Rcv. Med. Univ. Navarra, XVI: 217, 1972

UNIVERSIDAD DE NAVARRA. FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIONES MEDICAS

(CENTRO COORDINADO DEL C.S.I.C.)

Caracterización estructural de la proteína C reactiva

NÍ. Pérez Miranda* y P. Liso lrurzun

RESUMEN

Se ha aislado la proteína C reactiva (PCR) contenida en líquido ascítico humano, por medio de precipitación con SO, (NHa}2 y posterior croma­tografía en DEAE-celulosa. La PCR aislada ha sido fraccionada sucesiva­mente, mediante su incubación con urea SM y mercaptoetanol. Las carac­terísticas inmunoelectroforéticas, antigénicas y de ultracentrifugación de la molécula completa y de sus fragmentos han sido analizadas. El peso molecular de PCR ha sido 135.000 (7, 4 S); el de las fracciones obtenidas con urea SM (PCR-U), 21.000; el de las obtenidas tras la acción del mercaptoetanol (PCR-M), 23.000; finalmente, el de las tratadas sucesiva­mente con urea y mercaptoetanol (PCR-2F), 10.000.

Los fragmentos PCR-U conservan las características antigénicas e inmuno­electroforéticas de la PCR. Por el contrario, los fragmentos PCR-M mos­traron haber perdido las características específicas de la PCR. Estos re­sultados sugieren que la PCR está formada por 6 unidades que contienen en su interior un puente S-S, tendido entre dos subfragmentos iguales, y que están unidas 'entre sí, en forma circular, por medio de puentes H-H, para constituir la molécula completa.

La significación fisiológica de la proteí­na C reactiva sigue siendo desconocida. Esta proteína ha sido identificada en los sueros patológicos, en el curso de muy diversos cuadros clínicos 28 • Pero nos-

(*) Trabajo realizado con una Ayuda de In­vestigación del Ministerio de Educación y Ciencia.

otros pudimos demostrar que esta pro­teína se encuentra también en los sue­ros normales, siendo posible demostrarla en ellos mediante su precipitación en agar por medio de un antisuero especí­fico 22• El análisis antigénico de esta pro­teína de los sueros normales evidenció su completa independencia de las restan­tes clases de inmuhoglobulinas u. Por in-

218 M. PEREZ MIRANDA Y P . LISO IRURZUN Vol . XVI

munoelectroforesis pudo demostrarse igualmente que sus características elec­troforéticas son distintas de las inmuno­globulinas, dibujándose el arco de preci­pitación correspondiente a esta proteína entre los de la Ig A e Ig G. 2•

11•

28•

32• Las

pequeñas diferencias existentes en las ca­racterísticas de su migración electroforé­tica, pudimos demostrar también que son debidas solamente a diferencias de su concentración sérica 11 •

Dadas las características inmunoelectro­foréticas de la proteína e reactiva, que son las de una gamma globulina, y la importante misión que esta substancia desempeña en los procesos infecciosos, en los que parece jugar un pape1 defen­sivo humoral 2• 28 , sugerimos la posibili­dad de que ella fuese una inmunoglobu­lina 22.

Habla a favor de esta interpretación el hecho de que una proteína idéntica a la que se detecta en los sueros humanos, se encuentra también en los sueros de di­versos animales estudiados 1• 28 .

Aunque estas razones son suficientes pa­ra admitir que el papel fisiológico de la proteína C reactiva sea semejante al de una inmunoglobulina, no pueden consi­derarse como una demostración 6• Todas las inmunoglobulinas hasta ahora cono­cidas tienen una composición estructural semejante 9• 16• La estructura fundamen­tal de las mismas la constituye una uni­dad formada por cuatro cadenas pelipep­tídicas, iguales dos a dos : dos cadenas ligeras o L, de un peso molecular de alrededor de 20.000 y dos cadenas pesa­das o H, de un peso ·molecular variable entre 40.000 y 60.000 3• 4• 30• Las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas de dis­tintas clases son iguales entre sí, mien­tras que las cadenas pesadas son distin­tas, no mostrando comunidad antigénica con las de otras clases de inmunoglobu­linas 15, 25 ,21 .

