capitulo 76

I. EL GEN COMO FÁRMACO

A. CONCEPTOS GENERALES

Durante las dos últimas décadas se han producido enor-mes avances en el área de la biología molecular. Es muyprobable que al final de esta década se haya secuenciadola mayor parte del genoma humano, generando una nuevabase de datos sobre la cual se apoyará la medicina del fu-turo. Paralelamente, se están descubriendo y analizandocon detalle los mecanismos moleculares y celulares de ac-tuación de multitud de productos génicos cuya alteraciónproduce diferentes enfermedades. Ello, junto con avancestécnicos, como la obtención de modelos animales transgé-nicos y knockout1 para determinadas enfermedades, estárevolucionando no sólo el área del diagnóstico sino tam-bién el desarrollo de diversas formas de tratamiento. Comoconsecuencia, se está dando prioridad a la puesta a puntode nuevas modalidades terapéuticas encaminadas a com-plementar los métodos farmacológicos tradicionales paralograr tratamientos más efectivos.

La terapia génica es una nueva forma de medicina mo-lecular que tendrá un enorme impacto en el área de la sa-lud humana durante el próximo siglo. De forma genérica,la terapia génica se puede definir como la introducciónde un gen en determinadas células o tejidos con el fin deque su expresión pueda corregir la deficiencia causadapor la pérdida o alteración de un producto génico esen-cial. En este sentido, la terapia génica se puede incluirdentro de un concepto más general: la transferencia gé-nica, en la cual es posible que el propósito del gen trans-ferido no sea el beneficio terapéutico, sino el estudio oanálisis biológico de las células a las que se transfiere.

Actualmente, los ensayos de terapia génica se realizansolamente en células somáticas, que comprenden todos

1 Se denominan animales «transgénicos» a aquellos generados por introduc-ción al azar de secuencias de ADN recombinante en su línea germinal. Dichas se-cuencias se transmiten y expresan en los descendientes del animal manipuladoobedeciendo las leyes mendelianas. Los animales knockout se producen al intro-ducir mutaciones en regiones definidas del ADN de su línea germinal medianterecombinación homóloga. Dicho procedimiento anula o altera la expresión de losproductos génicos provenientes de genes localizados en las regiones mutadas.

76Terapia génica

J. M. Arán

los tipos celulares, excepto esperma, óvulos y sus precur-sores. La alteración genética de células somáticas afectasólo al paciente que se está tratando. Por el contrario, lamodificación de las células germinales afectaría a todoslos descendientes del paciente en tratamiento, con todaslas consecuencias éticas y morales que ello conlleva. Sehan explorado diferentes tejidos somáticos para ensa-yos de terapia génica, como médula ósea, fibroblastos,músculo, piel, hígado, cerebro, etc. (fig. 76-1). La eleccióndel tejido depende fundamentalmente de la enfermedadque debe corregirse.

Asimismo hay que diferenciar entre terapia génica exvivo, en la que las células que deben modificarse son ex-traídas del paciente, manipuladas genéticamente y de-vueltas a su propio organismo, y terapia génica in vivo,en la que las células son corregidas in situ, mediante téc-nicas esencialmente no invasivas. La terapia génica exvivo es un procedimiento complicado de aplicación limi-tada a un pequeño número de pacientes y sólo podrárealizarse si la reimplantación del tejido somático modi-ficado es factible. Aunque todavía se encuentra en sus fa-ses iniciales de desarrollo, la terapia génica in vivo, se-mejante a los tratamientos farmacológicos actuales, es laque alberga mayores posibilidades para el futuro.

B. BIOMOLÉCULAS TERAPÉUTICAS

El principal requisito para el desarrollo de terapias gé-nicas es la identificación y caracterización de secuenciasnucleotídicas que podrían estar directa o indirectamenteimplicadas en procesos patológicos. Ello incluye tanto ge-nes para el tratamiento de enfermedades genéticas espe-cíficas, como secuencias utilizadas para conferir nuevaspropiedades a células, para el tratamiento de enferme-dades adquiridas y del cáncer.

1. Secuencias codificadoras de proteínas

Las biomoléculas más utilizadas para terapia génicason copias de ADN complementario obtenidas a partirde ARN mensajeros. Éstos, a su vez, provienen de genesque codifican proteínas de interés terapéutico. Las copias

1273

1274 Farmacología humana

de ADN complementario se insertan dentro de vectores,que son elementos genéticos que facilitan la transferen-cia y la expresión de secuencias eucariotas a las célulasdiana. También se usan los llamados minigenes, genesnormales a los que se les ha eliminado todos sus intrones(secuencias no codificadoras), pero conservan tanto el

Tejidos diana, enfermedades y vectores utilizados

Fibrosis quística, enfisema familiar y cáncer de pulmón

Vectores adenovíricos,retrovíricos, basados en el adenovirus asociado yliposomas

Cáncer

Vectores retrovíricos

Otros órganos

Cáncer y enfermedadesgenéticas comohipercolesterolemia

Vectores retrovíricosy adenovíricos

Célulashemopoyéticas

Cáncer, sida yenfermedadesgenéticas

Vectores retrovíricos

Músculo

Inmunización

ADN purificado

Sistema vascular

Reestenosis y aterosclerosis

Vectores adenovíricos,retrovíricos y liposomas

Vías respiratorias

Sistema nervioso central

Fig. 76-1. El cuerpo humano como diana para tratamientos de tel tratamiento potencial de cualquier tipo de enfermedad humanres y enfermedades infecciosas) mediante modificación genética

ferme

promotor, como la señal de terminación de la transcrip-ción y otros elementos controladores de la actividad gé-nica. Ocasionalmente se pueden utilizar incluso largassecuencias de ADN genómico que contienen un gen com-pleto, incluyendo zonas reguladoras, exones (secuenciascodificadoras) e intrones.

Rutas potencialesde administración

Intracerebral

Intranasal

Intrapulmonar

Subcutánea

Intrahepática

Intravenosa

Intraperitoneal

Intratumoral

Intramuscular

erapia génica. La amplia definición de terapia génica comprendea (enfermedades genéticas, cáncer, enfermedades cardiovascula-de células del organismo con el fin de prevenir o eliminar la en-dad.

76. Terapia génica 1275

2. Sondas antisentido

La tecnología de las sondas antisentido se basa en la uti-lización de oligodesoxinucleótidos (ODN) de pequeño ta-maño para inhibir la expresión génica. La inhibición de laexpresión tiene lugar por hibridación de los ODN anti-sentido a la cadena complementaria codificadora de ARNen el interior de la célula. A la interacción entre la sondaantisentido y el ARN se aplican las reglas de apareamientode bases de Watson-Crick, lo cual permite diseñar ODNdirigidos a cualquier gen de interés. En teoría, una sondaantisentido de 15 nucleótidos de longitud tiene suficienteespecificidad para interaccionar con un determinado gendentro del genoma humano completo. Debido principal-mente a su reducido tamaño, las sondas antisentido suelensintetizarse químicamente y se administran como un fár-maco convencional, aunque también se ha examinado suexpresión in vivo mediante vectores víricos o plásmidos.

De forma análoga a lo que sucede con los fármacos,los ODN antisentido tienen que superar una serie de obs-táculos para alcanzar su diana sin perder potencia. Ini-cialmente tienen que atravesar membranas celulares paraalcanzar el citoplasma o el núcleo. Una vez dentro de lacélula, han de mostrarse resistentes a la degradación pornucleasas. Finalmente, tienen que ser capaces de unirseespecíficamente y con gran afinidad al ARN diana parainhibir su expresión. Para superar estas barreras, se estánestudiando modificaciones químicas en la estructura delos ODN con el fin de aumentar su actividad biológica.La primera generación de modificaciones en la cadena deODN con resultados positivos fue el cambio de los enla-ces fosfodiéster de la cadena por enlaces fosforotioato ometilfosfonato. Ello representó un incremento en esta-bilidad, pero no en afinidad. Sin embargo, avances re-cientes en la química de los desoxinucleótidos modifica-dos están produciendo nuevos análogos con las deseadaspropiedades de estabilidad, afinidad y permeación parasu uso terapéutico.

Actualmente se está evaluando el potencial de la tec-nología antisentido para el tratamiento del cáncer o parala supresión de determinados elementos endógenos: re-ceptores de mediadores celulares (p. ej., de neurotrans-misores), enzimas, etc. Resultados satisfactorios obteni-dos en modelos animales han permitido iniciar ensayosclínicos con ODN antisentido dirigidos contra el oncogénc-myb para eliminar las células tumorales presentes en lamédula ósea de pacientes con leucemia mieloide crónica.Asimismo, existen ensayos clínicos que utilizan sondasantisentido para inhibir la expresión de importantes on-cogenes, como K-ras, c-fos y c-myc, en varias neoplasiascomo el melanoma, el carcinoma de pulmón, el cáncer demama, etc.

Los ODN antisentido se han explorado también comoagentes antivirales. Los retrovirus, como el virus del sida,son susceptibles a dicho tratamiento, que pretende evitarla transcripción inversa de su ARN genómico, o la tra-ducción de ARN mensajeros codificadores de proteínas

virales, todo ello con el fin de prevenir los procesos de in-fección o de replicación vírica. Estudios in vitro con lí-neas celulares de linfocitos T han posibilitado el inicio deensayos clínicos que utilizan sondas antisentido dirigidascontra diferentes secuencias reguladoras, estructurales yfuncionales del virus del sida.

Finalmente, se están iniciando ensayos preclínicos queemplean ODN antisentido para el tratamiento de neuro-patías, como la gliosis astrocítica, para la que se han di-señado sondas antisentido dirigidas contra secuencias co-dificadoras de la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), quese encuentra sobreexpresada.

3. ADN triplex

Se denomina ADN triplex a la asociación colineal detres cadenas de ODN. Ello se produce cuando una ca-dena de ODN se une a la hendidura o canal ancho de unadoble hélice de ADN.

La tecnología del ADN triplex, paralelamente a la delas sondas antisentido, tiene un gran potencial terapéu-tico como modulador génico. La unión de un ODN for-mador de ADN triplex a un gen diana puede bloquear latranscripción del ARN, lo cual anularía su expresión. Ladiferencia de dicha técnica con las sondas antisentido ra-dica en que en el primer caso el ODN se une directamenteal gen en lugar de unirse a su ARN mensajero. Como elADN triplex actúa a nivel transcripcional, en teoría sóloson necesarias unas pocas moléculas de ODN para pro-ducir un efecto inhibidor.

El ODN formador de ADN triplex puede componersede polipurinas o polipirimidinas y se une a la cadena ricaen purinas de la doble hélice mediante puentes de hidró-geno. La especificidad de unión resulta de la comple-mentariedad de secuencia entre la región polipurínica deuna de las hélices de ADN y el ODN formador de triplex.

