito boa 0,615g 24%

CNPs G 1,656g Amarela

escura Liofilizado Muito boa 0,531g 32%

As soluções foram verificadas à luz UV (366nm) antes do isolamento e todas exibiam

fluorescência azulada. As CNPs são bastante solúveis em água e a sua dispersão em meio aquoso é

imediata. Os rendimentos de reacção para as sínteses hidrotérmicas variaram bastante. O rendimento

para produção de CNPs AC E é, de longe, o mais baixo com apenas 1,1%. Este rendimento foi

afectado pela perda de algum material fluorescente, provavelmente CNPs de massa inferior a

3000Da, durante a diálise. Sínteses com macromoléculas demonstraram ter maior rendimento. No

entanto os rendimentos apresentados são aparentes. Os produtos finais das reacções, especialmente

aqueles obtidos de macromoléculas, continham uma percentagem considerável de polímero não

carbonizado como se verificará adiante.

2 A densidade da etilenodiamina é ρ = 0,899g/cm

3. A massa de etilenodiamina usada é 1,506g.


30

III.1.2 Carbonização simples

As carbonizações foram efectuadas em atmosfera ambiente. As cascas de laranja usadas para

produção de CNPs CL ficaram completamente carbonizadas. Houve grande perda de massa devido à

evaporação da água (que é responsável por cerca de 70% da massa das cascas). As cascas

carbonizadas absorveram alguma água quando foram suspensas. A quase totalidade da restante

massa foi perdida na filtração com papel. O rendimento desta reacção é baixíssimo (0,027%).

Na carbonização de grãos de cortiça foi observou-se diferentes graus de carbonização

respectivos a cada temperatura de síntese (figura III.1). Além disso também era evidente que, de

carbonizações a temperaturas diferentes resultavam quantidades de carbonizados diferentes:

Figura III.1 – Cortiça em pó (A), carbonizada: a 180ºC (B), 220ºC (C), 260ºC (D) e 300ºC (E).

Tal como na síntese de CNPs feita com cascas de laranja notou-se alguma absorção de água

pelo carbonizado e também se perdeu a maior parte da massa na filtração.

Devido à presença de oxigénio durante as carbonizações, ocorrem oxidações nas superfícies

das estruturas e pequenas partículas com superfície oxidada separaram-se da macroestrutura e, por

serem hidrofílicas, ficam em dispersão. A purificação elimina as partículas de maiores dimensões.

Tabela III.2 – Resultados das carbonizações. (a)

Calculado com base na

massa medida depois da secagem de uma alíquota de 5ml.

Amostra Quantidade

de precursor

Aspecto

da solução Isolamento

Dispersão em água

após isolamento

Volume

final

Quantidade

de produto

CNPs CL 97,705g Castanho

Alaranjada Liofilização Medíocre - 0,0259g 0,027%

CNPs 300 3,035g Amarela Solução em

atmosfera inerte - 64ml 0,0307g

(a) 1,0%

CNPs 260 3,031g Amarelo

ténue

Solução em


(a) 0,81%

CNPs 220 3,069g Amarelo

ténue

Solução em


(a) 0,60%

CNPs 180 3,008g Amarela Solução em


(a) 1,0%

A C

D E

B


31

Tal como nos produtos resultantes das sínteses hidrotérmicas, à luz UV (366nm) todas as

soluções exibiam fluorescência azulada. Como está bem patente na tabela III.2, os rendimentos de

reacção são muito baixos. No entanto, rendimentos baixos não são preocupantes visto que o material

usado é biomassa que existe em abundância. A massa de CNPs obtidas a partir da carbonização da

cortiça foi estimada a partir da massa medida após a liofilização de uma alíquota de 5ml de cada

solução. Nos produtos finais, também foram obtidos restos de polímero (figuras III.31 e III.32). Os

rendimentos das reacções também são aparentes. Este facto não surpreende. Afinal, a estrutura dos

materiais precursores é fundamentalmente constituída por polímeros.

As CNPs obtidas com a carbonização da cortiça foram armazenadas em solução sob

atmosfera inerte para prolongar o seu tempo de vida (shelf life). Optou-se por este procedimento

porque nos ensaios preliminares, apesar de as soluções obtidas serem relativamente estáveis, era

notória uma ligeira floculação e precipitação ao fim alguns dias. Ao borbulhar a solução com um

gás inerte, neste caso azoto, remove-se oxigénio e dióxido de carbono em solução e ao manter uma

atmosfera de azoto sobre a solução (num balão selado), evita-se a redissolução destes gases. Esta

estratégia de preservação parece ter sido bem-sucedida na medida em que todas as soluções, com

excepção da CNPs 180, mostraram boa estabilidade coloidal, com pouca ou nenhuma precipitação e

floculação visível após mês e meio de armazenamento. Este procedimento é bastante usual em

síntese química quando se trabalha com compostos sensíveis a oxigénio ou outro gás dissolvido em

solução, mas não foi encontrada na literatura nenhuma menção à sua utilização para manter estáveis

suspensões coloidais de CNPs. As concentrações das soluções das CNPs foram estimadas a partir

das massas obtidas pela liofilização de alíquotas de 5ml e estão exibidas na tabela III.3.

Tabela III.3 – Concentrações aparentes das soluções de CNPs obtidas por carbonização de cortiça.

Amostra CNPs 300 CNPs 260 CNPs 220 CNPs180

Concentração

(mg/ml) 0,48 0,39 0,28 0,48

O isolamento da solução de CNPs CL por liofilização não resultou. Verificou-se alguma

dificuldade em re-dispersar o liofilizado em solução. Efectivamente, só era possível uma boa

dispersão recorrendo à sonicação. Além disso, a tendência para a precipitação em solução era

notória. Antes do isolamento a dispersão em solução aparentava ser bastante estável e o

armazenamento deveria ter sido feito em solução. Se fosse necessário proceder-se-ia ao

armazenamento sob atmosfera em inerte, como foi feito para as CNPs de cortiça carbonizada.

III.2 Caracterização

A caracterização das CNPs foi dividida em caracterização espectroscópica, morfológica e de

estrutura química. Na tabela III.4 estão exibidas todas as técnicas utilizadas na caracterização.


32

Tabela III.4 – Técnicas de caracterização utilizadas (FS=Espectroscopia de

fluorescência; S=Sim; N = Não; S.S. = Sem Sinal).

Amostra UV-Vis FS DLS SEM TEM FTIR DRX RMN Pot. ζ

CNPs PVP S S S S S S S N S.S.

CNPs AC E S S S.S. S S.S. S S N S.S.

CNPs PAA S S S.S. S.S. S.S. S S N S.S.

CNPs G S S S.S. S S S S N S.S.

CNPs CL S S S S S.S. S S N S.S.

CNPs 300 S S S S S S S S.S. S

CNPs 260 S S S.S. S.S. S S S S S.S.

CNPs 220 S S S.S. S S.S. S.S. S S S.S.

CNPs 180 S S S.S. S S.S. S S S S.S.

III.2.1 Caracterização espectroscópica

III.2.1.1 Espectroscopia de absorção no ultravioleta e visível

A caracterização espectroscópica de todas as amostras foi iniciada com espectroscopia de

absorção no UV-Vis. A concentração das amostras foi ajustada de modo a que absorvância a 360nm

fosse aproximadamente 0,1u.a.. Este valor de absorvância minimiza fenómenos de reabsorção em

espectroscopia de fluorescência. Os espectros de absorção foram adquiridos dos 200 aos 800nm mas

as absorvâncias relevantes encontram-se na gama dos 300 aos 500nm que é a gama em que foi feita

a excitação das amostras para adquirir os espectros de fluorescência. Apresentam-se em seguida os

espectros de absorção para cada amostra com inset das soluções dos respectivos CNPs à luz

ambiente (esquerda) e à lâmpada UV de 366nm (direita). Todas as soluções se apresentam incolores

ou ligeiramente amareladas a esta diluição e emitem luz azul.

Figura III.2 – Espectro de absorção de CNPs PVP.

Figura III.3 – Espectro de absorção de CNPs AC E.


33

Figura III.4 – Espectro de absorção de CNPs PAA. Figura III.5 – Espectro de absorção de CNPs G.

Figura III.6 – Espectro de absorção de CNPs CL. Figura III.7 – Espectros de absorção de CNPs 180.

Figura III.8 – Espectro de absorção de CNPs 220. Figura III.9 – Espectro de absorção de CNPs 260.


34

Os espectros de absorção (figuras III.2-10) demonstram que as CNPs absorvem

intensamente no UV e que a absorção decai à medida que o CDO aumenta. O espectro de absorção

das CNPs AC E (figura III.3) apresenta uma banda distinta centrada a 356nm associada a uma

transição electrónica. São visíveis também dois ombros nas CNPs 180 abaixo dos 300nm (figura

III.7). Nos outros espectros de absorção não são detectáveis regiões de absorção específicas. Com

efeito, os restantes espectros apresentam perfis de absorção semelhantes a curvas de decaimento

exponencial onde nalguns são visíveis ligeiras deformações a cerca de 300nm.

Os perfis de absorção registados estão de acordo com o que está mencionado na literatura

em relação à espectroscopia de absorção no UV-Vis. Quanto à atribuição das transições electrónicas

é preciso ter em conta que, devido à heterogeneidade da estrutura química destes nanomateriais, é

muito difícil atribuir as transições electrónicas associadas a ombros e bandas com exactidão. Por

este motivo as transições electrónicas não são identificadas. No entanto, sabe-se que as transições

podem ser de natureza n-π* ou π-π

*.

III.2.1.2 Espectroscopia de fluorescência

Nos ensaios de espectroscopia de fluorescência foram usadas as mesmas soluções com que

foram obtidos os espectros de absorção (tabela II.4). Como já foi referido, as concentrações foram

determinadas de forma a minimizar fenómenos de reabsorção. Estes fenómenos podem afectar as

medições em espectroscopia de fluorescência na medida em que a amostra não só absorve a luz

excitatória, como também absorve parcialmente a fluorescência que emite.

Para obter espectros de emissão com um espectrofluorímetro, o monocromador da excitação

é fixo enquanto o monocromador de emissão faz o varrimento da luz emitida por fluorescência

vinda da amostra na célula. Isto requer normalmente uma geometria de 90°.

Os espectros de fluorescência foram adquiridos com CDOs de excitação a partir dos 300nm,

incrementando 10nm a cada nova aquisição. Para melhor percepção apresentam-se espectros obtidos

varrendo os CDOs de excitação de 20 em 20nm. Para evidenciar o deslocamento para o vermelho

com o aumento do CDO de excitação, são exibidos os espectros de fluorescência e os respectivos

espectros de fluorescência normalizados para cada amostra.

Figura III.10 – Espectro de absorção de CNPs 300.


35

Figura III.11 Espectros de fluorescência de CNPs PVP (A) e respectivos espectros normalizados (B).

Figura III.12 – Espectros de fluorescência de CNPs AC E (A) e respectivos espectros normalizados (B).

Figura III.13 – Espectros de fluorescência de CNPs PAA (A) e respectivos espectros normalizados (B).

A B

B

A B

A


36

Figura III.14 – Espectros de fluorescência de CNPs G (A) e respectivos espectros normalizados (B).

Figura III.15 – Espectros de fluorescência de CNPs CL (A) e respectivos espectros normalizados (B).

Figura III.16 – Espectros de fluorescência de CNPs 180 (A) e respectivos espectros normalizados (B).

A B

A B

A B


37




A B

A B

A B


38

Através da visualização dos espectros de fluorescência verifica-se que os perfis de emissão

são diferentes em todas as amostras e que a emissão é dependente do CDO de excitação. Em todas

CNPs, com excepção das CNPs AC E, existe um nítido deslocamento da emissão de fluorescência

para o vermelho com o aumento do CDO de excitação, uma característica reconhecida das CNPs. As

maiores intensidades de emissão verificam-se para CDOs de excitação mais baixos. A intensidade

de fluorescência aumenta desde a excitação a 300nm até atingir o máximo, para depois decrescer

gradualmente com o aumento do CDO de excitação. Estas variações são típicas deste tipo de NPs.

As CNPs AC E também fogem à regra neste aspecto. Verificam-se também outras particularidades

das CNPs como a assimetria dos espectros e curvas de emissão bastante largas.

