búsqueda de péptidos inhibidores de la enzima convertidora...

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Búsquedadepéptidosinhibidoresdelaenzimaconvertidoradeangiotensinaenlasproteínaspresentesenlacerveza.

EvaRamosBécares

MásteruniversitarioenBioinformàticayBioestadísticaUOC-UB

NombreConsultor:MelchorSánchezMartínez

06/2016

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EstaobraestásujetaaunalicenciadeReconocimiento-NoComercial-CompartirIgual3.0EspañadeCreativeCommons

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FICHADELTRABAJOFINAL

Títulodeltrabajo:

Búsquedadepéptidosinhibidoresdelaenzimaconvertidoradeangiotensinaenlasproteínaspresentesenlacerveza.

Nombredelautor: EvaRamosBécares

Nombredelconsultor: MelchorSánchezMartínez

Fechadeentrega(mm/aaaa): 06/2016

ÁreadelTrabajoFinal: Bioinformática

Titulación:MásteruniversitarioenBioinformáticayBioestadísticaUOC-UB

ResumendelTrabajo:

Elobjetivodeestetrabajoeselestudioinsilicodelaposibilidaddeobtenercervezaquecontengapéptidosinhibidoresdelaenzimaconvertidoradeangiotensina(ACE).Debidoaqueestaenzimaestá involucrada en el aumento de la presión sanguínea, por lo tanto, el objetivo final es laproduccióndeunproductofuncionalqueayudearegularlapresiónsanguíneadepersonasquesufranhipertensión.

Una gran variedaddepequeños péptidos han sidopreviamentedescritos en literatura comoinhibidoresdelaACEDuranteesteproyectoserealizóunaseleccióndeaquellospéptidosconIC50 inferior a 20 20µMy búsqueda de su presencia dentro de la estructura primaria de lasproteínasmásabundantesenlacerveza.Además,secomprobóqueestospequeñospéptidosnopuedensercortadosporlasenzimaspresenteseneltractodigestivo.

Trasladigestióninsilico,seconcluyóquemedianteelusodelaenzimacomercialproteinasaKsepuedeobtenerunacervezaquecontengaelpéptidoinhibidordelaACESer-Tre.Lainteracciónentreestepéptidoylaproteínafuecomprobadomedianteunensayodeunión.

Porlotanto,seconfirmólaposibilidaddecrearunacervezaquecontengainhibidoresdelaACE.Sinembargo,laformacióndeespumapuedeversecomprometidayposiblementelaadicióndeestabilizadoresseránecesaria.

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Abstract:

Inthisthesisaninsilicofeasibilitystudyoftheproductionofbeercontainingnaturalangiotensinconverting enzyme (ACE) inhibitor peptides. As this enzyme is involved in blood pressureincensement, the final objective of this project is the production of a bioactive product thatregulatesbloodpressureinpatientssufferinghypertension.

AgreatamountofsmallpeptidesthatinhibitACEhavealreadybeendescribed.Aselectionofthe most convenient ones was performed and their presence in the sequence of the mostabundantproteinsinbeerwassearched.Afterthat,whichpeptidescannotbecleavedbythedigestiveenzymeswasstudied.

InsilicoenzymaticproteindigestionresultedintheachievementoftheACEinhibitingpeptideSer-TreafterthecleavagewithproteinaseK.Aprotein-peptidedockingapproachwasperformedinordertoconfirmtheinteractionbetweenbothproteinandpeptide.

Therefore,thepossibilityofbrewingabioactivebeerwasconfirmed.Nevertheless,itisimportanttomentionthatfoamstabilitymaybecompromisedandstabilisersmaybeneeded.

Palabrasclave

Cerveza,péptidoinhibidor,,enzimaconvertidoradeangiotensina,alimentofuncional,presiónsanguínea.

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Índice

1.Introducción..................................................................................................................................4

1.1ContextoyjustificacióndelTrabajo.......................................................................................4

1.2.Teoríadetrásdelproyectoyestadodelarte........................................................................4

Hipertensión...........................................................................................................................4

Obtencióndecervezafuncional............................................................................................7

1.3ObjetivosdelTrabajo..............................................................................................................8

1.4Enfoqueymétodoseguido.....................................................................................................9

1.5PlanificacióndelTrabajo.........................................................................................................9

1.6Brevesumariodeproductosobtenidos...............................................................................10

2.Métodosyresultados.................................................................................................................11

2.1Fase1:recoleccióndepéptidosdescritosenlaliteratura..................................................11

2.2Fase2:BúsquedapéptidosinhibidoresdelaACEenlacerveza.........................................11

Estrategiasfallidas................................................................................................................11

Alineamientofinal:...............................................................................................................13

Digestiónconendoproteasaspresenteseneltractodigestivo..........................................14

Obtencióndelospéptidos...................................................................................................15

2.3Ensayodeafinidad................................................................................................................16

2.4Efectosenelproductofinal..................................................................................................17

2.5BúsquedadepéptidosinhibidoresdelaACEenLTPs.........................................................18

3.Conclusiones...............................................................................................................................14

4.Glosario.......................................................................................................................................15

5.Bibliografía..................................................................................................................................16

6.Anexos.........................................................................................................................................20

Anexo1.Planificación.................................................................................................................20

Anexo2.PeptidosinhibidoresdelaACE....................................................................................21

Listadefiguras

Imagen1.Prevalenciadelahipertensiónnormalizadaporedades,enadultosde25añosomás...................................................................................................................................................5

Imagen2Relaciónentreelsistemarenina-angiotensina-aldosteronayelincrementodelatensiónarterial.........................................................................................................................5

Imagen3.Costototalestimadodelaampliacióndelaintervencionbasadaenelindividuoconmejorrelacioncalidad-precioenmateriadeenfermedadesnotransmisiblesentodoslospaisesdeingrsosbajosymedianos.........................................................................................6

Imagen4.Consumodecervezaenlosdistintospaísesdelmundo................................................7

Imagen5.Dipéptidospresentesenlaestructuraprimariadelaproteínazdelacebada...........14

Imagen6.Tripéptidospresentesenlaestructuraprimariadelaproteínazdelacebada..........14

Imagen7.ResultadosobtenidoseneldockingassaydelaACEconeldipeptidoST...................16

Imagen8.LugaresdecortetelaLTP1porlaproteinasaK............................................................17

Imagen9.LugaresdecortetelaLTP2porlaproteinasaK............................................................17

Imagen10.PéptidosinhibidoresdelaACEpresentesenlaestructurasecundariadelaLTP1...18

Imagen11.PéptidosinhibidoresdelaACEpresentesenlaestructurasecundariadelaLTP2...19

1.INTRODUCCIÓN

1.1CONTEXTOYJUSTIFICACIÓNDELTRABAJOEnestaúltimadécada,laindustriaalimentariaseestácentrandoenlabúsquedadealimentosfuncionalesquenosoloalimentensinoqueayudenamejorarlasaluddelosconsumidores.Sondeparticularinterésaquellosalimentosquepuedanayudareneltratamientodeenfermedadescongranprevalencia.Unejemplodeenfermedadesquesequieretratarconalimentosbioactivoseslahipertensión.

Lahipertensiónafectayaamilmillonesdepersonasenelmundo,ypuedeprovocarinfartosdemiocardioyaccidentescerebrovasculares,siendolacausadelamuertedemillonesdepersonascadaaño[1].

