rea de Enfermedades Infecciosas

2013

Trabajo prctico

Calidad de leche y diagnstico de

mastitis

Calidad de leche y diagnstico de mastitis

La mastitis es la respuesta inflamatoria de la glndula mamaria a infecciones microbianas principalmente, y otros agentes no infecciosos. Es probablemente la ms costosa de las enfermedades infecciosas endmicas que afecta a los bovinos y otras especies lecheras. Tiene impacto en la produccin animal, bienestar animal y en la salud pblica debido a la calidad de la leche producida.

De acuerdo con el grado de intensidad de la infeccin y la manifestacin de los signos clnicos, la mastitis se puede clasificar como clnica y subclnica.

Mastitis clnica: la infeccin puede provocar inflamacin de uno, varios cuartos o de toda la glndula, aumento de la temperatura en el rea afectada, as como enrojecimiento de la zona y dolor, por lo tanto, se observan anormalidades visibles en la ubre y/o en la leche con alteracin el color, presencia de sangre, grumos, pus, entre otros.

Mastitis subclnica: tanto la ubre como la leche tienen aspecto normal. Sin embargo, se observa disminucin en la produccin de leche, conteo elevado de clulas somticas y contenido de microorganismos en leche.

Mtodos de deteccin de la mastitis bovina

Diagnstico de Mastitis

Mientras se prepara la ubre para comenzar con el ordeo, se examinan los primeros chorros de leche. Este proceso comnmente se denomina despunte y permite la deteccin de leche clnicamente anormal, que presenta alteraciones en la coloracin, grumos, flculos y aspecto aguachento. En las salas de ordeo, donde el piso se puede enjuagar fcilmente con agua, estos chorros pueden observarse directamente sobre el piso de concreto o en el drenaje ubicado debajo del animal. Los grumos y flculos que se observan en la leche anormal son clulas somticas, fibrina y otros componentes de la sangre que se encuentran en el cuarto afectado para combatir la infeccin.

El diagnstico presuntivo de este tipo de mastitis se realiza mediante la observacin de los signos clnicos, confirmando el diagnstico mediante el aislamiento y la identificacin del patgeno involucrado.

PRUEBAS FSICAS

Estas pruebas slo son tiles en casos de mastitis clnicas y no detectan mastitis subclnicas.

Prueba del pao negro

Se realiza durante la preparacin de la vaca para el ordee. Consiste en la deteccin de grumos en la leche haciendo pasar los primeros chorros a travs de una malla negra.

Taza probadora (Strip cup)

Consiste en examinar los primeros chorros de leche de cada ordee al hacerlos caer sobre un recipiente de fondo (strip cup). Los cogulos, escamas, hilos, materia fibrosa, secreciones acuosas o color anormal indican alteraciones en la leche.

Referencias. Prueba de Strip cup al pie del animal. Obsrvese la presencia de cogulos.

Los mtodos diagnsticos de mastitis subclnicas, se basan en la deteccin de clulas somticas. Se define como clulas somticas aquellas clulas del propio organismo. Por tanto, las clulas somticas son clulas corporales. stas pasan a la leche procedente de la sangre y del tejido glandular. El contenido de clulas somticas en la leche nos permite conocer el estado funcional y de salud de la glndula mamaria en perodo lactante. Debido a su estrecha relacin con la composicin de la leche, es un criterio de calidad muy importante.

La leche de una ubre sana presenta pocas clulas somticas. En este caso se trata de clulas epiteliales de descamacin y clulas inmunes (neutrfilos polimorfonucleares, granulocitos, macrfagos, linfocitos). Estos dos tipos de clulas constituyen el conteo de clulas somticas (CCS) de la leche que comnmente es expresada por mililitros. El porcentaje de los diferentes tipos de clulas somticas en la leche de las glndulas mamarias sanas es: macrfagos (60%), linfocitos (25%), leucocitos polimorfonucleares (15%), mientras que en la

leche de un cuarto infectado aproximadamente el 99 % sern leucocitos y el restante 1% clulas secretoras que se originan de los tejidos de la ubre.

