CARACTERIZACIÓN DE TUBOS DE FIBROÍNA PARA REGENERAC IÓN NERVIOSA OBTENIDOS MEDIANTE ELECTROSPINNING

S. Herrero1,2, G.V. Guinea1,2, J. Pérez1,2, G.R. Plaza1,2

1Departamento de Ciencia de Materiales. E.T.S.I. de Caminos, Canales y Puertos Universidad Politécnica de Madrid. C/ Profesor Aranguren s/n E-28040-Madrid

2Centro de Tecnología Biomédica. Universidad Politécnica de Madrid

Campus de Montegancedo. E-28223 Pozuelo de Alarcón (Madrid)

RESUMEN

Los nervios periféricos tienen la particularidad de que pueden regenerarse si se dan las condiciones adecuadas. Gracias a la Ingeniería de Tejidos se han desarrollado andamios que facilitan esta tarea. La seda es un material excelente para este propósito puesto que sus propiedades mecánicas son inmejorables y, además, es biocompatible. En el presente trabajo se estudian las propiedades mecánicas y microestructurales de andamios de seda de gusano (Bombyx mori) regenerada para utilizarlos en la reparación de nervios periféricos.

ABSTRACT

Peripheral nerves can regenerate under the appropriate conditions. Scaffolds obtained by Tissue Engineering techniques have made easier this issue. Silk is a biomaterial that is suitable for this purpose due to its outstanding mechanical properties and its biocompatibility. In the present work we have studied the mechanical and microstructural properties of tubular scaffolds, made of regenerated silkworm (Bombyx mori) silk, to use them in the repair of peripheral nerves. PALABRAS CLAVE: Fibroína, Electrospinning, Scaffold, Comportamiento mecánico, Tubos.

1. INTRODUCCIÓN Existen múltiples causas (traumáticas, quirúrgicas, tumorales, etc) que pueden dar lugar a una lesión de los nervios periféricos implicando una pérdida de la función motora o sensitiva. A diferencia del sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico tiene una cierta capacidad regenerativa. Como respuesta a lesiones no muy importantes, los nervios periféricos son capaces de regenerarse bajo una serie de condiciones apropiadas, siempre y cuando la separación producida por dicha lesión no sea excesivamente grande [1]. Las dos técnicas quirúrgicas más comunes para la reparación de nervios periféricos son la construcción de puentes, que incluye técnicas de tunelización e injertos, y la operación directa sobre el nervio [2]. En este contexto, la ingeniería de tejidos proporciona una alternativa prometedora a través de injertos, tanto artificiales como biológicos. Este campo, relativamente nuevo y en auge, se basa en el reemplazo o la restauración de la función del tejido dañado combinando

biomateriales que sirven de andamiaje (scaffold), células y moléculas biológicamente activas. La seda es un biomaterial muy estudiado debido a sus excelentes propiedades mecánicas [3]. Desde hace unos años, la seda regenerada se ha venido utilizando para generar una amplia gama de biomateriales como geles, esponjas o membranas [4]. Se trata de un material biocompatible que favorece el crecimiento celular [5]. La única técnica que permite la fabricación de fibras continuas con diámetros micrométricos y submicrométricos de una manera fiable es el electrohilado [6,7]. Se trata de una técnica que utiliza la fuerza electrostática para producir fibras a partir de una disolución del material. La aplicación de un potencial del orden de kilovoltios es necesaria para poder generar fibras continuas y homogéneas de diferentes diámetros [7,8]. Una de las grandes ventajas del electrohilado es que es posible conseguir materiales altamente porosos [9]. El objetivo del presente trabajo es la fabricación y caracterización, macroscópica y microscópica, de tubos