Se han de superar varias limitaciones antes que sepueda aplicar dicha tecnología para terapia génica. Ac-tualmente, las regiones idóneas para la formación deADN triplex tienen que ser homopurínicas en una de lascadenas. Al igual que para las sondas antisentido, la afi-nidad de unión y estabilidad de los ODN formadores detriplex son factores importantes para determinar su efi-cacia. Además, la unión de los ODN a sus regiones dianaes transitoria, por lo cual la inhibición del gen diana estemporal. Sin embargo, se han realizado con éxito estu-dios experimentales preliminares, como la inhibición dela expresión del oncogén HER-2/neu por formación deun triplex dentro de una región polipurínica situada en supromotor. Se ha propuesto también a los ODN forma-dores de triplex como candidatos para la inhibición de laexpresión del virus del sida.

4. Ribozimas

Los ribozimas son moléculas de ARN con capacidadde catalizar la escisión específica de otras moléculas de


ARN. La especificidad de secuencia del ribozima se de-termina por su capacidad para aparearse o hibridarse connucleótidos complementarios de la molécula de ARNdiana cerca del sitio de escisión. Dicha escisión produceun ARN mensajero incompleto e inestable, lo cual inhibela expresión proteica.

En teoría, los ribozimas se pueden sintetizar o mani-pular para actuar sobre cualquier molécula de ARN com-prendida en el conjunto del ARN celular. Por lo tanto,cualquier ARN mensajero que codifique una proteínaasociada a una determinada enfermedad puede escin-dirse selectivamente mediante ribozimas expresados apartir de un vector de transferencia génica adecuado. De-bido a su flexibilidad de diseño y su extraordinaria espe-cificidad de secuencia, los ribozimas llamados hammer-head y hairpin podrían resultar muy útiles como agentesterapéuticos.

Los ribozimas tienen varias ventajas respecto a las pro-teínas cuando se considera su uso en aplicaciones de te-rapia génica: a) el ARN es menos susceptible a provocaruna respuesta inmunitaria que la expresión de una pro-teína exógena o modificada; b) los ribozimas son molé-culas de pequeño tamaño, lo que facilita su inclusión enlos vectores utilizados para terapia génica, y c) en un únicovector se pueden insertar incluso varios ribozimas dirigi-dos contra diferentes regiones de una molécula de ARNmensajero, o contra diferentes moléculas de ARN men-sajero, lo cual puede ser útil para actuar sobre los distin-tos dominios de un genoma viral (con el fin de contra-rrestar mutaciones en dicho genoma, que supriman elefecto terapéutico de un solo ribozima), o sobre múlti-ples mediadores de un determinado estado patológico.

Sin embargo, existen también varios obstáculos en di-cha tecnología que hay que resolver antes que pueda apli-carse con garantías de éxito. Para suministrar los ribozi-mas a partir de vehículos de expresión hay que diseñarlas unidades de transcripción con el fin de que se sinteti-cen las moléculas de ribozima en cantidad suficiente para

Tabla 76-1. Propiedades de los siste

Vectores víricos

HerpesCaracterísticas Retrovíricos Adenovíricos simple

Capacidad máxima (kb) 8 kb 7-8 kb 25-30 kb

Título (log10 [células 6-7 8-11 6-8transducidas/ml])

Integración Sí No No

Transmisión a células No Sí Síquiescentes

Expresión estable Sí Transitoria TransitoriaExpresión de proteínas No Sí Sí

víricasAdministración in vivo Rara Sí Sí

producir el efecto inhibidor deseado. Asimismo, los ri-bozimas deben elegirse de manera que hibriden una re-gión accesible de ARN mensajero y el ribozima expre-sado debe mantener capacidad catalítica suficiente paraescindir el ARN mensajero antes que éste sea traducido.Muy recientemente se ha indicado una nueva aplicaciónpara introducir nuevas funciones o corregir defectos enun gen determinado a partir de la capacidad de corte yempalme o splicing de los ribozimas.

C. ESTRATEGIAS Y MÉTODOSDE TRANSFERENCIA GÉNICA

Cuando se ha aislado y caracterizado un gen asociadoa una enfermedad concreta, se puede iniciar el estudio ydesarrollo de métodos terapéuticos que permitan la ad-ministración segura y eficaz de su secuencia nucleotídicaa las células afectadas. Para lograr introducir y expresarlos genes en las células o tejidos diana se ha desarrolladouna gran variedad de vehículos de transferencia o vecto-res. Actualmente, no existe ningún vector de terapia gé-nica que resulte idóneo para todas las enfermedades. Ca-da vector tiene sus ventajas e inconvenientes, por lo quela elección de un determinado vector dependerá de lascaracterísticas propias del tejido y de la enfermedad quedeba tratarse, de si la terapia génica es ex vivo o in vivo,y de que la expresión del producto génico pueda ser tran-sitoria o haya de ser permanente. Los vectores víricos sonmuy útiles para alcanzar niveles terapéuticos del pro-ducto génico deseado. Asimismo, métodos físicos y quí-micos de transferencia génica muy diversos, como la in-yección directa de ADN, complejos lípido-ADN, etc.,pueden resultar adecuados si la expresión del gen tera-péutico es suficiente durante un período transitorio (ta-bla 76-1).

Aunque el ADN puede ser transferido eficientementede forma transitoria, la proporción de células capaces de

mas actuales de transferencia génica

Vectores no víricos

Conjugados ADNAdenoasociados moleculares purificado Liposomas

4,5 kb No restrin- No restrin- No restrin-gido gido gido

8-10 — — —

Sí, pero con baja Rara Rara Rarafrecuencia

Sí Sí Sí Sí

? Transitoria Transitoria TransitoriaSí No No No

Sí ? Sí Sí


retener las secuencias transferidas de manera estable ypermanente es extremadamente baja (0,1-0,01 %), conindependencia del sistema de transferencia génica em-pleado, excepto en la transferencia mediada por vectoresretrovíricos que puede ser extraordinariamente eficiente(100 %) para algunos tipos celulares. Por lo tanto, es ne-cesario emplear métodos para identificar, aislar y hacercrecer las pocas células que se han transferido satisfacto-riamente dentro de la población celular tratada. Si el gentransferido expresa un fenotipo dominante (proteína demembrana, oncogén, etc.), es posible aislar las célulastransferidas directamente. Sin embargo, la mayoría de losgenes presenta un fenotipo no dominante y se completacon genes que tienen las características anteriormentemencionadas, llamados marcadores selectivos dominan-tes, que codifican proteínas cuya expresión permite a lascélulas favorecer un proceso de selección. Dichos mar-cadores se introducen de manera que estén físicamenteligados a la secuencia del ADN, de interés al diseñar elvector. Ejemplos comunes de marcadores selectivos do-minantes son el gen bacteriano neo, que codifica la en-zima neomicina-fosfotransferasa y, por lo tanto, confiereresistencia al antibiótico neomicina y sus análogos, y elgen MDR1, que produce un fenotipo de resistencia cru-zada a múltiples fármacos citotóxicos empleados paraquimioterapia antineoplásica (v. cap. 62).

1. Vectores víricos

La capacidad de algunos virus de ADN y ARN de pro-ducir transformaciones tumorales mediante la introduc-ción de su material genético a células hospedadoras fuela que condujo a su utilización como vectores para trans-ferencia génica. La lista de virus que se han estudiadocomo vectores es considerable e incluye papovirus, ade-novirus, virus de la vacuna, adenovirus asociados, virusdel herpes, retrovirus, etc.

1.1. Vectores retrovíricos

Los vectores víricos más estudiados provienen de losretrovirus. Los retrovirus más estudiados son los oncovi-rus sencillos, como el virus del sarcoma de Rous (VSR)y el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV).Cada partícula retrovírica (virión) contiene dos copias deARN genómico vírico empaquetadas dentro de un com-plejo proteico que, a su vez, está rodeado por una en-vuelta proteolipídica. La propiedad más interesante delos retrovirus es la producción de transcriptasa inversa,una polimerasa de ADN dependiente de ARN. La ma-yoría de ensayos clínicos de terapia génica utilizan ac-tualmente retrovirus murinos defectuosos, incapaces dereplicación.

El ciclo vital del retrovirus empieza por su unión a un receptor es-pecífico de la célula huésped o diana, mediada por la proteína de su en-vuelta (v. fig. 71-4). Dependiendo del tipo de retrovirus, el virión entraen la célula por endocitosis o mediante fusión directa del virus y la mem-

brana celular. Seguidamente, el complejo interiorizado de proteína-ARN atraviesa el citoplasma y entra en el núcleo celular. Durante sumigración se inicia la compleja reacción intermolecular de la transcrip-tasa inversa que acaba en el interior del núcleo con la generación deuna copia de ADN de doble cadena a partir del ARN original. Final-mente, el ADN producido se inserta inespecíficamente en un cromo-soma de la célula huésped por acción de la enzima integrasa. La se-cuencia integrada de ADN proviniente del ARN vírico se denominaprovirus (fig. 76-2).

La producción de retrovirus defectuosos se lleva a cabo mediante unsistema de dos componentes: la línea celular de empaquetamiento y elpropio vector retrovírico (fig. 76-3). Los vectores retrovíricos se handiseñado a partir de la secuencia de ADN del provirus, en la cual seconservan solamente elementos reguladores llamados repeticiones ter-minales largas (LTR), que incluyen la región promotora y la señal depoliadenilación, mediadoras del inicio y el final de la transcripción res-pectivamente, la señal de empaquetamiento (y) y señales necesarias parael inicio de la transcripción inversa. Dichos elementos comprenden so-lamente el 20 % del genoma retrovírico. Los genes víricos gag (codificalas proteínas estructurales), pol (codifica la transcriptasa inversa, la in-tegrasa y la proteasa vírica) y env (codifica la glucoproteína de la en-

Retrovirus (9,8 kb)(Virus de la leucemia murina)

LTR LTR

gag pol env

Adenovirus (36 kb)

E1A E1B L1 E3

E2B E2A E4

Virus del herpes simple (152 kb)

a b b' a' c' c a

Adenovirus asociado (4,7 kb)

ITR ITR

REP CAPy

y y y

y

y

Fig. 76-2. Estructura genómica de los principales virus utili-zados para la construcción de vectores víricos de transferenciagénica. En cada caso se muestra la secuencia de ADN del ge-noma vírico, que para retrovirus y adenovirus asociados es laforma provírica integrada. Se indican también las característi-cas relevantes de cada sistema, como la secuencia y, necesariapara la encapsidación de los genomas víricos. Asimismo se in-dica el tamaño de cada genoma y las principales regiones codi-ficadoras de proteínas víricas (excepto para el virus del herpessimple). Retrovirus: las regiones LTR se denominan repeticio-nes terminales largas y contienen secuencias promotoras, se-cuencias de poliadenilación y secuencias necesarias para la in-tegración. Adenovirus: las regiones E1A, E1B y E3 se puedeneliminar o sustituir por un gen recombinante de interés para for-mar los vectores adenovíricos. Virus del herpes simple: las re-giones a, b y c son repeticiones que se encuentran invertidas ena', b' y c'. Adenovirus asociados: las regiones ITR, llamadas re-peticiones terminales invertidas, flanquean al gen de interés envectores ba-


vuelta vírica) se pueden eliminar sin perjudicar la producción de retro-virus recombinantes. En lugar de la secuencia de gag, pol y env se insertala secuencia del gen o genes que se desea expresar y se obtiene un pro-virus defectuoso que contiene el gen recombinante de interés.