El CCS es la medicin ms ampliamente utilizada para supervisar el estado inflamatorio de las glndulas mamarias, y puede ser realizado en la leche de cada cuarto, de vacas o de la produccin lctea total del rodeo.

La infeccin intramamaria es el principal factor causante de cambios en la CCS en la leche. Cuando los microorganismos causantes de mastitis invaden un cuarto de la ubre, el sistema inmune responde con un proceso inflamatorio para combatir a dichos microorganismos causantes de la mastitis.

Referencias. Estructura de la glndula mamaria. Componentes tisulares. Dairy Management and Herd Health Certificate Program (Adapted from G.M. Jones).

De acuerdo al nivel de precisin en la deteccin del nmero de clulas, los

mtodos diagnsticos pueden clasificarse en:

Cualitativos Prueba de Whiteside

Semicuantitativos California Mastitis Test Prueba de Wisconsin

Cuantitativos

Mtodo de Breed Fossomatic

Counter Coulter

PRUEBAS QUMICAS

Conductividad elctrica de la leche

La Prueba de Conductividad Elctrica se ha utilizado como un indicador de la mastitis durante la ltima dcada. Se basa en el aumento de conductividad elctrica de la leche debido a su mayor contenido electroltico especialmente iones de sodio y de cloro.

Se le encuentra como parte de algunos equipos de ordeo computarizados dentro de las salas de ordee, como as tambin en forma de medidores porttiles, lo que permite el monitoreo individual por cuarto.

El dispositivo utilizado con mayor frecuencia se sostiene con la mano y tiene una copa empotrada donde se lanzan los chorros de la leche, proporcionando una lectura digital del resultado de la conductividad elctrica.

Referencias. Dispositivo para medicin de conductividad elctrica en leche.

Papel indicador de pH

Este mtodo consiste en dejar caer algunas gotas de leche directamente del pezn a un papel indicador de pH. Se consideran leches sospechosas aquellas cuya coloracin corresponda a un pH igual o superior a 7.

Prueba de Whiteside

La mezcla de leche con una solucin de NaOH al 4% ocasiona que la leche gelifique formando grumos visibles. Los grumos sern ms grandes conforme la leche contenga mayor nmero de clulas somticas. Para hacer ms visible la reaccin es conveniente usar una placa de acrlico negra que puede tener dibujada 4 cuadros de 3cm x 3cm, uno por cada cuarto. Procedimiento: a) Colocar 5 gotas de leche fra en el centro del cuadrito y agregar 2 gotas de la solucin de NaOH al 4%. b) Mezclar vigorosamente, dispersando la leche en el cuadrito por medio de un palillo. Continuar mezclando por alrededor de 20 segundos y dar lectura al resultado. c) Interpretar de acuerdo al siguiente cuadro:

Clulas somticas / mL

Negativo 0 325.000 Traza 300.000 600.000

1+ 600.000 1.000.000 2+ 1.000.000 2.000.000 3+ ms de 2.000,000

PRUEBAS BIOLGICAS

California Mastitis Test (CMT)

El California Mastitis Test (CMT) estima el nmero de clulas somticas de la leche y puede realizarse al pie de la vaca para detectar mastitis. Los valores del CMT se relacionan con el nmero de clulas somticas en la leche. El nmero es alto porque las clulas somticas migran de la sangre hacia la leche como respuesta a la infeccin. Cuanto ms severa es la infeccin, mayor ser el nmero de clulas somticas.

Cuando el mismo supera las 200.000/mL, estamos en presencia de condiciones anormales en la ubre. El nmero de clulas somticas en la leche tiende a crecer durante el ordeo y permanece alto durante varias horas. Por eso, para obtener resultados confiables, el CMT debe realizarse justo antes del ordeo, pero despus de la estimulacin y el despunte.