Os espectros de fluorescência das CNPs PVP, CNPs PAA, CNPs G e CNPs obtidas por

carbonização simples (figuras III.11 e III.13-19) apresentam nitidamente os típicos perfis de

emissão assimétricos das CNPs com prolongamento da emissão na direção do vermelho. Verifica-se

que os perfis de fluorescência mais intensos das CNPs PVP, CNPs PAA e CNPs G apresentam

emissão de fluorescência mais intensa no UV próximo e violeta com máximos absolutos com

excitação a 320nm (CNPs PVP e CNPs PAA – tabela III.5) e 330nm (CNPs G – tabela III.5). Os

perfis com maior intensidade de fluorescência das CNPs obtidas a partir da carbonização de cortiça

exibem emissão intensa no violeta e azul com máximo absoluto quando o CDO de excitação é

320nm ou 330nm (ver tabela III.6). Já para as CNPs CL o máximo absoluto de emissão ocorre

quando são excitadas a 310mn (ver tabela III.6) com a amostra a emitir fortemente no anil. Note-se

que todos os perfis de emissão são diferentes entre si. Apenas para as CNPs 220 e CNPs 260 são

muito similares (comparar figuras III.18 e III.17). Tal pode ser indicativo de que a variação de

temperatura na carbonização de cortiça entre as duas sínteses (40ºC) não seja muito preponderante

e, portanto, que estas CNPs possuam estruturas semelhantes. De maneira geral, com excepção da

semelhança verificada entre CNPs 220 e CNPs 260, é possível dizer que de precursores diferentes e,

para o caso da cortiça, diferentes temperaturas resultem CNPs com diferentes estruturas. Logo é

natural que os cromóforos responsáveis pela emissão também sejam diferentes.

O comportamento da emissão nas CNPs AC E (figura III.12) é particularmente interessante.

A fluorescência é mais forte no verde com a luz excitatória de maior energia usada. Depois existe

um deslocamento do máximo de emissão para o azul até à excitação a 340nm. A partir deste CDO,

ocorre o típico deslocamento do máximo da fluorescência o vermelho com o aumento do CDO de

excitação. A emissão é máxima a 360nm (máximo quase igualado com excitação a 300nm).

Observando o espectro de emissão aquando da excitação entre 300 e 330nm, os perfis de emissão

aparentam ser a sobreposição de duas curvas centradas em CDOs diferentes. Este comportamento

não é exibido por nenhuma outra amostra e sugere a presença de dois tipos distintos de cromóforos.

Tabela III.5 – Parâmetros espectroscópicos de emissão das CNPs obtidas por síntese hidrotérmica.

Parâmetros

ópticos CNPs PVP CNPs AC E CNPs PAA CNPs G

λem máx 404nm

(λex = 320nm)

438nm

(λex = 360nm)

382nm

(λex = 320nm)

414nm

(λex = 330nm)

FWHM 102nm

(λex = 320nm)

107nm

(λex = 360nm)

87nm

(λex = 320nm)

124nm

(λex = 330nm)

11%

(λex = 360nm)

10%

(λex = 360nm)

6%

(λex = 360nm)

4%

(λex = 360nm)


39

Tabela III.6 – Parâmetros espectroscópicos de emissão das CNPs obtidas por carbonização simples.

Parâmetros

ópticos CNPs CL CNPs 180 CNPs 220 CNPs 260 CNPs 300

λem máx 438nm

(λex = 310nm)

440nm

(λex = 320nm)

439nm

(λex = 320nm)

446nm

(λex = 330nm)

427nm

(λex = 320nm)

FWHM 114nm

(λex = 310nm)

118nm

(λex = 320nm)

106nm

(λex = 320nm)

108nm

(λex = 330nm)

137nm

(λex = 320nm)

2%

(λex = 360nm)

2%

(λex = 360nm)

5%

(λex = 360nm)

5%

(λex = 360nm)

3 %

(λex = 360nm)

Os FQYs calculados variam entre 2 e 11%. Através das tabelas III.5-6 podemos verificar que

os FQYs determinados demonstram que as NPs sintetizadas por via hidrotérmica são as mais

emissivas. É interessante verificar que nas CNPs obtidas a partir da carbonização da cortiça, o FQY

aumenta com o aumento da temperatura de carbonização até 5% quando a temperatura de síntese é

260ºC. As NPs produzidas pela carbonização a 300ºC são menos emissivas, com um FQY de 3%. A

diferença de FQYs entre CNPs produzidas por via hidrotérmica e carbonização simples não é

surpreendente. Considerando a necessidade de grupos funcionais na superfície das CNPs para a sua

luminescência e tendo em conta que o método hidrotérmico é feito em solução aquosa sob condições

extremas, é natural que as CNPs produzidas por esta via contenham grupos funcionais polares

(oxigenados e/ou azotados) na superfície das CNPs que na superfície de CNPs produzidas por

carbonização em que existe uma forte degradação térmica mas em que a oxidação ao ar é mais

moderada.

Na maioria das amostras de CNPs a fluorescência é mais intensa no violeta e azul com

máximos absolutos de emissão entre os 404 e os 446nm. As excepções são as CNPs PAA, que têm

máximo de emissão no UV próximo a 382nm e as CNPs AC E que emitem intensamente no verde e

no azul, com máximo absoluto de emissão a 438nm.

Os espectros das CNPs onde a emissão é a mais intensa têm FWHM com amplitudes a variar

entre os 87 e os 137nm. Larguras de banda elevadas são típicas deste tipo de NPs. As FWHM para

os restantes perfis de emissão não foram determinadas mas, pela observação dos espectros

normalizados, podemos inferir que terão aproximadamente os mesmos valores (notar que o efeito de

Raman distorce ligeiramente a percepção nalguns casos). A excepção serão os perfis de emissão das

CNPs AC E com CDO de excitação inferior a 340nm com FWHMs claramente maiores.

Além dos espectros de emissão também foram adquiridos espectros de excitação para cada

amostra de CNPs. A obtenção destes espectros é possível invertendo o funcionamento dos

monocromadores. Assim no registo de espectros de excitação o monocromador de emissão é

mantido fixo num CDO e o monocromador da excitação faz o varrimento. Um espectro de excitação

permite assim determinar quais as características de absorção das espécies que estão a contribuir

para o respectivo espectro de emissão. Os espectros de excitação foram obtidos fixando a emissão

no CDO apropriado, incrementando 10nm a cada nova aquisição mas para facilitar a percepção

apresentam-se os espectros de excitação recolhidos a CDO em intervalos de 20nm.


40

Figura III.20 – Espectros de excitação de CNPs PVP. Figura III.21 – Espectros de excitação de CNPs AC E.

Figura III.22 – Espectros de excitação de CNPs PAA. Figura III.23 – Espectros de excitação de CNPs G.

Figura III.24 – Espectros de excitação de CNPs CL. Figura III.25 – Espectros de excitação de CNPs 180.


41

Através da visualização dos espectros de excitação conseguimos reconhecer que existem

CNPs em que a fluorescência varia consoante a excitação de diferentes cromóforos e CNPs em que

são sempre os mesmos cromóforos a contribuir para a emissão. Os espectros de excitação permitem

ainda constatar que os cromóforos responsáveis pela emissão de fluorescência destas NPs absorvem

no UV próximo. As CNPs AC E são a excepção e absorvem no UV próximo e no visível (violeta e

azul).

Verifica-se que para as CNPs PVP, CNPs PAA, CNPs G, CNPs 180 e CNPs 220 um

deslocamento do máximo de absorção para o vermelho, sugestivo da que a excitação de diferentes

cromóforos é responsável pela emissão a diferentes CDOs (figuras III.20, III.22-23 e III.25-26).

Nas CNPs CL, CNPs 260 e CNPs 300 os máximos de absorção mantêm-se praticamente

invariáveis à medida que se vai varrendo os CDOs de emissão (figuras III.24 e III.27-28). Tal facto

aponta para uma emissão de fluorescência global como resultado da excitação dos mesmos

cromóforos. Destes espectros concluímos que estes cromóforos absorvem fortemente a cerca de

320nm.

Figura III.28 – Espectros de excitação de CNPs 300.

Figura III.26 – Espectros de excitação de CNPs 220. Figura III.27 – Espectros de excitação de CNPs 260.


42

O caso das CNPs AC E é diferente dos restantes (figura III.21). Tendo em conta os seus

perfis de emissão tal não surpreende. Estas CNPs exibem duas bandas de absorção distintas no

espectro de excitação, o que pressupõe a existência de dois tipos de cromóforos completamente

diferentes, como já foi mencionado. A banda da direita tem máximos que vão perdendo intensidade

e que se deslocam para o vermelho ao varrer o CDO de emissão. Neste caso deduz-se que há

diferentes cromóforos onde, aparentemente, os que absorvem entre 340 e 390nm serão sobretudo

responsáveis pela emissão da fluorescência de maior energia. Note-se que a banda centrada a 356nm

no espectro de absorção das CNPs AC E (figura III.3) é coincidente com a absorção destes

cromóforos responsáveis pela fluorescência de maior energia. Disto inferimos que a banda no

espectro de absorção é relativa à transição electrónica destes cromóforos. Na banda da esquerda

observa-se um aumento de intensidade à medida que se faz o varrimento dos CDOs de emissão e

constata-se que o seu máximo, centrado a cerca de 300nm, varia muito pouco. Verifica-se que o

máximo absoluto destes espectros passa da banda da direita para a da esquerda conforme é feito o

varrimento da emissão, e que este máximo mantem uma intensidade ligeiramente superior ao banda

da direita. Com esta análise deduz-se que a emissão de fluorescência de menor energia é o resultado

conjunto da relaxação dos cromóforos que absorvem a cerca de 300nm da banda da esquerda, e da

relaxação dos diferentes cromóforos da banda da direita. Tendo em conta as variações verificadas

nas duas bandas podemos ainda tirar outra ilação importante: a emissão a CDOs baixos possui

deslocamentos de Stokes pequenos e, à medida que se incrementa a emissão, os desvios de Stokes

aumentam.

III.2.2 Caracterização morfológica

III.2.2.1 Microscopia electrónica de transmissão

Foram obtidas imagens para todas as amostras de CNPs mas só foi possível encontrar NPs nas

amostras CNPs PVP, CNPs G, CNPs 260 e CNPs 300. Nas restantes não foram vistas NPs. Na

maioria dos casos houve a formação de um filme muito fino. Estes filmes são formados durante a

secagem por polímero residual. Como as CNPs possuem elementos de número atómico baixo, não é

esperado um contraste da imagem tão bom como para NPs metálicas. A formação de filmes é

responsável pela deterioração do contraste na imagem pois o filme, que é constituído por elementos

de número atómico idêntico ao das CNPs, também causa dispersão dos electrões. Nalguns casos o

filme rasgava quando o feixe de electrões incidia e enrolava em direcção ao cobre. No caso

particular das CNPs armazenadas em solução devia ter sido feita filtração prévia das amostras antes

de se adicionar uma gota à respectiva grelha de cobre. Como consequência desta falta, estas

amostras mostraram ter aglomerados de pequenas dimensões (de resíduos de polímero e/ou NPs

agregadas) em quantidades relevantes.

Das imagens não foi possível obter estatística suficiente para criar histogramas de dimensões.

Por esse motivo apresenta-se apenas uma tabela juntamente com cada imagem TEM com carácter

meramente elucidativo quanto aos tamanhos medidos por esta técnica.


43

Tabela III.7 – Tamanhos de CNPs PVP.

Exemplar 1 2 3 4 5

Dimensão (nm) 2,9 2,3 3,0 3,9 2,9

Tabela III.8 – Tamanhos de CNPs G.

Exemplar 1 2 3 4 5 6 7

Dimensão 6,4 5,4 9,4 5,9 2,9 7,1 6,3

Tabela III.9 – Tamanhos de CNPs 260.

Exemplar 1 2 3 4 5

Dimensão (nm) 6,1 5,4 6,7 8,0 5,9


Exemplar 1 2 3 4 5

Dimensão (nm) 6,2 6,1 4,9 8,7 4,7

Verifica-se que as CNPs PVP e CNPs G (figuras III.29-30) apresentam um contraste

superior ao das CNPs 260 e CNPs 300 (figuras III.31-32). A justificação para o facto pode residir na

falta de filtração destas últimas, visto que é observável algo que parece ser polímero aglomerado em

ambas imagens. Estes resíduos prejudicam o contraste das imagens. No caso das CNPs CL, CNPs

180 e CNPs 220 estes lixos não permitiram a distinção de NPs. De notar que nas imagens das CNPs

260 e CNPs 300 existem NPs que não foram identificadas mas os limites da maioria são de difícil

detecção. Nas grelhas de cobre com amostras de CNPs PAA e CNPs AC E não se visualizou NPs.

As imagens TEM não permitem um tratamento estatístico das dimensões mas permitem ter

uma noção do tamanho das CNPs. Os tamanhos medidos a partir das imagens TEM exibem

dimensões inferiores a 10nm (tabelas III.7-10). No caso das CNPs PVP e CNPs G estas dimensões

são consistentes com [46] e [48]. Além disso as imagens permitem ver que as CNPs apresentam

fundamentalmente formas com simetria esférica.

Figura III.29 – Imagem TEM de CNPs PVP. Figura III.30 – Imagem TEM de CNPs G.

Figura III.31 – Imagem TEM de CNPs 260. O

filme fino formado enrolou em direcção ao cobre. Figura III.32 – Imagem TEM de CNPs 300.