Hoyendía,lapresiónsanguíneaseintentacontrolarmedianteuncontroldeladieta,cambiosenelmododeviday la ingestadiariademedicamentos.Además,seconocequeelalcoholesenparte responsable del incremento de la presión sanguínea, por lo que su consumo estáespecialmentecontraindicadodentrodelapoblaciónhipertensa.

Elobjetivodeesteproyectoesestudiarlaposibilidaddecrearunacervezafuncionalquedeformanaturalayudealareduccióndelapresiónsanguíneay,porlotanto,ayudealareduccióndelatomademedicamentosymejorelacalidaddevidadelapoblaciónhipertensa.Estoserealizaramediante la búsqueda de péptidos con potencial para inhibir la enzima convertidora deangiotensina(ACE)dentrodelasproteínaspresentesenlacerveza.

1.2.TEORÍADETRÁSDELPROYECTOYESTADODELARTE.

HIPERTENSIÓN.Elfallocardiovasculareslaprincipalcausamundialdemuerte,siendoresponsabledel30%delasmismas[2].SegúnlaOrganizaciónMundialdelaSalud,17,5millonesdepersonasmurieronen2012debidoaestetipodeenfermedadesyestenúmerocreceráhastalos23,3millonesen2030[3].

Dentrodelasenfermedadescardiovascularescabedestacaralahipertensiónporsufrecuencia,consecuenciasycomplejidad.Lahipertensiónarterialesenlaactualidadunadelasfrecuentesenlospaísesdesarrollados[4].Elriesgodeestaenfermedadnoseencuentraenlaenfermedaden sí, ya que es asintomática, sino en los riesgos que lleva asociados. La hipertensión es unindicadordefuturoriesgocardiovascularylacronicidaddelaenfermedadreducelaesperanzade vida, incrementando lamortalidad de forma lineal según los valores de la presión [5]. Latensiónarterialesunavariablededistribucióncontinuay,portanto,ellimiteapartirdelcualseconsideraaunapersonacomohipertensaseestablecedeunaformapuramentearbitrariaporconvenio,basadoenlosnivelesderiesgocardiovascular[6].Además,setratadeunaenfermedadcomplejayaquesehandescritonumerososfactoresambientalesqueafectanaldesarrollodelahipertensión,comoson:laobesidad,circunstanciasdenacimiento,lasprofesionesestresantesyelconsumodealcohol.

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Imagen1.Prevalenciadelahipertensiónnormalizadaporedades,enadultosde25añosomás.

Existennumerososestudiosqueestablecenfirmementelarelaciónentreelconsumomoderadoyaltodealcoholylapresenciadehipertensión[7-9].Estarelaciónsehademostradoenambossexos,diferentesrazasyesindependientedeltipodebebidaalcohólica,adiposidad,educación,hábitotabáquico,consumodesalydeotrasvariascaracterísticas.Sinembargo,elmecanismoporelcualelalcoholelevalapresiónaúnnoestáclaro.

Unade las rutas involucradasenel incrementode lapresión sanguíneaesel sistema renina-angiotensina-aldosterona [10]. Por lo tanto se ha visto que su inhibición es un tratamientoefectivoparaeltratamientodelahipertensión[11].Dentrodelosfármacosinvolucradosenlaregulacióndeestaruta,losinhibidoresdeenzimaconvertidoradeangiotensina(ACE)sonunodelosmásrecetados.

Imagen2Relaciónentreelsistemarenina-angiotensina-aldosteronayelincrementodelatensiónarterial

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LaACE(EC3.4.15.1)actúaenelsistemarenina-angiotensina,hidrolizandolaangiotensina-I,undecapéptido inactivo producido por la acción de la renina, liberando la angiotensina-II y eldipéptido C-terminal Hys-Leu. La angiotensina-II es un compuesto de elevada potenciavasoconstrictora cuya acción provoca la contracción rápida de las arteriolas, y por tanto, elincremento de la presión sanguínea. Además, estimula la secreción de aldosterona por lasglándulassuprarrenales,locualinducelaretencióndesodioyaguaylaexcrecióndepotasio.Estoprovoca una acumulación de agua que incrementa el volumen extracelular, queconsecuentementeaumentadelatensiónarterial.LaACEactúasimultáneamenteenelsistemaquinina-calicreína, catalizando la degradación de las bradiquininas, compuestos de potenteacciónvasodilatadora,quetambiénfavoreceelincrementodelatensiónarterial[11,12].

Debidoalaprevalenciadelahipertensiónylosbuenosresultadosobtenidosalusarinhibidoresde la ACE, estos se han convertido en uno de los fármacos más consumidos en los paísesdesarrollados[13].Ademástambiénsuponenunode losmayoresgastosensanidadenpaísesconingresosbajosomedios[4].Elprimerinhibidorfueencontradoenelvenenodeunavíborayposteriormenteanálogossintéticosfuerondesarrolladosycomercializados[14].Sinembargo,elvenenodevíboranoeslaúnicafuentenaturaldepéptidosinhibidoresdelaACE,otrospéptidosconactividadessimilareshansidoencontradosenciertosalimentosypotencialesinhibidoreshansidodescritodentrodelaestructuraprimariadeproteínastantodeorigenanimalcomovegetal[15-18].

LasecuenciatripeptídicaC-terminaldelospéptidosinfluyealauniónconlaACE,yaquepuedeinteractuar con tres regiones del centro activo de la ACE [19]. Así, aminoácidos de carácterhidrofóbico,comoTrp,Tyr,PheoPro,favorecenlauniónaestaszonas.SiendoelpéptidoconsecuenciaC-terminalPhe-Ala-Pro,análogoalencontradoenelinhibidordevenenodevíbora,uno de losmás favorables para unirse al centro catalítico. La carga positiva de la Arg o Lys,respectivamente, contribuyen a la potencia inhibidora [20]. Por otro lado, la presencia deaminoácidos dicarboxílicos en la secuencia peptídica o de Pro como penúltimo aminoácidodisminuye o anula la actividad inhibitoria de la ACE [21, 22]. El extremoN-terminal tambiéninfluyeenlaactividad,yasí,lapresenciadeValodeIleenestaposiciónincrementalaactividadinhibitoriadelaACEenelpéptido.Lalongitudtambiénesunfactorclave,cuantomáspequeñosson,mayoressufuncióninhibidora.

Imagen3.Costototalestimadodelaampliacióndelaintervencionbasadaenelindividuoconmejorrelacioncalidad-precioenmateriadeenfermedadesnotransmisiblesentodoslospaisesdeingrsosbajosymedianos.

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OBTENCIÓNDECERVEZAFUNCIONALHoy en día, la industria alimentaria se está centrando en la identificación de componentesbiológicamenteactivosenlosalimentos,queofrezcanlaposibilidaddemejorarlascondicionesfísicasymentales,asícomodereducirelriesgoacontraerenfermedadesyreducirelconsumode medicamentos. A los alimentos con estas características se les conoce como alimentosfuncionales y deben cumplir ciertos requisitos. En primer lugar, debe ser consumidohabitualmentecomopartedeladietanormal.Debeestarconstituidoporingredientesnaturalesnopresentesenelalimentooriginaloenmayorconcentraciónalaexistenteendichoalimento.Susefectosbeneficiososdebendemostrarsecientíficamenteydebenmejorarelestadodesaluddel individuo, su calidad de vida y/o disminuir el riego de ciertas patologías. Finalmente, susefectosdebenestarautorizados[23].