El reactivo del CMT es un detergente que reacciona con el material nuclear de las clulas somticas formando un gel. A mayor presencia de clulas se libera una mayor concentracin de ADN, por lo tanto mayor ser la formacin del gel, traducindose en nuestra lectura e interpretacin del resultado como el grado ms elevado de inflamacin. Es decir, permite determinar la respuesta inflamatoria con base en la viscosidad del gel que se forma al mezclar el reactivo (prpura de bromocresol) con la leche, permitiendo evaluar cada cuarto independientemente. Esta reaccin se clasifica en 0, T (Trazas), 1, 2, 3 dependiendo de la cantidad de gel formado. Muchos productores prefieren utilizar el sistema simplificado de: negativo para ausencia o trazas de gel, sospechoso para algo de formacin de gel y positivo para gelificacin marcada.

Escala de CMT

Rango relativo del nivel de clulas somticas (cs/mL)

Negativo 5.000.000

Las investigaciones han demostrado que las reacciones del CMT se correlacionan bien con el promedio del nmero de clulas en la leche.

El CMT es un mtodo de diagnstico que posee una sensibilidad del 97% y una especificidad del 93%. Es valioso para detectar infecciones subclnicas que, de no realizarse, podran pasar por desapercibidas hasta alcanzar un estado ms avanzado o clnico. Sin embargo, el CMT no seala qu vacas deben ser tratadas.

Pasos a seguir para la realizacin de la Prueba de California para Mastitis:

1. Se desecha la leche del pre-ordeo. 2. Se ordean uno o dos chorros de leche de cada cuarto en cada una de las placas de la paleta. 3. Se inclina la paleta de modo que se desecha la mayor parte de esta leche. 4. Se aade a la leche un volumen igual de reactivo. 5. Se mezcla el reactivo y se examina en cuanto a la presencia de una reaccin de gelificacin. Antes de continuar con la vaca siguiente se debe enjuagar la placa. Referencias. Reactivo de CMT y reacciones positivas a la prueba.

Prueba de Wisconsin para Mastitis (WMT)

La Prueba de Wisconsin para mastitis (WMT), fue diseada para el uso en el laboratorio, y es utilizada para estimar el contenido de clulas somticas de muestras de leche fresca mezclada o leche de tanques de enfriamiento, as como para muestreo de vacas individuales. Se utiliza una solucin similar a la que se emplea con la prueba de California (CMT), pero en contraste con esta ltima, los

resultados se miden cuantitativamente dependiendo de la viscosidad, no cualitativamente o de estimarla como en el CMT.

La tcnica consiste en utilizar un tubo graduado en milmetros en donde se depositan 2 mL de leche y una mezcla de 2 mL de reactivo para CMT con agua destilada (1:1) ambas a temperatura ambiente. Enseguida se agita durante 10 segundos, horizontalmente y de izquierda a derecha. Se deja reposar 10 segundos y posteriormente se invierten los tubos durante otros 10 segundos.

Una vez transcurrido el tiempo, se procede a realizar la lectura en el tubo por debajo de la espuma que se forma. Los resultados se relacionan con la escala graduada en mililitros del tubo y su valor de clulas somticas, empleando para su interpretacin una tabla especfica para la prueba.

Referencias. Procedimiento WMT para el diagnstico de la mastitis subclnica.

Mtodo de Prescott - Breed

El recuento microscpico directo se realiza comnmente sobre una muestra

de leche. Para obtener el perfil de un rodeo debemos considerar una serie de muestras con intervalos de 15 o 30 das.

Se hacen dos extendidos sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. Se trabaja con 0,01 mL de leche que extendemos sobre una superficie de 1cm2. Se seca, se desengrasa, se colorea y se hace el recuento con objetivo de inmersin (100 X). De cada uno de los dos extendidos de 1 cm2 en un portaobjetos, se cuentan entre 20 y 50 campos (la mitad en forma horizontal y la otra mitad en

3ml leche + 3ml de reactivo,

dejar reposar 15 segundos Agitacin durante 10

segundos

Voltear durante 15 segundos Lectura

forma vertical). Por lo tanto de cada muestra de leche contamos entre 40 y 100 campos microscpicos.

