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CAPÍTULO 3
MATERIALES Y MÉTODOS
En éste capítulo se especifican los materiales y el equipo utilizados en la presente
investigación y se describe la metodología seguida en las diversas etapas del
proceso de producción del plásmido pVAX1-NH36. En esta parte del texto se
establece la manera en que fue preparado el medio de cultivo y el inóculo para la
fermentación a escala laboratorio. Se reportan las condiciones de operación de
cada una de las corridas experimentales. Así mismo se explican las estrategias
empleadas para monitorear el crecimiento de la biomasa. Se detalla el
procedimiento de purificación del plásmido y finalmente, se define cómo fue
llevado a cabo el análisis por electroforesis.
3.1 Materiales
Se utilizó el plásmido pVAX1-NH36 de 4 kpb (Fig. 5) hospedado en la cepa E. coli
DH5α, misma que fue proporcionada por el Dr. Jaime Ortega López del Centro de
Investigación y de Estudios Avanzados de Instituto Politécnico Nacional
(CINVESTAV).
El medio de cultivo utilizado fue el Terrific Broth (TB) que contiene (g/L): extracto
de levadura, 24; triptona, 12; glicerol, 4 mL/L, KH2PO4 0.17 M y K2HPO4 0.72 M.
El antibiótico agregado fue sulfato de kanamicina (100µg/mL). El medio TB fue
modificado en una corrida. Esta modificación consistió en la utilización de 30 mL
de glicerol por litro de medio y los demás reactivos fueron usados en las mismas
cantidades. Todos los reactivos son de la marca Sigma-Aldrich®. En la
fermentación a escala laboratorio, se elaboraron soluciones de hidróxido de sodio
NaOH 4 N y ácido clorhídrico HCl 1 N, además se utilizaron 200 µL de la emulsión
antiespumante C de Sigma-Aldrich®.
La resuspensión de las células cosechadas se llevó a cabo en buffer TE (Tris 10
mM/EDTA 1 mM, pH=8.0). En su preparación se utilizó Trizma base grado
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molecular de Sigma® y ácido etilendiaminotetraacético de sodio dihidratado
(Na2EDTA·2H2O) de Fisher Scientifics®. En la preparación del buffer de lisis
(NaOH 0.09 M y SDS 1%) y de la solución de neutralización (CH3COOK 3.0 M,
pH=5.5), todos los reactivos fueron de Sigma-Aldrich®. Para la precipitación de
DNA se utilizó isopropanol grado biología molecular y para los lavados del
precipitado se usó etanol (70% v/v) ambos de Sigma-Aldrich®. Para su uso en
cromatografía se prepararon 2 buffers: el primero fue el Tris/HCl (Tris 10 mM/HCl
pH 8.0) con base Trizma base grado molecular de Sigma® y el otro
(NH4)2SO4/Tris/HCl ((NH4)2SO4 1.5 M en Tris 10 mM/ HCl pH=8.0) con sulfato de
amonio de Merck®. Además se utilizaron dos columnas empacadas con Phenyl
Sepharose 6 fast flow (High substitution) de Sigma®.
En el análisis de pureza del cultivo se empleó agar Nutritivo de BBLDifco®, cristal
violeta, lugol, alcohol, acetona y safranina de Difco®. En el análisis de estabilidad
del plásmido se preparó agua peptonada (g/L): peptona de carne, 10 y NaCl, 5.
Además se utilizó agar LB (g/L): triptona, 10; extracto de levadura, 5; NaCl, 5 y
agarosa, 15 de Sigma-Aldrich®.
Con el propósito de contar con una referencia, se empleó el kit MaxiPrep de
Sigma®, para purificar el plásmido de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
En la electroforesis se utilizó el buffer TAE (Tris 40 mM, CH3COOH 20 mM, EDTA
1 mM, pH=7.6), agarosa al 0.8% (w/v), azul de bromofenol 6X y bromuro de etidio
0.5 µg/ml, preparados con reactivos de Sigma-Aldrich®. También se hizo uso del
marcador Supercoiled DNA Ladder, de Invitrogen®.
Todos los buffers fueron filtrados con filtros de membrana de nitrocelulosa con
poro de 0.45 m de Millipore®. Estos filtros fueron utilizados, además, para filtrar
y secar las muestras con las que se elaboró la curva de peso seco.
