Caracterización molecular y bioquímica de una nueva Xilanasa intracelular

activa a bajas temperaturas

Diana M. Rodríguez HernándezCod: 174605Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá Facultad de Ciencias – Departamento de Química.

IntroducciónEl xilano es un polímero de residuos de xilosa, que es a su vez el compuesto principal de la hemicelulosa, el segundo componente más común de la biomasa renovable de la Tierra.

Figura 1: Xilano¹

¹Tomado de: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/46/Xylan.svg/620px-Xylan.svg.png

Las endoxilanasas se encargan de romper los enlaces β-1-4 de la xilosa, lo que es un paso clave para la degradación del xilano.

Xilanasas

Extracelulares

Reconocen cadenas largas y ramificadas de xilano nativo.

Intracelulares

Reconocen xilooligosacáridos

pequeños, productos de la degradación de xilano

nativo.

Mesófilas o termófilas, pero no actúan a bajas

temperaturas.

Las endoxilanasas activas a baja temperatura son valiosas tanto para la investigación básica, por ejemplo en el entendimiento del mecanismo de adaptación estructural a la baja temperatura, como para diversas aplicaciones industriales potenciales, en aquellos procesos en los que la baja temperatura aumenta el costo, pero es requerida para evitar la aparición de microorganismos.

Figura 2: Clasificación de las xilanasas.

En este estudio, se describe la clonación de un gen del Bacillus sp. HJ2 albergado en un suelo salino, que codifica para una nueva endoxilanasa intracelular activa a baja temperatura de la familia de la GH 10. El gen se expresó en Escherichia coli, y la enzima recombinante purificada se caracterizó.

Además, la secuencia, la filogenia, y la estructura de los perfiles de las endoxilanasas intracelulares activas a bajas temperaturas de la familia GH 10 fueron revelados.

Figura 3: E. colli²

²Tomado de: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/32/EscherichiaColi_NIAID.jpg/250px-EscherichiaColi_NIAID.jpg

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Vectores y reactivos• Clonación y expresión de genes: E. coli Trans1-T1

y E. coli BL21 (transgen; Beijing, China).• Purificación de la proteína marcada en la His₆:

Nickel- NTA agarose (Qiagen; Valencia, CA, USA)• Kits de Aislamiento de ADN genómico,

purificación del ADN, yaislamiento de plásmidos (Tiangen; Beijing, China).• Vector pMD 18-T, endonucleasas de restricción,

ADN ligasa T4,ADN polimerasa (Taq y Pyrobest), y dNTPs (Takara; Otsu, Japón).

• Vector pET-28a (+) (Novagen; San Diego, CA, EE.UU.).• Sustratos: xilano de madera de haya, xilano de

avena, cebada β-glucano, pululano (deAureobasidium pullulans) y sal de carboximetil celulosa de sodio (Sigma;St. Louis, MO, EE.UU.). • Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)

(Amresco; Solon,OH, EE.UU)

2. Aislamiento de microorganismosEl suelo salino se obtuvo de una mina de sal abandonada ubicada en la "ciudad de la sal" en la famosa "Ruta de la Seda del Sur“ (Heijing, provincia de Yunnan, China)

Suspender 2g de suelo en

NaCl 0,7% p/v

Sembrar.Medio de cultivo:

Agar 0,5% harina de soja; 0,1% peptona y

0,1% NaCl

Cultivar a 10°C por 3

días.

Seleccionar cepas de acuerdo a la

forma de la colonia. (En este

caso, 11)

Purificar por “streaking” en Luria-Bertani a

10°C

Inocular.Medio inductor de

xilanasa: 0,5% xilano de madera de abedul; 0,1%

peptona; 0,1% NaCl

Medir actividad la xilanasa en las cepas. (En este caso, la cepa

HJ2 presentó la mejor)

Identificar taxón de la cepa por su

secuencua 16 S r-DNA amplificada por

PCR.

Figura 4: Procedimiento para el aislamiento de los microorganismos.

3. Clonación del gen y análisis de la secuencia.

Utilizar el kit de aislamiento genómico de Tiargen para

aislar el ADN de la cepa 12.

Diseñar el set de primers .

(Basado en G-H-T-L-[V/I/L]-W-H and W-D-V-V-N-E, of GH 10

endoxylanase)

Amplificar un gen parcial de

endoxilanosa por Touchdown PCR

Purificar el producto de PCR

utilizando la filtración por gel.