44

III.2.2.2 Microscopia electrónica de varrimento

Foram adquiridas imagens SEM para todas as amostras de CNPs. Nas imagens das CNPs

PAA e CNPs 260 não são visíveis NPs. Na maioria das imagens SEM notava-se uma clara

distorção. Essa distorção dever-se-á fundamentalmente à cobertura das CNPs com um filme fino.

Nalguns casos as NPs moviam-se bastante e era impossível adquirir imagens. O facto de a maioria

das amostras terem uma cobertura de um filme polimérico fino dificultou a obtenção de imagens

com bom contraste. Apesar destas limitações foram tiradas imagens e, mesmo não correspondendo

ao tamanho real, permitem a visualização destas nanoestruturas.

Tendo em conta o que foi observado em TEM, constatou-se que a filtração de CNPs

armazenadas em solução foi um procedimento correcto para a remoção de pequenos lixos.

Nalgumas imagens existem NPs suficientes para fazer um tratamento estatístico e apresenta-se o

respectivo histograma de dimensões. Para as restantes adoptou-se a abordagem feita em III.2.2.1.

Figura III.33 – Imagem SEM de CNPs PVP.

Tabela III.11 – Tamanhos de CNPs PVP.

Exemplar 1 2 3 4

Dimensão (nm) 46 47 26 25

Figura III.34 – Imagem SEM de CNPs CL.

Tabela III.12 – Tamanhos de CNPs CL.

Exemplar 1 2 3 4 5 6

Dimensão (nm) 46 64 47 36 46 54

Figura III.35 – Imagem SEM de CNPs 180.


Exemplar 1 2 3 4 5

Dimensão (nm) 108 121 104 98 130

Figura III.36 – Imagem SEM de CNPs 220.


Exemplar 1 2

Dimensão (nm) 64 86

1 2

3 4

1

2 3

4 5

6

1 2

1

2

3 4

5


45

Figura III.37 – Imagem SEM de CNPs AC E.

Figura III.38 – Histograma de dimensões de CNPs AC E.

Figura III.39 – Imagem SEM de CNPs G.

Figura III.40 – Histograma de dimensões de CNPs G.

Figura III.41 – Imagem SEM de CNPs 300. Figura III.42 – Histograma de dimensões de CNPs 300.

Nas imagens SEM das CNPs PVP e CNPs G é evidente o fraco contraste na imagem das

NPs, provavelmente, devido ao filme fino de polímero que as envolve (figuras III.33 e III.39).

Aquando da visualização das CNPs AC E por SEM (figura III.37) observava-se nitidamente o

movimento das NPs devido à interacção com o feixe de electrões. A consequência é uma forte


46

distorção das imagens obtidas. Para o histograma destas CNPs (figura III.38) foram contabilizadas

apenas as NPs com formas mais esféricas.

Os tamanhos medidos para as CNPs PVP estão acima de 24nm (tabela III.11) e as dimensões

médias determinadas a partir das NPs seleccionadas para criar os histogramas de CNPs AC E e

CNPs G (figuras III.38 e III.40 respectivamente) são 30nm e 40nm, respectivamente. Como os

tamanhos medidos estão em completo desacordo com [46] [47] [48], destas imagens apenas

podemos mencionar a forma quase esférica destas CNPs, se ignorarmos algumas das partículas nas

imagens de CNPs AC E e CNPs G que, ou são aglomerados, ou são NPs extremamente distorcidas.

Genericamente as imagens SEM das CNPs obtidas por carbonização a seco exibem melhor

qualidade, embora o contraste esteja longe do ideal excepto para as CNPs 300.

Relativamente às CNPs CL, estas aparentam ter formas esféricas (figura III.34). A

interpretação da imagem é difícil pois o contraste não é bom e isso dificulta a distinção de

aglomerados que parecem estar presentes e podem ser identificados erroneamente como NPs. Por

este mesmo motivo os tamanhos medidos (tabela III.12) também não são fiáveis.

No que toca à imagem SEM das CNPs 180 (figura III.35) observam-se sobretudo resíduos

poliméricos que dificultam a distinção de NPs. Além dos resíduos, parecem existir NPs com formas

e tamanhos variados. São identificadas algumas NPs por terem uma forma mais esférica. Os

tamanhos destas CNPs identificadas parecem rondar os 100nm (ver tabela III.13). Das CNPs 220

apenas se obteve uma imagem numa região onde existia pouco lixo (figura III.36). O contraste da

imagem é mau mas parece ser evidente que as NPs têm forma esférica. Mais uma vez a fraca

qualidade da imagem não permite a identificação do tamanho real das CNPs visíveis.

Para as CNPs 300 foram adquiridas as imagens SEM com melhor contraste. Na imagem

apresentada (figura III.41) é perfeitamente claro que estas NPs possuem formas esféricas. As CNPs

300 têm uma dimensão média de 50,5nm com uma distribuição de tamanhos consideravelmente

larga (figura III.42). Através das imagens SEM parece existir uma redução gradual dos tamanhos

das NPs obtidas a partir da carbonização da cortiça com a temperatura mas, infelizmente, a fraca

qualidade das imagens de CNPs 180 e CNPs 220 e a insuficiência de dados não permitem

corroborar esta suposição.

III.2.2.3 Dispersão dinâmica da luz

Com a técnica de DLS pretendeu-se a determinação dos diâmetros hidrodinâmicos das

CNPs. A técnica é simples de usar e o equipamento fácil de manusear. Obtiveram-se tamanhos para

três amostras: CNPs PVP, CNPs CL e CNPs 300. Não é claro o motivo pelo qual existem CNPs sem

sinal e outras com bom sinal.

Para apresentar os resultados das três amostras, foi selecionado um dos ensaios com melhor

sinal: para cada amostra, foi escolhido um ensaio à concentração em que os dados obtidos

apresentem maior concordância, ou seja, com índices de polisdispersivade mais baixos e com

tamanhos médios (Z-average) que sejam consensuais nessa concentração. A grande semelhança

entre Z-averages e índices de polidispersividade nos ensaios feitos a uma dada concentração aponta

para as condições experimentais ideais em DLS. Com efeito, foi verificado que se tivesse sido

escolhido outro ensaio à mesma concentração a respectiva distribuição de tamanhos seria


47

praticamente a mesma. Adicionalmente existia também uma grande similitude entre dados obtidos a

diferentes concentrações. Tendo isto em conta, estes resultados são considerados bastante precisos.

Figura III.43 – Distribuição de tamanhos DLS de CNPs PVP (A), CNPs CL (B) e CNPs 300 (C).

Tabela III.15 – Medições obtidas por DLS.

Amostra Z-average (nm) Índice de polidispersividade

CNPs PVP 8,8 0,19

CNPs CL 86 0,25

CNPs 300 48 0,49

A distribuição de tamanhos determinados por DLS das CNPs PVP é bastante diminuta

(figura III.43 A). O diâmetro médio destas CNPs determinado pelo método dos cumulantes (Z-

average) é 8,8nm e o índice de polidispersividade é relativamente baixo (tabela III.15). As CNPs CL

e CNPs 300 possuem distribuições de tamanhos maiores (figura III.43 B e C) com valores de Z-

average uma ordem de grandeza mais elevada: 86 e 48nm para as CNPs CL e CNPs 300,

respectivamente; os índices de polidispersividade apresentam valores superiores (ver tabela III.15).

Habitualmente os tamanhos medidos por DLS são maiores que as dimensões reais, pois

referem-se ao raio hidrodinâmico (o software do aparelho usado calcula directamente os diâmetros

através do algoritmo dos cumulantes). Adicionalmente, com a técnica DLS, as partículas de maiores

dimensões têm maior peso nos resultados pois dispersam mais a luz, mesmo que em número

francamente inferior face a NPs de tamanhos mais reduzidos. Neste sentido a análise por DLS das

CNPs PVP está em concordância com as dimensões esperadas para estas NPs [46] e com a análise

TEM. No que diz respeito às CNPs CL e CNPs 300, a análise dos resultados obtidos por DLS está

em concordância com as dimensões observadas na análise feita por SEM mas, para as CNPs 300,

não está de acordo com as dimensões apuradas por TEM. No entanto realça-se que em SEM se

obtiveram imagens de CNPs 300 com excelente contraste. Assim a forte correlação entre os

resultados determinados por DLS e os obtidos por SEM para as CNPs 300 ganha destaque.

A amostra de CNPs AC E, em solução, é muito escura mesmo a baixas concentrações e

absorve a luz incidente (535nm). Após terem sido tentadas medições para várias diluições chegou-se

à conclusão que não era possível arranjar um compromisso entre absorvância e concentração de

CNPs dentro do regime de detecção do instrumento.

Não existe uma explicação certa para a impossibilidade na obtenção de sinal de DLS para as

CNPs PAA e CNPs G. Tendo em conta que foi possível obter sinal para as CNPs PVP, era esperado

A B C


48

que também fosse possível para estas NPs. Foram feitos ensaios para várias concentrações que não

tiveram sucesso. Quanto às CNPs 180, CNPs 220 e CNPs 260 também não foi possível obter sinal

de DLS. A explicação pode residir na baixa concentração de NPs em solução: os rendimentos de

reacção são aparentes e as quantidades de produto não reflectem a massa real em NPs.

III.2.2.4 Difracção por raios-X

Com a técnica DRX pretende-se simplesmente averiguar se as amostras de CNPs são

nanoestruturas com carácter cristalino ou amorfo.

Figura III.44 – Difractograma de CNPs PVP. Figura III.45 – Difractograma de CNPs AC E.

Figura III.46 – Difractograma de CNPs PAA. Figura III.47 – Difractograma de CNPs G.

Figura III.48 – Difractograma de CNPs CL. Figura III.49 – Difractogramas de CNPs 180,

CNPs 220, CNPs 260 e CNPs 300.


49

Em relação às CNPs obtidas por síntese hidrotérmica verificámos que em todas as amostras

existe uma banda larga com centros localizados entre os 20 e os 25º. Estas bandas são o resultado da

sobreposição de múltiplos picos de difracção devido à desorganização estrutural dos átomos nas

CNPs e portanto, estas CNPs possuem natureza amorfa [23] [63].

No caso das CNPs PVP (figura III.44) existe uma segunda banda larga centrada a cerca de

11º que é típica da PVP à qual se aplica o argumento anterior e que também reflecte natureza amorfa

[64]. No difractograma das CNPs AC E parecem existir sobreposições desde ângulos muito baixos,

sendo impossível distinguir o início da banda (figura III.45). Para amostra CNPs PAA, é visível a

sobreposição de duas bandas largas, uma centrada a cerca de 20º mais intensa e outra por volta dos

35º (figura III.46). No difractograma das CNPs CL (figura III.47) verifica-se a existência de uma

banda larga centrada a cerca de 28º atribuída a desorganização da estrutura atómica das NPs e

observa-se ainda a presença de alguns picos nesta banda que poderão indicar uma fase cristalina na

amostra de CNPs. Aparentemente a estrutura destas CNPs tem carácter semi-cristalino.

No que toca à análise dos difractogramas das CNPs produzidas por carbonização de cortiça

(figura III.49) observa-se em todos difractogramas uma banda larga, tal como a visualizada nas

CNPs obtidas por síntese hidrotérmica, que está centrada a 22º. Observam-se também vários picos

estreitos, típicos de estruturas cristalinas. Durante os ensaios SEM eram visíveis cristais que se

formaram devido à secagem. Tendo em conta que as CNPs sintetizadas a partir de cortiça não foram

dialisadas é provável que as amostras estejam contaminadas com os sais que formaram os cristais

visíveis em SEM. Estes picos estreitos serão resultado da difracção por cristais formados por estes

sais que, apesar de serem em muito menor quantidade que as CNPs, difractam fortemente os raios-

X. No entanto é estranho que não haja grande correlação destes picos entre as diferentes amostras.

Reunindo estas informações, acredita-se que estas CNPs possuam uma estrutura desorganizada, ou

seja, são de natureza amorfa tendo por base a larga banda comum a todas as amostras nos

difractogramas, e que os picos estreitos apareçam nos difractogramas devido a cristais formados por

sais existentes em solução.

III.2.3 Caracterização da estrutura química

III.2.3.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier

Para identificar os grupos funcionais presentes nas CNPs foi feita uma análise FTIR

detalhada de cada amostra bem como das moléculas precursoras usadas na síntese hidrotérmica.

Assim é possível verificar se existem evoluções na estrutura química resultantes do tratamento

hidrotérmico. Relativamente às carbonizações a seco, apenas se obtiveram os espectros das CNPs.

Não se apresenta o espectro das CNPs 220 devido a pobre qualidade deste.

Os espectros são apresentados numa gama entre os 3800 e os 750cm-1

. Acima de 3800cm-1

não se verifica absorção em nenhuma das amostras. Por outro lado, com a técnica de amostragem

ATR utilizada, as absorvâncias obtidas a NDOs inferiores a 750cm-1

deixam de ser fiáveis. A região

das impressões digitais (fingerprint) de cada amostra (1500 a 750cm-1

) também foi identificada

embora a atribuição dos picos e bandas seja feita com menor fiabilidade relativamente ao restante


50

espectro. A análise FTIR dos precursores usados em sinteses hidrotérmicas, apresentada no apêndice

A, é bastante útil na análise dos espectros das respectivas CNPs.