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3.1.1 Equipo
Para pesar las sustancias necesarias para la preparación del medio de cultivo y
las soluciones, se empleó la balanza PB-S Mettler Toledo®.
En la preparación del inóculo se utilizó la Incubadora de Agitación Orbital modelo
1575 de VWR International®. El medio para el inóculo y para la fermentación a
escala laboratorio se esterilizó en la autoclave mod. FE-396 de Felisa®. Para los
estudios a nivel fermentador se usó un fermentador de 3 L marca Applikon® con
control de pH, T, OD, rpm y nivel, provisto de una consola de control ez-Control y
un software de operación BioXpert Lite 1.01 (Fig. 6).
El inóculo se alimentó al biorreactor con la bomba peristáltica modelo 7518-60 de
Cole-Palmer Instrument Company®. Con el objetivo de medir la absorbancia de
las muestras tomadas de la fermentación se utilizaron las celdas de cuarzo de 1
cm de ancho y 1.5 ml de capacidad de Hellman® y el Espectrofotómetro UV/VIS
Lambda 2S de Perkin Elmer®.
La cosecha celular, la remoción de impurezas del lisado, la recuperación del
precipitado, los lavados con etanol y la formación de una solución concentrada de
plásmido se llevaron a cabo en una centrífuga refrigerada BioFuge 17 R de
Baxter®. Para la etapa de purificación final se emplearon dos columnas
Econopack de Bio-Rad® de 1 cm de diámetro.
Figura 6. Sistema ez-Control para Reactores
Esterilizables de 3L de Applikon®
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La electroforesis en gel de agarosa se realizó en una Sub-celda GT de Bio-Rad® y
para mantener el voltaje constante una fuente de poder de la misma compañía.
Las muestras para realizar la curva de peso seco fueron secadas en una estufa
mod. 1350F de VWR International®.
Las tinciones Gram realizadas fueron observadas en un microscopio óptico Leica
ATC 2000.
3.2 Métodos
Los procedimientos realizados con el objeto de producir pVAX1-NH36 se
describen a continuación.
3.2.1 Fermentación
Las actividades relacionadas con la etapa de fermentación incluyen la
preparación del medio de cultivo, la preparación del inóculo, el establecimiento de
las estrategias de cultivo y la determinación del crecimiento celular.
3.2.1.1 Preparación del Medio de Cultivo
En las corridas uno y dos el medio utilizado fue el TB. En la corrida 3 se utilizó el
medio TB modificado. Se preparó la solución de compuestos orgánicos (triptona,
extracto de levadura y glicerol) y la solución de sales (fosfatos mono- y dibásicos
de potasio) en porcentajes (v/v) de 90 y 10, respectivamente. Las soluciones se
esterilizaron por separado, ya que estaban en sus respectivos contenedores del
sistema Applikon®, a una temperatura de 120°C durante 15 min. Las soluciones
se mezclaron cuando alcanzaron una temperatura de aproximadamente 40°C. Por
último, se le adicionó kanamicina (100 µg/ml).
3.2.1.2 Preparación del Inóculo
Se picaron dos colonias bacterianas de las placas donde fue sembrada, en agar
Luria-Bertani (LB) con kanamicina (50 µg/ml), la Escherichia coli DH5α hospedera
de pVAX1-NH36. Éstas sirvieron posteriormente para inocular tubos que
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contenían 2 mL de medio TB con kanamicina (50 µg/mL). En ambos casos, los
cultivos se incubaron de 10 a 12 horas a 37°C.
Para estudiar la curva de crecimiento se tomaron 100 µL de caldo del tubo y se
inocularon en matraces de 250 mL con 150 mL de medio TB. Cuando la curva
alcanzó la parte media de la fase exponencial se sustrajo caldo para hacer viales
de 10 mL con 15% (v/v) de glicerol. Finalmente, en la elaboración del inóculo para
la fermentación en el biorreactor Applikon®, se prepararon 140 mL de medio TB
que contenían 50 µg/mL de kanamicina y se colocaron en un matraz Erlenmeyer
de 500 mL, éste se inoculó con un vial de 10 mL para obtener un índice de masa
total (𝐼𝑀𝑡 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝐶𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜) de 25. Se incubó a 37°C con
una agitación de 250 rpm de 4.5 a 5 horas.