Las líneas celulares de empaquetamiento (habitualmente, fibro-blastos murinos) se han manipulado para sintetizar constitutivamente(de manera permanente y no regulada) las proteínas víricas proceden-tes de los genes gag, pol y env, y producen viriones vacíos. Asimismo,en dichas secuencias víricas se han eliminado o modificado elementoscomo la señal de empaquetamiento con el fin de disminuir en lo posi-ble las zonas de homología con el vector retrovírico, que podrían re-combinarse para dar lugar a virus capaces de replicación. Las partícu-las víricas recombinantes ensambladas por la línea celular productora(definida como la línea celular de empaquetamiento a la que se ha trans-fectado el vector retrovírico) ya pueden utilizarse para transferir lassecuencias que componen el vector a otras células diana. Debido a lanaturaleza defectuosa del vector retrovírico, dicho procedimiento detransferencia génica se denomina transducción. Análogamente, el tér-mino «infección» se reserva para virus capaces de replicación. Losviriones recombinantes se acumulan en el medio de cultivo de la líneacelular productora a concentraciones que pueden superar las 106 partí-culas/ml. Dichos viriones pueden emplearse directamente para trans-ducir otras líneas celulares o cultivos primarios.

Las principales ventajas de los vectores retrovíricoscomo vehículos de transferencia son su extraordinaria efi-ciencia, que les permite transducir cerca del 100 % de lascélulas diana, y su capacidad para integrar de manera es-table en los cromosomas celulares el material genéticoque contienen. Sin embargo, existen varias limitacionesque dificultan el uso de los vectores retrovíricos como ve-hículos generales de transferencia génica. Para que tengalugar la integración del provirus recombinante es nece-sario que la célula diana se replique. Por lo tanto, no esposible transducir a células posmitóticas, como neuronas

gag

LTR

LTR LTR

LTR

y

y

LTR y

genterapéutico

Línea cde retrov

Inserción génica

Fig. 76-3. Generación de retrovirus recombinantes para transferdas las secuencias codificadoras del genoma de un retrovirus, porres se introducen en líneas celulares empaquetadoras, manipuladcélulas resultantes, llamadas productoras, son capaces de encapsidriones recombinantes sin capacidad de replicación. Éstos se recog

tes de transferencia y expres

diferenciadas o fibras musculares. La eficiencia de trans-ducción puede mejorarse significativamente en algunostejidos, como la médula ósea o el hígado, cuando se provo-ca la división celular mediante cultivos ex vivo o mediantetratamiento con fármacos (5-fluorouracilo en médulaósea y tetracloruro de carbono en hígado). La concen-tración de partículas víricas recombinantes en los sobre-nadantes de las líneas celulares productoras es tambiénun factor limitante. Los retrovirus recombinantes son re-lativamente lábiles en comparación con otros virus. Se haintentado purificar o concentrar las partículas, aunqueello ha dado como resultado una pérdida considerable decapacidad de transducción. Los títulos habituales de 105

a 106 partículas víricas/ml de sobrenadante a veces resul-tan insuficientes, en especial para la terapia génica in vivo,ya que los viriones recombinantes son inactivados rápi-damente por el sistema del complemento. Otra limitaciónde los vectores retrovíricos está relacionada con el ta-maño de la secuencia que debe insertarse, que no debesuperar las 8 kb para que pueda ser empaquetada eficaz-mente y no influya negativamente en el título obtenido.Ello implica que algunas secuencias de ADN comple-mentario como la del gen de la distrofina, de 14 kb, nopuedan incluirse en vectores retrovíricos.

Finalmente hay que considerar también cuestiones deseguridad en torno al uso clínico de los vectores retro-víricos. Existe la posibilidad de que se generen virus«silvestres» con capacidad de replicación mediante re-combinación homóloga de secuencias retrovíricas, prin-cipalmente en las líneas celulares productoras. Además,la integración aleatoria del provirus recombinante en el

pol env

gag pol env

LTR

Transfección

Línea celular empaquetadora

elular productorairus recombinantes

encia génica. Los vectores retrovíricos se obtienen al sustituir to- secuencias recombinantes de interés terapéutico. Dichos vecto-as para expresar constitutivamente los genes gag, pol y env. Lasar el ARN derivado de los vectores retrovíricos produciendo vi-en en el sobrenadante celular y servirán como vehículos eficien-ión de los genes de interés.


genoma celular podría provocar la activación de oncoge-nes o la inactivación de genes supresores de tumores. Sinembargo, estudios de toxicidad en modelos animales fi-nalizados recientemente han indicado que no hay riesgosignificativo en el uso de los sistemas retrovíricos actua-les para terapia génica.

1.2. Vectores adenovíricos

Los adenovirus son patógenos débiles que afectanprincipalmente las vías respiratorias y no se han asociadoa enfermedades malignas. Cada partícula vírica contieneuna molécula de ADN de doble cadena de tamaño con-siderable (36 kb) y entra en las células mediante endoci-tosis mediada por receptores, seguido de la rotura delcorrespondiente endosoma y migración del genoma ade-novírico al núcleo donde permanece en forma extracro-mosómica. El genoma adenovírico comprende una seriede genes que se expresan al principio de la infección ycodifican proteínas reguladoras, y una serie de genes tar-díos, que codifican proteínas estructurales (fig. 76-2).Cuando el genoma vírico entra en la célula, se activan losgenes que se expresan inicialmente (E1). Ellos a su vezactivan otros genes reguladores importantes E2, E3 y E4.En la segunda fase de replicación se expresan los genestardíos (L1-L5), produciendo más virus que finalmenteprovocan la muerte de la célula. El actual conocimientode la genética molecular del adenovirus posibilita su ma-nipulación como vehículo para terapia génica.

La construcción de vectores adenovíricos se realiza mediante re-combinación homóloga entre ADN genómico del adenovirus y un plás-mido que contiene el gen de interés flanqueado por una región de se-cuencia idéntica a la del adenovirus. Los vectores adenovíricos actualesderivan de los serotipos humanos 2 y 5, en los cuales se ha eliminado oalterado la región esencial E1 para evitar la replicación viral. Dicha re-gión se sustituye por el conjunto promotor/gen de interés. La recombi-nación ocurre después de transfectar el plásmido junto con el ADN ví-rico a la línea celular humana 293, insertándose el gen de interés enel genoma del adenovirus. Las células 293, que expresan constitutiva-mente la región E1, sirven como fuente de proteínas E1 en el ensam-blaje de las partículas víricas recombinantes. La mayoría de vectoresadenovíricos actuales contiene también una deleción en la región noesencial E3, lo cual permite acomodar fragmentos de ADN recombi-nante mayores.

Los vectores adenovíricos ofrecen varias ventajas sobreotros métodos de transferencia génica: a) pueden infectarla mayoría de tipos celulares de mamífero; b) pueden pro-ducirse a títulos elevados (³ 1012 partículas/ml) mediantesu propagación en células 293 y su posterior purificaciónen gradientes de cloruro de cesio, por lo cual resultan ade-cuados para terapia génica in vivo; c) a diferencia de losvectores retrovíricos, son capaces de transducir eficiente-mente células quiescentes como neuronas y hepatocitos, yd) el hecho de que los vectores adenovíricos generalmenteno se integran en el genoma de las células transducidas eli-mina el peligro potencial de mutagénesis por inserción.

Las principales desventajas de los vectores adenovíri-cos son: a) la expresión del gen terapéutico es transitoria

y b) producen inducción de una respuesta inmunitariafuerte en las células hospedadoras, contra pequeñas can-tidades de proteínas víricas sintetizadas por el vector. Re-cientemente se ha obtenido la última generación de vec-tores adenovíricos, con una mutación termosensible en laregión E2A, lo cual los hace menos inmunogénicos.

1.3. Vectores basados en el virus del herpes

La compleja capacidad codificadora del genoma delherpes incluye, además de proteínas reguladoras y es-tructurales, proteínas implicadas en el metabolismo delos ácidos nucleicos. Por ejemplo, el virus del herpes sim-ple 1 (VHS-1) de 152 kb es el más utilizado para la cons-trucción de vectores y codifica 72 proteínas diferentes.Después de la infección celular y la migración del genomavírico al núcleo de la célula hospedadora, los virus delherpes pueden entrar en un período de latencia y man-tenerse como episomas circulares, o comenzar un ciclode replicación lítica con producción de viriones y lisis ce-lular.

Los virus del herpes simple 1 son virus neurotróficos, por lo que vec-tores derivados de dichos virus pueden proporcionar una estrategiaúnica para obtener la persistencia del ADN recombinante en célulasdel sistema nervioso central.

Se han desarrollado dos estrategias para la construcción de vecto-res basados en el virus del herpes simple 1, que pueden expresar genesexógenos en células huésped. En la primera estrategia, similar a la pro-ducción de adenovirus, los vectores víricos se generan mediante re-combinación entre un virus receptor y un plásmido donante que incluyeuna secuencia homóloga a la del virus receptor. En la segunda estrate-gia, los minivirus recombinantes se producen por complementación deun virus defectivo con capacidad de replicación, con un plásmido quecontiene un origen de replicación y una señal de empaquetamiento ví-ricos más el transgén de interés. Sin embargo, es difícil generar stocksde virus del herpes recombinantes completamente incapaces de repli-carse, debido a la compleja regulación que presenta su replicación.

Las ventajas de los vectores basados en el virus del herpes simplecomprenden la capacidad de transducir gran variedad de tipos celula-res, la capacidad de transducir células quiescentes, la disponibilidad destocks de título alto (105-109 partículas/ml) y la capacidad de incorpo-rar secuencias transgénicas grandes (hasta 30 kb).

Algunos vectores derivados del virus del herpes sim-ple 1 se han utilizado satisfactoriamente para expresar ge-nes en cerebro de ratón mediante inyección estereotá-xica. Sin embargo, el número de células transducidas esgeneralmente bajo, las células transducidas se encuentranlocalizadas en el lugar de la inyección y la expresión trans-génica es transitoria. Además, otras limitaciones como lacitotoxicidad y la moderada o completa eliminación de laexpresión transgénica, mediadas por el propio genomadel virus, han impedido que la expresión de los genes deinterés a largo plazo sea elevada y estable. Por lo tanto,dicho sistema está aún en vías de desarrollo.

1.4. Vectores basados en el adenovirus asociado

Los adenovirus asociados (AAV) son miembros de lafamilia de los parvovirus y no se han relacionado con nin-


guna enfermedad humana. Dichos virus son relativa-mente pequeños (4,7 kb), estables y pueden infectar tam-bién una gran variedad de células humanas. Pueden pro-pagarse como virus líticos o mantenerse como provirus,que se integran en el ADN de la célula hospedadora. Enun proceso de infección, para una replicación eficiente,el adenovirus asociado requiere coinfección con adeno-virus o virus del herpes simple; de ahí la clasificación delAAV como un virus defectuoso.

