caracterización del veneno de philodryas patagoniensis del nordeste de argentina

7/23/2019 Caracterización del veneno de Philodryas patagoniensis del Nordeste de Argentina.

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U N I V E R S I D A D N A C I O N A L D E L N O R D E S T EC o m u n i c a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T e c n o l ó g i c a s 2 0 0 3

Resumen: E-068

Caracterización del veneno de Philodryas patagoniensis del Nordeste de Argentina.

Peichoto, María E.1 - Leiva, Laura C.

1 - Acosta, Ofelia

2

Maruñak, Silvana2 - Ruíz, Raquel

2 - Teibler, Pamela

2

1. Cátedra de Química Biológica I - Facultad de Cs. Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE. Av. Libertad 5450 - (3400) Corrientes - Argentina. E-mail: [email protected]

2. Dpto. de Clínicas - Facultad de Cs. Veterinarias - UNNE.

Sargento Cabral 2139 - (3400) Corrientes - Argentina.Tel./Fax: +54 (03783) 425753 / 420854 - E-mail: [email protected]

ANTECEDENTES

Se conoce muy poco sobre la composición y actividades biológicas del veneno de Philodryas patagoniensis. Se

sabe que es una culebra opistoglifa que se adapta fácilmente a varios ambientes, incluso peridomiciliarios, gracias a queacepta una variada alimentación. Los ejemplares adultos llegan a medir más de un metro de longitud. Su distribucióngeográfica abarca: Brasil, Bolivia, Paraguay, Argentina y Uruguay (Peters and Orejas-Miranda, 1970; Rocha andMolina, 1987). Es semiarborícola (Rocha and Molina, 1987). Según Sazima and Haddad (1992), puede también ser

terrícola, siendo bastante común encontrarla en lugares descampados.Reportes de mordeduras en humanos por esta culebra son escasos (Fowler and Salomão, 1994; Nishioka and

Silveira, 1994; Araujo and dos Santos, 1997).

Al igual que en los casos de mordeduras por P. olfersii, los signos y síntomas locales producidos pormordeduras de P. patagoniensis pueden ser confundidos con los producidos por mordeduras de especies de Bothrops, loque es necesario evitar para impedir la aplicación del antiveneno específico, que podría desencadenar efectos perjudiciales sobre la salud del individuo (Nishioka and Silveira, 1994).

No habiendo estudios previos sobre la composición del veneno de Philodryas patagoniensis, en este trabajo se

presenta la caracterización del veneno de esta culebra que habita la región nordeste de Argentina.

MATERIALES Y METODOS

Veneno de Phi lodryas patagoniensis

El veneno se obtuvo a partir de serpientes adultas (90 – 120 cm de longitud) del Serpentario del Zoológico dela ciudad de Corrientes.

La extracción del veneno se realizó introduciendo una micropipeta de 100 µl en cada colmillo, siguiendo el procedimiento de Ferlan et al. (1983). El veneno crudo fue desecado, homogeneizado y conservado a -20 ºC. Para la

realización de los ensayos, el veneno se disolvió en solución salina amortiguada con fosfato 0.1 M (pH 7.2). La pequeñacantidad de material insoluble, que puedo formarse, se separaró por centrifugación, obteniéndose un sobrenadantelímpido que se destinó para los ensayos.

Estimación de la concentración de proteínasEl contenido de proteína fue estimado a partir de la medida de la absorbancia a 280 nm en una cuba de 1 cm,

asumiendo que la absorbancia de 1 mg/ml de veneno crudo es de 1.183.

Caracterización del veneno: -Ensayos in vi tro

Acti vidad proteolíti caLa actividad proteolítica fue determinada sobre caseína de leche bovina (Fluka Biochemika), mediante una

modificación del método de Friedrich y Tu (1971) como descripto por Lomonte y Gutiérrez (1983). El procedimiento

realizado fue el siguiente: a 2.0 ml de solución de caseína al 1% en solución salina amortiguada con fosfato 0.1 M (pH7.2) se le añadió 1.0 ml de solución de veneno de concentración determinada. La mezcla se incubó a 37 ºC durante 30minutos, y la reacción se detuvo mediante la adición de 4.0 ml de ácido tricloroacético al 5%. Luego de un período de

30 minutos a temperatura ambiente, los tubos se centrifugaron, y la absorbancia del sobrenadante se determinó en unespectrofotómetro Cam Spec M330, empleando una longitud de onda de 280 nm. Se utilizó un blanco en el cual fueomitida la solución de veneno. La actividad proteolítica se expresó en unidades/mg, para lo cual se dividió el cambio de

absorbancia en 30 minutos por los mg de veneno presentes en el tubo, multiplicándose la relación anterior por 100.