Em ATR as amostras estão expostas ao ar. Picos ou bandas juntos a 2350cm-1

são atribuídos

ao CO2 atmosférico a menos que sejam particularmente intensos. Também é importante ter em conta

que a linha de base não é uniforme nas CNPs de cortiça. Isto deve-se às diferentes espessuras da

amostra no silício. A atribuição de picos e bandas de absorção no IV foi feita de acordo com [65],

[66] e [67]. Apresentam-se seguidamente os espectros de IV para cada amostra de CNPs com a

análise respectiva a cada tipo de CNPs feita nas tabelas III.16-21.

Tabela III.16 – Atribuição de picos a CNPs PVP.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupo

funcionais

845 C-H Deformação Alcano




1103 C-N Deformação Amida






1493 C-H Estiramento Alcano

1646 C=O Estiramento Amida I



3413 O-H Estiramento Água

Comparando o espectro das CNPs PVP (figura III.50) com o espectro da PVP (ver figura

A.2 do apêndice A) verifica-se que são idênticos. Os picos e bandas são análogos. Os desvios de

número de onda (NDO) estão dentro do limite de resolução do aparelho. A amida está bem

identificada pelo intenso pico amida I a 1646cm-1

do carbonilo. A única diferença visível é o

aumento da intensidade deste pico e pode sugerir o aumento de número de carbonilos nas CNPs

como resultado de processos de oxidação ocorridos no decurso da síntese hidrotérmica. A atenuação

dos picos a 1016cm-1

e 2889cm-1

é observada mas não é relevante. A banda centrada a 3413cm-1

não

se deve à ligação N-H da amida visto ser uma amida terciária (ligação N-H é inexistente em amidas

terciárias), mas sim a vibrações O-H de água, que foi absorvida pela amostra higroscópica.

Três situações podem ter ocorrido: a) a temperatura e/ou tempo de síntese foram

insuficientes e apenas uma fracção de polímero foi efectivamente transformada em CNPs, b) a

quantidade de polímero inicial é demasiado grande para que ocorra uma transformação eficaz em

CNPs ou c) a estrutura química das CNPs é muito parecida com a da PVP. Seja qual for o caso,

parece existir uma grande fracção de PVP na amostra. No entanto, a presença de CNPs é

incontornável devido aos resultados de fluorescência, TEM e SEM. A análise FTIR para as CNPs

PAA e CNPs G é análoga à feita para as CNPs PVP e está feita no apêndice A (figuras A.10-11 e

tabelas A.5-6).

Figura III.50- Espectro FTIR de CNPs PVP.


51

Tabela III.17 – Atribuição de picos a CNPs AC E.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupo

funcional

1061 C-H

C-O

Deformação

Estiramento

Aromático

Álcool

1186 C-N Estiramento Amina

1288

C-O

C-O-C

C-O

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Éter

Epóxido

Ácido carb.

1373 C-H Deformação Alifático

1435 O-H Deformação Ácido carb.

1549 N-H

C=C

Deformação

Estiramento

Amida II

Aromático


1765 C=O Estiramento Acilo


[3400-2400] O-H Estiramento Ácido carb.

[3500-3200] O-H

N-H

Estiramento

Estiramento

Álcool

Amida A

Por oposição com o caso anterior, o espectro FTIR das CNPs AC E (figura III.51) mostra

profundas transformações decorrentes da reacção hidrotérmica (comparar com espectros FTIR do

ácido cítrico, figura A.4, e da etilenodiamina, figura A.6, no apêndice A). Como as reacções

ocorridas no interior do reactor de teflon não são devidamente conhecidas, a análise FTIR torna-se

bastante complicada. Ainda assim o espectro revela a presença de grupos funcionais expectáveis.

Um das características mais importantes mostradas no espectro é a formação de ligações

amida entre aminas e ácidos carboxílicos evidenciadas pelo pico amida I a 1641cm-1

. A absorção no

IV por parte de ácidos carboxílicos está parcialmente sobreposta com as amidas mas parece evidente

na larga banda de média intensidade típica deste grupo funcional entre os 3400 e 2400cm-1

. É

provável também a existência de grupos álcool e que a sua larga banda de absorção (3500 a 3200cm-

1) esteja sobreposta com a região da amida A. Nesta banda também é esperada a existência de

contribuições das vibrações O-H da água. No fundo, ácidos carboxílicos e álcoois são esperados

pois estes grupos funcionais existem no ácido cítrico. O pico a 1549cm-1

é, provavelmente, uma

sobreposição da absorção amida II (geralmente de menor intensidade que a amida I) com a absorção

de uma dupla ligação aromática pois a absorção é mais intensa que seria de esperar se fosse devida a

um ou outro grupo separadamente. Isto é particularmente importante pois parece mostrar que houve

aromatização na reacção. Aliás, a pequena banda a NDO acima de 3000cm-1

(não identificada)

sugere a presença de ligações C-H aromáticas. A restante região do espectro (região fingerprint)

possui múltiplos picos sobrepostos e é totalmente diferente das fingerprint das moléculas

precursoras. Destaca-se a existência de um pico que pode ser atribuido a ácidos carboxílicos,

epóxidos e éteres a 1288cm-1

e a possível existência de aminas aromáticas a 1186cm-1

, não

existentes nos precursores e que serão resultado da reacção hidrotérmica. Nesta região existem,

aparentemente, contribuições de muitos grupos funcionais distintos das CNPs o que torna a análise

extremamente difícil; os picos existentes foram imputados às respectivas ligações mais prováveis,

no entanto, a probabilidade de erro na atribuição é considerável.

Figura III.51 – Espectro FTIR de CNPs AC E.


52

A presença de grupos funcionais carregados é necessária para a solubilidade das CNPs.

Tanto o ácido cítrico como a etilenodiamina são solúveis devido aos seus grupos funcionais polares

(ácidos carboxílicos, álcoois e aminas primárias) e portanto é natural que a solubilidade das NPs se

deva também a grupos funcionais polares na sua superfície. Neste aspecto esta análise faz todo o

sentido na medida em que é demonstrada a presença inequívoca de amidas e ácidos carboxílicos.

Figura III.52 – Espectro FTIR de CNPs CL.

Tabela III.18 – Atribuição de picos a CNPs CL.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais

903 C-H

C-H

Deformação

Deformação

Alcano

Aromático

1120 C-O

C-O-C

Estiramento

Estiramento

Álcool

Éter

1245

C-O-C

C-O-C

C-N

C-O

C-O

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Éter

Éster

Amina

Epóxido

Ácido carb.

1271

C-O-C

C-O-C

C-N

C-O

C-O

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Éter

Éster.

Amina

Epóxido

Ácido carb.


1495 C=C Estiramento Aromático

1564 C=C

N-H

Estiramento

Deformação

Aromático

Amina

1695 C=O

C=O

Estiramento

Estiramento

Cetona

Ácido carb.


[3500-3200] O-H

O-H

Estiramento

Estiramento

Álcool

Água

A composição química das cascas de laranja abrange um grande número de moléculas

diferentes. Os principais responsáveis pela massa das cascas (com excepção da água) são hidratos de

carbono, nomeadamente a celulose e derivados, açucares etc. No entanto também existem outras

moléculas na composição das cascas tais como proteínas e ácidos gordos. Devido à grande

quantidade de moléculas diferentes que compõem as cascas de laranja, a atribuição de ligações

específicas a picos do espectro FTIR das CNPs CL (figura III.52) é bastante complicada de efectuar

com exactidão. A região fingerprint é a que coloca maior desafio na identificação. Por esse motivo,

aos picos são atribuídas múltiplas ligações possíveis. No fundo é muito provável que estas mesmas

ligações existam e que as contribuições das respectivas absorções se sobreponham no espectro.

É notória a presença de grupos funcionais polares como álcoois e ácidos carboxílicos. Estes

deverão ser os principais responsáveis pela solubilidade destas CNPs em água. A banda geralmente

atribuída a álcoois (3500-3200cm-1

) está presente mas sobreposta com a da água (dada a


53

possibilidade de o liofilizado absorver água da atmosfera por ser higroscópico). Ácidos carboxílicos

também estarão presentes, evidenciados pela sua larga banda de absorção característica. Esta banda,

não sendo tão visível como no caso dos CNPs AC E, não deixa de aparecer, bem com um ombro a

1695cm-1

. Este ombro encontra-se na região de absorção típica de ligações C=O de ácidos

carboxílicos mas também pode ser atribuído a cetonas. É importante constatar a existência de picos

correspondentes a grupos aromáticos. Um destes, a 1564 cm-1

,

é particularmente intenso (a

contribuição de aminas deverá ser marginal). A aromatização pode ter ocorrido durante o tratamento

térmico das cascas e é possível que existam estruturas aromáticas em abundância nestas CNPs.

Tabela III.19 – Atribuição de picos a CNPs 180.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupo

funcionais

854 C-H

C-H

Deformação

Deformação

Alifático

Aromático

930 C-H Deformação Alceno

1014 C-O Estiramento Álcool

1082 C-O

C-O-C

Estiramento

Estiramento

Álcool

Éter

1290 C-O-C

C-O

Estiramento

Estiramento

Éster

Ácido carb.

1342 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Álcool

Alifático

1373 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Álcool

Alifático

1448 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Ácido carb.

Alifático


1716 C=O

C=O

Estiramento

Estiramento

Ácido carb.

Cetona

2872 C-H Estiramento Alifático


[3500-3200] O-H

O-H

Estiramento

Estiramento

Álcool

Água

O espectro FTIR das CNPs 180 (figura III.53) acusa a presença de grupos funcionais típicos

das principais macromoléculas que compõe a cortiça: a suberina e lignina (ver tabela B.1 e figuras

B.2 e B.3 do apêndice B). Por existirem muitas ligações diferentes existem também muitas

sobreposições, especialmente na região fingerprint, tal como no caso anterior, dificilmente se pode

atribuir uma ligação específica a cada pico.

A 1716cm-1

aparece o pico característico da ligação C=O dos ácidos carboxílicos. Os picos

destes carbonilos são geralmente muito intensos mas neste caso surge bastante reduzido, o que pode

sugerir a presença de poucos ácidos carboxílicos. A banda O-H característica dos ácidos

carboxílicos (3400-2400cm-1

) também não é visível (talvez mascarada pela linha de base irregular) o

que reforça a sugestão anterior. O pico associado a carbonilos também pode ser atribuído a cetonas.

Observa-se um ombro, à esquerda do pico a 1716cm-1

, que se encontra na região de absorção de

carbonilos em ésteres. Note-se que também existe uma banda de absorção à direita deste pico.

Figura III.53 – Espectro FTIR de CNPs 180.


54

Possivelmente, aqui a absorção dever-se-á a grupos aromáticos e alcenos. Não é provável que esta

banda seja resultado da absorção de amidas visto que a presença de grupos nitrogenados na

constituição da cortiça ser bastante reduzida (ver tabela B.1 no apêndice B).

A 1082cm-1

encontra-se o pico mais intenso da amostra. O pico pode ser atribuído a dois

grupos distintos: álcoois e éteres. Relativamente as ésteres a absorção deveria ocorrer a NDOs

ligeiramente maiores. De facto, parece existir um ombro à esquerda deste pico que indica a

sobreposição de absorções de álcoois, éteres e ésteres. A solubilidade das CNPs deverá estar a cargo

destes grupos3 e de ácidos carboxílicos. Entre os 3500 e 3200cm

-1 temos uma larga banda que é

característica das ligações O-H de álcoois e água. É expectável que a banda seja a contribuição das

absorções dos dois grupos.

Grupos alifáticos (alcanos e alcenos) também são evidentes pela presença dos picos a 2872 e

2970cm-1

. Entre estes valores também se verificam regiões de absorção que devem ser derivadas

destes grupos. O espectro FTIR parece indicar a presença dos principais grupos funcionais que

fazem parte da constituição da cortiça. Provavelmente a temperatura de síntese não degradou

significativamente estes grupos. A análise 1H-RMN feita em III.2.3.2 corrobora esta análise FTIR.

Tabela III.20 – Atribuição de picos a CNPs 260.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais

820 C-H

C-H

Deformação

Deformação

Alifático

Aromático



1055 C-O

C-O-C

Estiramento

Estiramento

Álcool

Éter

1090 C-O

C-O-C

Estiramento

Estiramento

Álcool

Éter

1159 C-O

C-O-C

Estiramento

Estiramento

Álcool

Éter

1198 C-O-C

C-O

Estiramento

Estiramento

Éter

Ácido carb.

1375 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Álcool

Alifático

1448 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Ácido carb.

Alifático


1716 C=O

C=O

Estiramento

Estiramento

Ácido carb.

