caracterización molecular de mycoplasma gallisepticum y mycoplasma synoviae en ponedoras...

Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y

Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y

reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia

Cesar Enrique Ventura Politte, MVMaestría Salud Animal

Línea de Microbiología y Epidemiologia Aviar

CONTENIDOGeneralidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

Generalidades de la micoplasmosis




HISTORIA• 1898 en bovinos pleuroneumonia• En aves en los años 30- Sinusitis de

los pavos en 1938• Años 50, en pollos y pavos-ERC

Nocard y Roux, 1898; Nelson 1935; Dickinson y Hinshaw, 1938; Delaplane y Stuart, 1943;Markham y Wong, 1952; Van Roekel y Olesiuk, 1953

ETIOLOGÍA• Clase Mollicutes (mollis = suave y cutes = pared), • Orden Mycoplasmatales• Familia Mycoplasmataceae • Género Mycoplasma • 23 especies pueden afectar aves• Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma

sinoviae, Mycoplasma meleagris y Mycoplasma iowa

Kleven, 2000Browning & Markhan, 2004

600-1350 kpb, con 23-40 % de G-C, 740 genes. Funciones claras 469 genes.

Papasizi et al., 2003

GENOMA DE MG

EPIDEMIOLOGÍA

OIE, 2004;Kleven, 2006

Problemática de pollos, ponedoras, reproductoras y pavos

Aves silvestres y de traspatio

Distribución mundial

EPIDEMIOLOGÍATransmisión Horizontal y VerticalCondiciones de granja: alimento,

roedores, aguaReservorios y transmisores: Personas,

vehículos, Polvo, Insectos y BiofilmsBioseguridad

Kleven, 1996; Christensen, et al., 1994; Butcher, 2008

*

Estudios han demostrado la supervivencia de los micoplasmas a pesar de su notable sensibilidad a desinfectantes y condiciones ambientales extremas de frio y calor. Puede sobrevivir en plumas 4 dias, 3 en el pelo, 3 en el algodon, etc.

PATOGENICIDADCitoadhesinas – Hemaglutininas:

mgc2, vlhA , GapA , PvpA Perfil antigénico variableSon organismos intracelulares "Latencia "

Buyuktanir, et al., 2008; Razin, et al., 1998

DIAGNÓSTICO

Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008

IgM7-10 DPI

IgG15-21 DPI

ConfirmatoriaSerotipificación

Detección del material genético - ADN

Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008

DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA AVICULTURA NACIONAL

MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURALDEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO NACIONAL DE ESTADÍSTICA-DANEFEDERACIÓN NACIONAL DE AVICULTORES DE COLOMBIA-FENAVIFONDO NACIONAL AVÍCOLA-FONAV

63 Granjas de Ponedoras Comerciales – GPC9,5 % del Censo145 Lotes

30 Granjas de Reproductoras Pesadas- GRP33 % del Censo48 Lotes

ENCUESTA Ubicación geográfica

Tamaño y número de lotes en la granja

Uso de vacunas de MG y MS

Edad – Raza – Granjas Cercanas

Tipo de Explotación y Tipo Instalación

Programa de Bioseguridad

MATERIALES Y MÉTODOS• Enero de 2010 y marzo de 2012. • Hisopos traqueales

MATERIALES Y MÉTODOS• 45 animales por cada uno de los lotes

presentes en las granjas• Un hisopo humedecido en PBS por cada

tres aves.

MATERIALES Y MÉTODOS• Lavado del total de hisopos como un pool. • Conservación en un recipiente estéril a -20 0C • Extracción por un procedimiento no fenólico

Modificado de Hernández et al., 2009;OIE, 2008

Primers Secuencia Gen Producto

MG-FMG-R

5' CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A 3' 5' TAAACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C 3'

mgc2 237 pb300 pb

MS-F 1MS-R 1

5´ CCA TTG CTC CTG CTG TTA T 3´ 5´ GAT TCT GTT GTA GTT GCT TCA A 3´

vlhA 300 pb

MS-F 2MS-R 2

5´ AGT AAC CGA TCC GCT TAA TGC 3´ 5´ GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT 3´

vlhA 450 pb

28S-F28S-R

5´ GGC GAA GCC AGA GGA AAC T 3 5´ GAC GAC CGA TTT GCA CGT C 3´

28S 61 pb

García et al., 2005; Wetzel et al., 2010; Hammond et al., 2009; Suzuki et al., 2009

