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Capítulo 17

Tecnología del DNA Recombinante

Ingeniería genética – modificación deliberada de la información genética de un organismo al cambiar directamente la secuencia de nucleótidos en su genoma.

Tecnología del DNA recombinante – técnicas utilizadas para llevar a cabo la ingeniería genética:◦ Identificación y aislamiento de un gen específico

◦ La inserción de un gen en un vector – ej. un plásmido – para formar una molécula recombinante

◦ La producción de grandes cantidades de un gen o sus productos

“Clon o clono” – colección de moléculas o células todas idénticas a la molécula o célula original.

Clonar un gen significa hacer muchas copias de éste - por ejemplo replicándolo en un cultivo de bacterias.◦ El gen clonado puede ser una copia normal del gen (wild type)◦ El gen clonado puede ser la versión alterada (mutante)

La tecnología el DNA recombinante, hace posible la manipulación de genes

Plasmid

Chromosome: Most bacteria have one circular DNA chromosome ranging in size from 1,000 to 8,000 kilobase pairs.

Plasmid: Extrachromosomal genetic element also made of a circular DNA molecule.

Bacterial Genome: The collection of all of the genes present on the bacteria’s chromosome or its extrachromosomal genetic elements.

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Vea tabla 15:1 Finales 1960’s – Werner Arber & Hamilton Smith, descubren las

enzimas de restricción 1969 – Herbert Boyer aisla EcoRI 1970 – se descubre la transcriptasa inversa 1972 – Paul Berg, Stanford, hace la primera molécula

recombinante 1973 – Herbet Boyer & Stanley Cohen producen el primer

organismo recombinante

Técnica del DNA Recombinante: VistazoBacterial cell

Bacterialchromosome

Plasmid

Gene of interest

DNA containinggene of interest

Isolate plasmid.

Enzymatically cleaveDNA into fragments.

Isolate fragmentwith the gene ofinterest.

Insert gene into plasmid.

Insert plasmid and gene intobacterium.

Culture bacteria.

Harv est copies ofgene to insert intoplants or animals

Harv est proteinscoded by gene

Eliminateundesirablephenotypictraits

Produce v accines,antibiotics,hormones, orenzymes

Createbeneficialcombinationof traits

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Mutágenos Transcriptasa inversa ◦ Se obtiene de retrovirus◦ Utiliza templado de RNA para sintetizar cDNA

Oligonucleótidos Enzimas de restricción (endonucleasas) Sondas genéticas Electroforesis PCR Hibridación Secuenciación

Aislamiento de genes

“Gene splicing”

“Cloning vectors”

“Cloning hosts”

Genotecas

Expresión y aislamiento de proteínas

Hormonas/drogas

Vacunas-Ej. Hepatitis B

Enzimas

Pesticidas

Sondas genéticas

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(2) Production of medically useful biologicals (e.g. insulin)

Recombinant Human Growth Hormone

Recombinant insulin (Humulin)

Organismos transgénicos◦ Microbios

◦ Plantas

◦ Animales

Análisis genético

Tratamiento genético◦ Ej. Terapia génica

Enzimas de Restricción

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Cuts usually occurs at a palindromic sequence

SmaI: produces blunt ends

5´ CCCGGG 3´

3´ GGGCCC 5´

EcoRI: produces sticky ends

5´ GAATTC 3´

3´ CTTAAG 5´

EcoRI – Escherichia coli strain R, 1st enzyme BamHI – Bacillus amyloliquefaciens strain H, 1st enzyme

DpnI – Diplococcus pneumoniae, 1st enzyme HindIII – Haemophilus influenzae, strain D, 3rd enzyme

BglII – Bacillus globigii, 2nd enzyme PstI – Providencia stuartii 164, 1st enzyme

Sau3AI – Staphylococcus aureus strain 3A, 1st enzyme

KpnI – Klebsiella pneumoniae, 1st enzyme

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Enzimas de Restricción Clivan el DNA en Lugares (Secuencias) Específicos

Vea tabla en el libro de texto

Plásmidos

Bacteriófagos

Cósmidos

Cromosomas artificiales◦ YAC

◦ BAC◦ Otros

Plásmidos

Plásmidos

• Son moléculas de DNA extra- cromosómicas

• Son circulares y bicatenarias

• Son el medio principal mediante el cual la resistencia a los Abs es transferida de una bacteria a otra

• Pueden ser clivados por enzimas de restricción dejando extremos romos y/o “sticky”

• Se pueden construir plásmidos artificiales al unir nuevos fragmentos de DNA a los extremos “sticky” del plásmido

Tetr

Ampr

Ori pBR3224361bp

OripUC18

Ampr

MCSLacZ

Tetr

Ampr

Ori pBR3224361bp

OripUC18

Ampr

MCSLacZ

• Plásmidos como Vectores• Un vector puede ser un plásmido que

puede ser modificado para acarrear nuevos genes.