Por estas razones continuamos nuestras investigaciones sobre la proteína e reac-

tiva con un estudio encaminado a carac­terizar la composición estructural de esta proteína. Como se comunica en una pu­blicación inmediata 21 , pudimos demos­trar que la proteína C reactiva es una substancia de compos1c1on compleja, constituida por subunidades elementales más simples. Estas unidades elementales están unidas entre sí por enlaces no con­valentes, del tipo de puentes de hidróge­no, y por enlaces convalentes de puen­tes disulfuro.

En el presente trabajo se ha hecho un es­tudio de las características de ultracen­trifugación de los fragmentos obtenidos por reducción con mercaptoetanol y por disociación con urea 8-m. Al mismo tiempo se ha caracterizado por ultracen­trifugación el peso de la molécula com­pleta y se han analizado por inmunodi­fusión e inmunoelectroforesis sus carae­terísticas antigénicas.

MATERIAL Y MÉTODOS

l. Ultracentrifugación

La ultracentrifugación de las diversas muestras objeto del estudio fue hecha de acuerdo con la clásica sistemática de Pe­dersen 20, en la que se introdujeron algu­nas modificaciones condicionadas por la ultracentrífuga utilizada 7 o por el tipo de muestras proteicas que se utilizaron 33 •

Para este estudio se utilizó la ultracen­trífuga Spinco-E, de Beckman Instru­ments Corp. Se usó el rotor analítico D, que permitió utilizar 42.040 r. p. m. y 59.780 r. p.m. (equivalentes a 261.600 g). Se utilizó el sistema óptico de lentes cilíndricos. Ello obligó a hacer una con­centración de las muestras de un mínimo de 20 mgr. por ml. Para conseguir esta concentración fue necesario concentrar los eluídos cromatográficos por pervapo. ración.

La sistemática seguida en las operacio­nes de ultracentrifugación fue la habitual

Septiembre 1972 ESmUCTlJRA DE L A PROTEINA c 219

en este tipo de estudios. Las fotogra fías de los distintos "picos" se hicieron en placa metalográfica ortocromática Kodak, que se reveló con D-76. Los intervalos entre cada fotografía fueron de 8 minu­tos. La constante de sedimentación se

dx/dt calculó según la fórmula S = ----

con corrección de temperatura para 20º c.

2. Cálculo del Peso Molecular

Se hizo a partir del valor de Ja constante de sedimentación corregida a 20º C (S2o), siguiendo la fórmula siguiente 17• 31• Peso Molecular = R. T. S20 / D (1 - V p), en la que R, es la constante de los gases ; T, la temperatura absoluta ; D, la cons-tante de difusión; V, el volumen espe­cífico parcial y p, la densidad del sol­vente. Se consideró un volumen específi­co parcial de 0,75 como corresponde a las proteínas y una densidad de solvente de l. (0,15 M cloruro sódico).

3. Reducción de puentes disulfuro (S-S)

Se hizo mediante el tratamiento de las preparaciones con mercaptoetanol 8· 10).

4. Rotura de puentes de hidrógeno

Puesto que habíamos comprobado que es posible romper la molécula de proteí­na C reactiva en unidades más elemen­tales mediante el tratamiento de la mis­ma con urea hipermolar, utilizando de nuevo este método para obtener estas fracciones. La sistemática seguida ahora ha sido, igualmente, la de Slobin y Sela 29•

5. Inmunosueros monoespecíficos

Los hemos obtenido mediante inmuniza­ción de conejos con las preparaciones proteicas correspondientes. Antisueros

monoespecíficos frente a PCR, a las in­munoglobulinas y frente a cadenas lige­ras y pesadas de Ig G, fueron obtenidos de fuente comercial.