Los péptidos bioactivos se incluyen en el grupo de ingredientes funcionales de naturalezaproteica, que permiten la obtención de alimentos funcionales. La liberación de los péptidosbioactivosapartirdeunasecuenciaproteicapuedeproducirsebienporhidrólisisenzimática,porprocesos fermentativos o bien por la combinación de ambos procesos, que tiene lugar bienduranteelprocesadodealimentosobienduranteladigestióngastrointestinal[24].

Dentrodelgrupodelospéptidosbioactivos,aquellosconactividadantihipertensivahancentradoelinterésdeloscientíficosylasindustrias,debidoalincrementodelamortalidadenlospaísesindustrializadosporlahipertensióny/oporsuscomplicaciones.

Enlamayoríadelospaíses,lasbebidasalcohólicascomocervezaovinosonunaparteintegraldeladietayconsistendeaproximadamentedeun4aun65%delaingestaenergéticamedia.LacervezaesunabebidamuypopularenEspaña.En2003,habíaunaingestadeaproximadamente150,4mldecervezapordía/porpersona[25].Sinembargo,hasidorelacionacomounadelasbebidas alcohólicas relacionadas con la hipertensión en esta población [25]. Por lo tanto, laobtención de una cerveza funcional con péptidos inhibidores de la ACE, que no solocontrarrestaraelefectonegativodelalcoholsinoqueayudaraamejorarlapresiónsanguínea,seríadegraninterésparalaindustriacervecera.

Imagen4.Consumodecervezaenlosdistintospaísesdelmundo

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Lacervezaesunabebidadebajagraduaciónalcohólicaelaboradamediantelafermentacióndelmosto procedente de cereales que contienen almidón. Los cereales son transformables enazúcarespordigestiónenzimática,ycocción,yaromatizadoconfloresdelúpulo.Lamayorpartede las cervezas se elaboran con cebada malteada que se da sabor con lúpulo, siendo losconstituyentes de estas cerveza provienen de sus cuatro principales materias primas malta,lúpulo,agua,levadura.

A pesar dequeel componenteprincipal de los cereales son los azúcares, también contienenproteínas que pueden ser degradados y resultar en la obtención de los péptidos deseados(siempre en cuanto estos estén dentro de su secuencia aminoacídica). La degradación de lasproteínas presentes en los ingredientes hasta péptidos puede ser el resultado de la propiafermentaciónllevadaacaboporlalevadura,delasenzimaspresenteseneltrastodigestivoodeenzimasexternasqueseañadandurantesufabricación[26].

La capacidad de un péptido para desarrollar la actividad antihipertensiva in vivo depende dedistintos factores, como el procesado al que ha sido sometido el alimento, la estabilidad delpéptido,lacapacidaddeabsorciónyelmecanismodeinhibicióndelaACE.Lospéptidosdebenpermaneceractivostras ladigestiónpor lasenzimasdigestivasy lasproteasaspresentesenelintestinoyenelplasmasanguíneo[27].Además,hayquetenerencuentaqueladigestibilidadestáinfluidaporlascondicionesdelprocesadoyporlasinteraccionesantagónicasysinérgicascon otros componentes de la dieta. Asimismo, los péptidos de bajo pesomolecular sonmuyreactivos,pudiendointeraccionarconcarbohidratosylípidosynoserabsorbidos.Unavezlleganalamicrovellosidadesintestinales,lospéptidospuedenserabsorbidosytransportadosalsistemasanguíneo,perosuactividaddependerádelalongituddelmismo.Porlotanto,hayquetenerencuentaquelosresultadosobtenidosenesteestudioinsilicodebenserprobadosenellaboratorioyaqueenmuchoscasossehavistoquelosresultadosinvitroeinvivodifieren.Estoesdebidoaquelospéptidosdebenllegardeformaactivaalaenzimadianaparaserefectivos.

Tambiénhayquetenerencuentaquelapresenciadepéptidospequeñospuedeincrementarlaamarguradelproductofinal[28].Elcaracterísticosaboramargodelacervezasueledebersealaadicióndellúpulo.Porlotanto,esposiblequeparaquenoresultedemasiadoamarga,hayaqueañadirmenoslúpuloenlaformulaciónfinal.

1.3OBJETIVOSDELTRABAJO1. RecolectarlospéptidosinhibidoresdelaACEquetenganunaconcentraciónIC50(alacualel

50%delaactividaddelaenzimaseencuentrainhibida)igualomenoresa20µM.

2. BuscarpéptidosinhibidoresdelaACEdentrodelasproteínasdelacerveza.

3. EncasodehaberpéptidosinhibidoresdelaACEenlaestructuraprimariadealgunadelasproteínas,estudiarsiresistiríanelpasoporelsistemadigestivo.

4. EncasodehaberpéptidosinhibidoresdelaACEenlasecuenciadealgunadelasproteínasqueresistanelpasoporelsistemadigestivo,encontrarunaformasencilladeconseguirlosenelproductofinal.

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1.4ENFOQUEYMÉTODOSEGUIDOEneltrabajosoloserecolectaranytendránencuentalospéptidosdescritosenlabibliografíaconunaconcentraciónIC50(alacualel50%delaactividaddelaenzimaseencuentrainhibida)igualomenoresa20µM.Sehadecididoponerestelimiteapesardequeponerestarestriccióndentrodelabúsquedareducelaprobabilidaddeencontrarposiblesinhibidoresdentrodelproducto,yaquepéptidoscuyaIC50seamuyelevadaimplicaquedebenencontrarseengrandescantidadesenelproductoparaquetenganefecto.Laconcentracióndeproteínasenelproducto finalesbastantereducida,debidoaladegradacióndepartedeellasduranteelmalteadoyporlalevadurayasuprecipitaciónenciertaspartesdelprocesodefabricación.Porlotanto,laconcentraciónfinaldepéptidoinhibidorquesepuedeconseguirnoesdemasiadoelevaday,portanto,debeserlosuficientementeactivocomoparacumplirsufunciónabajosniveles.

Enprimerlugar,serealizóunabúsquedadelospéptidosconlascaracterísticasdeseadasdentrodelasproteínasmásabundantesdescritasenelproteomadelacebada,trigoylamalta.Solosetuvieron en cuenta estas proteínas ya que son la única fuente que puede proporcionarconcentracionesefectivasenelproductofinal.Unpéptidoqueseencuentreenunaproteínaqueesexpresadaabajosnivelesnuncapodráserobtenido,enelproductofinal,aunaconcentraciónmayoro igualasu IC50.Por lotanto,paraalcanzarconcentracionesefectivassenecesitaríaobienunaextensadegradacióndelasproteínasobiensuposterioradiciónalproducto.Yaquelospéptidos son en gran parte responsables de las propiedades organolépticas, estos procesospodrían llevar a cambios indeseados. En este caso solo se tuvo en cuenta los ingredientesvegetalesynolapropialevadura,debidoaqueenlafabricacióndelacervezaaescalaindustrial,enmuchos casos la levadura es retiradadel producto final. Por lo tanto, sus proteínas no seencuentran presentes en el producto que llega al consumidor. Sin embargo, esta estrategiaresultopocoproductiva,comoseexplicaposteriormente,ademásdequeposteriormentesevioque esta estrategia no tendría sentido ya que la mayoría de las proteínas analizadas no seencuentranenelproductofinal.Porlotanto,unnuevoenfoquefuenecesario.