• Plásmidos útiles como vectores deben tener:

• Un origen de replicación (A)

• Un marcador (gen resistencia a los antibióticos, como (ampr

and tetr). (B)

• Múltiples sitios de clonación (C)(MCS) (lugares donde la inserción de DNA foráneo no interfiera con la replicación o inactive marcadores esenciales

• Fáciles de purificar

A

B

B

C

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Clonación Genética y

cDNA (DNA complementario)

Produciendo un un Vector Recombinante (Clonando un Vector)Antibioticresistancegene

Restrictionsite

mRNA for humangrowth hormone (HGH)

Rev ersetranscription

Plasmid (v ector)cDNA for HGH

Restrictionenzyme

Restrictionenzyme

Sticky ends

Gene for humangrowth hormone

Ligase

Recombinant plasmid

Introduce recombinantplasmid into bacteria.

Recombinantplasmid

Bacterialchromosome

Inoculate bacteriaon media containingantibiotic.

Bacteria containingthe plasmid withHGH gene surv ivebecause they alsohav e resistance gene.

Clonación G

enética

2 enzimas necesarias:• Enzima de

restricción• Ligasa

Síntesis de cDNA

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GENOTECAS

Biblioteca de genes (Genoteca)◦ Una colección de clonos bacterianos o de fagos

Cada clono en la biblioteca consiste usualmente de un gen del genoma del organismo

◦ La biblioteca puede contener todos los genes de un cromosoma

◦ La biblioteca puede contener de cDNA complementario al mRNA

Producción de una Biblioteca de GenesGenome

Isolate genomeor organism.

Generate fragments usingrestriction enzymes.

Insert each fragmentinto a vector.

Introduce vectorsinto cells.

Culture recombinant cells;descendants are clones.

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Técnicas del DNA Recombinante

Polimerase Chain Reaction (PCA)

Electroforesis de gelatina (Gel electrophoresis”)

Southern Blotting

Nothern Bloting

Otras….

Multiplicación del DNA in vitro: The Polymerase Chain Reaction (PCR)◦ Un número grande de moléculas de DNA se producen in vitro

◦ Crítico para amplificar DNA en una variedad de situaciones Los epidemiólogos la utilizan para amplificar el genoma de un patógeno

The Polymerase Chain Reaction (PCR)◦ Proceso repetitivo que consiste de 3 pasos Desnaturalización

Priming

Extensión

◦ Puede automatizarse utilizando un “thermocycler”

© 2012 Pearson Education Inc.

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Figure 8.5a The use of PCR to replicate DNA, steps 1-33´Original DNA

molecule5´

5´

3´

Heat to 94°C

DNA primer

DNA polymerase

Deoxyribonucleotidetriphosphates

Denaturation

Priming

Cool to 65°C

DNA polymerase

DNA primerExtension

3´

72°C

3´ 5´

5´

5´

5´

A thermophilic (heat-loving) bacteria called Thermus aquaticusis the source of Taq DNA polymerase used in PCR reactions.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

94°C 37-65°C 70-75°C

The First Round of PCR of PCR

Desnaturalización Priming

Repeat

First cycle

2 DNAmolecules

4 DNAmolecules

Second cycle Third cycle Fourth cycle

8 DNAmolecules

16 DNAmolecules

PCR Ciclos

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PCR increases the yield of DNA exponentially Begins with DNA containing a sequence to be

amplified and a pair of synthetic oligonucleotide primers that flank the sequence.

Next, denature the DNA to single strands at 94˚C.

Rapidly cool the DNA (37-65˚C) and annealprimers to complementary single strand sequences flanking the target DNA.

Extend primers at 70-75˚C using a heat-resistant DNA polymerase such as Taq polymerase derived from Thermus aquaticus.

Repeat the cycle of denaturing, annealing, and extension 20-45 times to produce 1 million (220) to 35 trillion copies (245) of the target DNA.

Extend the primers at 70-75˚C once more to allow incomplete extension products in the reaction mixture to extend completely.

Cool to 4˚C and store or use amplified PCR product for analysis.

A typical PCR protocol

• Desde 1987, PCR ha tenido un impacto

◦ importante en la detección de enfermedades prenatales causadas por un solo gen defectuoso. Enf. de Tay-Sachs,fenilcetonuria, fibrosis quística, hemofilia, Huntingdon's

disease, distrofia muscular de Duchenne (DMD).