Retraso del tiempo de coagulación de Tr ombina

A 200 µl de fibrinógeno humano 4 mg/ml (fibrinógeno humano tipo I, Sigma) se le adicionaron alícuotas de 50

µl de soluciones conteniendo las siguientes cantidades de veneno: 4.65, 9.3 y 18.6 µg. Las mezclas fueron pre-incubadas a 37 ºC durante 10 minutos. Luego se agregó, a las mezclas de reacción, 50 µl de trombina humana (Sigma)10 NIH unidades/ml; y los tiempos de coagulación fueron registrados con un cronómetro (Assakura et al., 1994).




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Actividad fi bri nolíticaSe trabajó con un coágulo de fibrina obtenido a partir de mezclas de plasma de cinco carneros, empleando

citrato de sodio como anticoagulante. El plasma se diluyó al 1/2 con el buffer Tris-HCl 0.05 M (pH 7.5), conteniendoSulfato de amonio 0.07 M, Cloruro de Sodio 0.09 M y Cloruro de Magnesio 0.69 mM. Se transfirieron 22 ml de lasolución de plasma/buffer a placas plásticas (13 x 8 cm). Se adicionaron 2.2 ml de solución de Cl 2Ca 0.25 M y 132 ìl

de trombina humana (Sigma) 10 NIH unidades/ml. Se incubó a 37 ºC por una hora. Se perforaron orificios de 2 mm dediámetro manteniendo una distancia de 1.5 cm entre un pozo y otro. Se adicionaron 10 ìl de las muestrascorrespondientes en cada uno de los pozos. Se incubó por 18 horas a 37 ºC. La Concentración Fibrinolítica Mínima(CFM) fue definida como la concentración (mg/ml) de veneno que indujo un área de 12 mm de diámetro (Rojas et al.,1987).

Electroforesis SDS-PAGE Se realizó electroforesis del veneno de Philodryas patagoniensis en gel de poliacrilamida en presencia de

dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), por el método de Laemmli (1970) usando 15% de gel de poliacrilamida. Los

geles fueron teñidos con Coomassie Blue R250.

-Ensayos de toxi cidad en animalesPotencia letal del veneno

Ratones blancos de la Cepa CF-1 de 18-20 g de peso corporal distribuídos en grupos de cuatro, fueron

inyectados por vía intraperitoneal con veneno entero, disuelto en buffer PBS (pH 7.2) en dosis que fueronincrementándose en un factor de 1.5. El volumen inyectado fue de 0.1 ml. Los ratones control, recibieron 0.1 ml de buffer PBS (pH 7.2). La supervivencia fue observada a las 48 hs y la DL50 (Dosis Letal 50) y sus límites de confianzafueron estimados mediante el método de Spearman-Karber (World Health Organization, 1981).

Actividad edematizanteSe utilizó el método de Yamakawa et al. (1976). Grupos de 4 ratones de 18 a 20 g de peso corporal fueron

inoculados en almohadilla plantar dérmica con 50 µl de solución conteniendo diferentes cantidades de veneno, el

miembro contrario fue inoculado con 50 µl de buffer PBS (pH 7.2). Una hora después de la inyección, los ratonesfueron anestesiados con hidrato de cloral i.p. 300 mg/kg y sacrificados por dislocación cervical. Luego se cortaron

ambos miembros inoculados para ser pesados en balanza analítica. El edema fue expresado en porcentaje comoincremento de peso del miembro inoculado respecto al opuesto. La Dosis Mínima Edematizante (DME) fue definidacomo la menor cantidad de veneno que causa un 30% de incremento en el peso, comparado con el control.