Paracontinuarconelproyecto,serealizóunabúsquedadelasproteínasqueseencuentranenmayorconcentraciónenlacerveza.Porlotanto,alahoraderealizarelestudiofinal,solosehatenido en cuenta la proteínamás abundante y cuya degradación afecte lomínimo posible elproductofinal.

1.5PLANIFICACIÓNDELTRABAJOEste se trata de un estudio in silico, por lo que no se llevaran a cabo comprobaciones en ellaboratorio de ningún tipo. Por lo tanto, para llevar a cabo este proyecto solamente seránnecesarios: una gran biblioteca de artículos referentes a péptidos inhibidores de la ACE, losproteomas de la cebada, el trigo y lamalta, información sobre las proteínas presentes en lacervezacomoproductofinalyelarchivoPDBdelaACE.

Enlaplanificacióninicial,elproyectofuedivididoentresfases:

Fase1. Búsqueda de las características comunes de los péptidos inhibidores de la ACEM yadescritosenlabibliografía.1.1. Búsquedabibliográficaenzima,tensiónarterialycerveza.1.2. Búsquedabibliográficapéptidos.

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1.3. Recoleccióndepéptidosydiseñodebasededatosconlosmismos.1.4. Búsquedadecaracterísticascomunesdelospéptidos.

Fase2. Búsqueda de péptidos inhibidores de la ACE dentro del proteoma de los principalesingredientesdelacerveza.2.1. Búsquedaenelproteomadecebada.2.2. Búsquedaenelproteomadetrigo.2.3. Búsquedaenlasproteínasdescritasygenomadelamalta.2.4. Búsquedadeotrosgenomassialgosalemal/análisisderesultados.

Fase3. Últimosajustesyescribireltrabajo.3.1. Margendeerror/nuevasideas.3.2. Escribirlamemoriafinal.3.3. Entregamemoria.3.4. Presentación.

Eldiagramadelaplanificaciónpuedeverseenelanexo1.

Comosehacomentadoconanterioridad,uncambioenlaestrategiageneralfuenecesaria.Comosehabíandefinidodossemanasdemargendeerror,unaparabúsquedadeotrosgenomasyotradeideasnuevas,elproyectopudoserterminadodentrodelasfechasestablecidas.Paraello,seutilizó la semanadebúsquedadenuevos genomaspara buscar las proteínas presentes en lacervezayelestudiodelapresenciadepéptidosinhibidoresdelaACEenlasmismas,ylasegundasemana para el estudios de si dichos péptidos resistirían el paso por el sistema digestivo,encontrarunaformasencilladeconseguirlosenelproductofinalyestudiarposiblesefectosenelproductofinal.

1.6BREVESUMARIODEPRODUCTOSOBTENIDOSTrasesteestudioinsilico,laposibilidaddeobtenerunacervezafuncionalqueayudeacontrolarlapresiónsanguíneapareceposible.

Además,comosegeneraránunamemoria,unapresentaciónyunaautoevaluacióndeltrabajocomoproductosdeltrabajo.

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2.MÉTODOSYRESULTADOS

2.1FASE1:RECOLECCIÓNDEPÉPTIDOSDESCRITOSENLALITERATURA.Mediantelabúsquedaenliteratura,sehanrecolectadounalistadepéptidosinhibidoresdelaACEquesonactivosaunaconcentraciónIC50(alacualel50%delaactividaddelaenzimaseencuentrainhibida)igualomenoresa20µM.Dichospéptidoshansidorecopiladosenunarchivofastaquecontieneunaúnicaveztodosaquellospéptidos.Labasededatosgeneradaconsisteenlospéptidosordenadosporlongitudydemaneraalfabética,nombradossegúnlasecuenciayelartículodondefueronencontrados.Untotaldel174péptidosfuerondocumentados[15,16,18,20,24,29-66].

La anotación se ha realizado demaneramanual ya que en cada caso se debía comprobar laactividad descrita y no existe ninguna base de datos en la actualidad que ofrezca dichainformación.

En el anexo 2 se encuentra una lista completa de los péptidos seleccionados y una fuentebibliográficadondepuedeserencontrado.

2.2FASE2:BÚSQUEDAPÉPTIDOSINHIBIDORESDELAACEENLACERVEZA.Esta segunda etapa del proyecto se basaba en la búsqueda de los péptidos inhibidores de laenzimaconvertidoradeangiotensina (ACE)dentrode lasproteínasde la cebada,el trigoyellúpulo.Debidoaproblemasa lahoradeobtenerresultadosconlaestrategiaplanteadaenunprimer momento, no se ha seguido el plan inicial, sino que se han ido probando otrasaproximacionesquesedetallanacontinuación.

ESTRATEGIASFALLIDAS.ElprimermétodopropuestoyprobadofuerealizarunBLASTentreelficherofastacreadoconlospéptidosinhibidoresdelaACEylosdistintosproteomasusandolaherramientadeBLASTdelNCBI[67,68].Noseobtuvoningunacorrelacióncomorespuesta.Lafaltaderesultadosnosedebeaqueestospéptidosnoseencuentrenenningunadelasestructurasprimariasdelasproteínasdelosproteomasdeestosorganismossinoaquedebidoaquelamayoríadeestospéptidossondi-ytripéptidos,lapuntuaciónobtenidaenelalineamientonoeslosuficientementealtacomoparaque se muestren como resultado. Viendo que esta herramienta no iba a tener utilidad, seprocedióarealizarelalineamientomedianteelusodeotrossoftwares.

Hoyendía,existenmultituddeherramientasonlinequenospermitenrealizaralineamientodesecuencia.EnestetrabajosóloseutilizanunapequeñapartedetodaslasposiblescomosonlaherramientaBLATdelUCSC[69,70],SequenceServer1.0.8[71],laherramientaBLASTdeExPASy[72],laherramientaFASTMdeEMBL-EBI[73].Ningunadeestasherramientasreportóningunaconexiónentre lospéptidos inhibidoresde laACE y losdistintosproteomas. Esto sedebealmismoproblemaquealrealizarlaalineaciónconBLAST,noalafaltaderesultadoscompatibles.

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A continuación, se explicará brevemente algunas de las diferencias entre las diferentesherramientasutilizadas.

LaherramientaBLASTdelNCBItepermiterealizargrancantidaddealineamientosdesecuenciastanto aminoacídicas como nucleotídicas. . El alineamiento se hace comparando la secuenciaproblema frente a la base de datos y calculando la significatividad de los matches. Estaherramientatepermitepersonalizartubúsqueda,pudiendoajustarmúltiplesvariables(comoladatabasededóndequieresqueseextraiganlascoincidencias,elorganismoenelqueteinteresabuscaryparámetrosdentrodelalgoritmodebúsqueda)paraquetubúsquedasealomásóptimaposible.Sinembargo,noescapazareconocerpéptidosdemasiadopequeños,yaqueelscorequeconsiguennoeslosuficientementealtocomoparaquesemuestreenresultados.

Porotraparte,laherramientaBLATdelUCSCnecesitaunaalineaciónperfectaomuyparecidaparamostrarelalineamientocomoresultado,porloquenoestanflexiblecomoblast.Enestecaso,BLATcontieneuníndicedelgenomaydelproteomacompleto,porloquelabúsquedaesmás rápida. En este caso, la búsqueda no es tan personalizable, ya que la mayoría de losparámetrosdebúsquedavienenpreestablecidos.Perocomoenelcasoanterior,nodaresultadosparasecuenciasdemasiadocortas.