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

• Estadística descriptiva para las diferentes variables

• Pruebas de correlación de variables chi cuadrado

• Pruebas de regresión logística• Software estadístico Statistix 8.0

Mycoplasma gallisepticum

Cepa F

Cepa 6/85

POS NEG

300 pb

300 pb

Mycoplasma synoviae

POS NEG

POS NEG

300 pbWVU1853

450PbWVU1853

300 pb

450 pb

300 pb

500 pb

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

Cepa F Cepa 6/85

Cepa WVU1853 Cepa

WVU1853

300 pb

300 pb

200 pb

Alto porcentaje de positividad a MG y MS

0

20

40

60

80

MSMG

51,81

30,05

48,18

69,94

NEG POS

Po

rcen

taje

n : 193

Positividad a MG y MS

GRPGPC

0

20

40

60

80

100

MG

MS

45,8

20,8

77,9

57,2

Po

rce

nta

jeMayor positividad a MS en los dos tipos de

explotación

p<0,05

Variables sin diferencias estadísticasGPC

Ponedoras comerciales

GRPReproductoras

PesadasAltitud 268-2780 m.s.n.m

p>0,051010-2572 m.s.n.m p>0,05

Tamaño de los lotes

1000 – 121380 avesp>0,05

770 – 36300 avesp>0,05

Departamento p>0,05 p>0,05

Tipo de Instalación

p>0,05 p>0,05

BioseguridadCumplimiento de 6 parámetros

61,8 % p>0,05

100 %

Variables con diferencias estadísticasGPC GRP

Raza 5 Razas p<0,05 en MG 20 – 73 %p<0,05 en MS 60 – 91 %

2 razas p<0,05 en MG 4 – 36 %p<0,05 en MS 39 – 52 %

Grupos Etáreos p<0,05 MG 13% al 74 %p<0,05 MS 13 % al 94%

p<0,05 MG 17% al 33 %p<0,05 MS 17% al 100%

Numero de lotes 1 – 10 p>0,05 en MS p<0,05 para MG 40% - 83%

1 - 3 lotes p>0,05

USO de Vacunas MG y MS

35,2 % MG p>0,050% MS

91,7 % MG p>0,050 %

Infecciones Mixtas MG y MS

POS MG y MS0

20

40

60GPC

GRP

8,3

55,2

Po

rce

nta

jeMayor positividad mixta en Ponedoras Comerciales

Cepas MG Sitios de corte HaeIII en el gen mgc2 de MG Longitud de losFragmentos

Cepa F

TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAATCCACAGGGTTTTGGTGGCCCAATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCGCCACAAATGGGTGGGATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCACCTAACCAAATGGGTGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAATCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTCTCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTAAA

31 pb 53 pb 63 pb 157 pb

Cepa 6/85

TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCGCAGGGCTTTGGTGGCCCAATGTCACTTAACCAAATGGGGATGCGACCAGGGTTTAACCAAATAGCCCCCACAAATGGGAGGAATAGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATAGCCTAATATGAACCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGCGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGG

53 pb 184 pb

Cepa R

CGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCACAGTGCTTTGGTGGCCCAATGCAACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAACCAACCTAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTA

52 pb248 pb

Acceso Genbank AY556230.1; AY556231.1 y AY556228.1

PCR-RFLP para diferenciar cepas de MG

www.insilico.ehu.es

MG 300

157 184

HaeIII 63

53

31

53

MG 237

248

52

CampoCepa F

6/85

Lectura de Patrones de restricción para M. gallisepticum

ROJO: Patrón 1

AMARILLO: Patrón 2

Identificación de patrones RFLP de MG con Tinción de plata

Control Cepa

F

Muestra con

Patrón1

Control Cepa6/85

Muestra con

Patrón1

Muestra con

Patrón2

100pb

40pb

200pb

60pb

300pb

160pb

Patrones RFLP de MG

POS MG0

20

40

60

80Patron 1

Patron 260,2

39,8

Po

rce

nta

jeMayor porcentaje de cepas de campo de

MG

n:93

Sin diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2

Altura p>0,05 p>0,05

Número de lotes en las granjas

p>0,05 p>0,05

Tamaño de los lotes p>0,05 p>0,05

Departamento p>0,05 p>0,05

Bioseguridad cumplimiento de 6 parámetros

p>0,05 p>0,05

Con diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2

Raza p<0,05 7 – 40 % GPC

p<0,05 2 – 53 % GPC

Tipo de Instalación

p<0,05 Jaulas 22% - Piso 57%

p<0,05 Jaulas 5-9 %- Piso 86 %

Tipo de Explotación

p<0,05 30% GPC- 90% GRP

p<0,05 70% GPC- 10 % GRP

Secuenciación de 80 muestras

seleccionadas

MS46 muestras

MG34 muestras

Patrón 222 muestras

Patrón 112 muestras

Única Banda36 muestras

Doble banda10 muestras

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTAcceso Genbank AY556230.1 , HQ591358.1, AY556228.1