El genoma vírico está compuesto por ADN monocatenario con dosrepeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 bases. Las primeras 125bases de estas repeticiones se repliegan para formar una doble cadenaen forma de «T» que se cree que actúa como cebador para la replica-ción del ADN vírico. Durante el ciclo de infección, el virus se integraen el genoma celular como ADN de doble cadena (fig. 76-2). Todas lasetapas de biosíntesis vírica tienen lugar en el núcleo de la célula hos-pedadora. El genoma vírico produce como mínimo seis tránscritos apartir de tres promotores internos y los dos principales marcos abier-tos de lectura, los genes rep y cap. Dichos genes codifican como mínimocuatro y tres polipéptidos, respectivamente. Cap codifica proteínas es-tructurales, mientras rep codifica proteínas responsables de la replica-ción vírica.

Los vectores AAV actuales incorporan simplemente las dos repeti-ciones terminales de 145 bases que flanquean el transgén de interés, quesustituye a los genes rep y cap. Dichos vectores requieren complemen-tación con proteínas víricas para replicarse y encapsidarse. El vector serecupera a partir de lisados celulares. Las partículas recombinantes pue-den transducir eficientemente células diana y el gen de interés, flan-queado por las ITR, puede integrarse en el genoma celular. El proce-dimiento actual para producir partículas víricas recombinantes utilizauna cotransfección de células (normalmente se emplean las líneas ce-lulares humanas KB o 293) infectadas con adenovirus, con el vectorAAV y con un plásmido de ayuda que expresa las proteínas rep y cap.Estos dos plásmidos se construyen de manera que no contengan se-cuencias homólogas, para evitar la síntesis de virus «silvestres» medianterecombinación homóloga. Las células transfectadas se cultivan durante48 horas y se lisan. Posteriormente, el lisado se trata a 56 °C para eli-minar las partículas de adenovirus (AAV es resistente a dicho trata-miento). Los rendimientos de partículas recombinantes varían entre 106

y 107 partículas por cada placa de células de 100 mm, las cuales puedenconcentrarse hasta 1012 por centrifugación.

La integración del genoma de los adenovirus asocia-dos en el ADN del hospedador es menos eficiente y pre-cisa que la integración retrovírica, puesto que en dichoproceso se producen frecuentemente pequeñas delecio-nes y/o reordenamientos. Sin embargo, los genomas in-tegrados de AAV son estables. Una propiedad caracte-rística de los adenovirus asociados es que la integraciónde su genoma vírico se produce dentro de una pequeñaregión del cromosoma 19. No obstante, no parece queninguno de los adenovectores asociados, construidos has-ta la fecha, conserve dicha propiedad. Otra limitación delos vectores AAV es la restricción en el tamaño de lassecuencias transgénicas que deben acomodarse, que nopuede superar las 4,5 kb.

Recientemente, experimentos in vivo han demostradoque los vectores AAV pueden persistir y expresar eltransgén en células de crecimiento lento o incluso quies-centes, sin que se observen respuestas inflamatorias o in-munológicas tóxicas.

1.5. Otros vectores víricos

Actualmente se está considerando gran variedad de ti-pos víricos para su caracterización como vectores en te-rapia génica: virus de la vacuna, virus de la hepatitis d,virus de la hepatitis B, virus de la polio, virus del sida,Sindbis/Semliki forest virus, etc. Sin embargo, los siste-mas de empaquetamiento/complementación para produ-cir dichos vectores no están aún lo suficientemente desa-rrollados.

2. Métodos físicos y químicos

Aunque la mayor parte de la investigación en terapiagénica se ha centrado en el uso de virus recombinantespara transferir genes a células alteradas, se ha progresadotambién en el desarrollo de nuevas tecnologías que per-mitirán formular a los genes como productos farmacéu-ticos convencionales y su administración directa a los pa-cientes. Estos sistemas de transferencia génica no víricosse denominan a veces virus artificiales ya que imitan confrecuencia funciones biológicas de los sistemas víricos.

Sin embargo, los sistemas de transferencia no víricosdifieren de los sistemas de transferencia víricos en cuantoa su composición, elaboración, caracterización y perfilterapéutico, y entrañan también riesgos clínicos y comer-ciales diferentes. Estudios en animales demuestran quelos métodos actuales de transferencia génica no vírica sonmenos eficientes que los métodos víricos para introducirgenes a un gran número de células in vivo; sin embargo,son relativamente más seguros y más flexibles en cuantoal tamaño y composición de las secuencias que debentransferirse. Actualmente se están realizando ensayos clí-nicos que incluyen métodos de transferencia no víricaaprobados en Estados Unidos y Europa. Algunos méto-dos de transferencia génica no víricos, como los liposo-mas y los lípidos catiónicos fueron desarrollados inicial-mente para la administración controlada de fármacosconvencionales y productos biológicos.

La transferencia génica no vírica se está realizando ac-tualmente en tejidos accesibles por administración in-tersticial directa, como músculo, tumores sólidos, piel yepitelio pulmonar, así como en tejidos accesibles al com-partimiento vascular, como el endotelio pulmonar y loshepatocitos, obteniéndose una expresión transitoria delos productos génicos terapéuticos.

El reto de la terapia génica no vírica consistirá endesarrollar medicinas génicas que puedan distribuirse,prescribirse y administrarse como medicinas tradiciona-les para enfermedades comunes, y que muestren perfilesde seguridad y eficacia similares a los fármacos y pro-ductos biológicos convencionales.

2.1. ADN purificado

Uno de los obstáculos más importantes de la transfe-rencia de ADN purificado radica en que los mismos plás-


midos son partículas con carga negativa neta y con un diá-metro hidrodinámico que supera los 100-200 nm. Debidoa estas características, es improbable que el ADN se di-funda lejos del lugar de inyección o que atraviese sin di-ficultad barreras, como el endotelio, el epitelio querati-nizado o la barrera hematoencefálica. Por el contrario, elADN introducido en el espacio vascular será captado yeliminado fácilmente del organismo por células reticulo-endoteliales.

A pesar de ello, se ha inyectado ADN recombinanteen varios tejidos para evaluar su incorporación y expre-sión. Aunque la eficiencia de transferencia génica utili-zando dicho procedimiento es baja, unos pocos tejidos,en especial músculo, tiroides y tejido sinovial, expresanlos genes recombinantes inyectados. Se desconoce el me-canismo por el que dichas células incorporan y expresanel ADN purificado. Aunque la inyección directa de ADNen músculo puede ser útil para vacunación, dicho proce-dimiento no es válido para el tratamiento de enfermeda-des sistémicas como la distrofia muscular de Duchenne.

Para intentar aumentar in vivo la incorporación celu-lar de ADN purificado se ha descrito otro método queutiliza el bombardeo con micropartículas inertes de ororecubiertas de ADN que se proyectan en los tejidos dianamediante una «pistola génica». Con dicho procedimientose han transferido genes a varios órganos, como piel, hí-gado y músculo, aunque la expresión se observa sola-mente en las capas más superficiales del tejido tratado.Dicho método se ha usado también para expresar antí-genos para vacunación y para la cicatrización de heridasen un modelo experimental animal.

2.2. Liposomas

Recientemente se ha destacado el uso de los lípidos ca-tiónicos que forman complejos con ADN, como reacti-vos importantes para transferencia génica, tanto ex vivocomo in vivo. Formulaciones de ADN con lípidos catió-nicos, como DOTMA (bromuro de 1,2-dioleil-oxipropil-3-trimetil-amonio) o análogos, y un fosfolípido neutro,como DOPE (dioleil-fosfatidil-etanolamina), producencomplejos lípido-ADN capaces de introducirse en las cé-lulas con eficiencias que pueden sobrepasar el 90 % enalgunas líneas celulares y cultivos primarios. Los com-plejos lípido-ADN en dichas formulaciones no son ver-daderos liposomas, sino que el lípido catiónico forma unapartícula que condensa el ADN mediante interaccionesiónicas. Dichos complejos pueden incluir también variasmoléculas de plásmido por interacciones hidrófobas en-tre los lípidos unidos.

El tamaño y la carga del complejo lípido-ADN y la efi-ciencia de transferencia génica se pueden optimizar alte-rando la composición de lípidos y ADN del complejo.Aunque varias combinaciones de lípidos catiónicos yotros lípidos muestran eficiencias de transferencia génicadiferentes en distintos tipos celulares, no se ha estable-cido un patrón lipídico ideal.

Los lípidos catiónicos se han utilizado para transferirgenes a varios tejidos in vivo. Los pulmones al parecerson particularmente susceptibles a transferencia génicamediada por liposomas catiónicos administrados por víaintratraqueal o incluso intravenosa, aunque se desconocesu mecanismo de actuación. Estudios de expresión dea-antitripsina y del producto génico de la fibrosis quís-tica (CFTR) en pulmones de animales han posibilitado elcomienzo de ensayos clínicos de terapia génica para la de-ficiencia de dichas proteínas utilizando liposomas. Variosestudios han empleado complejos de lípido catiónico-ADN administrados directamente a tumores para au-mentar su inmunogenicidad, en terapia antitumoral. Sehan propuesto también ensayos clínicos usando lípidoscatiónicos para transferir el gen que codifica la interleu-cina 2 (IL-2) a tumores con el fin de provocar una res-puesta inflamatoria antitumoral.

D. APROXIMACIONES INNOVADORASPARA TERAPIA GÉNICA

El vehículo o vector ideal para terapia génica tendríaque transferir el gen terapéutico eficiente y específica-mente a los tejidos diana apropiados. Una vez en el inte-rior de la célula, el gen terapéutico tendría que ser trans-portado al núcleo donde se mantendría en un plásmidofuncional o se integraría de manera estable, y a ser posi-ble específica, en un cromosoma celular. Finalmente, ten-dría que expresarse de forma predecible y controlada enniveles adecuados en función de la célula o tejido.

Sin embargo, la amplia gama de enfermedades sus-ceptibles de ser tratadas mediante terapia génica implicauna gran dificultad a la hora de diseñar un único sistemade transferencia génica universalmente apropiado.

Recientemente se ha progresado en la incorporaciónde características que aumentan la especificidad de ac-ción en la mayoría de los sistemas actuales de terapia gé-nica. Dichas características pueden ser: a) en cuanto a re-conocimiento de la superficie celular diana, mediantemanipulación de los componentes de reconocimiento su-perficiales de virus y liposomas, y/o b) respecto a restric-ciones transcripcionales en las células huésped, mediantela incorporación de elementos transcripcionales en elplásmido o genoma vírico, de manera que el gen tera-péutico se exprese sólo en ciertos tipos celulares y a ni-veles deseados.