LaherramientaBLASTdeSequenceServernoseencuentrademaneraon-line.Porloque,aunqueesmuyparecidaalaalineaciónBLASTdelNCBI,elpaquetedebeserdescargadoeinstalado.Estaherramientaestádiseñadaparamostrardeunaformafácilysencilla,haciendoqueelusuariotengaquetomarlamenorcantidaddedecisionesposible.Porlotanto,esmuyútilparagenteque este empezando con alineamientos y no tenga gran conocimiento de los parámetros debúsquedaycomoajustarlos.Estabasededatostampocodamatchescondiytripéptidos.

Porotro lado, laherramientadeBLASTdeExPASysebaseenlosmismosprincipiosqueladelNCBI,pudiendotambiénescogerentrediferentesvariablescomoeltipodematriz.Enestecaso,seusacomobasededatosdeproteínasUniProtylabasededatosEuropeanNucleotidArchive(ANE)paralabúsquedadesecuenciasgenómicas.Porlotanto,alusarbasesdedatosdiferentes,losresultadospuedenvariar.Sinembargo,comousaunsistemasimilaraldeBLASTdelNCBI,tampocoresultaútilparasecuenciascortas.

FASTM de EMBL-EBI es una herramienta especializada en el alineamiento de proteínas. Estarealizaalineamientoslocalesentretumuestrayunacoleccióndepéptidos.Enestecasopuedesescogerentrediferentesbasesdedatos(incluyendoladepatentes)ymultituddeparámetrosparaconseguirunalineamientoqueseajusteatusnecesidades.Sinembargo,comoenloscasosanteriores,noseconsiguenbuenosresultadosconpéptidosmuypequeños.

Porlotanto,laherramientaausardependedeloquebusques.Nosepuededecirqueunaseamásóptimaquelaotra,sinoquelabasequedebesusardependedeloquequierasobtener.Porejemplo,sisebuscanalineamientosconsecuenciasremotasesmejorusarBLASTysisequiereunarespuestamásrápidayunaalineamientomásprecisoesmejorusarBLAT.

Alavistadequeunalineamientogeneralnoibaafuncionar,sediseñóunanuevaestrategia.Elproteoma de los distintos organismos fue descargado y se hizo un alineamiento local de losproteomasylassecuenciasfastaconlospéptidosinhibidoresgraciasalaayudadeEmboss[74].

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SehizounabúsquedadesecuenciasidénticasconlaherramientaWordmatch.Estaherramienta,solo encuentra alineamientos exactos. Por lo tanto, una vez descrito la longitudmínima delalineamiento, solo encontraremos aquellos lugares donde ambas secuencias coincidenexactamente.Enestecasodebemosintroducirtantolamuestraproblemacomolabasededatosdondequeramosbuscar.Enestecaso,sepuedenrealizaralineamientosentresecuenciasmuycortas. Sin embargo, esta forma de alineamiento solo es útil si nos interesa encontrar unasecuenciadentrodeproteínasdenuestrointerés,comoesnuestrocaso,noparalabúsquedadesecuenciascercanasalaproblema.

Para poder definir la longitud de de palabra acorde a la longitud de del péptido, y así evitaralineamientosenlosquesolosetuvieraencuantaunapartedelospéptidos,elficherofastaconlos péptidos original fue dividido en distintos ficheros con solamente los péptidos de iguallongituddeencadaunodeellos.

Comobasededatosseutilizóelproteomadescritoparalacebada.

Enestecaso,elproblemafueelcontrario.Debidoaquesehaceunalineamientoentremultituddedi-ytripéptidosymilesdeproteínas,elnúmeroderesultadosesdemasiadoalto,porloquees difícil de resumir y el estudio pierde el sentido, ya que no podemos centrarnos en cómoconseguirelpéptidoquequeremosenunaproteínaespecificasinoquetendríamosqueestudiardemasiadasproteínasporseparado.Además,muchosdelosresultadospropuestos involucranproteínas que solo se expresan en condiciones muy determinadas o en ciertos estadios deldesarrollodelaplanta,enzonasdelaplantadiferentesa lasemillaoseexpresanentanbajacantidad que su concentración en el producto final es prácticamente nula. Por lo tanto, esnecesariounnuevocambiodeestrategia.

ALINEAMIENTOFINAL:Perrocheauetal.describieronlasproteínasqueseencuentranmayorconcentraciónenlacerveza[26].Comonosinteresaquenuestropéptidoinhibidorseencuentreenconcentracionesenlascuales resulteactivo, sólo tienesentido tenerencuentaestasproteínasa lahoradehacerelestudioy,porlotanto,enelalineamiento.

Lasproteínasmásabundantesdentrode la cerveza son laproteínaZ (tambiénconocía comoserpin-likecysteineproteaseinhibitor)ylasproteínastransferidorasdelípidos(LTPs)1y2.Estassegundasproteínas sonunpocomenosabundantes ymuy importantespara la formacióndeespuma,característicaquelamayoríadelosconsumidorescreefundamentalenunacerveza,noscentraremosenlabúsquedadentrodelaproteínaz.

MedianteelusodelapáginadelNCBIobtenemoslasecuenciadelaproteínaenformatofasta[75]:

>gi|19068|emb|CAA36015.1| protein Z [Hordeum vulgare] MATTLATDVRLSIAHQTRFALRLRSAISSNPERAAGNVAFSPLSLHVALSLITAGAAATRDQLVAILGDG GAGDAKELNALAEQVVQFVLANESSTGGPRIAFANGIFVDASLSLKPSFEELAVCQYKAKTQSVDFQHKT LEAVGQVNSWVEQVTTGLIKQILPPGSVDNTTKLILGNALYFKGAWDQKFDESNTKCDSFHLLDGSSIQT QFMSSTKKQYISSSDNLKVLKLPYAKGHDKRQFSMYILLPGAQDGLWSLAKRLSTEPEFIENHIPKQTVE VGRFQLPKFKISYQFEASSLLRALGLQLPFSEEADLSEMVDSSQGLEISHVFHKSFVEVNEEGTEAGAAT VAMGVAMSMPLKVDLVDFVANHPFLFLIREDIAGVVVFVGHVTNPLISA

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Serealizóunalineamientoentrelasecuenciadelaproteínaylosdistintosarchivos.fastaquecontienenlosdipéptidos,tripéptidos,etc.conlaayudadeWordmatchdeEmboss[74],siguiendolamismatécnicausadaenelúltimointentodelapartadoanteriorperoenestecasoconsolounaproteínacomofuentedealineamientos.Encadacasoseajustalalongituddepalabraalalongituddel péptido. Obtenemos que existen coincidencias con 16 secuencias, 12 dipéptidos y 4tripéptidos.

Imagen5.Dipéptidospresentesenlaestructuraprimariadelaproteínazdelacebada.

Imagen6.Tripéptidospresentesenlaestructuraprimariadelaproteínazdelacebada.