6. Análisis antigénico por inmunodifusión

Se realizó con el método de Ouchterlo. ny 18, en la forma habitual en nuestro laboratorio 23 , :u.

7. Obtención de proteína C reactiva

Se realizó siguiendo la pauta de Hokama y Riley 14 que ya ha sido descrita deta­lladamente en---informes precedentes. Se utilizó igualmente líquido ascítico, como fuente de proteína C.

8. Test de Latex para determinación de proteína e reactiva

Con objeto de disponer de un método más sensible de identificación de las ca­racterísticas antigénicas de la PCR que el de la precipitación en agar, se utiliza­ron partículas de latex recubiertas de an­tisuero anti-PCR. Se utilizó un equipo de latex y de buffer de reacción que se obtuvo de fuente comercial (Hyland Lab., Los Angeles). Se siguió la siste­mática de reacción que recomienda la casa comercial suministradora.

RESULTADOS

l. Selección de preparaciones cromatográficas de PCR

Con objeto de disponer de suficiente can­tidad de proteína e reactiva para poder hacer la ultracentrifugación y las expe­riencias de fragmentación, fue necesario proceder a su aislamiento cromatográfico un total de 8 veces. Se utilizaron otras tantas preparaciones distintas de precipi­tados de líquido ascítico. Los resultados obtenidos en esta etapa del trabajo fue-

220 M. PEREZ MIRANDA Y P. LISO IRURZUN Vol . XVI

ron semejantes a los que ya fueron des­critos en un informe precedente 21 •

Durante la purificación de las prepara­ciones, en la segunda columna de DEAE­celulosa, con gradiente de pH y de fuer­za iónica, se obtuvo siempre una gráfica como la que se reproduce en la figura l. Como en ella puede observarse, se obtu­vieron 3 fracciones diferentes. La frac­ción I era la que contenía contaminantes proteicos que no mostraron característi­cas antigénicas de PCR. Las fracciones Il y III mostraron ambas características de PCR, tanto por inmunodifusión en gel de agar como por medio del test de latex. La fracción II fue cuantitativamen­te la más importante aunque por su pro­ximidad con la fracción I mostró conte­ner contaminantes de otras proteínas sé­ricas en su porción inicial (fig. 2).

En las pruebas de ultracentrifugación se usó esta fracción, que era cuantitativa­mente la más importante después de concentrada hasta un total de 20 veces.

z o -- E u c.. z o

X

LIJ

.. . 1

'º 20

Antes de hacer la concentración se elimi­naron los tubos correspondientes al pri­mer tramo del pico, para evitar los con­taminantes que se habían detectado en ellos. Para las pruebas de reducción se usaron mezclas de la fracción II y de la fracción III, puesto que todas ellas mos­traron ser antigénicamente idénticas. Al enfrentar estas preparaciones a los anti­sueros monoespecíficos dirigidos frente a cada una de las inmunoglobulinas y frente a la albúmina, pudo comprobarse la ausencia de comunidad antigénica de esta preparación con estas otras proteL nas séricas (fig. 3).

2. Fraccionamiento de las preparaciones de PCR

Se hicieron tres distintos tipos de frac­cionamiento:

a) Fraccionamiento en columna de Se­phadex equilibrada con urea 8 M.;

DEAE- CELULOSA

11

JO 40 50

TUBOS

Fig. 1. Gráfica de la elución de PCR durante la purificación cromatográfica en DEAE-celulosa, con gradiente iónico y de pH.