1. Transferencia génica dirigida

1.1. Vectores retrovíricos

El principal determinante de la capacidad infectantede los retrovirus es la interacción entre receptores espe-cíficos de la membrana de la célula hospedadora y glu-coproteínas situadas en la envuelta lipídica de la partícularetrovírica. Sin embargo, la mayoría de retrovirus tienen


capacidad para infectar diferentes tipos celulares dadoque los receptores celulares con los que interaccionan seencuentran ampliamente distribuidos.

La mayor parte de los vectores retrovíricos y líneas em-paquetadoras producidas hasta el momento se basan envirus de leucemia murina (MLV) que, dependiendo de sutropismo (capacidad de infección), pueden clasificarse aefectos de transferencia génica, en ecotrópicos (infectancélulas murinas) y anfotrópicos (infectan prácticamentetodas las células de mamíferos). Por lo tanto, para dise-ñar vectores retrovíricos dirigidos se ha de restringir lapromiscuidad de tropismo de las partículas anfotrópicaso conferir a las partículas ecotrópicas una afinidad res-tringida para ciertas células humanas. Esto se está estu-diando actualmente mediante métodos diversos.

a) Manipulación genética de la línea productora de forma que, enlas partículas víricas, la envuelta anfotrópica o la ecotrópica se sustituyepor una proteína diferente, vírica o no, que aporta la afinidad deseada(seudotipación). Muy recientemente se ha demostrado la transducciónde neuronas que utilizan vectores basados en el virus de la inmunode-ficiencia humana (VIH), causante del sida, que se seudotiparon con laglucoproteína de la envuelta del virus de la leucemia murina de Molo-ney, habitualmente utilizado para experimentos de terapia génica.

b) Dotación directa de una determinada afinidad a la glucopro-teína de la envuelta mediante ingeniería genética. Actualmente, la adi-ción de dominios proteicos es la mejor aproximación para el diseño deenvueltas dotadas de diferentes especificidades, ya que éstas se suelenexpresar eficientemente en las partículas víricas y son capaces de mo-dificar la dirección de unión de los viriones. La dificultad reside en quedichos dominios deben plegarse separadamente y no interferir con otrosdominios esenciales de la envuelta retrovírica. Por ejemplo, se han ex-presado factores de crecimiento y fragmentos de anticuerpos mono-clonales como extensiones aminoterminales del dominio de superficiede la envuelta del virus de la leucemia murina de Moloney. Sin embargo,hasta el momento la eficiencia de transducción resultante de las partí-culas víricas dirigidas obtenidas a partir de dicha aproximación ha sidomuy baja o nula.

c) Estrategias que emplean conjugados moleculares, en las que seacoplan ligandos a la superficie de la partícula retrovírica. Los hepato-citos poseen un receptor que interioriza eficientemente las asialoglu-coproteínas. Se ha conjugado lactosa a partículas retrovíricas ecotrópi-cas, lo cual les permitió ser reconocidas como asialoglucoproteínas, porlo que se amplió su tropismo para incluir células humanas de hepatoma.

1.2. Vectores adenovíricos

Aunque las enfermedades provocadas por adenovirusasientan comúnmente en el epitelio respiratorio o eltracto gastrointestinal, parece que sus receptores celula-res están ampliamente distribuidos. Por lo tanto, el pro-blema, como en el caso de los retrovirus, es limitar su tro-pismo a un determinado tejido.

A partir de las proteínas adenovíricas responsables de unión e inte-riorización se están estudiando estrategias para manipular el tropismodel adenovirus. Por un lado, se puede limitar la infección provocada poradenovirus en la etapa de su unión a la célula sustituyendo la regióncarboxiterminal de la fibra pentón, una de las subunidades que com-ponen la cápsida, por un ligando que confiera un determinado tropismo;por ejemplo, un hapteno de anticuerpo. Por otro lado, también se puedesustituir una determinada región de la base pentón (otra subunidad dela cápsida) por secuencias que tengan afinidad por un ligando diferentea las integrinas, su ligando natural.

1.3. Liposomas

Para la transferencia génica dirigida, los liposomas ocomplejos lípido-ADN convencionales tienen la desven-taja de ser eliminados fácilmente por células del sistemareticuloendotelial, particularmente macrófagos residen-tes en hígado, bazo y médula ósea. Dicha interacción conel sistema reticuloendotelial se puede retrasar conside-rablemente, aunque no eliminar, utilizando liposomas lla-mados stealth que incluyen sustancias cargadas negativa-mente, como gangliósido GM1 o polietilenglicol.

Asimismo, se están estudiando diferentes sistemaspara dirigir los liposomas hacia tipos celulares específi-cos. El acoplamiento de anticuerpos a los liposomas (in-munoliposomas) puede determinar especificidades dife-rentes dependiendo del anticuerpo incorporado. Porejemplo, se ha observado que acoplando a liposomas unanticuerpo contra células de glioma, se puede incremen-tar hasta siete veces la eficiencia de transferencia génicaa dichas células en cultivo. Se pueden conjugar tambiéna liposomas otros ligandos, como factores de crecimientoy hormonas. La inyección intravenosa de liposomas con-jugados con transferrina a un modelo animal de conejodio como resultado una localización del transgén en eri-troblastos de médula ósea.

Sin embargo, no es suficiente dotar al vector de unacapacidad de unión específica; el liposoma debe contenerun ligando que posibilite su fusión con las membranas ce-lulares, puesto que el ADN debe llegar intacto hasta elnúcleo. La incorporación de glucoproteínas víricas desuperficie a liposomas podría crear un sistema de trans-ferencia génica con las propiedades de unión e interiori-zación eficientes propias de los virus, pero sin las des-ventajas de éstos en cuanto a seguridad. Estudios en dichaárea están desarrollando un sistema para dirigir liposo-mas al epitelio respiratorio mediante su conjugación aproteínas de superficie del virus respiratorio sincitial, res-ponsable de infecciones en las vías respiratorias.

1.4. Conjugados moleculares

La conjugación de un plásmido a un determinado li-gando con afinidad por un tejido o tipo celular puede pro-porcionar especificidad de unión. Ello se consigue me-diante la unión covalente de un policatión como polilisinaal ligando. Posteriormente, el policatión se une al ADNy lo condensa mediante interacciones electrostáticas, ex-poniendo el ligando en la superficie del conjugado. Sinembargo, el sistema resultante es muy ineficiente ya quela mayoría de procesos de endocitosis mediada por re-ceptores dirigen los conjugados a los lisosomas, donde lamayor parte del ADN resulta degradado.

Recientemente se ha desarrollado una nueva genera-ción de conjugados moleculares. Mediante la unión de losadenovirus al conjugado se puede crear un vector muyeficiente gracias a la capacidad de las proteínas adenoví-ricas de romper el endosoma antes que el vector sea de-


gradado. Sin embargo, este proceso elimina la especifici-dad de unión conferida por el ligando, ya que el complejopuede penetrar las células tanto mediante interacción conel receptor del ligando como con el receptor adenovírico,que se encuentra ampliamente distribuido. Para dotar deespecificidad a dichos complejos, será necesario utilizarcápsidas adenovíricas modificadas, que mantengan el me-canismo de escape lisosómico, pero que no puedan inter-accionar con el receptor adenovírico. Aun así, es pocoprobable que dichos complejos puedan aplicarse para te-rapia génica in vivo fundamentalmente debido al tamañodel complejo (los conjugados transferrina-policatión tie-nen aproximadamente un diámetro de 100 nm; en com-plejos con adenovirus serían incluso mayores) que impidesu penetración en los tejidos y a la potencial inmunoge-nicidad de las proteínas del adenovirus.

2. Transferencia génica modulada

2.1. Restricción a nivel transcripcional

Otra forma de conseguir que los vectores actuales deterapia génica adquieran especificidad es limitar, a niveltranscripcional, la expresión del gen terapéutico a deter-minados tejidos diana.

Una expresión génica regulada correctamente puedeincluir, además de la secuencia promotora, elementos dis-tantes situados en posición 5' o 3' de la región codifica-dora. Dichos elementos, que ya se han identificado paravarios genes, actúan junto con el promotor y permiten laexpresión específica en un determinado tejido a nivelesadecuados, independientemente del sitio de integracióndel transgén. Sin embargo, la utilización de dichos mó-dulos transcripcionales para terapia génica in vivo resul-taría problemática debido a su considerable tamaño, porlo que actualmente su uso está restringido para estrate-gias ex vivo.

Cuando un déficit monogénico produce una enferme-dad que se manifiesta en más de un tejido, la estrategiamás utilizada para limitar adecuadamente la expresióndel ADN complementario terapéutico radica en el uso delos propios elementos celulares de promotor/aumentadorque presenta el gen defectuoso. Dichos elementos se ac-tivan solamente si existen factores de transcripción nu-cleares específicos del tejido o tejidos diana. Además, eluso de promotores celulares, al contrario que los víricos,reduce la probabilidad de que se produzca una pérdidade expresión del ADN complementario debido a inacti-vación de las secuencias por metilación u otros mecanis-mos. Por lo tanto, con los promotores celulares se puedeobtener expresión a largo plazo, restringida a determi-nados tejidos. Por ejemplo, se ha utilizado el promotorde la creatín-cinasa en un plásmido junto con el ADNcomplementario de la distrofina, para restringir la ex-presión de este gen a músculo esquelético y cardíaco.Además, en ratones mdx (modelo murino para la distro-fia muscular de Duchenne), transgénicos para dicho plás-

mido, se observó la corrección de los síntomas distró-ficos.

2.2. Regulación intracelular

Para controlar a voluntad la actividad de un gen tera-péutico, no a nivel tisular sino a nivel intracelular, se haintroducido la utilización de fármacos o ligandos peque-ños cuya administración o eliminación pueda provocar laexpresión génica. Un ejemplo de este tipo de sistemases el formado a partir de un activador transcripcionalhíbrido, que comprende el dominio de unión de ADNGAL4 de levadura fusionado al dominio activador VP16del virus del herpes simple y a un dominio de unión mu-tante del receptor de progesterona. Dicho sistema mues-tra elevada afinidad por RU486, un antagonista de laprogesterona. Se ha demostrado que la capacidad de ac-tivación transcripcional de la proteína híbrida GAL4-VP16 es reversible y depende de la presencia de RU486a concentraciones inferiores a las necesarias para inhibirla acción de la progesterona in vivo.

3. Cromosomas mamíferos artificiales

La expresión génica estable a partir de elementos ex-tracromosómicos se limita actualmente al uso de plásmi-dos incorporados a células quiescentes y los niveles deexpresión se establecen en dichos plásmidos por incor-poración de elementos reguladores transcripcionales ypostranscripcionales. El desarrollo de elementos extra-cromosómicos estables y con capacidad de replicación esun área de investigación con considerable potencial en elfuturo. Los cromosomas mamíferos artificiales (MAC)que contienen como elementos funcionales esenciales elcentrómero (secuencia central de los cromosomas, queforma una estructura para unirse a los microtúbulos en elproceso de división celular), los telómeros (secuencias fi-nales de los cromosomas) y el origen de replicación pue-den transformarse en vectores no víricos de interés. Sinembargo, hasta el momento solamente se han caracteri-zado con detalle los telómeros mamíferos y no se avan-zará en este campo hasta que los centrómeros y losorígenes de replicación se caractericen y puedan mani-pularse.