DIGESTIÓNCONENDOPROTEASASPRESENTESENELTRACTODIGESTIVO.Debidoaquelospéptidosdebenllegarintactosalaenzima,estosnopuedencontenerdianasderestricciónparalasendoproteasaspresenteseneldigestivo.Pararealizarelestudioinsilicoenelquesecompruebelaresistenciadelospéptidosdescritosanteriormenteaatravesarelaparatodigestivo sin ser degradados se utilizó la herramienta PeptideCutter de ExPASy [76].Seleccionamos cortar con las endoproteasasmás abundantes presentes en el tracto digstivo:tripsina, quimotripsina y la peptinas; y llevamos a cabo la digestión virtual de los péptidos.Obtenemosquelamayorpartedelospéptidossondegradadosporalmenosunadelasenzimasestudiadas(Tabla1)y,porlotanto,noseráncapacesdellegarintactasalaACEyteneractividadinhibidora.

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Tabla1.CortedelospeptidosinhibidoresdelaACEpresentsenlaestructuraprimariadelaproteinazporlasenzimasdigestivas

AF AW DG DF FE FL KP LW LY PR ST VF DGL LKP LLP LPP

Tripsina x x x x x x x x x x x x x x x x

Quimotripsina x x x x ✓ ✓ x ✓ ✓ x x x x ✓ ✓ x

Pepsina ✓ ✓ x ✓ ✓ ✓ x ✓ ✓ x x ✓ ✓ x ✓ x

PodemosverquesolamentelospéptidosDG,KP,PR,STyLPPsoncapacesdeatravesarelsistemadigestivosinserdegradados,porlotantosonlosquesondeinterésennuestroproductoynosinteresaseguirestudiando.

OBTENCIÓNDELOSPÉPTIDOSUna vez hemos definido los péptidos de interés, tenemos que encontrar una forma deconseguirlosennuestroproductofinal.

La formamás sencillaeselusodeunaproteasaquecorte laproteínaZ y libere lospéptidosdeseados.Asípues,alahoradefabricarlacerveza,sellevaríanacabotodoslospasosquesellevan a cabo normalmente en la fabricación de la cerveza y antes de esterilizar la cervezamediantechoquetérmico,seañadiríaunaproteasaquecortaralaproteínaZyliberarapéptidosinhibidoresdelaACE.Trasellosellevaríaacaboelchoquetérmicoquesesuelellevaracaboparaponer fina la fermentaciónyparaasegurarqueelproductoes seguroparael consumohumanoyquenopresentaningúnpatógeno.Enestecaso,conestechoquetérmicotambiénconseguiríamospararladigestiónenzimática.

Paracomprobarsiestaestrategiaseríaposible,serealizaunasimulaciónvirtualdelcortedelaproteínacondistintasproteasascomerciales.ParaellosseusódelaherramientaPeptideCutterdeExPASy[76].ObtenemosquealañadirproteinasaKelpéptidoSTqueseencuentraentrelasposiciones264Y265delaproteínaZesliberado.

Asípues,sepuedeconcluirquesegúnlosestudiosinsilicoesposiblelaproduccióndeunacervezaque contenga péptidos inhibidores de la ACE. Para su producción solo sería necesario añadirpreoteinasaKalúltimobiorreactorohacerpasar lacervezaporunbiorreactorcon laenzimamovilizada.Seguramenteestaúltimaopciónsea lamásconvenienteenestecaso,yaquenospermitereutilizarlaproteasayademásnoquedaenelproductofinal.

CabedestacarquesegúnYu-Kaietal.,estepéptidoposeealtaspropiedadesinhibidorasconunIC50detansolo4.03±0.10μMcuandoesobtenidomediantefermentacióndeAceteschinensisporLactobacillusfermentumSM605[77].Porlotanto,seesperanvaloressimilaresalrealizarelestudioinvitroconelmismopéptidoobtenidodesdelaproteínaz.Mas,nohayquepasarporaltoqueenestecaso la IC50hasidomedidaconenzimaensolucióny losresultadospuedenvariar al llevar a cabo experimentos en humanos, debido a variables como la absorción delpéptidoenelintestino.

TambiénhayquetenerencuentaquetraselusodeproteinasaKobtendremospéptidosquecontienenlosdi-ytripéptidosinhibidoresdelaACEensuestructurasecundariayquepuedenserdegradadosporlasenzimasdeltractodigestivo.Porlotanto,esposiblequealgunodelosotrospéptidosdescritosseanliberadosdentrodelsistemadigestivoyaumentelaspropiedades

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hipotensorasdelproducto.Debidoaque lacervezaesunproductocomplejoysudigestiónyabsorciónporelcuerpohumanoesunprocesoaúnmáscomplejo,losresultadosobtenidosinsilico,aunqueprometedores,tienenunafiabilidadlimitadaydeberíansercomprobadamedianteestudiosenellaboratorio.

2.3ENSAYODEAFINIDADLainteracciónentreelpéptidoSTylaproteínafuecomprobadograciasalusodelaherramientaSwissDockdelSIB[78].Sólosehatenidocuentaestepéptido,apesardequehayotrospéptidosque se encuentran dentro de la estructura secundaria que también tienen propiedadesinhibidorasdelaACE,debidoaqueeselúnicoquesabemosqueseencontraraseguradentrodelproducto final. Como hemos comentado anteriormente, el resto se encuentran dentro depéptidosmáslargos,loscualesnohansidodefinidoscomoinhibidoresdelaACE.

Enprimerlugarsegeneróunarchivomol2delpéptido,medianteelusodePeptidehelixbuilderdeJmol[79,80],ysemodelomedianteelusodeAvogadro[80,81],haciendounaminimizacióndeenergía.

TraselloserealizóeldockingutilizandocomoeltargetselectionunarchivopdbdelaACEdelasopcionesdentrode laherramienta,concretamente laproteínaconPDB ID1O8A,yelarchivo.mol2delpéptidocomoligandselection.Viendolosresultadospodemosconcluirqueelpéptidoes capaz de unirse a la proteína. Puede interactuar en diferentes cavidades, siendo la másprobablela11,quesepuedeverenlaimagen7.

Imagen7.ResultadosobtenidoseneldockingassaydelaACEconeldipéptidoST.

Podemos ver también que existen numerosas cavidades donde el péptido puede reaccionaradoptandovariasconformacionesconunaafinidadrazonablementealta.Estosedebeaqueesdifícildiscernircuandounpéptidoespequeño,yaquetiendeatenermuchareactividadcontralaproteínay losmétodosdedockingno suelenestarpreparadospara ser lo suficientementeselectivos conpéptidosymoléculaspequeñas. Sinembargo, sepuedeconcluir la interacción,aunquenosepuedasaberconexactitudenquélugardelaproteína.

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2.4EFECTOSENELPRODUCTOFINAL.Elhechodeañadirunaproteasaalproductofinalpuedellevarconsigocambiosenelproductofinal. Sobretodo esperamos cambios en las propiedades organolépticas del producto y en laformacióndeespuma.

ElusodelaproteinasaKresultaenladegradacióndelaproteínazenpéptidosmuypequeños.Sesabequelapresenciadepéptidospequeñosresultaenunsaboramargoenelproductofinal.Enestecaso,estonotieneporquéresultarunproblemayaque lacervezasecaracterizaportener precisamente este sabor.Normalmente, el amargor se consigue gracias a la adicióndelúpulo,porloquealahoradefabricarestacervezaesposiblequenoseanecesarioañadirlúpulooquesenecesitenmenorescantidades.

Unproblemamayorresultalaformacióndeespuma,lacualestárelacionadaconlapresenciadelasproteínasLTP1y2[75].