3.2.1.3 Condiciones de Operación y Control
La fermentación del pVAX1-NH36 hospedado en E. coli DH5se realizó en el
biorreactor Applikon® con capacidad de 3 L, con un volumen de trabajo de 2 L. El
armado, conexión y calibración del sensor de OD del mismo, se realizaron de
acuerdo a los protocolos del apéndice A.
Se llevaron a cabo tres fermentaciones a una temperatura de 37°C y un pH de 7,
el cual se mantuvo constante adicionando NaOH 4N y HCl 1 N. El porcentaje de
oxígeno disuelto (OD) se fijó en 30 y el flujo de aire alimentado se mantuvo en un
valor de 1 vvm.
La corrida 1 fue llevada a cabo con un sistema de control por retroalimentación
(RA) con parámetros fijos, con un control proporcional para el pH y un control
proporcional e integral para la temperatura.
Las corridas 2 y 3 se realizaron con el mismo sistema de control para las variables
del proceso (T y pH). Además en estos dos experimentos se empleó un sistema
de control por retroalimentación con parámetros fijos con múltiples actuadores,
con un control proporcional e integral del porcentaje de oxígeno disuelto en el
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cultivo. En nuestras dos últimas corridas experimentales utilizamos como único
actuador la velocidad de agitación con control proporcional.
3.2.1.4 Determinación del Crecimiento Celular
Con la finalidad de monitorear el crecimiento de la biomasa, así como evaluar el
crecimiento del plásmido, se elaboraron la curva de densidad óptica (DO) y la
curva de peso seco.
3.2.1.5 Curva de Densidad Óptica
Desde el inicio de la fermentación (t = 0) se tomaron muestras de 25 mL, cada
hora, para registrar la absorbancia del cultivo a una longitud de onda de 600 nm y
para obtener la curva de peso seco. La cuantificación de la absorbancia se utilizó
para calcular el volumen de muestra necesario para obtener un IMt = 25.
Se elaboró un gráfico de ABS vs tiempo y se determinó µ de acuerdo al modelo
logístico (Ec.1) (Shuler y Kargi, 2001):
𝑋 𝑡 =𝑋𝑜𝑒
𝜇𝑡
1 −𝑋𝑜
𝑋∞(1 − 𝑒𝜇𝑡 )
3.2.1.6 Curva de Peso Seco
Las muestras de 25 mL tomadas cada hora durante la fermentación, fueron
filtradas en Membranas de de Millipore y secadas dentro de cajas de Petri a 100°C
durante 30 min. Se construyó una gráfica de peso seco (g/L) contra tiempo y se
determinó el parámetro µ de acuerdo al modelo logístico.
𝑋 𝑡 =𝑋𝑜𝑒
𝜇𝑡
1 −𝑋𝑜
𝑋∞(1 − 𝑒𝜇𝑡 )
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3.2.2 Recuperación Primaria
En la recuperación primaria se realizaron la cosecha celular y la lisis alcalina.
3.2.2.1 Cosecha Celular
Las muestras con IMt=25 se cosecharon por centrifugación a 11400 rpm a 4°C
durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y se determinó el peso de las células
húmedas.
3.2.2.2 Lisis Alcalina
Las cosecha celular se resuspendió agregando 8 mL de buffer TE por cada gramo
de células. A esta suspensión se agregó un volumen igual de buffer de lisis y se
agitó suavemente por 5 min. La mezcla se quedó en reposo a temperatura
ambiente por otros 5 min. Pasado este tiempo, el lisado se neutralizó con el
mismo volumen de buffer de neutralización a 4°C. Se agitó brevemente de manera
delicada e inmediatamente después de incubó en hielo por 10 min.
La mezcla resultante se centrifugó a 11300 rpm (aprox. 14000 g) por 30 min a 4°C.
Se colectó el sobrenadante y se repitió esta última operación. Se midió el volumen
del sobrenadante.
3.2.3 Recuperación Intermedia
La etapa de recuperación intermedia está comprendida por la precipitación con
isopropanol del pDNA y la clarificación del sobrenadante con sulfato de amonio.