II. ESTUDIOS DE TRANSFERENCIAGÉNICA. ENSAYOS PRECLÍNICOSY CLÍNICOS

1. Estudios de marcaje

El marcaje genético de células hemopoyéticas no pro-duce un beneficio inmediato a los pacientes, pero la in-formación obtenida de dichos estudios ayuda a mejorarlos resultados de terapias que emplean el trasplante deprecursores hemopoyéticos (HSC) con el fin de erradi-


car tumores. También ayuda a conocer con mayor pro-fundidad la biología de los HSC y a mejorar la eficienciade la transferencia y expresión génicas.

1.1. Marcaje de linfocitos infiltradores de tumores

El marcaje de linfocitos aislados de tumores sólidos(TIL) fue el primer experimento de transferencia génicaa seres humanos aprobado en Estados Unidos en 1989.En dicho experimento se marcaron ex vivo TIL aisladosde pacientes con cáncer en estadios avanzados mediantetransducción con un vector retrovírico que contenía elgen de la resistencia a la neomicina (neo) como marca-dor selectivo y se reinfundieron al paciente. Los resulta-dos obtenidos demostraron que las células manipuladaspodían ser devueltas al paciente sin ningún riesgo y pos-teriormente se podían detectar in vivo.

1.2. Marcaje de células hemopoyéticas

Para diferentes enfermedades malignas, la recupera-ción de precursores hemopoyéticos puede mejorar la es-peranza de vida de los pacientes sometidos a radiotera-pia o quimioterapia. Sin embargo, la recidiva es la causaprincipal por la cual dicho tratamiento suele ser ineficaz.La posibilidad de que las células reinfundidas al pacientepudieran contribuir a la recidiva condujo a una evalua-ción exhaustiva de las técnicas utilizadas para «limpiar»la médula ósea con el fin de eliminar las células malignas.Ello se realizó marcando la médula ósea recogida del pa-ciente y analizando posteriormente la presencia del genmarcador en células malignas cuando se producía la re-cidiva.

Dichos estudios empezaron en 1991 e incluían pacientes con leu-cemia mieloide aguda y con neuroblastoma. La médula ósea de dichospacientes se transdujo ex vivo con vectores retrovíricos análogos a losempleados en el estudio de marcaje de TIL. Los datos recogidos de-mostraron que la médula ósea obtenida después de los tratamientosde «limpieza» puede contener aún células tumorales residuales quecontribuyen a la recidiva de la enfermedad. Así pues, será necesariomejorar los métodos de «limpieza» para mayor eficiencia en el tras-plante autólogo de médula ósea. Asimismo, otros estudios de marcajepara analizar la causa de la recidiva en la leucemia aguda, cáncer demama y mieloma no han mostrado hasta el momento recidivas en lasque se encuentre células hemopoyéticas marcadas con el gen neo, pro-bablemente porque las técnicas actuales de marcaje aún son inefi-cientes.

Actualmente existe mayor interés en los estudios de marcaje conretrovirus para analizar la eficiencia de transducción de las célulashemopoyéticas precursoras antes de utilizarlas para trasplante. Es-tudios en la población infantil han demostrado que el gen marcadorneo se detecta en el 2-15 % de las células precursoras después deltrasplante autólogo de médula ósea y se expresa durante más de3 años en la población hemopoyética descendiente. Dichos experi-mentos de marcaje permitirán valorar el efecto de la administraciónde factores de crecimiento sobre la capacidad de colonización de lascélulas hemopoyéticas precursoras a corto y largo plazo, y sobre sutransducibilidad. Asimismo servirán para identificar fenotípicamentea dichas células con el fin de estudiar con mayor profundidad su bio-logía.

2. Estudios terapéuticos

2.1. Enfermedades genéticas clásicas

De la multitud de enfermedades genéticas que se handescrito para las cuales no existen actualmente tratamien-tos satisfactorios, sólo unas pocas han sido seleccionadaspara ensayos clínicos de terapia génica. Entre ellas se en-cuentran enfermedades que afectan a células hemopoyé-ticas, como el déficit de adenosín-desaminasa y la enfer-medad de Gaucher; enfermedades que afectan el hígado,como la hipercolesterolemia familiar, y enfermedades queafectan el pulmón, como la fibrosis quística (tabla 76-2).

a) Deficiencia de adenosín-desaminasa

La deficiencia de adenosín-desaminasa (ADA) es unaenfermedad genética poco frecuente en la que los niñosafectados carecen de esta enzima necesaria para la fun-ción normal de su sistema inmunitario.

En septiembre de 1990, una niña de 4 años que sufríadeficiencia de ADA recibió una infusión de sus propioslinfocitos T que habían sido manipulados ex vivo para in-troducirles una copia normal del gen de la ADA. Se es-cogió esta deficiencia de ADA como la primera enfer-medad susceptible para terapia génica por varias razones:a) el gen había sido clonado y su correspondiente ADNcomplementario era del tamaño adecuado para insertarsefácilmente en un vector retrovírico; b) estudios previosde trasplante de médula ósea sugerían que solamente eranecesario corregir los linfocitos T para curar la enferme-dad; c) la cantidad de enzima necesaria para mantener lafunción del sistema inmunológico en determinados casospuede ser el 5-10 % del nivel normal, y d) las células Tcorregidas tienen una ventaja selectiva sobre las célulasdeficientes en ADA.

A partir de dicho protocolo se demostró que los linfo-citos de un paciente con inmunodeficiencia se pueden ais-lar, pueden crecer en el laboratorio, manipularse genéti-camente y ser devueltos al propio paciente sin mayorriesgo (fig. 76-4). Los dos primeros pacientes han res-pondido positivamente a la terapia. El número total delinfocitos en su sangre ascendió a niveles normales y enel primer niño tratado la cantidad de enzima ADA en suslinfocitos T ascendió hasta el 25 % de los niveles norma-les. Además, durante una pausa de 6 meses y medio ensu tratamiento, tanto el número de linfocitos manipula-dos genéticamente como los niveles de enzima ADA semantuvieron constantes. Ello sugería que la vida mediade los linfocitos corregidos era mayor de 6 meses y me-dio, y que dichos linfocitos proliferaban creando un nivelterapéutico de células corregidas. Sin embargo, es posi-ble que las pocas células T corregidas no abarquen com-pletamente el repertorio de un sistema inmunitario nor-mal, por lo cual se ha iniciado ya una modificación alanterior protocolo en que células hemopoyéticas precur-soras de sangre periférica se modifican mediante trans-


ducción con el mismo vector retrovírico empleado en elprimer protocolo, para proporcionar una protección ex-traordinaria al sistema inmunitario del paciente.

b) Enfermedad de Gaucher

Está causada por una deficiencia de la enzima lisosó-mica glucocerebrosidasa, que hidroliza glucosilceramidaen ceramida y glucosa. La acumulación de dicho glucolí-pido se produce principalmente en los macrófagos del sis-tema reticuloendotelial, lo cual produce esplenomegalia,lesiones dolorosas en los huesos y en determinados ca-sos lesiones neurológicas. Esporádicamente se ha utili-zado con éxito el trasplante alogénico de médula óseacomo modalidad terapéutica. Al igual que para la defi-

Tabla 76-2. Enfermedades con protocolos apr

Enfermedad Gen o secuencia transferida

Enfermedades hereditariasEnfisema familiarEnfermedad granuloma-

tosa crónicaFibrosis quística

Hipercolesterolemia fami-liar

Anemia de Fanconi

Enfermedad de Gaucher

Síndrome de HunterInmunodeficiencia combi-

nada grave

Enfermedades adquiridasVirus del sida

Enfermedad de las arteriasperiféricas

Artritis reumatoidea

Cáncer

a1-Antitripsinap47PHOX (oxidasa)

CFTR

Receptor de lipoproteínas debaja densidad

Gen de complementación delgrupo C

Glucocerebrosidasa

Iduronato-2-sulfatasaAdenosín-desaminasa

Ribozimas y sondas antisen-tido contra el virus del sida

Factor de angiogénesis tu-moral

Antagonista del receptor deIL-1

Genes supresores de tumores

VHS-timidín-cinasa/ganci-clovir

ARN antisentido contrac-fos- y c-myc

Gen MDR1Factor de necrosis tumoral

Cofactor B7HLA-B7

Citocinas

Interferón g

CFTR: proteína reguladora transmembrana de conductancia de la fibrosis quística

ciencia de ADA, conocer la secuencia de ADN comple-mentario del gen que codifica la glucocerebrosidasa y elhecho de que el principal tipo celular afectado derive delsistema hemopoyético, ha llevado a proponer a la terapiagénica ex vivo utilizando vectores retrovíricos como tra-tamiento alternativo. En este caso, las células diana sontambién las células hemopoyéticas precursoras con capa-cidad de producir macrófagos corregidos en el paciente.

c) Hipercolesterolemia

En la hipercolesterolemia familiar hay un defecto en unade las proteínas principales implicadas en el metabolismodel colesterol, el receptor de lipoproteínas de baja densi-dad (LDL) (v. cap. 55). El principal órgano responsable de

obados para ensayos clínicos de terapia génica

Órgano o células diana Vectores

Vías respiratoriasCélulas mieloides

Vías respiratorias

Hepatocitos

Células precursoras hemopo-yéticas

Células precursoras hemopo-yéticas

LinfocitosLinfocitos

Linfocitos

Células endoteliales

Células sinoviales

Carcinomas de hígado, pul-món, etc.

Tumores cerebrales y de ova-rios

Cáncer de mama

Células hemopoyéticasLinfocitos infiltradores de tu-

moresMelanomaMelanoma (HLA-B7 nega-

tivo)Tumores de pulmón, prós-

tata, colon, etc.Melanoma maligno

LiposomasRetrovíricos

Basados en el adenovirus aso-ciado, adenovíricos y lipo-somas

Retrovíricos

Retrovíricos

Retrovíricos

RetrovíricosRetrovíricos

Retrovíricos

Plásmidos (ADN purificado)

Retrovíricos

Retrovíricos y adenovíricos

Retrovíricos y adenovíricos

Retrovíricos

RetrovíricosRetrovíricos

RetrovíricosLiposomas

Retrovíricos y liposomas

Liposomas

.


la síntesis del receptor de LDL es el hígado. Los individuosafectados por dicha enfermedad genética tienen niveles ex-tremadamente elevados de colesterol, lo cual predisponea enfermedades cardiovasculares prematuras.