Ligar el producto al vector PMD 18-T

Secuenciar( Beijing Genomics

Institute (Guangzhou, China)

Usar TAIL-PCR con 11 primers arbitrarios y 4

primers SP para encontrar las regiones

5’ y 3’

Purificar en gel los productos de PCR Secuenciar.

Figura 5: Procedimiento para la clonación del gen y el análisis de la secuencia.

3.1 Especificaciones

• Diseño y análisis de primers: Primer Premier 5.0 (PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA, EE.UU.) y Oligo 6,0 (Molecular Insights Biología, Cascade, CO, EE.UU.)• Síntesis de primers: Invitrogen (Carlsbad, CA,

EE.UU.).• Secuencias de montaje y alineaciones:

software Vector NTI 10,3 (InforMax, Gaithersburg, MD, EE.UU.).

• Predicción de la señal del péptido en la secuencia de aminoácidos: SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).• Alineación de secuencias de ADN y proteína:

BLASTN y BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), respectivamente.• Clasificación de la familia de glicosil hidrolasa de

XynAHJ2: InterProScan http://www.ebi.ac.uk/Herramientas/PFA/iprscan/ )

4. Análisis filogenético y de estructura

• Las secuencias de alineación múltiple, el cálculo de la distancia de matrices (modelo Kimura con dos parámetros para los nucleótidos y el modelo PAM para aminoácidos), y la construcción del árbol filogenético se realizaron con MEGA 4,0. La fiabilidad los árboles se evaluó mediante 1.000 repeticiones de arranque.

• La estructura terciaria de las xilanasas se predijo por el modelado de homología utilizando SwissModel (http://swissmodel.expasy.org/ )

• Los puentes disulfuro, los puentes de sal (distancia ≤ 4 A), y los enlaces de hidrógeno se predijeron con Dianna 1,1, VMD 1.8.6 [14], y UCSF Quimera 1,2540, respectivamente.

• El área superficial accesible (ASA) y volumen de empaque se calcularon utilizando Vadar.

5. Expresión de xynAHJ2 en E. coli

Amplificar el gen por PCR.

Primers: rxynAHJ2EF y rxynAHJ2XR

Purificar con gel los productos

de PCR

Digerir con EcoRI y XhoI

Clonar en los sitios

correspondientes del vector pET-

28a(+)

Transformar el plásmido recombinante, pET-xynAHJ2, en células

competentes E. coli BL21

Identificar los trnasformantes

por PCR

Confirmar el resultado por secuenciación

del ADN.

Cultivar un transformante positivo en medio LB

enriquecido con 100mg/ml de Kamacina a

37°C

Inocular en una dilución 1:100 en LB fresco con kinamicina y cultivar en atmósfera anaeróbica a

37°C

Añadir IPTG

Figura 6: Procedimiento para la expresión de xynAHJ2

6. Purificación e identificación de xilanasa recombinanteCentrifugar a

10000 xg por 8 min a 10°C

Lavar con agua esterilizada

Resuspender en buffer (20mM Tris-HCl 0,5M

NaCl pH=7,2

Romper las células por ultrasonido (7s, 150W)

Centrifugar por 10 min a 10000xg

a 10°C

Aplicar el sobrenadante a columna de agarosa Ni²⁺-

NTA

Correr cromatografía

con gradiente de imidazol.

Detectar la proteína con SDS-

PAGE

Identificar la proteína con

MALDI-TOF/MS

Hacer método de Bradford para cuantificar la

concentración de la proteína.

Figura 6: Procedimiento para la purificación e identificación de la xylanasa recombinante

7. Ensayo de la enzima. La actividad de xilanasa se determinó midiendo la liberación del azúcar reducido del xilano de madera de abedul utilizando el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).

Incubar durante 10 min a 37°C 0,1 ml de enzima

con 0,9 ml de tampón de McIlvaine (pH6,5) que

contenía 0,5% (w / v) de madera de abedul xilano.

Detener con 1,5 ml de DNS

Hervir durante 5

min

Enfriar a T ambiente

Medir absorbancia

a 540 nM

Una unidad (U) de actividad de xilanasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de azúcar por minuto.

Figura 7: Procedimiento para medir la actividad de la enzima

8. Caracterización Bioquímica

Determinación Ensayo

pH óptimo Medición de la actividad enzimática a 37°C usando tampones con rango de pH de 4 a 11.

