Caracterización de la respuesta inmune inducida en ratón por vacunas

frente al virus de la fiebre aftosa basadas en cápsidas quiméricas de

Calicivirus.

Vacunas basadas en capsidas vacías

Ventajas:

•  Seguridad (vacunas de subunidad, no virus infectivo)

•  Presentación multimérica de epítopos antigénicos.

•  Capaces de estimular respuesta celular.

•  No requieren adyuvantes.

•  Pueden inducir protección por vía oral y nasal.

•  Pueden inducir inmunidad sistémica y en mucosas.

VLPs = Virus-like particles (capsidas vacías)

Vacunas basadas en VLPs de Calicivirus

VLPs del Virus de la Enfermedad Hemorrágica del Conejo (RHDV), buenas candidatas:

•  Están compuestas por una única proteína estructural.

•  Son altamente inmunogénicas.

•  Son bastante estables.

•  Pueden purificarse fácilmente en grandes cantidades (sistema de baculovirus).

Precedente: Las VLPs del virus Norwalk (Calicivirus humano del género Norovirus) inducen respuesta inmune sistémica y en mucosas en ratones inoculados por vías oral e intranasal.

Vacunas basadas en VLPs quiméricas

Son VLPs a las que se ha insertado secuencias heterólogas.

Para vacunas: Secuencias inmunogénicas (epítopos B y T).

Nuestro objetivo: Producir VLPs quiméricas de Calicivirus que contengan epítopos B y T del virus de la fiebre aftosa.

VLPs quiméricas

Cápsida de Calicivirus: 180 copias proteína estructural.

VLP quimérica: puede presentar 180 copias del epítopo insertado.

VP60

Bac-VP60

Baculovirus

Plásmido

Recombinación Homóloga

Construcción de baculovirus recombinantes Bac-VP60

(en cultivos celulas de insecto) (virus dsDNA 136Kb)

Expresión en células de insecto

CARACTERIZACION ESTRUCTURAL DE LAS VLPs DE RHDV

Paso previo a la construcción de VLPs quiméricas

Condiciones de los sitios de inserción:

•  Sitios que no eliminen la capacidad de autoensamblaje de las VLPs.

•  Sitios que estén expuestos hacia el exterior y accesibles al sistema inmune.

Análisis mutacional de la proteína VP60

VP60

NTDA3

CTDA3

NT29

CT30

579

550

549

593

592

DA3

DA3

518

476

NT61

NT103

CT60

CT100

519

479

NT42 537

Estudio de la capacidad de los mutantes para autoensamblarse formando VLPs

Construcción Formación VLPs

VP60 SI (40 nm)

NT29 SI (27 nm)

NT42 SI (27 nm)

NT61 SI (27 nm)

NT103 NO

CT30 NO

CT60 NO

CT100 NO

NT-DA3 SI (40 nm)

CT-DA3 SI (40 nm)

Análisis mutacional de la proteína VP60

Estudio de la capacidad de los mutantes para autoensamblarse formando VLPs

VP60 NT29 NT42

NT61 NT-DA3 CT-DA3

Microscopía electrónica (tinción negativa)

VLPs RHDV VLPs NV VLPs RHDV

180 copias 60 copias

Modelo estructural de la cápsida de RHDV

Criomicroscopía y procesamiento digital de imágenes

180 copias

LOCALIZACION DE EPÍTOPOS T Y B INMUNODOMINANTES EN EL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA

Proteínas maduras

VP4

2A

L/L’ VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A

3B

3C 3D

Péptido B Péptido T (Sitio A)

140 160 20 34 Péptido T

Induce anticuerpos neutralizantes

Esther Blanco

Motivo RGD

RGD 26 ggatcc acta cgacctacaccgccagtgcacgcggggatttggctcacct aacgacgac gcatgc tcggcat ttgccg tga G S T T T Y T A S A R G D L A H L T T T H A R H L P RGD 22 ggatccaccgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacgac gac gcatgc tcgg catttgccg tga G S T A S A R G D L A H L T T T H A R H L P RGD 19 ggatcc cgac g catgc tcg g tga G S T A S A R G D L A H L T T T H A R RGD 14 ggatcc accgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacg tga G S

T3A22 ggatccgcagccattgaattctttga gggcatggtacacgact ccat taaggaggaactccggccc tga G S A A I E F F E G M V H D S I K E E L R P T3A17 ggatccgcagccattgaattctttga gggcatggtacacgactccat taag tga G S A A I E F F E G M V H D S I K TVP417 ggatcc ataattaac aactactatatgcagcagtaccaaaactccatggac tga G S I I N N Y Y M Q Q Y Q N S M D

Inserción de epítopos del virus de la fiebre aftosa en las VLPs de RHDV

Epítopos B, Sitio A (respuesta inmune humoral)

Epítopos T (respuesta inmune celular)

accgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacga

T A S A R G D L A H L T

VLPs

Si

Si

Si

Si

Si

Si

No

Inserciones en el extremo carboxi terminal

Nuevas construcciones VLPs quiméricas

VP60

C-B

C-BT

NT-CB

B1

B2

B3

Epítopo B Epítopo T

Inmunogenicidad de VLPs de calicivirus en ratones

Inmunógeno: PBS (control negativo) VLPs RHDV: Lagovirus, transmisión aerógena. VLPs NV: Norovirus, transmisión vía digestiva.

Vía de administración: Intranasal Intramuscular Intraperitoneal

Dosis: 2µg 10µg

Variables examinadas:

60 ratones BALB/c de 5 semanas, hembras. Grupos de 4 ratones.

Tiempo 20 dpi (sangría)

Tiempo 0 dpi (sangría preinmunes)

Tiempo 35 dpi (sangría)

1ra Inoculación

Sacrificio

Protocolo de Inmunización

2a Inoculación (boost)

Por cada vía de inoculación (intranasal, intramuscular e intraperitoneal):

PBS RHDV (2µg) RHDV (10µg) NV (10µg) NV (2µg)

1

10

100

1.000

10.000

100.000

1.000.000

2 µg 10 µg 2 µg 10 µg

RHDV NV

Intranasal

1

10

100

1.000

10.000

100.000

1.000.000 Intramuscular

1

10

100

1.000

10.000

100.000

1.000.000 Intraperitoneal

2 µg 10 µg 2 µg 10 µg

RHDV NV 2 µg 10 µg 2 µg 10 µg

RHDV NV

4/4

1/4 1/4

1/4

3/4

4/4 4/4

4/4 4/4 4/4

4/4

4/4

TÍTULACION IgG EN SUERO

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

3.21%

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

3.8%

RHDV-VLPs Mock

IFNγ

CD4+

CD8+ 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

0.31%

0.32%