>LTP1 Non-specific lipid-transfer protein 1 OS=Hordeum vulgare GN=LTP1 PE=1 SV=1 MARAQVLLMAAALVLMLTAAPRAAVALNCGQVDSKMKPCLTYVQGGPGPSGECCNGVRDL HNQAQSSGDRQTVCNCLKGIARGIHNLNLNNAASIPSKCNVNVPYTISPDIDCSRIY >LPT2 Non-specific lipid-transfer protein Cw18 OS=Hordeum vulgare GN=CW18 PE=1 SV=1 MARTAATKLALVALVAAMLLVAADAAITCGQVSSALGPCAAYAKGSGTSPSAGCCSGVKR LAGLARSTADKQATCRCLKSVAGAYNAGRAAGIPSRCGVSVPYTISASVDCSKIH Enprimerlugarbuscamoslassecuenciasdeestasdosproteínas,medianteelusodelapáginadelNCBI.

SillevamosacabounestudiodeproteólisisdelasLTPs1y2conuntratamientoconproteinasaK(medianteelusolaherramientaPeptideCutterdeExPASy,comoencasosanteriores),vemosquelaproteínasresultangravementedegradadas[76].

Imagen8.LugaresdecortetelaLTP1porlaproteinasaK

Imagen9.LugaresdecortetelaLTP2porlaproteinasaK

Como se hamencionado, esto seguramente tenga graves consecuencias en la formación deespumaenelproductofinal,yaquesonestasproteínaslasencargadasdeestabilizarla.

Yaque laespumaesunode losfactoresclavesa lahoradeproducirunabuenacerveza,seránecesariodesarrollarunasoluciónaesteproblema.

Nosepuedehacerquelaproteasasolodegradenuestraproteínadeinterés.Laúnicaformaenlaqueesoseríaposibleconsistiríaensepararlosdostiposdeproteínas(mediantealgunatécnicadeseparacióndemoléculas,comounacromatografía),degradarlaproteínadeinterésyluego

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añadirlasdiferentesfasesobtenidasenlaseparaciónylaproteínadegradadaalproductofinal.Peroestaopciónnoesviablealahoraderealizarelprocesoaescalaindustrial.

Otra formacon laquenoveríamoscomprometida la formacióndeespumaseríamediante larealizacióndedosbatchesdecerveza:unoqueserádegradadoyunoenelquesemantendránlas LTPs intactas. Trasello, lospéptidosobtenidosenelprimerbatchpueden serañadidosalsegundobatch,obteniendounacervezaconlasdoscosas,lasproteínasenterasylospéptidos.Pero en este caso, además de incrementar el precio del producto final, se está diluyendo lacantidaddepéptidoenelproductofinal,por loqueesposiblequelaconcentraciónnosealosuficientementealtacomopararesultaractivas.

Otra manera sería mutar todos los sitios de corte presentes en las LTPs y cambiarlos porsecuenciasaminoacídicasquenoseanreconocidaspor laproteasa.Asípues,podemosver lossitiosdecortegraciasa laherramientadePeptideCutterdeExPASyymodificaresossitiosdecorte.Alahoradehaceresasmodificacionesdeberemostenerencuentalaspropiedadesfísicoquímicas de los aminoácidos que cambiemos, para que la estructura y las propiedades de laproteínaresultantesea lomásparecidoposiblea lawildtype.Sinembargo,estaopcióntienegrandesdesventajas.Apartedequemodificarlaproteínaentantospuntosesbastantelaboriosoy es muy difícil no modificar las propiedades de las proteínas, estaríamos hablando de unaproteína genéticamente modificada en un alimento. Hoy en día, la política anti-organismosgenéticamentemodificadosesbastanteestrictaencasitodoelmundoylosproductosqueloscontienen generalmente no son aceptados por la mayoría de los consumidores, por lo quenuestracervezanoestaríapermitidaen lamayoríadelmundoynotendríamuchoéxitoenelmercado.

Paraconseguirunacervezaconespumasepuedenañadirestabilizadoresdeespumacomerciales.Setratadeunproductoqueyaseampliamenteusadoenla industriacervecera.Simplementeconañadirloantesdelembotellado,conseguiremosunproductoconlospéptidosinhibidoresdelaACEquedeseamosyconunaformacióndeespumaóptima.

2.5BÚSQUEDADEPÉPTIDOSINHIBIDORESDELAACEENLTPSComolasLTPs1y2vanaserdegradadasdetodasformas,esinteresanteestudiarlapresenciadepéptidosinhibidoresdentrodelasestructuraprimariadeestasproteínas.

Llevamosacabolamismaestrategiausadaconproteínaz[74].

Imagen10.PéptidosinhibidoresdelaACEpresentesenlaestructurasecundariadelaLTP1

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Imagen11.PéptidosinhibidoresdelaACEpresentesenlaestructurasecundariadelaLTP2

VemosqueenamboscasosexistenposiblespéptidosinhibidoresdelaACE.Porloquevamosaestudiarcuálesdeellosresistiríanelpasoporeltractodigestivo[76].

Tabla2.CortedelospéptidosinhibidoresdelaACEpresentesenlaestructuraprimariadelasLTPsporlasenzimasdigestivas

IY KP PR LVL AY ST VK LGPTripsina x x ✓ x x x ✓ x

Quimotripsina ✓ x x x ✓ x x ✓Pepsina ✓ x x ✓ ✓ x x x

VemosqueenestecasosoloeldipéptidoKPdelaLPT1yeldipéptidoSTdelaLPT2semantienendespuésdepasarporel sistemadigestivo.Por loquecomprobaremos si esposible liberarlosmediante la proteólisis con proteinasa K [76]. Los péptidos resultantes tras la digestión son:DSKMKPCLyRST,porloquenosonefectivoseneltratamientodelahipertensión.Sinembargo,como ocurría con los péptidos producidos al degradar la proteína z, estos péptidos serándegradados por las enzimas digestivas, pudiendo liberar péptidos inhibidores de la ACE en elaparatodigestivo.Laactividadhipotensoradelproductonopuedeserestablecidamediantelarealizacióndeestudiosinsilico,sinoquedeberásercomprobadaenellaboratorio.

3.CONCLUSIONES

ComoresultadodeesteproyectosehaconseguidounundatasetdepéptidosinhibidoresdelaACE con una concentración IC50 (a la cual el 50% de la actividad de la enzima se encuentrainhibida)igualomenoresa20µM(adjuntoaltrabajo).

Además,sepuedeconcluirquelaproduccióndeunacervezaquecontengapéptidosinhibidoresde la ACE es en principio viable. El producto contendría el dipéptido Ser-Ter, el cual ha sidodemostrado que interacciona con la proteína. Sin embargo, al estar estudiando un productocomplejo,unapruebadeconfirmaciónenellaboratoriosiguesiendonecesaria.

Apesardequelaestrategiaenprincipiohatenidoqueserredefinidaenmúltiplesocasiones,elobjetivodelproyectosehalogrado.Porlotanto,creoquealahoradeplanificarunproyectocomoesteesimportanteestableceruntiempodemargenparaposiblescosasquesalganmalytantountiempopreviopararecolectarinformacióncomountiempoalfinalpararecopilartodoslosdatosyanálisis.

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4.GLOSARIO

Alimentofuncional:alimentosdiseñadosnosóloporsuscaracterísticasnutricionalessinoparaademásmejorarlasaludyreducirelriesgodecontraerenfermedadesdelosconsumidores.