Cetona



[3500-3200] O-H

O-H

Estiramento

Estiramento

Álcool

Água

3 No entanto ésteres em cadeias alifáticas longas reduzem solubilidade. Os principais polímeros da cortiça,

que são completamente insolúveis em água, são constituídos por cadeias deste género.

Figura III.54 – Espectro FTIR de CNPs 260.


55

O sinal do espectro FTIR das CNPs 260 (figura III.54) é pior que o obtido para as CNPs 180

(figura III.53) devido ao efeito crescente da linha de base mas as absorções presentes dever-se-ão a

ligações semelhantes. Consequentemente, análise FTIR para as CNPs 260 é semelhante (comparar

tabela III.20 com tabela III.19).

O espectro parece demonstrar a presença de grupos alifáticos e aromáticos. Face à banda de

absorção na amostra de CNPs 180 situada na gama entre 1500 e 1700cm-1

, aparece um pico a

1637cm-1

mais intenso. Este pico deverá ser originado pela absorção de estruturas aromáticas. Tendo

em conta a temperatura de carbonização superior, faz todo o sentido que as ligações mais

susceptíveis como alcenos e ésteres tenham sido quebradas, que compostos alifáticos tenham

volatilizado e que tenham ocorrido reacções de aromatização durante a reacção.

Parecem também evidentes as absorções por parte de ligações C-O de álcoois e C-O-C de

éteres, ligações essas que, aparentemente, também presentes nas CNPs 180. As contribuições de

ésteres deverão ser marginais.

Tabela III.21– Atribuição de picos a CNPs 300.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais


1089

C-O

C-O-C

C-O

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Álcool

Éter

Ácido carb.

1375 C-H

O-H

Deformação

Deformação

Alifático

Álcool

1578 C=C

C=C

Estiramento

Estiramento

Alceno

Aromático

1706 C=O Estiramento Ácido carb.


No espectro FTIR das CNPs 300 (figura III.55) subsistem poucos picos de absorção no IV.

O pico mais intenso, a 1089cm-1

, pode ser atribuído a álcoois, éteres e ácidos carboxílicos. Este pico

é consideravelmente largo e pressupõe a sobreposição da absorção destes grupos funcionais. A

vibração C-O de ácidos carboxílicos costuma dar-se a NDOs maiores. No entanto não é invulgar a

ligação C-O de ácidos carboxílicos absorver a menores NDOs (ver figura A.7 no apêndice A). A

banda referente à ligação O-H dos ácidos carboxílicos, entre 3400 e 2400cm-1

, e o ombro localizado

a 1706cm-1

(ligação C=O) evidenciam a presença deste grupo funcional, embora as intensidades dos

sinais referentes a estas absorções sejam fracas. Estes grupos funcionais também parecem estar

presentes nas amostras de CNPs 180 e CNPs 260. Não são detectados ésteres. Não é provável que

estas ligações tenham resistido ao tratamento térmico. Verifica-se ainda o desaparecimento das

absorções a NDOs logo abaixo dos 3000cm-1

respectivas a estiramentos de ligações C-H alifáticas.

Tal é sugestivo da volatilização de compostos alifáticos durante o tratamento térmico.

No espectro FTIR não se visualiza a presença de estiramentos associados a ligações O-H,

geralmente definidos na banda entre os 3500 e 3200cm-1

, o que leva a considerar que o pico a

1089cm-1

se deve a vibrações de éteres e ácidos carboxílicos e que o pico 1375cm-1

se deva

fundamentalmente a deformações em ligações C-H alifáticas. Em relação à presença de grupos

Figura III.55 – Espectro FITR de CNPs 300.


56

funcionais oxigenados, a análise FTIR demonstra a existência destes mas eram esperados picos de

C=O mais intensos e o aparecimento da banda de absorção de ligações O-H. No fundo álcoois e

ácidos carboxílicos deveriam ser os principais responsáveis pela solubilidade em meio aquoso.

Como estas CNPs foram sintetizadas à temperatura mais elevada são esperados mais grupos

funcionais aromáticos que nas outras amostras de CNPs de cortiça carbonizada. Com efeito, a

1578cm-1

existe um pico que é atribuído, essencialmente a grupos aromáticos. Contribuições de

ligações C=C de alcenos devem ser negligenciáveis. Seguindo o raciocínio da análise anterior, esta

amostra de CNPs obtida a partir de cortiça carbonizada, é aquela onde houve maior volatilização de

compostos alifáticos e maior número de aromatizações. De facto, a absorção nestas regiões de

grupos aromáticos parece intensificar-se com o aumento da temperatura de síntese. Este raciocínio

tem cabimento na análise feita por 1H-RMN, feita a seguir.

III.2.3.2 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão

Foram caracterizadas por 1H-RMN todas as amostras de CNPs obtidas por carbonização da

cortiça. Os espectros de 1H-RMN permitem estabelecer que com o aumento de temperatura existe

diminuição no número de compostos alifáticos nas CNPs concomitantemente com o aumento do

número de compostos aromáticos.

As CNPs que foram liofilizadas para determinação de rendimentos de reacção foram

dispersas em água deuterada, D2O, usada como solvente. A D2O não é 100% pura e contém

vestígios de DHO e água. Adicionalmente as amostras são higroscópicas e podem ter absorvido

alguma água. Além disso, a liofilização nunca remove totalmente a água das amostras. Por estes

motivos nos espectros 1H-RMN observa-se um pico muito intenso a 4,71ppm correspondente ao

desvio químico da água e DHO. De facto este pico é dominante em todos os espectros e

efectivamente, indicia uma predominância de protões da molécula de água. Isto traduz-se numa

diminuição do sinal da amostra. As regiões dos desvios químicos dos protões foram identificados

atendendo a [68].

O espectro 1H-RMN adquirido para as CNPs 300 tinha muito pouco sinal e, por esse motivo,

não é apresentado. As amostras de CNPs 220 e CNPs 260 estão, muito provavelmente,

contaminadas com outro solvente utilizado anteriormente. A contaminação é evidenciada pelas duas

regiões mais proeminentes destes espectros: um quarteto centrado a 3,58ppm e um tripleto centrado

a 1,10ppm. A contaminação pode ter sido provocada por restos de etanol ou éter etílico [69].

No espectro de protão das CNPs 180 (figura III.56) temos a presença de grupos alifáticos

evidenciados pela ressonância de protões em grupos alquilo (R-CH3, R1-CH2-R2 e R1-CH-R2R3). Os

desvios químicos destes grupos encontram-se na região entre 1,08 e 4,09ppm. O pico dominante,

centrado a 1,09ppm e os dois picos a 1,19 e 1,26ppm são relativos a hidrocarbonetos saturados. Os

desvios químicos entre 1,87 e 4,09ppm são relativos à ressonância de protões de grupos alquilo em

éteres, grupos metóxido, álcoois e grupos alquilo ligados a grupos com ligações duplas de alcenos

ou de carbonilos. Os carbonilos podem ser de ésteres e de derivados de ácidos carboxílicos.

Observe-se a região entre 3,2 e 3,8ppm, indicadora de múltiplos picos sobrepostos e impossíveis de

identificar com clareza.


57

Figura III.56 – Espectro 1H-RMN de CNPs 180. O inset exibe a região aromática ampliada.

Entre 6,87 e 8,13ppm temos uma região de picos correspondentes a desvios químicos

associados a protões em grupos aromáticos (inset da figura III.56).

Hidrocarbonetos saturados, alcenos, éteres, ésteres, álcoois e grupos aromáticos são

abundantes nas principais estruturas que compõem a cortiça, suberina e lignina (ver figuras B.2 e

B.3 do apêndice B), e como a temperatura de síntese é relativamente baixa não é expectável que

exista uma intensa degradação destes polímeros, nomeadamente em ligações duplas. Neste aspecto a

análise 1H-RMN está de acordo com a feita em FTIR.

Figura III.57 – Espectro

1H-RMN de CNPs 220. O inset exibe a região aromática ampliada.

No espectro de protão das CNPs 220 também temos a presença de grupos funcionais

alifáticos ligados a grupos alquilo (figura III.57). Neste caso a contaminação pode provocar perda de

sinais significativos pois é possível que estejam sobrepostos com os desvios químicos do CH3

tripleto e do CH2 quarteto do etanol ou do éter etílico.


58

Os grupos alifáticos são exibidos numa gama de desvios químicos entre 1,26 e 3,28ppm. A

presença de hidrocarbonetos saturados é denunciada pelo pico a 1,26ppm. Não é possível investigar

a degradação de hidrocarbonetos com o tratamento térmico devido à contaminação. Os picos entre

2,15 e 3,28ppm são relativos éteres, álcoois e derivados de ácidos carboxílicos. A grande

diminuição de sinal nesta região pode ser atribuída a degradação ocorrida durante a reacção

(designadamente a volatilização de grupos alifáticos). Os grupos com ligações duplas, tais como

ésteres e alcenos oxidam facilmente com oxigénio molecular a temperaturas elevadas. Apesar de

existirem menos picos, observa-se o aumento de sinal nos desvios químicos entre 2,15 e 3,28ppm.

Isto pressupõe a diminuição de ligações mais reactivas e o possível aumento de grupos oxidados no

material.

Os protões ligados a grupos aromáticos também estão presentes no espectro na região entre

6,21 a 8,04ppm (inset da figura III.57). Relativamente às CNPs 180 estes grupos serão, porventura,

mais numerosos mas como o sinal neste espectro é mais fraco que o do anterior não se pode

confirmar esta suposição. Efectivamente, com temperatura de síntese mais elevada, são esperadas

mais reacções de aromatização [70].

Figura III.58 - Espectro 1H-RMN de CNPs 260. Em inset é exibida a região aromática ampliada.

No espectro 1H-RMN CNPs 260 (figura III.58) verifica-se a mesma contaminação com

solvente observada no espectro anterior. Os grupos alifáticos encontram-se entre 1,51 e 3,27ppm,

com os hidrocarbonetos a serem identificados pelo pico a 1,51ppm. Os picos a 2,15ppm, 2,60ppm e

3,27ppm são referentes a éteres, álcoois e derivados de ácidos carboxílicos. Ésteres e alcenos já não

deverão estar presentes. Existe uma clara diminuição no número de grupos alifáticos face a ambos

casos anteriores.

No que toca aos grupos aromáticos, verifica-se um aumento de intensidade de sinal na

respectiva região (7,60 a 8,76ppm) relativamente aos dois casos anteriores, bem como um nítido

deslocamento para desvios químicos maiores (ver inset da figura III.58). Esse deslocamento pode

ser evidência de conjugação de grupos aromáticos. Neste ponto, a análise por espectroscopia de

protão e por FTIR validam-se mutuamente.


59

III.2.3.3 Potencial Zeta

O potencial ζ revela os efeitos práticos da composição estrutural na superfície das NPs. Foram

feitas três medições independentes de potencial ζ para a amostra de CNPs 300 sem diluição. O valor

médio de potencial ζ para as CNPs 300 é de -25,7±1,2mV. Não se obteve sinal para as CNPs PVP e

CNPs CL. As restantes amostras não exibiam sinal de DLS e, por isso, não fazia sentido testá-las.

As medições de potencial ζ ( > |25mV|) para estas NPs demonstram a sua propensão à

estabilidade coloidal em meio aquoso. Potenciais negativos estão em concordância com os grupos

funcionais oxigenados na superfície esperados para estas CNPs. Grupos funcionais oxigenados

como álcoois, ácidos carboxílicos e derivados, e éteres são electronegativos e é a sua presença na

superfície das CNPs que gera o potencial de superfície negativo medido com esta técnica. Esta carga

negativa torna as CNPs solúveis em meio aquoso e previne a agregação por repulsão electroestática.

Além disso, prevê a eficácia de internalização celular, visto que NPs com grupos funcionais de

superfície carregados favorecem interacções electrostáticas com as membranas celulares [71].

III.3 Marcações celulares

A marcação celular foi feita em linhas celulares Saos-2 e HFFF2 usando todos os tipos de

CNPs. As concentrações usadas para marcação com CNPs armazenadas a seco (ver subcapítulo

II.3.4) estão numa gama considerada adequada para manter boa viabilidade celular [21] [30] [41]

[72]. As alíquotas usadas na marcação com CNPs armazenadas em solução (ver subcapítulo II.3.4)

são superiores às mencionadas em [32] e [73] e eram desconhecidas as consequências que a

diminuição da concentração dos constituintes do meio teria na viabilidade celular mas,

aparentemente, a diluição do meio de cultura não prejudicou a viabilidade em ambas as linhas

celulares. As concentrações de CNPs armazenadas em solução usadas para a marcação são

consideravelmente inferiores às concentrações usadas para marcação com amostras de CNPs

armazenadas a seco.