Estabilidad con pH Medición de la actividad enzimática residualdespués de la incubación de la enzima (0,01 mg) en solución con diversos tampones. (25°C, 1 hora)

Temperatura óptima Medición de la actividad enzimática en tampón de McIlvaine (pH 6,5) con rango de temperatura entre 0 y 60°C

Termoresistencia Preincubación de la enzima (0,01 mg) en tampón de McIlvaine (pH 6,5) a 37, 45, 50 ° C sin sustrato para varios períodos.

Efecto de agentes químicos

Medida de la actividad a 37°C en McIlvaine (pH 6,5) probando varios reactivos: NaCl, KCl, CaCl2, CoCl2, NiSO4, CuSO4, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, Pb (CH3COO) 2, HgCl2, EDTA, SDS, o β-mercaptoetanol

Km, Vmáx, Kcat Se usaron 1-10 mg / ml de xilano de madera de abedul como el sustrato en McIlvaine (pH 6,5) a 35°C. Los datos se representaron gráficamente siguiendo el método de Lineweaver-Burk.

Tabla 1: Ensayos para la caracterización bioquímica de la enzima

9. Números de secuencia de nucleótidos

• Las secuencias de nucleótidos del Bacillus sp. HJ2 16S rDNA y del gen xilanasa (xynAHJ2) se depositaron en el GenBank con el números de acceso JF745865 y JF745867, respectivamente.

RESULTADOS

1. Identificación de la cepa

La comparación de la secuencia parcial de 16S rDNA de la cepa HJ2 (706 pb; JF745865) con los datos del GenBank mostró una identidad de nucleótidos del 99,9% con Bacillus niacini AS2-8 (N º de Acceso JF496375), el 99,9% con Bacillus sp. RC33 FJ263036), y 99,7% con Bacillus sp. 210_54 (GQ199756). Así, la cepa HJ2 se clasificó en el género Bacillus.

El árbol de distancia creada por el “neighbor-joining method” también reveló la misma clasificación pero no se muestran datos.

2. Clonación del gen y análisis de secuencias

• Un fragmento de xynAHJ2 (150 pb) se amplificó por PCR (primers: iXyn10F y iXyn10R). Los fragmentos de ADN amplificados por TAIL-PCR se separaron en gel de agarosa al 2%. Los productos de PCR, que muestran el cambio diferencial esperado, fueron purificados, secuenciados, y alineados a continuación con el fragmento xynAHJ2.

• El xynAHJ2 de longitud completa (JF745867), que es 990 pb, comienza con el codón ATG putativo, termina con TAG, y codifica un polipéptido de 329 residuos (XynAHJ2) con una masa calculada de 38,4 kDa. Se encontró en el análisis de secuencia un dominio catalítico de GH10.

Figura 8: Secuencia de alineación de XynAHJ2 con endoxilanasas GH 10

Identidades

65,3% con iM-KRICT PX1-Ps a partir de

Paenibacillus sp. HPL-001 (ACJ06666)

64,4% iM-iXylC-Cl de Cohnella laeviribosi HY-21 (ADE08352)

63,2% con IXT6 de Geobacillus stearothermophilus T-6 (ABI49937o 2q8x)

o con iH-XynMT1-Gs de G. stearothermophilus MT-1(AAZ74783)

59,9% con iH-BSXYNA-Tx de Thermobacillusxylanilyticus

D3 (CAA76420)

<45% endoxilanasas extracelulares

Figura 9: Parecido genético de la xynnAHJ2 con otras endoxilanasas

3. Análisis filogenético y de estructuraSe construyó una árbol filogenético basado en endoxilanasas GH10 intracelulares y extracelulares termófilas, mesófilas y activas a bajas temperaturas representativas. Se separaron los grupos en dos closters: las intracelulares (i) y las extracelulares (e). La XynAHJ2 del Bacillus sp. HJ2 se agrupó en el closter i, que está cerca de endoxilanasas intracelulares pero lejos las endoxilanasas extracelulares activas a bajas temperaturas.

Figura 10: Árbol filogenético construido utilizando el “neighbor-joining method” basado en las secuencias de aminoácidos de endoxilanasas GH 10 intracelulares (i) y extracelulares (e) termófilas (H), mesófilas (M), y de activas a bajas temperaturas(L)

• La “Homology modeling” de rXynAHJ2, iH-BSXYNA-Tx, iH-XynMT1-G, IM-iXylC Cl-, iM-KRICT PX1 Ps-, el- Xyn10-F, y El-xynA Gm-se realizó a través 2q8xA o 1ur2A (un miembro de PDB) como una plantilla.