Actividad hemorrágicaLa actividad hemorrágica fue cuantitativamente determinada por el método de la piel de Kondo et al. (1960) y

modificada por Gutiérrez et al. (1985). Las soluciones a testear (100 µl) fueron inyectadas en la piel de la espalda deratones. Dos horas después de la inyección, las pieles fueron removidas, y los diámetros de las manchas hemorrágicas

fueron medidos sobre la superficie interna. La mínima cantidad de proteína que produjo una mancha hemorrágica de 10mm

2 fue tomada como la Dosis Mínima Hemorrágica (DMH).

RESULTADOS

-Ensayos in vitro

Acti vidad proteolíti caLa actividad proteolítica fue testeada usando soluciones de diferente concentración del veneno. Los valores del

cambio de absorbancia obtenidos ( Abs 280) fueron graficados en función del logaritmo de la concentración delveneno. La relación lineal obtenida (r = 0.992) nos permitió determinar la actividad proteolítica. El veneno de P. patagoniensis mostró un alto valor de actividad proteolítica (143 U/mg de veneno) cuando fue testeado sobre caseína bovina.

Retraso del tiempo de coagulación de Tr ombinaLa actividad fibrinógenolítica del veneno de P. patagoniensis fue estimada mediante el retraso del tiempo de

coagulación de trombina. La coagulación de fibrinógeno por trombina fue significativamente retardada cuando el

fibrinógeno fue incubado con soluciones de veneno antes del ataque de la trombina. El retraso del tiempo decoagulación de fibrinógeno por trombina fue proporcional a la cantidad de veneno presente en cada solución. Lacantidad de proteína que causó un cambio de 20 a 60 segundos sobre el tiempo de coagulación de trombina fue de 9.53ìg.

Actividad Fi bri nolíticaLa actividad fibrinolítica fue testeada usando soluciones de diferente concentración del veneno. Los valores delos diámetros de los halos de fibrinólisis fueron graficados en función del logaritmo de la concentración del veneno. Larelación lineal obtenida (r = 0.949) nos permitió determinar la CFM, encontrándose un valor de 1.50 mg/ml.




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Electroforesis SDS-PAGEBajo condiciones reductoras y no reductoras, el veneno de P. patagoniensis mostró las mismas cadenas

polipeptídicas constituyentes sobre SDS-PAGE.

Perfiles electroforéticos de los venenos crudos de Philodryas patagoniensis y Crotalus durissus

terrificus.A- Electroforesis en gel SDS-poliacrilamida 12% delveneno crudo de Crotalus durissus terrificus (línea 2),marcadores de peso molecular (línea 1). B-Electroforesis en gel SDS-poliacrilamida 12% delveneno crudo de Crotalus durissus terrificus (línea 3),

veneno crudo de Philodryas patagoniensis encondiciones no reductoras (línea 2), veneno crudo de Philodryas patagoniensis en condiciones reductoras

(línea 1).

-Ensayos de toxicidad en animalesPotencia letal del veneno

La Dosis Letal 50 hallada para el veneno de P. patagoniensis fue de 2.93 ìg/g, limites de confianza del 95 %:2.31 a 3.71 ìg/g.

Actividad edematizanteEl veneno de P. patagoniensis exhibió intensa actividad edematogénica, cuando fue testeado mediante el

ensayo de la almohadilla plantar. Los incrementos porcentuales en peso del pie derecho comparado al izquierdo fueronevaluados 1 hora después de la inyección del veneno y fueron proporcionales a la cantidad de veneno inyectado; la

relación lineal obtenida (r = 0.9837) nos permitió determinar la DEM, obteniéndose un valor de 0.26 ìg.

Acti vidad hemorrágica El veneno de P. patagoniensis exhibió fuerte actividad hemorrágica cuando fue testeado mediante el ensayo de

la piel. Los diámetros de las manchas hemorrágicas fueron evaluados 2 hs después de la inyección y fueron proporcionales a la cantidad de veneno inyectado; la relación lineal obtenida (r = 0.995) nos permitió determinar la

DHM, encontrándose un valor de 0.035 ìg.