III.3.1 Linhas celulares Saos-2

Foram semeados 20 poços da placa com 15000 células em cada poço. Em 18 poços as

células foram incubadas com CNPs nas circunstâncias referidas no subcapítulo II.3.4. Os restantes

dois poços serviram como controlos. A marcação de osteoblastos foi bem-sucedida com as CNPs

AC E em apenas 6h de incubação com CNPs. As imagens da marcação fluorescente em ambas as

concentrações usadas não revelaram nenhuma diferença significativa, quer ao nível da intensidade

da fluorescência das NPs internalizadas, quer ao nível da morfologia exibida pelas células. Os

restantes tipos de CNPs não foram eficazes na marcação destas células. Apresentam-se

seguidamente as imagens de fluorescência com emissão azul e verde (excitação no UV próximo,

340-380nm, e azul 465-485nm, respectivamente).


60

Figura III.59 – Imagens de microscopia de epifluorescência de células Saos-2 marcadas com CNPs AC E

(concentração de CNPs em meio de incubação: 1mg/ml). As imagens A e C foram obtidas com luz excitatória

no UV próximo e as imagens B e D com luz azul. Ampliação: A e B de 100× e C e D de 400×. As imagens

foram adquiridas com tempos de exposição de 1s.

A visualização das imagens da figura III.59 permite constatar que estas CNPs foram

internalizadas com sucesso e que emitem fortemente a partir do meio intracelular com excitação no

UV próximo e azul. De acordo com os espectros de emissão adquiridos (ver figura III.12) e o

elevado FQY destas CNPs (ver tabela III.5), é esperada forte fluorescência azul e forte fluorescência

verde (embora com cerca de metade da intensidade da emissão azul). Note-se que o contraste nas

imagens B e D da figura III.59 é muito superior ao das imagens A e C da figura III.59, por isso a

fluorescência nestas imagens aparenta maior intensidade. Tal deve-se a um fundo de fluorescência

muito intenso nas imagens A e C da figura III.59. A origem da fluorescência de fundo pode residir

predominantemente noutras moléculas fluorescentes que fazem parte da constituição dos meios de

cultura celular, como a riboflavina, que aderem às lamelas de vidro e não são devidamente

removidas pela lavagem com PBS e aparentam ser particularmente emissivas quando excitadas no

UV próximo.

A B

C D


61

As imagens de microscopia de fluorescência A e B da figura III.59 permitem verificar que

houve uma internalização bastante homogénea por parte dos osteoblastos. As imagens C e D da

figura III.59 permitem averiguar que as CNPs se localizam preferencialmente na membrana nuclear

e no interior do núcleo. Esta afinidade pelo núcleo dos osteoblastos deverá ser consequência da

estrutura química da superfície destas CNPs. Esta marcação é indiciadora de especificidade das

CNPs AC E na marcação deste organelo neste tipo de células. Também é visível a emissão de

fluorescência proveniente do citoplasma, embora com muito menor intensidade.

Para garantir que a fluorescência exibida pelas células é proveniente de NPs e não da própria

célula (autofluorescência) foi feito um controlo com imagens de células incubadas sem CNPs. O

controlo efectuado assegura que a fluorescência observada é fruto da internalização celular de CNPs

AC E (ver figura E.2 do apêndice E).

III.3.2 Linhas celulares HFFF2

Tendo sido demonstrada a eficácia da marcação com CNPs AC E em linhas celulares Saos-2

optou-se por trabalhar com linhas celulares HFFF2 pois o meio de cultura usado para a linha Saos-2

(meio de cultura McCoy´s 5A) contém vermelho de fenol que, por ser uma molécula fluorescente,

pode contribuir para a fluorescência de fundo. No entanto não foi detectado nenhum decréscimo na

fluorescência de fundo ao usar meio de cultura DMEM sem vermelho de fenol.

A abordagem experimental para marcação dos fibroblastos com CNPs foi análoga à usada

para marcar os osteoblastos. Foram semeadas cerca de 10000 células por poço e foram usadas as

mesmas concentrações de CNPs com o mesmo de tempo de incubação em meio com NPs. No

entanto, ao fim das 6h de incubação não foi detectada internalização celular por nenhuma das CNPs

visto que em nenhuma das lamelas era visível fluorescência diferente da fluorescência intrínseca dos

fibroblastos (ver figura E.4 do apêndice E). Perante este resultado, apostou-se na marcação da linha

HFFF2 com períodos de incubação maiores com toda a gama de CNPs disponíveis, para investigar

se a variável tempo de incubação teria alguma influência no sucesso da marcação. Foram

estipulados tempos para incubação de 12h, 24h e 48h. As concentrações e alíquotas de CNPs em

meio foram mantidas.

No segundo ensaio com esta linha celular foram semeadas aproximadamente 15000 células

por poço e o tempo de incubação foi de 10h. Não foi detectada fluorescência emitida por CNPs em

meio intracelular.

Nos dois ensaios seguintes foram semeadas cerca de 10500 células por poço. O tempo de

incubação com CNPs no terceiro ensaio rondou as 24h inicialmente previstas. Neste ensaio foi

verificada uma marcação eficaz com as CNPs AC E e CNPs CL para as duas concentrações usadas.

As células incubadas com outros tipos de CNPs não exibiram sinais de internalização de NPs uma

vez que não foi observada fluorescência de CNPs no meio intracelular.


62

Figura III.60 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs AC E com

tempos de incubação de 24h. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (A) e 1mg/ml (B) com

excitação no UV próximo e ampliação de 100×. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (C) e

1mg/ml (D) com excitação no azul e ampliação de 400×. As imagens foram adquiridas com exposição de 1s.

A partir das imagens da figura III.60 verifica-se que a fluorescência é bastante mais intensa

nas células que incubaram durante 24h na solução de meio com concentração em CNPs de 1mg/ml

(figura III.60 B e D). Esta observação é generalizada para todas as imagens obtidas com os

diferentes filtros de excitação e a diferentes ampliações. Aparentemente as CNPs parecem localizar-

se no citoplasma.

A B

C D


63

Figura III.61 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs CL com

tempos de incubação de 24h. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (A) e 1mg/ml (B) com

excitação no UV próximo e ampliação de 100×. As imagens foram adquiridas com tempos de exposição de 1s.

No caso das CNPs CL não se verifica nenhuma alteração visível ao nível da intensidade de

fluorescência do meio intracelular com a concentração de NPs usada para marcação. A fluorescência

nestes fibroblastos é fraca e fornece pouco detalhe ao nível da morfologia celular (figura III.61)

mas, por comparação com o controlo de autofluorescência feito para os fibroblastos, a fluorescência

celular deverá mesmo ser oriunda da internalização das CNPs CL (comparar com figura E.4 do

apêndice E). Relativamente aos fibroblastos que internalizaram CNPs AC E (figura III.60, imagens

A e B) a fluorescência é notoriamente mais fraca. Note-se que estas NPs possuem o FQY mais baixo

(ver tabela III.6). Tal como no caso anterior, as NPs parecem situar-se preferencialmente no

citoplasma. Não foi possível obter imagens com ampliação de 400× devido à dificuldade de

focagem.

No quarto ensaio as 48h previstas para incubação com CNPs transformaram-se em 72h por

indisponibilidade da câmara de cultura no dia antevisto. A marcação da linha celular HFFF2 foi

bem-sucedida com as CNPs AC E, CNPs 180, CNPs 220 e CNPs 300. As restantes CNPs não

marcaram esta linha celular. Apresentam-se seguidamente as imagens de microscopia de

epifluorescência.

A B


64

Figura III.62 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs AC E com

tempos de incubação de 72h. CNPs internalizadas a concentrações de 0,5mg/ml (A, C e E) e 1mg/ml (B, D e

F) com excitação no UV próximo (A e B) azul (C e D) e verde (E e F) – excitação no verde: 528 a 553nm.

Ampliação de 400× em todas as imagens. Tempos de exposição na aquisição: 0,5s (A, C e E) e 1s (B, D e F).

A B

C D

E F


65

À semelhança do que foi observado na figura III.60, na figura III.62 verifica-se que as

células que incubaram em meio com maior concentração de CNPs AC E exibem fluorescência mais

intensa (imagens B, D e F da figura III.62). Nestas células as CNPs situam-se no citoplasma, com

preferência à volta do núcleo. Outra observação muito importante pode ser feita comparando as

figuras III.60 e III.62: a maiores períodos de incubação com este tipo de NPs correspondem taxas de

internalização mais elevadas. Apesar desta importante observação, para uma quantificação da

internalização rigorosa seria necessário um estudo mais sistemático.

Tanto quanto foi possível apurar não existem registos de períodos de incubação com CNPs

tão longos. Em contraste de fase as células em todos os poços cultivados possuíam uma morfologia

normal (ver figura E.3 no apêndice E). Tal observação é indicadora da excelente biocompatibilidade

apresentada por estas CNPs.

Figura III.63 – Imagens de microscopia de epifluorescência de fibroblastos marcados com CNPs 180 (A),

CNPs 220 (B) e CNPs 300 (C). A alíquota usada em todas as marcações foi de 0,3mL. Os espécimes foram

excitados com luz azul. A magnificação usada é de 100×. Os tempos de exposição para adquirir as imagens

foram de 3s (A e C) e 2s (B).

A fluorescência das células que foram marcadas com CNPs obtidas a partir da carbonização

de cortiça (figura III.63) é muito ténue e não possibilita uma distinção adequada da morfologia das

células e estruturas celulares. Comparativamente com o controlo de autofluorescência efectuado

(figura E.4 do apêndice E) parece de facto existir fluorescência proveniente de NPs internalizadas

mas tal internalização deverá ser muito reduzida. Aqui o principal factor responsável pela fraca

fluorescência celular deverá ser a baixa concentração em CNPs dispersas no meio de incubação mas

as intensidades emissivas das próprias CNPs que são relativamente baixas também não colaboram

neste ponto (ver perfis de fluorescência das figuras III.16-17 e III.19 e ver tabela III.6).

A B C


66

Capítulo IV – Conclusões e perspectivas futuras

67


A produção e caracterização de nanopartículas de carbono fluorescentes é uma área em que a

investigação está numa fase preliminar. Neste sentido, esta classe recente de nanomateriais

fluorescentes é particularmente atractiva em investigação biomédica. Com este trabalho procurou-se

não só estudar as propriedades de foro espectroscópico, morfológico e estrutural, como também

validar a utilização de CNPs produzidas por métodos económicos e simples como marcadores

celulares fluorescentes. Para o efeito foram caracterizadas nove amostras diferentes de CNPs

produzidas através de dois métodos térmicos: síntese hidrotérmica e carbonização a seco em

atmosfera ambiente. Para estudar a eficiência das CNPs em imagiologia celular, as diferentes

amostras de CNPs foram usadas como marcadores celulares fluorescentes para visualização de

células em MF.

As primeiras sínteses de CNPs foram realizadas usando procedimentos inspirados em

referências da literatura e permitiram ganhar o know-how necessário para os métodos de produção e

caracterização. Destas sínteses iniciais foram seleccionadas para uso futuro as quatro que exibiam

propriedades espectroscópicas mais interessantes e que foram armazenadas a seco: CNPs PVP,

CNPs AC E, CNPs G e CNPs CL.

Após a fase inicial decidiu-se produzir CNPs a partir de dois precursores que, tanto quanto

se sabe, nunca foram utilizados em produção de CNPs: PAA, pelo método hidrotérmico, e cortiça,

por carbonização simples. O estudo intencionado com CNPs a partir de PAA foi abandonado por

pôr em causa a biocompatibilidade pretendida, tendo sido produzida apenas uma amostra cujas

propriedades foram devidamente estudadas. Com a cortiça em grão foram feitas algumas sínteses

iniciais para estabelecer o tempo de reacção necessário e seguidamente, com este tempo

determinado, foram produzidas quatro amostras a temperaturas diferentes: 180ºC, 220ºC, 260ºC e

300ºC. Estas amostras de CNPs são fluorescentes e foram devidamente caracterizadas e empregues

como marcadores para imagiologia celular por fluorescência.

A síntese hidrotérmica mostrou ser um método produtivo com maior rendimento aparente. A

análise FTIR revela que as amostras obtidas por síntese hidrotérmica de macromoléculas (CNPs

PVP, CNPs PAA e CNPs G) são na realidade constituídas maioritariamente pelo respectivo

precursor molecular. Nas amostras de CNPs obtidas por carbonização simples também parecem

existir restos de polímeros (visíveis em todas as imagens TEM adquiridas). Possivelmente o

rendimento calculado que mais se aproxima de uma transformação efectiva de precursores

moleculares em NPs é o das CNPs AC E, apesar da ligeira perda de material fluorescente verificada

durante a diálise. Para evitar esta perda devia ter sido usada uma membrana com massa de corte

inferior. Tendo estas considerações em conta, o método hidrotérmico parece ser o mais eficiente na

produção de CNPs comparativamente com a carbonização a seco, embora seja difícil quantificar

com precisão a taxa de transformação de precursor em NPs por ambos os métodos. Para tal seria

necessário recorrer a um método para a separação eficiente entre NPs e fase polimérica. Deve-se

realçar ainda o potencial observado da técnica sparging para soluções de CNPs com vista a

aumentar a estabilidade e a prolongar o tempo de armazenamento das amostras em solução.