3.2.3.1 Precipitación con isopropanol
A cada volumen de lisado se le agregó 2-propanol en proporción 0.7 (vol.
isopropanol/vol. sobrenadante). Se incubó por dos horas a -20°C. Después de
este período de incubación, el precipitado formado se recuperó por centrifugación
a 10400 rpm (aprox. 12000 g) por 15 min a 4°C. A la pastilla formada se le agregó
1.0 mL de etanol al 70'% (v/v). Se resuspendió y centrifugó a 10400 rpm (12000 g
aprox.) por 15 min a 4°C. Esta operación se repitió una vez más en las mismas
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condiciones. El pellet fue secado al ambiente durante 5 a 10 min invertido sobre
papel, luego se colocó en una posición horizontal y se secó por 30 min.
3.2.3.2 Clarificación y Concentración con Sulfato de Amonio
Una vez seco el pellet, se resuspendió en 500 µL de buffer Tris. Con el objeto de
eliminar las proteínas contaminantes se agregaron 0.165 g de sulfato de amonio
sólido (para alcanzar una concentración 2.5 M en la solución). Se homogenizó
bien y se dejó reposar en hielo 15 min. Se centrifugó a 11400 rpm (aprox. 14000
g) a 4°C y se recuperó el sobrenadante.
3.2.4 Purificación Final
La etapa de purificación final del proceso base comprende las operaciones
cromatográficas de HIC y SEC (Fig. 7). Se llevó a a cabo con un método
estandarizado por Diogo y col., 2000.
3.2.4.1 Cromatografía HIC
Se empacó una columna Econopack de 1 cm de diámetro con 10 ml de Phenyl
Sepharose 6 fast flow (High substitution) de Sigma-Aldrich® y se le acopló una
válvula de salida. Se equilibró la columna por flujo con gravedad con 20 mL de una
Figura 7. Columnas EconoPack de BioRad empacadas con Phenyl Sepharose 6 fast flow (High substitution) de Sigma.
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solución (NH4)2SO4/Tris/HCl. Se cargó directamente a la columna la muestra de
0.5 ml de plásmido concentrado, se abrió ligeramente la válvula hasta que la
muestra penetró por completo en el lecho. Manteniendo la válvula cerrada, se
agregaron a la columna 3 mL de (NH4)2SO4/Tris/HCl. Se abrió la válvula y se
descartaron 3 mL. Manteniendo la válvula cerrada, se adicionaron 2mL de la
solución de (NH4)2SO4/Tris/HCl. Se abrió la válvula y se colectó la misma cantidad
alimentada que contiene el plásmido purificado. Para eluir las especies retenidas
se pasaron 20 mL de solución Tris/HCl. Por último, se reequilibró la columna con 2
volúmenes (NH4)2SO4/Tris/HCl.
3.2.4.2 Cromatografía SEC
Se empacó una columna Econopack de 1 cm de diámetro con 10 ml de Phenyl
Sepharose 6 fast flow (High substitution) de Sigma-Aldrich® y se le acopló una
válvula de salida. Se equilibró la columna con 20 mL de una solución de Tris/HCl
por flujo con gravedad. Los 2 ml de plásmido purificado por la columna de HIC
fueron alimentados a la columna de SEC manteniendo la válvula de salida
cerrada. Se abrió la válvula y se descartó una cantidad igual a la recién
adicionada. Con la válvula cerrada se le agregaron 1.5 mL de buffer Tris/HCl. Se
abrió la válvula y se descartó un volumen de 1.5 mL. Manteniendo la válvula de
salida cerrada se agregaron a la columna 3 mL de solución de Tris/HCl y se
recolectó el mismo volumen con el plásmido purificado. La columna fue lavada y
reequilibrada con 40 ml de buffer Tris/HCl.
Para guardar las columnas fueron lavadas con 5 volúmenes de NaOH 1.0 N y 5
volúmenes más de agua destilada, por último quedaron en una solución de etanol
al 20%.
Con el propósito de contar con una referencia, se empleó el kit MaxiPrep de
SIGMA, para purificar el plásmido de acuerdo a las indicaciones de fabricante.
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3.2.5 Control de Calidad
Se realizaron diversos análisis para verificar la pureza del cultivo. Así como
también para conocer la calidad del plásmido producido y su estabilidad en la cepa
hospedera. Por último, se evaluó el sistema de control utilizado en las
fermentaciones.
3.2.5.1 Análisis de Pureza del Cultivo
Se tomaron muestras de 1 mL al final de cada fermentación y se sembraron por
duplicado en placas con agar Nutritivo por el método de estría cruzada. Se
incubaron durante 10 a 12 horas a 37°C, y se hicieron preparaciones (tinción
Gram) de las colonias, para ser observadas al microscopio.