Para tratar a individuos con esta deficiencia se ha ini-ciado un programa de terapia génica ex vivo en que se rea-liza una lobectomía hepática a los pacientes. El lóbuloextraído se procesa con colagenasa para obtener los he-patocitos deficientes, que se transducen mediante un vec-tor retrovírico que contiene el gen del receptor de LDL.Finalmente, los hepatocitos transducidos se devuelven alpaciente mediante inyección en el bazo y/o la vena porta.Los hepatocitos corregidos tienen la capacidad de elimi-nar el colesterol de la sangre, lo cual ayuda a prevenir laprogresión de la enfermedad cardiovascular. Dicho pro-cedimiento había sido realizado previamente con éxitoen un modelo animal de la enfermedad, el conejo hiper-lipidémico Watanabe. Estudios aún en fase experimen-tal están evaluando la eficiencia de otros sistemas detransferencia, como la terapia génica in vivo mediante re-trovirus o adenovirus recombinantes.

Extracción sang

Aféresis(separación celular)

Linfocitos o célulashemopoyéticas precursorasdel paciente

Retrovirusrecombinante

Fig. 76-4. Terapia génica ex vivo para el tratamiento de enfermyéticas se extraen a partir de sangre o médula ósea del paciente. Dquecer a la población de interés, las células resultantes se tratan co

nalmente, las células corregidas se reintroduce

d) Fibrosis quística

Siendo la enfermedad genética más común entre la po-blación de raza blanca, la fibrosis quística se caracterizapor un defecto en la estimulación de la secreción de clo-ruros en el epitelio pulmonar debido a la alteración deuna proteína reguladora transmembrana de conductan-cia de la fibrosis quística (CFTR) (v. cap. 43). Ello pro-voca infecciones pulmonares frecuentes, que pueden lle-gar a ser letales.

Para el tratamiento de esta enfermedad se ha consi-derado principalmente la terapia génica in vivo. Se ha de-mostrado la capacidad de los vectores adenovíricos paraintroducir genes en el epitelio pulmonar de modelos ani-males y ello ha promovido el inicio de ensayos clínicospara pacientes con fibrosis quística. Asimismo, se han ini-ciado ensayos clínicos utilizando transferencia génica porliposomas. Dado que ambas técnicas tienen como limita-ción el hecho de que la expresión génica es solamentetransitoria, será importante evaluar las consecuencias desu uso repetido.

uínea

Transfusión de células queexpresan el gen terapéutico

edades que afectan células hemopoyéticas. Las células hemopo-espués de ser sometidas a un proceso de purificación para enri-

n retrovirus recombinantes que contienen el gen terapéutico. Fi-n al paciente mediante transfusión sanguínea.


2.2. Enfermedades de coagulación y otrasenfermedades que implicanla circulación sanguínea

En estudios preclínicos se ha estudiado el desarrollode métodos para aportar productos génicos a la circula-ción sanguínea. Se han realizado diversos estudios detransducción de tejidos primarios, como queratinocitos,mioblastos y fibroblastos. Algunos de estos experimen-tos han indicado que es posible la expresión génica a largoplazo in vivo después de trasplantar las células transdu-cidas ex vivo.

En el caso de los queratinocitos, se han utilizado sa-tisfactoriamente vectores retrovíricos y métodos de tras-plante establecidos, aunque ningún producto génico ex-presado por dichos vectores se secretó a la circulacióndurante largo tiempo.

Experimentos con mioblastos y fibroblastos han de-mostrado expresión génica prolongada después de sutrasplante. Para el tratamiento de la hemofilia B, despuésde inyectar por vía intramuscular mioblastos primariostransducidos con el gen que codifica al factor de coagu-lación IX humano, dicha proteína fue sintetizada efi-cientemente y excretada a la circulación durante más de6 meses. En cuanto a los fibroblastos, se ha conseguidola expresión de b-glucuronidasa durante más de 5 mesesy la corrección del defecto de acumulación lisosómica enratones deficientes en dicha enzima. Sin embargo, en am-bos estudios se tuvo que utilizar vectores que conteníanpromotores no víricos, ya que las regiones promotoras ví-ricas (LTR) resultaron inactivas.

2.3. Neuropatías

Es muy probable que pronto se establezcan terapiasgénicas para varias enfermedades y lesiones del sistemanervioso central. Entre los estudios actuales de terapiagénica para corregir neuropatías destacan los trasplantesde células manipuladas ex vivo.

Es probable que los injertos de células modificadasgenéticamente para sintetizar y secretar factores trófi-cos o trópicos, o para producir componentes de vías neu-rotransmisoras, puedan mejorar disfunciones neurona-les, incluso en caso de que se desconozcan las causasgenéticas. Las enfermedades neurodegenerativas foca-les o los déficit neurológicos globales, como la enfer-medad de Alzheimer o la de Parkinson, son claras can-didatas para este tipo de terapia génica. Por ejemplo, esposible generar una rata modelo de la enfermedad deParkinson mediante inducción de una degeneraciónde la vía dopaminérgica nigrostriatal mediante la neu-rotoxina 6-hidroxidopamina. En dicho modelo se pue-den reconstituir durante un tiempo prolongado algunasde las funciones normales de dicha vía y, por lo tanto, elcomportamiento anormal de la rata, mediante injertosde fibroblastos o mioblastos modificados para producirdopamina.

Sin embargo, uno de los objetivos principales en el de-sarrollo de terapias génicas para neuropatías es la admi-nistración directa, in vivo, del material genético a las cé-lulas del sistema nervioso central. Existen dos obstáculospropios del cerebro que dificultan la transferencia génica:la barrera hematoencefálica y el hecho de que la mayo-ría de las células diana, por tratarse de neuronas posmi-tóticas, no puedan ser transducidas por vectores retro-víricos. Por lo tanto, se están analizando otros sistemasvíricos que sean eficientes y capaces de infectar célulasquiescentes, como los vectores basados en el virus delherpes, vectores adenovíricos y vectores basados en losadenovirus asociados. Muy recientemente se ha produ-cido un vector retrovírico basado en el virus del sida, dela familia de los lentivirus, capaz de transducir e integrarel transgén de manera estable en neuronas del sistemanervioso central.

2.4. Enfermedades infecciosas:el sida como modelo

Actualmente se están explorando dos estrategias dife-rentes para el tratamiento de enfermedades infecciosas,aunque ambas emplean células manipuladas genética-mente. La primera, denominada inmunización intracelu-lar, está enfocada a conferir resistencia a la replicaciónvírica y a limitar la propagación del virus en el individuoinfectado. La segunda estrategia es inmunológica, enca-minada a aumentar la inmunidad antivírica utilizando cé-lulas modificadas genéticamente para expresar proteínasvíricas con el fin de provocar una respuesta celular in-munitaria, antivírica.

Un candidato obvio para tratamiento mediante inmu-nización intracelular es el sida. Puesto que el virus de lainmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológicocausante del sida, infecta células hemopoyéticas, la in-serción de genes de resistencia a dichas células podría re-ducir o incluso eliminar la propagación del virus en el or-ganismo. Los genes de resistencia específicos para VIHtendrían que satisfacer tres criterios: a) tendrían que serefectivos, b) tendrían que carecer de toxicidad y c) su fun-ción no debería afectarse por variaciones (p. ej., muta-ciones) en el VIH.

Se ha propuesto un gran número de estrategias para disminuir la re-plicación del VIH utilizando inhibidores basados en ARN o inhibido-res proteicos. Actualmente, dichos genes de resistencia se evalúan porsu capacidad para inhibir la replicación del VIH cuando se transducende manera estable a líneas de linfocitos T humanos (CEM, Jurkat, etc.).Los inhibidores basados en ARN son menos inmunogénicos, se puedenexpresar a niveles más elevados y suelen ser más específicos. Los másutilizados son las sondas antisentido y los ribozimas. Otra aproxima-ción para inhibir la replicación del VIH implica la expresión de proteí-nas VIH alteradas que tengan un fenotipo transdominante, como lasformas mutantes de gag, rev, tat y env. Varios estudios han demostradola eficiencia de una forma mutante de env al proteger células T de la re-plicación del VIH. Se ha descrito también la expresión intracelular deanticuerpos específicos para la envuelta del VIH.

Para la transferencia de los genes de resistencia vírica a células he-mopoyéticas se emplean los vectores retrovíricos, aunque su eficiencia


aún es baja en dichas células y además se requiere división celular parasu integración. Se están analizando también otros sistemas de transfe-rencia génica, como los vectores basados en el adenovirus asociado.

El sistema inmunitario es un mecanismo de defensa extraordinarioque limita la propagación de agentes infecciosos en el organismo. Lascélulas T citotóxicas (CTL) son capaces de reconocer patógenos intra-celulares y eliminar las células infectadas. Por lo tanto, dichas célulasserán particularmente efectivas en el control de enfermedades infec-ciosas que tienen una fase crónica, como el sida. Actualmente se estándesarrollando estrategias para activar y aumentar respuestas de CTL alVIH utilizando vacunas generadas mediante ingeniería genética, queconsisten en fibroblastos autólogos transducidos ex vivo con vectoresretrovíricos que expresan proteínas del VIH como env o gag.

2.5. Cáncer

Durante los últimos años se han producido avances sig-nificativos en el conocimiento de las bases genéticas delcáncer, lo cual ofrece nuevas oportunidades para su pre-vención y tratamiento. Existe hoy la posibilidad de em-plear la terapia génica para tratar y destruir selectiva-mente las células tumorales. La mayoría de los ensayosclínicos de terapia génica que han sido aprobados hastala fecha están dirigidos al tratamiento de diferentes for-mas de cáncer. Ello es debido a: a) la situación clínica «in-curable» de gran número de pacientes, b) los recursosdisponibles para la investigación del cáncer y c) investi-gaciones en modelos animales sugieren que un mismo genpodría resultar útil para varios tipos de cáncer. Existenbásicamente cuatro categorías de terapia génica contra elcáncer que se han aprobado para ensayos clínicos, quepueden catalogarse dentro de la inmunoterapia o de laterapia génica correctiva (tabla 76-2).

a) Modificación de la respuesta inmunitariaantitumoral del paciente

Ello se realiza mediante la inserción del gen que codi-fica la citocina IL-2 o de un gen de histocompatibilidad(HLA-B7) en las células tumorales del propio paciente.La introducción de estos moduladores inmunológicos es-timulará el sistema inmunitario del paciente a identificary destruir células tumorales.

El primer protocolo aprobado para terapia génica delcáncer insertó al gen que codifica el factor de necrosis tu-moral (TNF-a) en linfocitos infiltradores de tumor (TIL)para aumentar su actividad antitumoral. En el protocoloclínico, los linfocitos transducidos ex vivo con un vectorretrovírico se reinfunden a pacientes con melanoma me-tastásico avanzado. Un segundo protocolo comporta in-munizaciones con células tumorales autólogas transduci-das con el gen TNF-a (vacunas autólogas).