As propriedades espectroscópicas das CNPs produzidas enquadram-se no comportamento

óptico característico destas NPs, com excepção das CNPs AC E. Observam-se perfis de absorção


68

intensos no UV, intensidade essa que decai com o aumento do CDO. Em relação aos espectros de

fluorescência são verificados perfis de emissão largos e assimétricos em que se observa um

deslocamento do máximo de emissão para o vermelho com o aumento do CDO de excitação. Esta

dependência da emissão com o CDO de excitação é típica neste tipo de NPs. Neste ponto a amostra

de CNPs AC E emerge como um caso singular na medida em parece existir fluorescência centrada a

dois CDOs distintos quando a amostra é excitada a CDOs baixos. O máximo absoluto de emissão

para esta amostra verificou-se aquando da excitação a 360nm. Para as restantes amostras de CNPs o

máximo absoluto de emissão varia entre CDOs de excitação de 310 e 330nm. Com os espectros de

excitação adquiridos foi possível fazer uma ligação entre a emissão a dado CDO e o CDO a que os

cromóforos responsáveis por essa emissão absorvem. Verifica-se que nalgumas amostras a

fluorescência das CNPs é resultado da excitação de diferentes cromóforos enquanto noutras são os

mesmos cromóforos a contribuir para emissão a diferentes CDOs. No caso particular das CNPs AC

E os espectros de excitação demonstram a presença de duas regiões de absorção distintas

correspondentes à contribuição emissiva por parte de dois cromóforos distintos. Não foi apurado se

os dois cromóforos diferentes correspondem a regiões emissivas totalmente distintas na superfície

das NPs ou a CNPs de diferentes formas e/ou tamanhos. A imagem SEM obtida para estas CNPs

não revela informação fiável para inferir quanto à legitimidade da segunda hipótese. A utilização de

uma técnica de separação adequada poderia averiguar se esta hipótese é válida.

A medição dos FQYs permite constatar que as CNPs produzidas pelo método hidrotérmico

são, em geral, mais emissivas com FQYs a variar entre 4 e 11%. Os FQYs mencionados na literatura

para CNPs de gelatina, CNPs de PVP e CNPs de ácido cítrico e etilenodiamina são de 31,6%, 23,6%

e 24,7% respectivamente. Comparativamente os FQYs medidos são mais baixos. Em relação às

CNPs produzidas por carbonização a seco, os valores de FQY situam-se entre os 5 e 2%. Estes

valores estão em maior concordância com a literatura (FQY de 7,1% para CNPs obtidos a partir de

cascas de melancia carbonizadas).

No que diz respeito à morfologia, a maioria das CNPs produzidas apresenta uma simetria

quase esférica, observável a partir das imagens SEM e TEM. No que toca a dimensões existe uma

grande divergência. De modo genérico é possível dizer que as dimensões das CNPs produzidas se

encontram numa gama de dimensões considerada normal para este tipo de NPs visto que a grande

maioria dos tamanhos cai entre os 2 e os 150nm. Neste aspecto, a discordância entre os tamanhos

medidos pelas imagens TEM e SEM dificulta a análise. As três medições feitas por DLS apontam

para aqueles que devem ser os tamanhos correctos para as respectivas CNPs, e consolidam os

tamanhos observados a partir de imagens TEM ou SEM. Embora não seja possível esclarecer

devidamente qual dos métodos usados produz NPs de menores dimensões, a análise global dos

dados adquiridos parece sugerir que com o método hidrotérmico se obtêm CNPs mais pequenas.

Em termos da organização estrutural dos átomos, todas as CNPs, com excepção das CNPs

CL, possuem natureza amorfa. A estrutura das CNPs CL deverá ser fundamentalmente amorfa mas o

difractograma obtido para estas NPs aponta para a existência de regiões em que os átomos possuem

organização estrutural. Por isso esta amostra tem um carácter semi-cristalino.

No que toca à análise da estrutura química das CNPs, a análise FTIR das amostras de CNPs

produzidas a partir de macromoléculas pelo método hidrotérmico revelou ligações químicas

praticamente idênticas às dos precursores. Este facto parece acusar uma transformação ineficiente

dos precursores em NPs. Embora também ser possa dar o caso de terem sido produzidas CNPs


69

poliméricas e, portanto, com estrutura química idêntica à do precursor, a formação de filmes finos

nas imagens SEM e TEM fortalece a primeira suposição. Por sua vez a análise FTIR feita para as

CNPs AC E deve fornecer exclusivamente informação referente às ligações químicas das CNPs. Em

relação às CNPs obtidas por carbonização a seco a informação estrutural contida nos espectros FTIR

também deverá ser respeitante às CNPs. De facto também existem lixos nestas amostras mas devido

à degradação térmica é possível que estes lixos apresentem estruturas químicas semelhantes às das

próprias CNPs. As análises FTIR e 1H-RMN para as CNPs obtidas a partir de cortiça carbonizada

apontam para a diminuição no número de grupos alifáticos e o crescimento do número de grupos

aromáticos com o aumento da temperatura de carbonização. Adicionalmente por 1H-RMN é possível

deduzir a ocorrência de conjugação dos grupos aromáticos com o aumento da temperatura.

A análise estrutural feita para as CNPs AC E, CNPs CL e CNPs obtidas por carbonização de

cortiça indicia a presença de grupos funcionais oxigenados e nitrogenados que são polares e por isso

são responsáveis pela solubilidade destas CNPs em meio aquoso. Adicionalmente as medições de

potencial ζ feitas para as CNPs 300 estabelecem uma carga à superfície negativa (-25,7mV),

presumivelmente derivada de grupos oxigenados presentes na superfície, que aponta para a

estabilidade coloidal destas NPs.

A fase final deste trabalho consistiu na aplicação das CNPs para marcação por fluorescência

em linhas celulares. De todas as CNPs produzidas, as CNPs AC E foram as únicas que marcaram

eficazmente as duas linhas celulares usadas: Saos-2 e HFFF2. A fluorescência exibida pelas NPs

internalizadas é bastante intensa e permite a obtenção de imagens com excelente contraste. Foi ainda

verificada uma dependência da internalização destas CNPs com o tempo de incubação nos

fibroblastos. Aparentemente, a maiores tempos de incubação em meio com estas CNPs corresponde

um maior número de NPs internalizadas. Apesar desta observação, é necessário um estudo mais

sistemático para confirmar esta observação. Adicionalmente a dependência do contraste de imagem

com a concentração de CNPs AC E nos fibroblastos parece verosímil mas os estudos feitos não são

adequados para confirmar esta hipótese. Existem algumas publicações que referem estudos de

viabilidade celular para diferentes concentrações de CNPs com períodos de incubação inferiores a

24h. No entanto, se para algumas linhas celulares a eficácia de internalização for dependente do

tempo de incubação com NPs, como os resultados deste trabalho parecem sugerir, existe grande

carência de estudos respeitantes à citotoxicidade para longos períodos de exposição. Estudos deste

género também são de importância capital para testes in vivo. As amostras de CNPs CL, CNPs 180,

CNPs 220 e CNPs 300 também parecem ter sido internalizadas mas o seu potencial para marcação

não foi provado visto que as imagens de MF obtidas possuem fraca fluorescência proveniente das

células e, portanto, fraco contraste. É de realçar que a incubação com CNPs em longos períodos de

tempo (72h) parece não afectar significativamente as células e, de facto, a morfologia das células,

após este período de tempo, não evidencia alterações visíveis, mesmo no caso das CNPs PAA,

supostamente citotóxicas. Para confirmar esta aparente biocompatibilidade seria necessário a

realização de testes de viabilidade celular. As amostras de CNPs PVP, CNPs PAA, CNPs G e CNPs

260 não marcaram nenhuma das linhas celulares usadas.

Em suma, o objectivo inicialmente proposto para este trabalho foi integralmente atingido

com a amostra de CNPs AC E. As restantes amostras demonstraram que procedimentos de síntese

simples têm capacidade para produzir CNPs. De facto, as restantes amostras possuem as

propriedades típicas deste tipo de NPs. No entanto não foram capazes de marcar as linhas celulares

usadas ou fizeram-no fracamente. O facto de ser possível produzir NPs solúveis em água por um


70

método térmico extremamente simples a partir de um material termicamente resistente e

hidrofóbico, como a cortiça, revela a possibilidade de produção de CNPs a partir de, virtualmente,

qualquer biomassa. Deve-se ainda referir que, se não forem aplicadas técnicas de separação eficazes

entre pequenos resíduos poliméricos e as CNPs obtidas, a pureza das amostras fica comprometida

bem como a correcta caracterização estrutural. Tendo em conta os procedimentos experimentais

mencionados em muitas publicações, este deve ser um problema comum (embora nunca seja

mencionado). Por este motivo os métodos top-down permanecem como estado de arte na síntese de

CNPs.

Para que estas NPs sejam alternativas realistas aos fluoróforos comuns existe necessidade de

estudos sistemáticos que investiguem mais aprofundadamente reacções envolvidas na síntese, os

mecanismos de fluorescência das CNPs e também investigação para aplicações específicas. Para o

futuro antevê-se:

O aperfeiçoamento de métodos de síntese bottom-up;

A realização de estudos sistemáticos relativos à citotoxicidade das CNPs em função do

tempo de incubação e concentração;

Estudos in vitro da importância das variáveis concentração e tempo de incubação na

internalização;

O desenvolvimento de CNPs funcionalizadas, por exemplo, com PEG ligado

covalentemente a anticorpos, para marcação específica de estruturas celulares e

biomoléculas in vitro;

Marcação específica in vitro com congregação de sinais de diferentes CNPs;

Compreensão do processo de internalização (validação da teoria de endocitose);

Compreensão do mecanismo de fluorescência;

Análises metódicas dos efeitos de carga de superfície e de tamanho das CNPs para a

internalização celular;

Realização de estudos in vivo;

Desenvolvimento de biossensores de elevada sensibilidade;

Desenvolvimento de outras aplicações (fotónica, etc.).

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76

Apêndices

77

Apêndices

Apêndice A – Análise estrutural de precursores moleculares e CNPs

Neste apêndice é feita a análise FTIR dos precursores moleculares usados em síntese

hidrotérmica e a análise FTIR das CNPs PAA e CNPs G. Esta análise demonstrou ser uma valiosa

fonte de informação na medida em que permite investigar as alterações estruturais decorrentes do

tratamento hidrotérmico. É apresentada a estrutura molecular dos precursores (desenhadas com o

ChemDraw), o espectro FTIR e a análise estrutural respectiva. O espectro FTIR da etilenodiamina

foi retirado da literatura e os seus picos não foram identificados.

Figura A.1 – Estrutura química da PVP.

Tabela A.1 – Atribuição de picos FTIR ao PVP.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupo

funcionais

















3430 O-H Estiramento Água

Figura A.2 – Espectro FTIR da PVP.


78

Figura A.3 – Estrutura química do ácido cítrico.

Tabela A.2 – Atribuição de picos FTIR ao ácido cítrico.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais




1053 C-O Estiramento Álcool prim.


1207 C-O

C-O

Estiramento

Estiramento

Álcool

Ácido carb.

1254 O-H

C-O

Deformação

Estiramento

Álcool

Ácido carb.

1288 C-O Estiramento Ácido carb.


1390 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Ácido carb.

Alcano

1417 O-H

C-H

Deformação

Deformação

Ácido carb.

Alcano

1686 ? ? ?


1821 ? ? ?

2555 ? ? ?

2661 ? ? ?



3221 ? ? ?

3311 ? ? ?


[3500-3200] O-H Estiramento Álcool

Figura A.4 – Espectro FTIR do ácido cítrico.

Apêndices

79

Figura A.5 – Estrutura química da etilenodiamina.

Figura A.6 – Espectro FTIR da etilenodiamina. Retirado da base de dados electrónica da National Institute of

Standards and Terminology: ” http://www.nist.gov/”.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais











Tabela A.3 – Atribuição de picos FTIR ao PAA.

Figura A.7 – Espectro FTIR do PAA.

Figura A.8 – Estrutura química do PAA.


80

Tabela A.4 – Atribuição de picos FTIR à gelatina.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais

972 C-H

C-H

Deformação

Deformação

Alcano

Aromático





1234 C-N

C-O

Estiramento

Estiramento

Amina

Ácido carb.

1333 C-N

O-H

Estiramento

Deformação

Amina

Álcool


1446 C-H

C-N

Deformação

Estiramento

Alcano

Amida III

1520 C=C

N-H

Estiramento

Deformação

Aromático

Amida II




3074 C-H Estiramento Aromático


[3500-3200]

N-H

O-H

O-H

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Amida A

Álcool

Água

Tabela A.5 – Atribuição de picos a CNPs PAA.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupo

funcional










[3500-3200] O-H Estiramento Água

A análise FTIR para o espectro das CNPs PAA é idêntica à feita para as CNPs PVP. Os

espectros IV da amostra de NPs (figura A.10) e do PAA são semelhantes (ver figura A.7). Os ácidos

Figura A.9 – Espectro FTIR da gelatina.