DISCUSION DE RESULTADOS

El veneno de Philodryas patagoniensis estudiado mostró tener una elevada actividad proteolítica sobre caseína bovina. Si comparamos su actividad proteolítica con la correspondiente a la de Bothrops alternatus (20 U/mg) (Ruíz etal., 2001), especie de Bothrops responsable de la mayoría de los accidentes ofídicos en Corrientes, podemos deducir que

el veneno de P. patagoniensis es mucho más proteolítico que el de Bothrops alternatus.El retraso del tiempo de coagulación de trombina demuestra que el veneno degrada fibrinógeno in vitro

volviéndolo incoagulable por la trombina. También, a través de este ensayo, se pudo probar que el veneno no coagulafibrinógeno purificado, ya que no se pudo observar la formación de coágulo durante el tiempo (10 minutos) que elveneno fue pre-incubado con fibrinógeno a 37 ºC. Por lo tanto, el veneno no tiene actividad thrombin-like, la cualconvierte fibrinógeno a fibrina. Mientras que ensayos realizados con venenos de especies de Bothrops, mostraron

formación de coágulos, ya que estos venenos poseen enzimas thrombin-like (Gené et al., 1989).

A través del ensayo en placa, se pudo demostrar que el veneno de P. patagoniensis, además de degradar elfibrinógeno, también es capaz de degradar fibrina. Esta actividad también se puede evidenciar en venenos de especies

de Bothrops (Gené et al., 1989).En la electroforesis SDS-PAGE del veneno de P. patagoniensis se observan bandas de PM del orden de 30 a

60 kD, compatibles con proteínas de peso molecular detectadas en el veneno de otra especie de Philodryas (metaloproteasas de peso molecular 47; 45 y 58 kD y serinoprotreasa de 36 kD presentes en el veneno de P. olfersii;Assakura et al., 1994).

Con respecto a la letalidad, si nosotros comparamos las DL50 de P. patagoniensis y P. olfersii, ambos venenosexhiben la misma toxicidad (aproximadamente 3 ìg/g), la cual es comparable a la correspondiente a muchos venenos bothrópicos (Weinstein and Kardong, 1994).

El veneno de P. patagoniensis mostró tener una actividad edematizante mucho más grande que la exhibida por

venenos de especies de Bothrops de Argentina: B. jararaca, B. jararacussu,B. neuwiedii y B. alternatus, los cuales presentan valores de DEM de 0.85 ìg, 1.5 ìg, 2.05 ìg y 4.00 ìg, respectivamente (Acosta et al, 1998).

También se pudo demostrar que el veneno de P. patagoniensis exhibe una considerable actividad hemorrágica.La DHM encontrada para este veneno es mucho más pequeña que la correspondiente al veneno de P. olfersii (DHM =1.2 ìg) (Assakura et al., 1994). También podemos comparar su actividad hemorrágica con la correspondiente a




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Bothrops alternatus (yarará grande) (DHM = 3.6 ìg) (Acosta et al., 1998), especie de Bothrops responsable de lamayoría de los accidentes ofídicos en el Nordeste de Argentina. De estas comparaciones, podemos presumir que lamordedura por esta culebra provocará efectos hemorrágicos importantes sobre las víctimas.

CONCLUSIONES

El veneno de Philodryas patagoniensis exhibió elevadas actividades proteolítica, fibrinolítica, fibrinógenolítica

y edematizante. Metaloproteasas y serinoproteasas son probablemente las enzimas responsables de tales actividades

biológicas.Los resultados ponen en evidencia la toxicidad del veneno de esta culebra, pudiendo ocasionar lesiones graves

en el individuo accidentado.

BIBLIOGRAFIA

− Acosta de Pérez, O; Koscinczuk, P.; Teibler, P.; Sánchez Negrette, M.; Ruiz, R. y Bogarín G.. Actividadeshemorrágica y edematizante y alteraciones histológicas en almohadilla plantar del ratón inducidas por venenos deserpientes de los géneros Bothrops y Crotalus de Argentina. Toxicon, 36, 8: 1165-1172, 1998.

− Araujo, M.E., dos Santos, A.C.. Cases of human envenoming caused by Philodryas olfersii and Philodryas patagoniensis (Serpentes: Colubridae). Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 30, 517-519, 1997.

− Assakura, M. T., Reichl, A. P., Mandelbaum, F. R.. Isolation and characterization of five fibrin(ogen)olyticenzymes from the venom of Philodryas olfersii (green snake). Toxicon, 32: 819-831, 1994.