3.2.5.2 Análisis por Electroforesis
Con el objetivo de evaluar el estado del plásmido pVAX1-NH36, se realizó el
análisis por electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, con el buffer de
electroforesis TAE, buffer de carga 6X y un marcador de plásmido superenrollado
en Sub-celdas GT. Los geles se corrieron a 80 V durante una hora (Fig. 8). Estos
fueron teñidos en bromuro de etidio durante 40 min con agitación suave constante
y se lavaron en agua desionizada brevemente. Los geles fueron fotografiados bajo
luz UV en un documentador de geles de BioRad®.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa.
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3.2.5.3 Análisis de Estabilidad del Plásmido
A partir de caldo de fermentación conservado en glicerol al 15%, se hicieron cuatro
diluciones seriadas de 10 mL de volumen (1:1000, 1:10,000, 1:100,000,
1:1’000,000) usando como diluyente agua peptonada estéril. Seguido a esto, se
sembró un volumen de 0,1 mL de la suspensión celular en placas con agar Luria-
Bertani, con y sin antibiótico (50 µg de kanamicina /mL de caldo), teniendo el
cuidado de esparcir completamente el inóculo con una varilla metálica triangular,
previamente flameada con alcohol. El experimento se realizó por duplicado. Se
incubaron las placas de manera invertida a una temperatura de 37°C, durante 10-
12 hrs. Se contaron individualmente las UFC (unidades formadoras de colonias) y
se calculó una media, con lo que se determinó el porcentaje de viabilidad de
células transformadas respecto al número de UFC totales (media de
contabilización en placas sin kanamicina). Este experimento está basado en el
establecido por Camacho y col., 2009.
3.2.6 Evaluación del Sistema de Control
Con el objetivo de verificar el funcionamiento del sistema de control se determinó
la constante volumétrica de transferencia de masa (kLa).
3.2.6.1 Determinación del Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Masa (kLa)
Se agregaron al fermentador 2 L de agua desionizada y se mantuvo a una
temperatura constante de 37°C. Después se introdujo un flujo de nitrógeno
gaseoso, para simular el crecimiento celular y se agitó a 650 rpm hasta que el
porcentaje del OD llegaba a cero. A partir de ese momento, se cambió el punto de
consigna de la agitación al valor deseado de 100 rpm. Posteriormente se introdujo
el flujo de aire constante de 1 vvm hasta que el agua se saturara con oxígeno.
Este experimento se repitió para 250, 450, 650 y 1000 rpm.
En otra parte de este experimento se fijó el valor de la velocidad de agitación en
250 rpm y se introdujo un flujo de aire de 0.5 vvm
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Los datos del %OD y su variación en el tiempo, se capturaron con el software
BioXpert. Con estos se elaboraron gráficas de la concentración de O2 contra el
tiempo y la ecuación de la curva resultante está dada por la Ecuación 6.
𝑑𝐶𝐿
𝑑𝑡= 𝑘𝐿𝑎 𝐶
∗ − 𝐶𝐿 (6)
Se construyeron nuevas gráficas utilizando los datos de la fase logarítmica de las
curvas anteriores. La linealización de la Ecuación 6 fue el modelo que se ajustó a
estos datos. La pendiente de estas rectas es el coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno a las condiciones de agitación y flujo determinadas.
Se elaboró una gráfica de OTR (Ec. 2) y OUR (Ec. 3) contra %C* (porcentaje de
OD) y X (densidad de peso seco celular) respectivamente, para valores de kLa a
velocidad de agitación máxima utilizado en el sistema de control en las
fermentaciones por lotes de E. coli DH5α como hospedera de pVAX1-NH36, para
una velocidad de crecimiento típica de µ = 0.50 g/L-h según las tres
fermentaciones realizadas, una Xmax = 5 g de células/ L cultivo que fue el mayor
valor obtenido de las tres corridas experimentales, un Y x/o2 = 1 (Shuler y Kargi,
2002) y hasta %OD = 50.
𝑂𝑇𝑅 = 𝑘𝐿𝑎 𝐶∗ − 𝐶𝐿
𝑂𝑈𝑅 =𝜇𝑋
𝑌𝑋 𝑂2