Figura A.10 – Espectro FTIR de CNPs PAA.

Apêndices

81

carboxílicos do PAA estão claramente presentes. Provavelmente, da reacção hidrotérmica

resultaram CNPs com composição semelhante à do polímero e uma fracção desconhecida de

polímero residual.

A diferença mais evidente relativamente ao espectro FTIR do PAA é o surgimento de um

pico a 1043cm-1

atribuído a uma ligação C-O. Esta ligação pode surgir devido à formação de

ligações C-O de álcoois. O pico também pode ser atribuído a éteres. A região de absorção da ligação

O-H de álcoois a 3500 a 3200cm-1

não evidencia diferenças significativas relativamente ao espectro

FTIR do PAA e por isso é difícil inferir quanto à presença deste grupo funcional. O mais provável é

esta banda aparecer devido à vibração O-H da água tanto na amostra de CNPs PAA como no próprio

PAA (a amostra e o polímero são higroscópicos).

Tabela A.6 – Atribuição de picos a CNPs G.

Absorção

(cm-1

) Ligação

Modo de

vibração

Grupos

funcionais

974 C-H

C-H

Deformação

Deformação

Alcano

Aromático





1240 C-N

C-O

Estiramento

Estiramento

Amina

Ácido carb.

1333 C-N

O-H

Estiramento

Deformação

Amina

Álcool


1448 C-H

C-N

Deformação

Estiramento

Alcano

Amida III

1531 C=C

N-H

Estiramento

Deformação

Aromático

Amida II




3074 C-H Estiramento Aromático


[3500-3200]

N-H

O-H

O-H

Estiramento

Estiramento

Estiramento

Amida A

Álcool

Água

A partir do espectro FTIR das CNPs G (figura A.11) não se retira nenhuma evolução

evidente da estrutura química da gelatina com o tratamento hidrotérmico (ver figura A.9). O

espectro FTIR destas NPs é análogo ao espectro da gelatina. Apenas se observa a intensificação do

pico a 1633cm-1

respeitante aos carbonilos de amidas. É provável que se tenham obtido CNPs de

composição semelhante à da própria gelatina e que exista ainda bastante gelatina residual. A análise

deste espectro acaba por ser análoga às feitas para CNPs PVP e CNPs PAA.

Figura A.11 – Espectro FTIR de CNPs G.


82

Apêndice B – Características da cortiça

No presente apêndice apresentam-se as caracteristicas físicas da cortiça utilizada, a possível

composição da cortiça e as estruturas químicas dos dois polímeros exsitentes em maior quantidade

na cortiça, a suberina e a lignina.

Figura B.1 – Características físicas dos grãos de cortiça usados em síntese de CNPs.

Tabela B.1 – Possíveis elementos estruturais da cortiça usada com respectiva proporção composicional.

Tabela retirada de: S. Silva, M. Sabino, E. Fernandes, V. Correlo, L. Boesel e R. Reis, “Cork: properties,

capabilities and applications”, International Materials Reviews, vol. 50, pp 345-365, 2005.

Apêndices

83

Figura B.2 – Possível estrutura química da suberina. Figura retirada de: S. Silva, M. Sabino, E. Fernandes,

V. Correlo, L. Boesel e R. Reis, “Cork: properties, capabilities and applications”, International Materials

Reviews, vol. 50, pp 345-365, 2005.

Figura B.3 – Possivel estrutura química da lignina. Figura retirada de: S. Silva, M. Sabino, E. Fernandes, V.

Correlo, L. Boesel e R. Reis, “Cork: properties, capabilities and applications”, International Materials

Reviews, vol. 50, pp 345-365, 2005.


84

Apêndice C – Preparação e caracterização espectroscópica da

solução de sulfato de quinino

Preparação da solução de sulfato de quinino em 0,1M H2SO4

1. Pipetou-se 0,555ml de H2SO4 para um balão volumétrico de 100ml

2. Adicionou-se água desionizada ao balão até à marca.

3. Com uma pequena espátula retirou-se uma pequena quantidade de sulfato de quinino a olho

para um eppendorf.

4. O sulfato de quinino foi dissolvido em 1ml de solução a 0,1M de H2SO4.

5. A solução foi passada para uma célula de quartzo à qual foi adicionada mais 1ml de solução

a 0,1M de H2SO4.

6. Foi medida a absorvância desta solução.

7. Seguidamente foi feita a diluição necessária (absorvância varia linearmente com a

concentração) para ajustar a absorvância da solução para 0,1u.a. a 360nm.

Análise espectroscópica e cálculo de rendimentos quânticos de fluorescência.

Com a solução obtida com o procedimento anterior obtiveram-se os espectros de absorção

(figura C.1) e fluorescência (figura C.2) do sulfato de quinino. Os espectros de fluorescência foram

obtidos dos 300 aos 400nm de 10 em 10nm mas para facilitar a interpretação são exibidos em

intervalos de 20nm. Os espectros de absorção foram adquiridos nas mesmas condições usadas para a

obtenção de espectros das CNPs.

Os FQYs foram calculados a 360nm de acordo com a equação II.3. As absorvâncias são

obtidas a partir dos dados dos espectros de absorção das amostras e as áreas dos espectros de

fluorescência com excitação da amostra a 360nm são calculadas pelo software usado (OriginPro 8).

O factor de correcção referente aos índices de refracção dos solventes é dispensável pois usou-se

sempre água desionizada como solvente. O cálculo de FQYs está sempre sujeito a grande erro

experimental e por isso é apresentado sem casas decimais.

Figura C.1 – Espectro de absorção do sulfato de quinino. Figura C.2 – Espectros de emissão do sulfato de quinino.

Φ = 0,54 (360nm)

Apêndices

85

Apêndice D – Culturas celulares

As linhas celulares usadas são conservadas em solução de meio e DMSO numa arca

congeladora a -80ºC. Para realizar as sementeiras é necessário descongelar as células e proceder à

sua transferência para um T25 onde irão proliferar em meio de cultura celular.

Sementeiras celulares

Em todas as sementeiras foram usadas placas de 24 poços. O procedimento usado em todas

sementeiras foi idêntico e é descrito seguidamente.

1. Verificar a morfologia das células no T25 ao microscópio para assegurar a viabilidade da

cultura.

2. Retirar o meio do frasco T25 com uma pipeta de Pasteur sem arrastar o fundo onde as

células estão aderidas.

3. Lavar o fundo do T25 com 5ml de PBS.

4. Tripsinar com 500μl de tripsina. Varrer bem o fundo onde as células estão aderidas.

5. Colocar o T25 com as células com a tripsina 5 minutos na incubadora a 37ºC com atmosfera

de CO2 a 5%. Após os 5minutos de incubação, bater suavemente no frasco para as células se

soltarem.

6. Confirmar ao microscópio se as células ficaram em suspensão.

7. Adicionar 5ml de meio. Aspirar e repor a solução 3 vezes passando pelo fundo onde as

células estiveram aderidas.

8. Passar a solução com meio e células para um tubo Falcon de 15ml.

9. Retirar 50μl de solução de meio e células para um microtubo.

10. Adicionar 50μl de solução de azul tripano ao microtubo.

11. Aspirar e repor a solução várias vezes para homogeneizar a mistura.

12. Inserir a solução corada no hemocitómetro.

13. Contar o número de células em viáveis em cada câmara e estimar o número total de células

por mililitro na suspensão através da equação D.1:

Equação D.1


86

14. Adicionar a solução com as células a um tubo Falcon de 50ml.

15. Fazer a diluição necessária com meio (depende do número de células contadas e do número

de células que se deseje semear por poço). Agitar revirando o tubo para cima e para baixo

sucessivamente.

16. Adicionar uma lamela a cada poço da placa usado.

17. Adicionar 1ml de solução a cada poço.

18. Inserir a placa na incubadora a 37ºC com atmosfera a 5% de CO2.

Apêndices

87

Apêndice E – Controlos de autofluorescência celular

Os controlos de autofluorescência celular foram feitos com células não marcadas. É feita a

aquisição de imagens de microscopia em modo de contraste de fase com ampliação a 100× e

aquisição de imagens de MF na mesma zona com a mesma ampliação.

Células Saos-2

Células HFFF2

Figura E.1 – Imagem de contraste de fase de células

Saos-2 com ampliação de 100×.

Figura E.2 – Imagem da autofluorescência de células

Saos-2 com ampliação de 100× (excitação no UV

próximo). Tempo de exposição de 1,6s na aquisição.

Figura E.3 – Imagem de contraste de fase de

células HFFF2 com ampliação de 100×.

Figura E.4 – Imagem da autofluorescência de células

HFFF2 com ampliação de 100× (excitação no UV

próximo). Tempo de exposição de 3s na aquisição.


88

Apêndice F – Tentativa de funcionalização com hidrocloreto de L-

cisteína-etil-éster

O objectivo do procedimento de funcionalização foi a investigação da facilidade de

manipulação da estrutura química na superfície das CNPs 300 e eventuais alterações no

comportamento óptico destas CNPs.

Era esperada a substituição de grupos carbonilo e hidroxilo por moléculas de hidrocloreto

de L-cisteína-etil-éster (L-CEEH) através da ligação destes grupos funcionais às moléculas. A

formação de uma ligação amida entre o grupo amina da L-CEEH e um grupo carboxilo é viável a

temperaturas moderadas. As ligações amida, uma vez formadas, são muito estáveis. Para potenciar o

ataque nucleófilo da amina neutralizou-se a solução com hidróxido de sódio antes do tratamento

térmico. Em vez de se optar por um refluxo, a funcionalização foi feita em meio hidrotérmico em

condições moderadas (T=120°C) de forma a acelerar as reacções de funcionalização.

Obteve-se uma solução de cor amarela com fluorescência de cor azul esverdeada o que pode

indicar que houve funcionalização (figura F.1 C). No entanto, foi feita uma síntese controlo em que

se fez o tratamento hidrotérmico de uma solução de L-CEEH neutralizada com uma concentração

idêntica à usada no procedimento de funcionalização. O resultado deste controlo foi a obtenção de

uma solução com a mesma cor e com a mesma fluorescência da suposta solução funcionalizada

(figura F.1 B).

Comparando a imagem SEM das CNPs 300 (figura III.41) com a imagem SEM das supostas

NPs funcionalizadas (figura F.3) verifica-se que os tamanhos das CNPs não são compatíveis. A

medição de tamanhos com o ImageJ é dificultada pela dificuldade de distinção dos limites das CNPs

nos agregados formados na secagem (mas foram medidos mais tamanhos que os apresentados na

tabela F.1). No entanto, a observação anterior parece ser válida (foram tiradas mais duas imagens

SEM que suportam esta linha de pensamento). Apesar de não se poder concluir que não houve

funcionalização temos porém um grande grau de certeza que existe contaminação da fluorescência

por NPs derivadas de L-CEEH.

Na literatura não foram encontradas quaisquer alusões a procedimentos de síntese

hidrotérmica de CNPs a temperaturas tão baixas. Existem algumas referências que descrevem

processos de funcionalização em refluxo durante longos períodos de tempo. A temperatura usada

nesta tentativa de funcionalização é idêntica às usadas em refluxo e, portanto, insuspeita de gerar

NPs. O factor chave deverá ter sido a pressão, mesmo apesar de esta ser comparativamente muito

menor que a gerada nas outras sínteses hidrotérmicas, quer por efeitos de temperatura, quer por

efeitos de volume de fluido no interior do reactor. Assim, em retrospectiva, deveria ter-se decidido

pela implementação de um procedimento de funcionalização por refluxo ou por um método de

crosslinking. No entanto, não deixa de ser interessante a síntese de CNPs a condições de

temperatura e pressão relativamente baixas. Comparando os espectros da figura III.19 com os

espectros da figura F.2 parece claro que são estas CNPs produzidas por acaso que possuem o

máximo absoluto de emissão no verde, característica espectroscópica que lhes é exclusiva.

Apêndices

89

Caracterização por espectroscopia de fluorescência

Figura F.1 – Imagens à lâmpada UV de CNPs 300 (A), CNPs L-CEEH (B) e CNPs 300 + CNPs L-CEEH (C).

Figura F.2 – Espectros de fluorescência da solução com CNPs 300 + CNPs de L-CEEH e

respectivos espectros normalizados.

Imagem de microscopia electrónica de varrimento

Figura F.3 – Imagem SEM de CNPs 300 e CNPs de L-CEEH.

Tabela F.1 – Tamanhos SEM de

CNPs 300 e CNPs de L-CEEH.

Exemplar Dimensão

(nm)

1 29

2 28

3 31

4 38

1 2

3

4

A B C

carbon dots: nanopartículas de carbono fluorescentes para ...carbon dots: nanopartículas de...

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