Para producir dichas vacunas, se están incluyendo tam-bién en ensayos clínicos genes que codifican otras citoci-nas, introducidos en las células tumorales mediante vec-tores retrovíricos. Otros genes que codifican proteínasexógenas de histocompatibilidad y b2-microglobulina,transferidos mediante complejos liposoma-ADN se hanutilizado para modificar tumores in situ con el fin de au-mentar la respuesta inmunitaria antitumoral (fig. 76-5).

b) Modificación de la médula óseapara quimioprotección

Esta categoría implica la modificación de la médulaósea del paciente para protegerla de los tratamientos dequimioterapia. Uno de estos protocolos utiliza el gen dela resistencia a múltiples drogas (MDR1) transducido amédula ósea para incrementar su tolerancia a fármacosutilizados comúnmente en quimioterapia, como vincris-tina, adriamicina y taxol, que muestran elevada toxicidaden dicho tejido. La posibilidad de utilizar dosis más ele-vadas de taxol en cáncer de mama y de ovario puede me-jorar las respuestas a dicho tratamiento quimioterapéu-tico. Como los fármacos pueden resultar tóxicos paravarios órganos cuando se administran a dosis elevadas (p.ej., el taxol es neurotóxico), será necesario proteger a másde un tejido del efecto tóxico del fármaco.

c) Manipulación de oncogenes y antioncogenes

El primer ensayo clínico que ha utilizado dicha estra-tegia ha sido la inserción del gen supresor de tumores,p53, y la inserción de una sonda antisentido contra el on-cogén K-ras, para tratar el cáncer de pulmón. Las dos se-cuencias se introdujeron en el tumor mediante vectoresretrovíricos. La inserción del gen p53 en las células ma-lignas, que tenían el suyo propio inactivado, podría su-primir el fenotipo del tumor o provocar apoptosis (muertecelular). En dicho ensayo clínico, la tecnología antisen-tido dirigida contra K-ras se ha utilizado para inhibir laexpresión de dicho oncogén.

Para ser efectiva, esta forma de terapia antitumoral ne-cesita una elevada eficiencia de transferencia y expresiónde las secuencias introducidas. Una cuestión importantea la que pueden responder estos ensayos clínicos es si lascélulas tumorales alteradas genéticamente podrán ad-quirir resistencia a los genes introducidos. Muchos tu-mores que provienen de mutaciones múltiples en célulassomáticas tienen un alto grado de inestabilidad, que po-dría anular los efectos antitumorales del gen introducidoal provocarle deleciones, reordenamientos, etc.

d) Protocolos enzima/profármaco

La terapia génica enzima/profármaco ataca las célulastumorales basándose en la incorporación preferencial,mediante vectores retrovíricos, de genes suicidas queconfieren sensibilidad a un determinado fármaco. Ac-tualmente, todos los ensayos clínicos aprobados, entre losque se encuentra el tratamiento de tumores cerebrales invivo, se basan en el sistema de la timidín-cinasa del virusdel herpes simple (HS-tk) asociada al profármaco ganci-clovir (GCV), antivírico estudiado en el capítulo 71.

La cinasa codificada por el gen HS-tk convierte al pro-fármaco no tóxico GCV en una toxina metabólica que in-hibe la polimerasa de ADN e impide la proliferación ce-lular (la timidín-cinasa humana tiene una afinidad muy


baja por el GCV y por lo tanto no provoca toxicidad). Lascélulas tumorales que han incorporado dicho gen mue-ren después de ser tratadas con GCV.

Una ventaja importante de dicho sistema es que notodas las células tumorales necesitan contener el genHS-tk para lograr la destrucción del tumor. Las célulastumorales que no contienen el gen terapéutico muerentambién durante el tratamiento con GCV debido a la exis-tencia de alguna célula transducida que sí lo contiene. Sedesconoce el mecanismo que provoca la muerte indirectade las células tumorales, aunque se ha denominado efectoadyacente.

Análogamente a otros tratamientos para terapia gé-nica del cáncer, es probable que aparezcan mecanismosde resistencia a la combinación enzima/profármaco. Porlo tanto, para que dicho tratamiento sea totalmente efec-tivo, será necesario emplear varios genes suicidas, o com-binaciones de genes suicidas y genes inmunomodulado-res. Actualmente se están desarrollando otros sistemasenzima/profármaco, como el de la citosín-desaminasa/5-fluorocitosina.

III. ESTADO ACTUALDE LA TERAPIA GÉNICA

1. Logros alcanzados en terapia génica

Probablemente, la conclusión más importante de losensayos clínicos de terapia génica hasta el momento es

Gen HLA-B7se transfiere alnúcleo de lascélulas tumorales

Célulatumoral

Inyecciónintratumoralde liposomas

Fig. 76-5. Terapia génica in vivo para el tratamiento de melanomel gen del antígeno de histocompatibilidad HLA-B7 se completa rectamente a las células tumorales para que expresen la proteína tema inmunitario del paciente como extraña. Ello deberá provoca

morales y producir una r

que la transferencia génica a seres humanos es factible.La mayoría de estudios han demostrado que los genespueden ser transferidos a individuos, tanto ex vivo comoin vivo, y que todos los vectores utilizados han funcio-nado como se esperaba. Además, varios estudios handemostrado que genes terapéuticos transferidos a sereshumanos mediante vectores retrovíricos, vectores ade-novíricos y complejos plásmido-liposoma, pueden pro-ducir respuestas biológicas a partir del producto génicoque generan. La mayoría de dichos estudios se han cen-trado en anomalías hereditarias monogénicas, donde elfenotipo biológico anormal podría corregirse si el pro-ducto génico normal se expresara de forma apropiada enel lugar adecuado.

La experiencia de los estudios de marcaje ha mostradoque la transferencia génica a seres humanos puede apor-tar conocimientos importantes de biología humana al ha-cer posible el seguimiento de células genéticamente mar-cadas en el individuo receptor. En este sentido, se haobservado que la contaminación de médula ósea autólogacon células tumorales es bastante común, por lo que es-tudios actuales se están centrando en mejorar los méto-dos de limpieza para eliminar totalmente dichas célulasmalignas. Otros estudios terapéuticos apoyan el conceptobiológico de que la corrección mínima de un genotipopuede tener consecuencias significativas en el fenotipo.

Finalmente, teniendo en cuenta el número total de in-dividuos que ha sido sometido a ensayos de transferen-cia génica, han sido muy pocos los efectos adversos. Ade-más, éstos principalmente han sido debidos a la dosis y a

Gen codificadordel antígeno dehistocompatibilidadHLA-B7

Liposomas

Células tumoralesexpresan la proteínaHLA-B7 y provocan unarespuesta inmunitariacontra el tumor

ProteínaHLA-B7

a. En dicho procedimiento, un vector de expresión que contienecon lípidos que forman liposomas. Los liposomas se inyectan di-HLA-B7 en su superficie celular, la cual es reconocida por el sis-r una respuesta inmunológica potente para destruir las células tu-ecidiva del melanoma.


la forma de administración de los vectores, como la in-ducción de inflamación en el epitelio pulmonar debido ala administración de vectores adenovíricos.

2. Dificultades actuales que limitan el éxitode la terapia génica

Algunos de los problemas surgidos en los ensayos deterapia génica son genéricos de dicha metodología, mien-tras que otros son específicos del vector de transferenciautilizado.

La mayoría de estudios de terapia o transferencia gé-nica se han visto afectados por resultados inconsistentes,con variaciones inexplicables entre individuos. Por ejem-plo, en los ensayos de fibrosis quística, vectores adenoví-ricos y complejos plásmido-liposoma pudieron transferirel gen CFTR al epitelio respiratorio, pero su expresión seprodujo solamente en menos del 5 % de las células dianay no se observó en todos los pacientes. Asimismo, en lamayoría de ensayos de marcaje de médula ósea realiza-dos ex vivo, la transferencia génica se observó de maneraintermitente.

También ha habido varios ejemplos en los cuales laspredicciones basadas en estudios de transferencia génicautilizando modelos animales no se han traducido en es-tudios seguros y eficaces aplicados a seres humanos. Porejemplo, en los estudios realizados con vacunas antitu-morales para intentar generar una respuesta inmunitariaantitumoral específica, no ha habido prueba concluyentede regresión de los tumores, contrariamente a los resul-tados obtenidos en modelos animales.

Asimismo, existen problemas en la producción de vec-tores que habría que resolver antes que se puedan iniciarensayos clínicos a gran escala. Se ha observado la gene-ración de vectores retrovíricos y adenovíricos capacesde replicación cuando se producen los respectivos stockspara aplicarse clínicamente. Además, la producción destocks de complejos plásmido-liposoma se ha visto afec-tada por falta de reproducibilidad, agregación y conta-minación con endotoxinas.

Finalmente, la experiencia clínica acumulada hasta lafecha sugiere que todos los vectores utilizados para tera-pia génica necesitan mejoras, aunque cada uno en parti-cular puede resultar relativamente adecuado para los te-jidos a los cuales se ha dirigido. Las características que sehan de mejorar en todos los vectores son: a) un incre-mento en la eficiencia de transferencia génica; b) un in-cremento en especificidad; c) la posibilidad de regulaciónde la expresión génica, y d) la posibilidad de producciónde grandes stocks de vector puro. Son también obstácu-los específicos del tipo de vector utilizado el riesgo de mu-tagénesis por inserción en vectores retrovíricos, la in-munidad e inflamación desarrolladas por los vectoresadenovíricos, y la ineficiencia de translocación del trans-gén al núcleo por los complejos plásmido-liposoma. Noserá posible encontrar el vector ideal, debido a la diver-sidad de aplicaciones humanas de transferencia génica;

para cada una de ellas, el vector ideal tendrá que ser di-ferente.

3. Perspectivas futuras

El proyecto del genoma humano proveerá alrededorde 100.000 genes que podrán incluirse en vectores de ex-presión para terapia génica. Por lo tanto, el futuro de di-cha terapia innovadora es prometedor.

Sin embargo, en la actualidad se ensaya mayoritaria-mente la terapia génica ex vivo. Este procedimiento uti-liza tecnologías muy especializadas y es demasiado caropara aplicarse rutinariamente en cualquier centro mé-dico. Para que la terapia génica humana tenga un impactoreal en el área de la salud, será necesario desarrollar vec-tores que puedan ser administrados con seguridad y efi-cacia directamente a los pacientes, tal y como se ha con-seguido con los fármacos actuales. El diseño de nuevosvectores (víricos, sintéticos o una combinación de ambos)comportará la posibilidad de actuar sobre tipos celularesespecíficos, la inserción o el mantenimiento de la infor-mación genética en un lugar seguro dentro del núcleo ce-lular y la regulación mediante estímulos fisiológicos.

Junto con los métodos de diagnóstico, la terapia génicatambién podrá aplicarse para prevenir estados patológi-cos al suministrar genes protectores antes que dichas en-fermedades se manifiesten.

Nos encontramos en un período de implantación y ex-perimentación clínica que incluye a más de 1.000 pacien-tes en todo el mundo, aunque todavía existen pocos re-sultados publicados. Conforme mejore la tecnología dela transferencia génica (hecho que se está produciendocon rapidez) y se entiendan mejor las características bio-lógicas causantes de los procesos patológicos, será posi-ble incorporar plenamente la terapia génica en la prác-tica clínica para el tratamiento de una gran variedad deenfermedades humanas.

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capitulo 76

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