de seda regenerada obtenidos mediante electrohilado. El siguiente paso será su implantación en ratas para regeneración de nervios periféricos. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Obtención de la fibroína Los capullos de gusano de seda (Bombyx Mori) se desgomaron para eliminar su recubrimiento de sericina. Para ello, se cocieron dos veces en una disolución de NaCO3 con una concentración de 0.5% (p/v) durante media hora cada vez, y después se aclararon con agua destilada a 80 ºC durante diez minutos. Se dejó secar la seda extraída a temperatura ambiente durante 24-48 horas y se disolvió en bromuro de litio (LiBr) 9.4M. Una vez disuelta, se dializó la disolución en polietileneglicol (PEG, 20% p/v) durante tres días en un casete de diálisis (Fisher scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Casette; 3,500 MWCO), con el fin de eliminar completamente el LiBr. Seguidamente la disolución acuosa obtenida se liofilizó, dando lugar a una esponja de fibroína.

Figura 1: Diagrama esquemático del sistema de electrohilado

2.2. Electrohilado Para este propósito se utilizó una máquina NANON-01A (by Mechanics Electronic Computer Corporation MECC CO, LTD, Japón). Se presenta un esquema del proceso de hilado en la Figura 1. Se rellenaron jeringuillas de polipropileno con capacidad para 3ml con una disolución de seda en hexafluoroisopropanol (HFIP) a una concentración del 20% (p/v). El potencial eléctrico, el bombeo de la disolución y la distancia de la aguja hasta el colector se seleccionaron de manera que el chorro fuera estable. Los parámetros utilizados, obtenidos tras una serie de ensayos preliminares, fueron 20kV, 2.0ml/h y 150mm. Como colector se utilizó una

varilla de acero de 2.6 mm de grosor girando a una velocidad de 1000 rpm. 2.3 Estabilización en etanol Una vez electrohilados, se sumergieron los tubos de fibroína en etanol durante cinco minutos para favorecer el cambio de estructura secundaria y, de esta manera, hacerlos insolubles en agua. 2.4. Caracterización de la microestructura mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) Se realizaron medidas de espectroscopía 13C NMR CP/MAS en un espectrómetro Bruker Advanced 400MHz Wide Bore (9.39 T) operando a una frecuencia de 100MHz para núcleos de 13C. Se empleó una frecuencia de 12 Hz en un rotor de ZrO2 de 4 mm de diámetro. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Los desplazamientos del 13C se representaron en relación a los del tetrametilsilano (TMS). 2.5. Morfología de las fibras Se utilizó un microscopio electrónico de barrido (JEOL 6300) para analizar la morfología de las fibras. Las muestras fueron metalizadas con oro durante tres minutos. Se aplicó un voltaje de 10V y una intensidad de 6·10-11 A. Las imágenes se han obtenido a 4000 aumentos.

Figura 2: Tubos de fibroína obtenidos mediante electrohilado y sometidos a un tratamiento posterior de etanol.

2.6. Ensayos mecánicos Con el fin de caracterizar el comportamiento de los tubos de fibroína en dirección longitudinal se realizaron ensayos mecánicos de tracción simple. Se utilizó una máquina Instron 4411, a la que se le acopló una balanza AMD 1200g, para realizar los ensayos en aire. La velocidad del ensayo se estableció en 0.2 mm/min. Los ensayos mecánicos en agua se realizaron en una máquina de tracción electromecánica Nanobionix MTS con una célula de carga de 600 mN. La velocidad del ensayo se estableció en 0.01 mm/min.

1 mm

Figura 3: Imagen de microscopio electrónico de las fibras de seda que componen los tubos obtenidos mediante electrohilado sin tratamiento posterior.

Figura 4: Imagen de microscopio electrónico de las fibras de seda que componen los tubos obtenidos mediante electrohilado con inmersión posterior de etanol.

0

50

100

150

1 2 3 4 5 6 7 8

Núm

ero

de F

ibra

s

Grosor(micras)

Figura 5: Grosor medio de las fibras de seda que componen los tubos obtenidos mediante electrohilado sin tratamiento posterior.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Núm

ero

de F

ibra

s

Grosor (micras)

Figura 6: Grosor medio de las fibras de seda que componen los tubos obtenidos mediante electrohilado con inmersión posterior de etanol.