• Los valores de identidad con plantilla de homología (> 40%) y las puntuaciones QMEAN4 (> 0,65) sugirieron que la calidad de estos modelos de estructura es satisfactoria . El número de residuos de arginina y puentes de sal de las endoxilanasas intracelulares G10 termófilas y mesófilas eran más que los de endoxilanasas extracelulares GH 10 activas a bajas temperaturas y que los de rXynAHJ2. Sin embargo, los valores otros de parámetros, incluyendo los números de glicina, prolina, puentes disulfuro y enlaces de hidrógeno, ASA, y volumen de embalaje fueron similares o mostraron irregularidad.

• Además, en comparación con endoxilanasas extracelulares G10 activas a bajas temperaturas, eL-Xyn10-FS y El-XynA-Gm, rXynAHJ2 mostró menos ASA total y no polar.

4. Expresión y purificación de rXynAHJ2

El gen que codifica para xynAHJ2 se expresó en E. coli BL21 (DE3) y se indujo con IPTG 0,7 mM a 20°C por 20 h. La enzima extraída de las células de E. coli BL21 (DE3) se purificó por cromatografía de afinidad. La enzima purificada migró como una sola banda en el SDS-PAGE con una masa molecular de unos 46 kDa, cercana al valor calculado de rXynAHJ2 (43,1 kDa). Tres péptidos internos de la enzima purificada, VYEEYFNIGAAVNLNTIK, AFEYAHEADPDALLFYNDYNESNPEK, y NHITSVTFWGAADDYTWLSDFPVR que fueron seleccionados al azar a partir de los resultados de MALDI-TOF/MS, coincidieron con la secuencia de aminoácidos deducida de rXynAHJ2, confirmando que la enzima purificada era rXynAHJ2.

Figura 11: Análisis DS-PAGE de rXynAHJ2.

5. Caracterización de la enzima

Figura 12: Caracterización bioquímica de la enzima.

Determinación Resultado

A. pH óptimo 6,5 a 37°C

B. Estabilidad con pH

Mantiene más del 50% de su actividad luego de haber sido incubada a 25°C con buffers de pH de 6 a 10.

C. Temperatura óptima

35°C con pH= 6,5

D. Termoresistencia Estable a 37°C por tiempos >60 min a temperaturas ≥45°C

Tabla 2: Caracterización bioquímica de la enzima.

Tabla 3: Efecto de 10 mM de iones metálicos y reactivos químicos en la actividad de xilanasa purificada de rXynAHJ2 (0,01 mg).

Usando el xilano de madera de abedul como sustrato: Km= 0,5 mg/mLVmáx= 16,1μmol/min/mgKcát= 11,9/s

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Señal en el N-terminal

indica que la enzima es

una endoxilanasa intracelular.

Estas forman una nueva subclase separada de las

extracelulares con distintos enlaces

entre aa necesarios para su actividad

con los xilooligosacáridos.

El análisis filogenético

sitúa a la xynAHJ2

como endoxilanasa intracelular.

Su perfil térmico la sitúa como activa a

baja temperatura. Su actividad a altas concentraciones de NaCl sugiere que el suelo salino es clave

en la producción de la nueva xilanasa

Tienen menos restos de arginina y

uniones salinas que las meso y

termófilas, lo que les da más flexibilidad

La inhiben totalmente Cu²⁺ y Hg²⁺; parcialmente

Ni²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ y EDTA>5nM

CONCLUSIÓN

Una endoxilanasa GH 10 intracelular activa a baja temperatura XynAHJ2 de Bacillus sp. HJ2 albergado en un suelo salino, fue clonada y expresada en E. coli. La Secuencia, filogenia, el análisis de la estructura y la caracterización de la enzima revelaron la novedad de la XynAHJ2 como endoxilanasa GH 10 intracelular activa a baja temperatura. Así, XynAHJ2 podría representar un buen material para estudiar la relación entre la estructura y función de intracelular y/o la actividad a baja temperatura de las endoxilanasas y una alternativa para los procesos biotecnológicos que implican las bajas temperaturas.

BIBLIOGRAFÍA• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22534297