Septiembre 1972 ESffiUCTURA DE LA PROTEINA C 22 1

Fig. 2. Inmunodifusión de los picos I, lI" y III de la cromatografía, precipitados por anti­SHN y anti-PCR.

b) Fraccionamiento por reducción con mercaptoetanol;

c) Fraccionamiento sucesivo con urea 8 M y con mercaptoetanol.

a) Fraccionamiento con urea 8 M: Una porción del total de PCR de las fraccio­nes II y III fue dializada contra urea 8 M y filtrada en Sephadex G-200. La lectura del contenido proteico del eluído mostró un solo pico, siendo la gráfica de delución semejante a la que se reproduce en la figura 4. El pico obtenido de esta forma fue concentrado por pervapora­ción 10 veces. El test de Latex para pro­teína e reactiva dio un título de positi­vidad de este concentrado de 1/4. A esta fracción se la denominó PCR-U y con ella se inmunizaron 2 conejos.

b) Frriccionamiento con mercaptoetanol:

Fig. 3. Inmunodifusión de una mezcla de los picos ll y 111 (en el centro) frente a anti­sueros anti-SHN y antiinmunoglobulinas.

Se procedió de la manera que ha sido descrito en la sección correspondiente utilizándose igualmente una mezcla de las fracciones II y III de PCR. Como resultado de la filtración final en co­lumna de Sephadex se obtuvo igualmen­te un único pico. El eluído se concentró por pervaporación 10 veces. El test de Iatex para proteína C reactiva fue nega­tivo con estas preparaciones, que fueron denominadas PCR-M. Con esta prepara­ción se inmunizaron otros 2 conejos.

c) Fraccionamiento combinado: Una parte de las preparaciones PCR-U fue­ron tratadas también con mercaptoetanol. Como resultado final se obtuvo igual­mente un eluido que mostró contener so­lamente un pico proteico. El test de La­tex de estas preparaciones dio, como en el caso anterior, un resultado negativo.

222 M. PEREZ MIRANDA Y P. LISO IRURZUN Vol. XVI

z o u z I­

X

lJ.J

1 1

BMU-Seph.

----- ----' ' '

TUBOS

Fig. 4. Elución en columna de Sephadex G-200 equilibrado con urea 8 M, de una mezcla de los picos II y lll.

Estas preparaciones fueron denominadas PCR-2F, para indicar el doble fraccio­namiento que se había realizado en ellas.

3. Análisis antigénico diferencial de PCR y de sus fracciones

Por medio de la inmunodifusión se en­frentaron las distintas fracciones a los antisueros anti-PCR, anti-PCR-U y anti­PCR-M.

Con el suero anti-PCR enfrentado a to­das las demás fracciones sólo se consi­guió precipitación frente a PCR y frente a PCR-U (fig. 5A).

Con el suero anti-PCR-U, el resultado fue idéntico al obtenido en el caso pre­cedente (fig. 5B).

Con el suero anti-PCR-M sólo se obtuvo la formación de precipitación frente a PCR-M y frente a PCR-2F, mientras que el resultado fue negativo con las otras dos preparaciones (fig. 5C).

4. Resultados de la ultracentrifugación

El cálculo del peso molecular por ultra­centrifugación, realizado según las fór­mulas que hemos referido, dio los si-

Fig. 5A). fracciones.

Anti-PRC frente a las distintas

Septiembre 1972 ESTRUCTURA DE LA PROTEINA C 223

Fig. 5B). Anti-PCR-U

guientes valores: La preparac10n de PCR completa, 135.000. Las preparacio­nes de PCR-U, un peso molecular de 21.000. Las preparaciones de PCR-M un peso molecular de 23.000. Las prepara­ciones de PCR-2F, un valor de peso mo­lecular de 10.000.