Las probetas se cortaron directamente de los tubos tratados con etanol y se sujetaron a las mordazas por los extremos. El espesor de las mismas se determinó con un medidor Mitutoyo 7301 que tiene una precisión de 10 µm. El largo y ancho de las probetas se midió con un proyector de perfiles de precisión 1 µm. Se realizaron al menos 10 ensayos por cada condición a temperatura ambiente (20 ºC) con el fin de comparar las propiedades del material antes y después de humedecerlo con agua. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 Morfología y distribución de grosores de fibras en los tubos de fibroína Los tubos obtenidos se ilustran en la Figura 2. El proceso de electrohilado resultó ser óptimo para los parámetros indicados anteriormente, dando como resultado fibras homogéneas y continuas (Figura 3).

La velocidad de rotación no fue suficientemente alta como para producir fibras alineadas, obteniendo tubos formados por fibras en una orientación aleatoria. Como muestra la Figura 3, las fibras no son circulares sino aplanadas. La razón por la cual las fibras tienen un aspecto aplanado puede estar relacionada directamente con la tasa de evaporación del disolvente durante el proceso de electrohilado [10], ya que la evaporación del HFIP se produce a un ritmo muy alto, haciendo que en la punta de la aguja se forme una capa sólida de disolución con un núcleo líquido. Debido a la presión atmosférica y a la evaporación del disolvente de dicho núcleo, la fibra colapsa pasando rápidamente de una forma circular a una forma plana. El aspecto de las fibras cambia significativamente después de haberlas introducido en etanol. Las fibras se ensanchan y la porosidad disminuye (Figura 4). Como se muestra en las figuras 5 y 6, el grosor medio de las fibras después del electrohilado es de 3.18±0.05 µm, mientras que al introducir los tubos en etanol, el grsosor

15µm 15µm

de las fibras es 3.71±0.06 µm (media ± error estándar), por lo que el grosor medio aumenta en un 16% con el tratamiento. Este aumento, junto a una mayor compactación como se ilustra en la Figura 4, tiene un efecto directo en el descenso de la porosidad. 3.2 Resonancia Magnética Nuclear En la Figura 7 se muestran los espectros de resonancia magnética de la seda natural desgomada (a), después de liofilizarla (b), del tubo de fibroína sin tratamiento (c) y del tubo de fibroína tratado con etanol (d). La fibroína puede asumir dos conformaciones diferentes denominadas Silk I y Silk II. Diversas investigaciones indican que la forma Silk I corresponde a una conformación aleatoria con giros β, mientras que la forma Silk II evidencia una estructura de hoja β antiparalela. Los picos característicos correspondientes a los carbonos asociados a la alanina (Cα, Cβ y carbonilo) son suficientes para identificar las formas Silk I y Silk II de la fibroína [11].

050100150200

ppm

Ala Cβ II IA

la C

=O I

IG

ly C

=O

II

a

b

c

d

Figura 7: Espectro de resonancia magnética de a) seda desgomada, b) seda regenerada liofilizada, c) fibras obtenidas mediante electrohilado, d) fibras tratadas con etanol.

Los espectros de la seda desgomada y la seda lioflizada son totalmente diferentes. La seda desgomada muestra un pico claro en 22 ppm correspondiente a la estructura de hoja β, mientras que en la seda liofilizada este pico no aparece. Sin embargo aparece un pico en 18.5 ppm que indica estructura desordenada o hélice α. En el caso del tubo de fibroína sin tratar el espectro es similar al de la seda liofilizada, lo que indica que no se ha formado estructura secundaria. Una vez introducido el tubo de fibroína en etanol la estructura cambia sustancialmente, aproximándose el espectro al de la seda desgomada. Aunque el pico más característico coincide con la estructura desordenada, se observa un pico de baja intensidad en 22 ppm, indicando que se ha formado