• Importante también para detectar portadores de enfermedades genéticas

• Importante para detectar enfermedades infecciosas

Detectar enfermedades infecciosas como:◦ Otitis media

◦ Lyme disease

◦ Helicobacter pylori◦ ETS Herpes

Virus del papiloma humano (HPV)

Clamidia

Detectar genomas virales◦ HIV

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Evidencia forense crucial puede estar presente en cantidades pequeñas

• a veces muy poco material disponible para un análisis directo de DNA

• PCR puede generar DNA suficiente a partir de una sola célula

• PCR posible en DNA extensamente degradado• Ejemplos incluyen: DNA de una gota de sangre seca, saliva en la colilla de un cigarrillo, tejido

debajo de las uñas, raíz del pelo

Otras ventajas de PCR en las ciencias forenses son:

• fácil de llevar a cabo, fácil de estandarizar

• resultados obtenibles en 24 horas

El principal problema legal del PCR es el potencial para la contaminación cruzada entre las muestras y la complejidad para explicar los resultados al jurado

Ejemplo de su Uso en el Caso de OJ Simpson

Separando las Moléculas de DNA: Gel Electroforésis y Southern Blot◦ Electroforésis en gelatina (Gel Electrophoresis) Separa las moléculas basada en carga eléctrica, tamaño y forma◦ Permite a los científicos aislar el gen de interés ◦ DNA (-) es atraído al electrodo +◦ Agarosa se usa para hacer el gel; actúa como un cedazo molecular◦ Fragmentos más pequeños emigran más rápido que los grandes◦ Tamaño se determina al comparar las distancias emigradas con

estándares

Electroforésis de Gelatina

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Separando las Moléculas de DNA: Electroforesis de Gelatina y Southern Blot◦ Southern blot DNA es transferido de la gelatina a una membrana de nitrocelulosa

Sondas se utilizan para localizar la secuencia de DNA

de interés

Northern blot: se utiliza para detectar RNA

Técnica del Sothern BlotDNA molecules

Restriction enzymes

Restriction fragmentsUse gel electrophoresis to separatefragments by size; denature DNAinto single strands with NaOH.

Side v iew

DNA

DNA bands Gel

NitrocellulosemembraneAbsorbentmaterial

The DNA fragmentsare inv isible to theinv estigators atthis stage.

ElectrophoresisgelNitrocellulosemembraneAbsorbentmaterial

Nitrocellulose membranewith DNA fragments atsame locations as in gel(still inv isible) is baked topermanently affix DNA.

Add radioactive probescomplementary to DNAnucleotide sequenceof interest.

Probes bind to DNAof interest.

Incubate with film; radiation exposes film.Dev elop film.

Dev eloped film

-Purificar el DNA genómico-Cortarlo con enzimas de restricción-Correr gel de agarosaPasarlo a la membrana de nitrocelulosaAñadir marcador radioactivoAutoradiografía

Resumen

◦ Usos del Southern blot Genetic “fingerprinting” o DNA fingerprinting

Diagnóstico de enfermedades infecciosas

Demonstrar la incidencia y prevalencia de organismos que no pueden ser cultivados

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Insertando DNA en las Células ◦ El blanco de la tecnología del DNA es la inserción del DNA en las células

◦ Métodos naturales Transformación

Transducción

Conjugación

◦ Métodos Artificiales Electroporación

Fusión de protoplastos

Inyección: gene gun and microinyección

Electroporación

Chromosome

Electroporation

Pores in wall and membrane

Competent cell

Electricalfield applied

DNA fromanother source

Cell synthesizesnew wall

Recombinant cell

Fusión de Protoplastos

Cell walls

Protoplast fusion

Polyethyleneglycol

Protoplasts

Enzymes removecell walls

Fused protoplasts

Recombinant cellNew wall

Cell synthesizesnew wall

Gene Gun

Gene gun

Protoplasts

Nylonprojectile

Nylonprojectile

Blank .22caliber shell

DNA-coated beads

Vent

Target cell

Plate to stopnylon projectile

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Figure 8.9d Artificial methods of inserting DNA into cells: microinjection

Microinjection

Target cell

Suction tubeto hold targetcell in place

Target cell’snucleus

Micropipettecontaining DNA

Técnica del DNA Recombinante: VistazoBacterial cell

Bacterialchromosome

Plasmid

Gene of interest

DNA containinggene of interest

Isolate plasmid.

Enzymatically cleaveDNA into fragments.

Isolate fragmentwith the gene ofinterest.

Insert gene into plasmid.

Insert plasmid and gene intobacterium.

Culture bacteria.