Patrón 1 Patrón 2

96-100 % Entre ellas

96-100 % entre ellas

96-99% con la Cepa F

Cepa F control 98% y 100% Eis7C10

96-98 % cepa R de referencia

Similaridad de las secuencias de MG

Nucleotide Substitutions (x100)0

16.6

246810121416

AY556230.1 Strain F.s eqMG189.seqHQ591358.1 Eis7-C-10.seqMG20.seqMG61.seqMG86.seqMG126.seqMG27.seqCepaF.s eqMG13.seqMG7.s eqMG69.seqMG172.seqMG12.seqAY556231.1 Strain 685.seqVacuna 6-85.s eq

Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

_________________

_________________

__________________________________

Patrón 1 en Muestras de campo


23.4

5101520

MG54.seqMG139.seq

MG142.seqMG149.seqMG143.seqMG85.seqMG94.seq

AY556229.1 Strain S6.seqMG186.seqMG22.seqMG29.seqMG46.seqMG190.seq

MG194.seqMG156.seq

AY556228.1 strain R.s eqMG165.seq

MG70.seqMG89.seq

MG72.seqMG75.seq

MG201.seqAY556230.1 Strain F.s eq

AY556231.1 Strain 685.seq


_________________

Patrón 2 en Muestras de campo

__________________________________

Similaridad de las secuencias de MS

Se escogieron un grupo de cepas con mas alto porcentaje de similaridad en BLAST

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTGenbank HQ326484.1; DQ661614.1; FM164370.1; AB507391.1 ; FJ495803.1

83,2 % - 96,9 % Entre ellas

40-99 % En muestras de doble banda

Similaridad de las secuencias de MS

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTGenbank HQ326484.1; DQ661614.1; FM164370.1; AB507391.1 ; FJ495803.1

Cepa WVU1853 : 38,9 % - 43,8 %

Cepa EEA: 82 % - 97 %

Cepa 94011: 89 % - 96 %

Cepa NZMSID181: 82 % – 98 %

Cepa B45/04: 88 % - 95 %



77.7

10203040506070

MS30.seqMS21.seqMS101.seq

MS12.seqMS142.seqMS149.seq

MS87.seqFM164370.1 Strain B45 04.seq

MS51.seqAB507391.1 Strain NZMSID181.seqDQ661614.1 Strain 94011.seq

MS134.seqFJ495803.1 Strain EAA.seq

MS62.seqMS43.seqHQ326484.1 WVU1853.seq_________________

_________________

__________________________________

_________________

Productos de MS de una sola banda



58.1

1020304050

MS28.seqMS190-1.seqMS37.seqMS37-1.seqMS104.seqMS104-.seqMS60-.s eqMS76-1.seqAB507391.1 Strain NZMSID181.seqMS194.seqMS28-1.seqMS76.seqFM164370.1 Strain B45 04.seqFJ495803.1 Strain EAA.seqMS194-1.seqMS52-1.seqDQ661614.1 Strain 94011.seqMS52.seqMS60.seqHQ326484.1 WVU1853.s eq

Productos de MS de dos bandas

_________________

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_________________

_________________

CONCLUSIONES• Alta presencia de MG y MS de campo

en los dos tipos de explotación en estudio.

• Mayor presencia en granjas multiedad y mayor edad de los lotes

• Posibilidad de Transmisión Vertical

CONCLUSIONES• Infecciones mixtas que afectan el

manejo farmacológico y vacunal de lo agentes a nivel de granja

• Se debe determinar el uso y la importancia del uso de vacunas para el control de la enfermedad en las granjas

RECOMENDACIONES• Estudios que involucren todas las etapas de

producción en los diversos tipos de explotación

• Evaluación de programas vacunales • El mismo tipo de estudio en otras zonas

avícolas del país• Evaluar interacción de micoplasmas con

otros patógenos respiratorios

caracterización molecular de mycoplasma gallisepticum y mycoplasma synoviae en ponedoras...

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