estructura tipo hoja β. La presencia de este tipo de estructura está confirmada por su insolubilidad en agua, cosa que no ocurre con el tubo sin tratamiento de etanol. Asimismo los picos correspondientes a los carbonilos de la alanina y la glicina están completamente separados en el caso de la seda desgomada, lo que implica de nuevo una gran presencia de estructura secundaria en forma de hoja β. Esto no ocurre para la seda liofilizada o para el tubo sin tratar. En el caso de las fibras tratadas con etanol observamos una ligera separación, lo que sugiere que existe esta estructura secundaria necesaria para la cristalización, aunque no suficiente ya que el espectro es diferente al de la seda natural desgomada. 3.3 Ensayos mecánicos Las figuras 8 y 9 muestran las gráficas tensión-deformación de probetas longitudinales extraídas de los tubos de fibroína ensayadas en aire y en agua, respectivamente. La dispersión en ambos casos es muy alta, sobre todo en el caso de los ensayos en seco.

0

2

4

6

8

10

12

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Ten

sión

(M

Pa)

Deformación

Figura 8: Gráficas tensión-deformación de probetas longitudinales obtenidas de tubos de fibroína ensayadas en seco.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0

200

400

600

800

1000

1200

Ten

sión

(kP

a)

Deformación

Figura 9: Gráficas tensión-deformación de probetas longitudinales obtenidas de tubos de fibroína ensayadas en agua.

En la Tabla 1 se recoge la tensión media de rotura, la deformación media de rotura y el módulo de elasticidad medio de ambos tipos de ensayo. Aunque, como hemos dicho antes, la dispersión es muy alta, se observa una clara diferencia entre las dos condiciones de ensayo. La tensión de rotura alcanzada por las muestras ensayadas en seco es un orden de magnitud mayor que en las humedecidas. Lo mismo ocurre con el módulo de elasticidad, que es también mayor en el caso de los ensayos en seco. La deformación, en cambio, es ligeramente más alta en los ensayos en agua.

Tabla 1: Tensiones de rotura, deformaciones y módulo de elasticidad de los tubos húmedos y secos

Tubo σR (kPa) εR (mm/mm) E (kPa)

Seco 4000±1000 0.07±0.02 60000 ±10000

Húmedo 400±80 0.13±0.01 3100±300

Aunque la inmersión en un medio acuoso afecta de modo importante a las propiedades del material, los tubos producidos mediante electrohilado presentan una resistencia y flexibilidad suficiente para su introducción en un modelo animal mediante cirugía. 4. CONCLUSIONES En el presente artículo se han estudiado las propiedades de tubos de fibroína obtenidos mediante la técnica de electrohilado, bajo diferentes condiciones. Se ha realizado un estudio de la morfología de las fibras de seda que componen los tubos. Asimismo se ha estudiado su microsestructura mediante resonancia magnética nuclear, y su comportamiento mecánico en agua y en aire. Se ha encontrado que el grosor de las fibras que componen los tubos de fibroína aumenta cuando se les aplica un tratamiento de etanol, mientras que la porosidad disminuye. Los espectros de resonancia magnética nuclear muestran que sólo después del tratamiento de etanol se obtiene estructura secundaria en forma de hoja β, necesaria para la insolubilidad del tubo. Los tubos secos resisten mayores tensiones, pero son muy frágiles. Los tubos humedecidos son más flexibles.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer la colaboración por la financiación prestada, a la Fundación Marcelino Botín a través del proyecto “Diseño y desarrollo de nuevos biomateriales para medicina regenerativa”, al Ministerio

de Ciencia e Innovación a través del proyecto MAT2009-10258 y a la Comunidad de Madrid por el proyecto NEUROTEC S2011/BMD-2640.

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[10] Seeram Ramakrishna, Kazutoshi Fujihara, Wee-

Eong Teo.Teik-Cheng Lim & Zuwei Ma. An introduction to electrospinning and nanofibers. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.

[11] Tetsuo Asakura, Juming Yao, 13C CP/MAS NMR

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