− Ferlan, I., Ferlan, A., King, T. and Russel, F. E.. Preliminary studies on the venom of the colubrid snakeRhabdophis subminiatus (red-necked keelback). Toxicon, 21: 570-574, 1983.

− Fowler, I.R. and Salomão, M. da G.. Activity patterns in the colubrid snake genus Philodryas and their relationshipto reproduction and snakebite. Bull. Chicago Herp. Soc. 29, 229-232, 1994.

− Friedrich, C. and Tu, A. T.. Role of metals in snake venoms for hemorrhagic, esterase and proteolytic activities. Bioch. Pharm., 20: 1549-1556, 1971.

− Gené, J. A., Roy, A., Rojas, G., Gutiérrez, J. M., Cerdas, L., 1989. Comparative study on coagulant, defrinating,

fibrinolytic and fibrinogenolytic activities of costa rican crotaline snake venoms and their neutralization by a polyvalent antivenom. Toxicon, 27: 841-848.

− Gutiérrez, J. M., Gené, J. A., Rojas, G. and Cerdas, L.. Neutralization of proteolytic and hemorrhagic activities ofcosta rican snake venoms by a polyvalent antivenom. Toxicon, 23: 887-893, 1985.

− Kondo, H., Kondo, S., Ikesawa, H., Murata, R. and Ohsaka, A.. Studies on the quantitative method for thedetermination of hemorrhagic activity of Habu snake venom. Japan J. Med. Sci. Biol., 13: 43-51, 1960.

− Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . Nature, 227:680-685, 1970.

− Lomonte, B. y Gutierrez, J. M.. La actividad proteolítica de los venenos de serpientes de Costa Rica sobre lacaseína. Rev. Biol. Trop., 31: 37-40, 1983.

− Nishioka, S. de A. and Silveira, P. V. P.. Philodryas patagoniensis bite and local envenoming. Rev. Inst. Med.

Trop. São Paulo, 36:279-281, 1994.

− Peters, J. A. and Orejas-Miranda, B.. Catalogue of the Neotropical Squamata. Part I. Snakes. Bull. U. S. Nat. Mus.,297: i-viii + 1-347, 1970.

− Rocha, M. B. and Molina, F. B.. Considerações preliminares sobre a biología e manejo de Philodryas

patagoniensis, parelheira, em cativerio (Colubridae, Ophidia). In: Resumes do ΧΙV Congres. Brasil. de Zoología, 134, 1987.

− Rojas, G.; Gutiérrez, J. M.; Gené, J. A.; Gómez, M. and Cerdas, L.. Neutralización de las actividades tóxicas y

enzimáticas de cuatro venenos de serpientes de Guatemala y Honduras por el antiveneno polivalente producido enCosta Rica. Rev. Biol. Trop.. 35, 1: 59-67, 1987.

− Ruiz de Torrent, R.; Leiva, L. C. A. y Acosta de Pérez, O.. Efecto proteolítico de venenos de serpientes del género Bothrops (yarará) de la Argentina y su neutralización por un antiveneno bivalente. Acta Toxicol. Argent . 9,1: 9-12,

2001.

− Sazima, M. V., Hadad, C. F. B.. Répteis da Serra de Japi: notas sobre historia natural. In: Morellato, L. P. (Ed.).

História Natural da Serra do Japi: Ecología e Preservacão de uma Area Florestal do Sudeste do Brasil . Editora daUnicamp Fapesp, São Paulo, 212-236, 1992.

− Weinstein, S. A. and Kardong, K. A.. Properties of Duvernoy’s secretions from opistoglyphous and aglyphouscolubrid snakes. Toxicon, 32: 1161-1185, 1994.

− World Health Organization. Progress in the Characterization of Venoms and Standardization of Antivenoms,World Health Organization, Geneva, 1981.

− Yamakawa, M., Nozaki, M. and Hokama, Z.. Fractionation of Sakishima-Habu (Trimeresurus elegans) venom and

lethal hemorrhagic, and edema forming activities of the fractions, p. 97-109. In: Ohsaka, A.; Hayashi, K. and Sawai,Y (eds.). Animal, plant and microbial toxins, vol. 1, Biochemistry. Plenum Press, New York, 1976.

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