DISCUSIÓN

Los resultados que hemos obtenido hasta ahora evidencian que la PCR es una pro­teína compleja compuesta de subunida­des. Por medio de la reducción con urea SM hemos obtenido una substancia ho­mogénea, de un peso molecular aproxi­madamente 6-7 veces menor que el de la molécula completa y que presenta las mismas propiedades antigénicas que ella. Como la urea lo que hace es romper las uniones no covalentes 29, ello significa que estas unidades de peso molecular más pequeño y que conservan las mismas propiedades antigénicas pueden haberse reunido entre sí espontáneamente, o bien a consecuencia del proceso físico de ob­tención de proteína e reactiva, o bien como consecuencia de las circunstancias

patológicas diversas que hacen que esta proteína se presente en el suero en can­tidad considerable. Efectivamente, la po­sibilidad de que la acción del calor, cam­bios de pH, etc., den lugar a agregados macromoleculares de esta substancia ha sido comunicado 5 •

Sin embargo, la gran constancia de pre­sentación de la agregación molecular en dos líquidos ascíticos que fueron utiliza­dos para su obtención, sugieren que en este líquido estuviese ya en forma ma­cromolecular. Ello explicaría las diferen­tes características inmunoelectroforéticas que esta substancia ha mostrado tener en sueros de pacientes con procesos patoló­gicos distintos 2• 19.

En cualquier caso, estas unidades estruc­turales fundamentales son todas idénti­cas, puesto que la filtración en Sephadex proporcionó único pico. La reducción con mercaptoetanol dio lugar también a la aparición de unidades idénticas entre sí con un peso molecular aproximada­mente igual, de 23.000.

Estas subfracciones, en cambio, no tie­nen las mismas propiedades antigénicas que la PCR y no pudieron dar lugar a la

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aglutinación del latex, a pesar de que Ja concentración de las preparaciones se hizo en las mismas condiciones que la de las preparaciones obtenidas bajo la acción de la urea, 8M. Como la redue­ción con mercaptoetanol lo que hace es romper uniones S-S 13• 16• 27, los resultados que hemos obtenido evidencian que en Ja molécula de PCR existen estos puen­tes disulfuro y que su rotura lleva consi­go la pérdida de las características anti­génicas de la proteína. Cuando hicimos el doble fraccionamiento, obtuvimos fragmentos que tienen un peso molecu. lar de 10.000, siendo todos ellos idénti­cos y careciendo igualmente de las pro­piedades antigénicas de la molécula com­pleta. Según estos resultados podría su­ponerse que la unidad fundamental de

p. m. 21.000, y que a su vez está com­puesta de dos unidades idénticas, que se unen entre sí por una unión disulfuro. Sin embargo, no es posible decidir aún si esta unidad fundamental se presenta como tal en el suero o sólo en forma de un agregado macromolecular de un peso molecular 6 ó 7 veces superior, o por acción de diversas circunstancias pato­lógicas. Puesto que la proteína C reac­tiva es posible detectarla en el suero normal 11 • n habría que hacer el estudio que hemos realizado usando una prepa­ración de CPR obtenida de un pool de s~elos normales. De esta manera, po­dría saberse si la formación macromo­Jecular es espontánea o está condiciona­da por una circunstancia patológica.

SuMMARY

Structural Aspects of C Reactive Protein

C-Reactive Protein (CRP), contained in hu­man ascitic fluid, has been isolated by means of precipitation witb (NHa)z SQ4 and after­wards with Cellulose-DEAE chromatography. The CRP thus isolated was successfully frac­tionated by incubation in 8M Urea with mer­captoethanol. The immunoelectrophoretic, anti­genic and ultracentrifugal characteristics of the complete molecule and its fragments were ana!ysed. 135,000 (7,4S) was found to be the molecular weight of CRP; 21,000 that of fractions obtained with 8M Urea; 23,000, that obtained after the action of mercaptoe­thanol (CRP-M); and finally 10,000, that of

the fractions treated successfully with urea and mercaptoethanol (CRP-2.F). The CRP-U fragments retain the antigenic and immunoelectrophoretic characteristics of the CRP. On the contrary, the CRP-M fragments show a loss of the specific characteristics of CRP. These results suggest, therefore, that the CRP is formed by six units of which contain an S-S bond in its interior, shared between two equal fragments and that they are in themselves united in a circular manner, by means of H-H bonds to form a complete mo­lecule.

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