Harv est copies ofgene to insert intoplants or animals

Harv est proteinscoded by gene

Eliminateundesirablephenotypictraits

Produce v accines,antibiotics,hormones, orenzymes

Createbeneficialcombinationof traits

Mapeo Genético◦ Localización de genes en una molécula de DNA ◦ Provee datos importantes concernientes al metabolismo, características de

crecimiento, y relaciones entre los organismos

Localización de Genes◦ Hasta 1970, los genes eran identificados por métodos que consumían

mucho tiempo, esfuerzos ◦ Métodos universales y sencillos están disponibles ahora◦ Fragmentación por restricción◦ Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Figure 8.10 FISH

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Estudios Ambientales◦ La mayoría de los microorganismos nunca han sido cultivados o

crecido en el laboratorio

◦ Los científicos los conocen solamente por sus huellas genéticas (DNA fingerprints)

◦ Han permitido la identificación de sobre 500 especies de bacterias de la boca humana

◦ Han determinado que las bacterias Archaea productoras de CH4

(metanógenas)son un problema en la agricultura del arroz

Aplicaciones Farmacéuticas y Terapéuticas◦ Síntesis de proteínas Creación de péptidos sintéticos usados en clonación

◦ Vacunas Producción de vacunas más seguras

“Subunit vaccines”

Genes de patógenos introducidos dentro de frutas y vegetales comunes

Inyectar humanos con plásmido que acarrea gen del patógeno

Humanos sintetizan las proteínas del patógeno

Aplicaciones Farmacéuticas y Terapéuticas◦ Cernimiento genético

“DNA microarrays” – utilizados para screen individuos para enfermedades hereditarias causadas por mutaciones

Puede identificar también el DNA de patógenos en la sangre o en los tejidos

“DNA fingerprinting”

Identificar individuos u organismos por la secuencia única y distintiva de su DNA

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Figure 8.8 DNA microarray-overview Figure 8.12 DNA fingerprinting

Aplicaciones Farmacéuticas y Terapéuticas Terapia génica Genes defectuosos o que no están presentes, son reemplazados con

copias normales del gen Sistema inmune de algunos pacientes reacciona de forma negativa

Diagnóstico médico Muestras o especímenes del pte pueden ser examinadas para detectar

la presencia de secuencias de genes únicas de ciertos patógenos Xenotransplantes Células, tejidos y órganos de animales introducidos en el cuerpo

humano

Producción de plantas transgénicas◦ Plantas recombinantes alteradas por la adición de genes de otros organismos

Tolerancia a herbicidas◦ Gene de Salmonella confiere resistencia a Glysophato (round up)

Tolerancia a la sal◦ Los científicos han insertado genes para la tolerancia a la sal en plantas de

tomate y canola

◦ Plantas transgénicas no solamente sobreviven sino que producen fruto y remueven la sal del terreno

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Plantas resistentes a las heladas◦ Cosechas se rocían con bacterias genéticamente modificadas y pueden

tolerar heladas leves

Plantas resistentes a las plagas◦ Bt toxin

Genes que codifican para la Bt toxin insertados en varias plantas de cosecha

Genes para la resistencia a Phytophtora insertados en las cosechas de papas

Mejorar el valor nutritivo y la producción en las plantas de cosecha◦ Tomate Gen que codifica para enzima que degrada la pectina suprimido – tomate madura

en la planta

◦ Arroz

Gen que codifica para β caroteno (vit A) insertado en plantas de arroz

VNTR is based on hypervariable microsatellite sequence polymorphisms within the human genome. These sequences (e.g., CACACA …) are found in many locations in the human genome and

vary greatly from person to person.

Individuals A & C are excluded by this analysis. The samples from individual B will be subjected to further tests.

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Definición – inserción de un gen normal en una célula para corregir un desorden especifico genético o adquirido que es causado por un gen defectuoso.

Vectores utilizados - virus◦ Adenovirus◦ Retrovirus◦ Adeno associated virus◦ Herpesvirus

Usos◦ Tx de fibrosis quística◦ Tx de SCID, ADA

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Los estudios no han mostrado riesgo para los seres humanos y el ambiente?

Hay protocolos, estándares, restricciones impuestos en laboratorios que envuelven la tecnología del DNA Rec

Pueden crear armas biológicas utilizando la misma tecnología◦ Rusia

Asuntos éticos◦ ¿Cernimiento rutinario?

◦ ¿Quién debe pagar?◦ ¿Derechos de privacidad genética?

◦ ¿Ganancias o lucro económico por organismos genéticamente alterados?◦ Cernimiento genético requerido u obligatorio?◦ Corrección forzada de “anormalidades genéticas”