El total de las clulas somticas contadas se dividen por el nmero de campos microscpicos contados para obtener el promedio de clulas somticas por campo. Ese promedio se multiplica por el factor microscpico y as obtenemos el nmero de clulas somticas por ml de leche.

Como reactivos se pueden utilizar tanto la solucin Breed como la solucin alcohlica de azul de metileno.

Referencias. Mtodo de Breed. Observacin microscpica. Con flechas se indica clulas somticas y bacterias.

Mtodo Somaticell

Es un mtodo que puede ser utilizado para analizar la leche proveniente de una o muchas vacas. En el caso de las muestras individuales de leche, se determina la probablidad de la presencia de mastitis Se utiliza un kit con un procedimiento similar al de la prueba de WMT.

Referencias. Kit Somaticell.

MTODOS DE CONTEO ELECTRNICO CELULAR

Los mtodos electrnicos de recuentos tienen en la actualidad una

aplicacin universal, sobre todo en usinas lcteas, laboratorios de control lechero o dedicados al diagnstico o investigacin de la mastitis, utilizndose el Bactoscan, Fossomatic (Foss Electric, Dinamarca) y el Counter Coulter (Coulter, Inglaterra). Referencias. Bactoscan, Fossomatic y Counter Coulter.

Mtodo fluoro-opto-electrnico (Fossomatic) y Counter Coulter

Estos dos aparatos poseen alta correlacin con la microscopia ptica, por lo que proporcionan una medida segura en el recuento de clulas somticas. Sin embargo, se pueden presentar variaciones en el recuento en las mismas muestras cuando se realizan con los dos aparatos debido a la diferencia de operacin de cada uno de ellos.

El Fossomatic basa su clculo en la tincin fluoromtrica del material nuclear, mientras que el Counter Coulter cuenta el nmero de impulsos elctricos resultantes de las partculas que pasan entre dos electrodos. Es decir, cuenta partculas de un dimetro determinado, que para el caso seran las clulas, pero en el rango de recuento entraran otras partculas, aumentando ligeramente el valor en comparacin con el Fossomatic.

El Fossomatic es un contador especfico de ADN basado en un principio ptico de fluorescencia. Debido a que el bromuro de etidio penetra en la clula y forma un complejo fluorescente con el ADN nuclear, cada clula produce un pulso elctrico que se amplifica y se registra.

En los ltimos aos se han desarrollado equipos porttiles que funcionan a

batera y posee un medidor ptico de clulas somticas de la leche. Los equipos utilizan casettes que se cargan con cantidades pequeas de leche. Ya dentro de stos, la leche se mezcla con reactivos que llegan al ncleo de las clulas

somticas, lo cual permite su conteo, mediante un sensor de fluorescencia, traducindose en el nmero de clulas somticas en leche, el cual aparece rpidamente en la pantalla del equipo.

PRUEBAS BACTERIOLGICAS PARA DETERMINACIN DEL AGENTE

CAUSAL

Toma de muestra para cultivo y antibiograma

Los cultivos en laboratorio son necesarios para identificar los organismos especficos que se encuentran involucrados en un caso clnico de mastitis. La fidelidad de los resultados de laboratorio depende de los cuidados sanitarios que se tengan durante la toma de muestra y su manipulacin posterior.

Materiales necesarios para la toma de muestra Tubos estriles de 5 a 15 ml de capacidad. Alcohol al 70%. Algodn embebido en alcohol al 70% dentro de un recipiente hermtico. Toallas de papel. Cmo tomar las muestras?

Lavar y secar la ubre y los pezones si tienen barro. Descartar los primeros chorros de leche y desinfectar los pezones con

algodn embebido en alcohol al 70%. Recolectar las muestras en tubos estriles.

Cmo se envan las muestras? Refrigeradas.

ACTIVIDAD PARA COMPLETAR 1) Para la prueba de CMT indique en el siguiente esquema qu fue lo que observ en cada uno de los pocillos y explique el fundamento de la prueba y su interpretacin.