Endoproteasa:enzimaquecortalacadenapeptídica,generalmenteenposicionesdeterminadas.

Enzima convertidora de angiotensina (ACE): es el componente central del sistema renina-angiotensina,elcualcontrolalapresiónsanguíneamediantelaregulacióndelvolumendefluidosenelcuerpo.

LTPs:acrónimodelasproteínastransferidorasdelípidos,delingléslipidtransferproteins.

Péptidoinhibidor:pequeñasecuenciadeaminoácidoscapazdeinactivarodificultarlaactividaddeunaenzimaenparticular.

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19

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67. NCBI.BLAST.2016;Availablefrom:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins.

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69. UCSC.BLAT.2016;Availablefrom:https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQblat.html.70. Kent,W.J.,BLAT--theBLAST-likealignmenttool.GenomeRes,2002.12(4):p.656-64.71. PriyamA,W.B.,RaiV,WurmY,SequenceServer:BLASTsearchmadeeasy.2016.72. ExPASy,BLAST.2016.73. EMBL-EBI.FASTM.2016;Availablefrom:http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fastm/.74. Emboss.Wordmatch.2016;Availablefrom:http://www.bioinformatics.nl/emboss-

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78. SIB.SwissDock.2016;Availablefrom:http://www.swissdock.ch/docking.79. Jmol.Peptidehelixbuilder2016;Availablefrom:

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20

6.ANEXOS

ANEXO1.PLANIFICACIÓN

21

ANEXO2.PEPTIDOSINHIBIDORESDELAACE.

>Matsuietal.(1999)

AF

>Cheungetal.(1980)

AW

>DeLeoetal.(2009)

AY

>Hai-Lunetal.(2013)

CF

>DeLeoetal.(2009)

DG

>Wuetal.(2006)

DF

>i-Lunetal.(2013)

FE

>DeLeoetal.(2009)

FL

>Wuetal.(2006)

FW

>Suestsuna(1998)

FY

>Hai-Lunetal.(2013)

EY

>Cheungetal.(1980)

IW

>Cheungetal.(1980)

IY

>Wuetal.(2006)

KP

22

>Wuetal.(2006)

KW

>Wuetal.(2006)

KY

>Breeetal.(2006)

LW

>Wuetal.(2006)

LY

>Wuetal.(2006)

MF

>Wuetal.(2006)

MW

>Saitoetal.(1994)

PR

>Wuetal.(2006)

RW

>DeLeoetal.(2009)

RY

>Hai-Lunetal.(2013)

ST

>DeLeoetal.(2009)

TF

>Matsuietal.(1999)

VF

>DeLeoetal.(2009)

VK

>Cheungetal.(1980)

VW

>Saitoetal.(1980)

VY

23

>Wuetal.(2006)

YH

>DeLeoetal.(2009)

YL

>Wuetal.(2006)

YW

>Wuetal.(2006)

AKK

>Wuetal.(2006)

AVL

>Wuetal.(2006)

DGL

>WuandDing(2002)

DLP

>Yamamoto(1997)

FAP

>Wuetal.(2006)

FEP

>Hernández-Ledesmaetal.(2007)

FQP

>Wuetal.(2006)

FNF

>Wuetal.(2006)

FYN

>Saitoetal.(1994)

GGY

>Wuetal.(2006)

GKV

>Wuetal.(2006)

GQP

24

>DeLeoetal.(2009)

GLP

>Wuetal.(2006)

GLY

>ByunandKim(2001)

GPL

>Wuetal.(2006)

GPM

>DeLeoetal.(2009)

GPP

>Kimetal.(2001)

GPV

>Wuetal.(2006)

GRP

>Hai-Lunetal.(2013)

GTG

>Shinetal.(2001)

HHL


IAK

>DeLeoetal.(2009)

IAP

>Wuetal.(2006)

IAY

>Jimsheenaetal.(2010)

IEP

>Matsumuraetal.(1993)

IKP

>Fujitaetal.(1999)

IKW

25

>Wuetal.(2006)

IKY

>Wuetal.(2006)

IMY

>Duanetal.(2014)

IQW

>NakarumaandYamamoto(1995)

IPP

>Miyoshietal.(1991)

IRA


IRP

>Duanetal.(2014)

IRW

>Reynethaeal.(2014)

IVR

>Matsuietal.(1999)

IVY

>FujitaandYoshikawaetal.(1999)

IWH

>Wuetal.(2006)

LAA

>Wuetal.(2006)

LAP

>Miyoshietal.(1991)

LAY

>Wuetal.(2006)

LEP

>DeLeoetal.(2009)

LGP

26

>Wuetal.(2006)

LIY

>FujitaandYoshikawaetal.(1999)

LKP

>Wuetal.(2006)

LLP

>Yamamoto(1997)

LPP

>Miyoshietal.(1991)

LQP

>Miyoshietal.(1991)

LRP

>Wuetal.(2006)

LRW

>Wuetal.(2006)

LRY

>Miyoshietal.(1991)

LSP

>Wuetal.(2006)

LTF

>JungKwonLee(2010)

LVE

>Wuetal.(2006)

LVQ

>Wuetal.(2006)

LVL

>DeLeoetal.(2009)

LVR

>Wuetal.(2006)

LWA

27

>Yamamoto(1997)

LYP

>Hai-Lunetal.(2013)

MAW

>Wuetal.(2006)

MKY

>DeLeoetal.(2009)

MPP

>Wuetal.(2006)

MRW

>DeLeoetal.(2009)

PSY

>Saitoetal.(1994)

PRY

>Wuetal.(2006)

SVY

>Wuetal.(2006)

TAP

>Wuetal.(2006)

TKY

>DeLeoetal.(2009)

TVY

>Yamamoto(1997)

VAP

>Hai-Lunetal.(2013)

VIF

>Wuetal.(2006)

VIY

>JungKwonLee(2010)

VKP

28

>Wuetal.(2006)

VLP

>NakarumaandYamamoto(1995)

VPP

>Wuetal.(2006)

VQV


VRP

>Miyoshietal.(1991)

VSP

>Saitoetal.(1994)

VWY

>Wuetal.(2006)

YEY

>Wuetal.(2006)

YPR

>Lietal.(2002)

YQY

>Wuetal.(2006)

YVA

>Hai-Lunetal.(2013)

AHSY

>Yamamoto(1997)

FVAP

>Hai-Lunetal.(2013)

GWAP

>JungKwonLeeetal.(2010)

IAPG

>Saitoetal.(1994)

IYPR

29

>DeLeoetal.(2009)

TAPY

>DeLeoetal.(2009)

TVPY

>Matsuietal.(1999)

VFPS

>Hai-Lunetal.(2013)

VIIF

>Hai-Lunetal.(2013)

VYAP

>Saitoetal.(1994)

YGGY


ALPHA

>DeLeoetal.(2009)

FFVAP


LKPNM

>DeLeoetal.(2009)

LYPVK

>R.Baltietal.(2015)

VELYP

>DeLeoetal.(2009)

AVNPIR

>DeLeoetal.(2009)

AYFYPE

>DeLeoetal.(2009)

DIGYY

>DeLeoetal.(2009)

DYVPG

30

>Goudaetal.(2006)

VLIVP

>Leietal.(2008)

VLPVP

>Hai-Lunetal.(2013)

IFVPAF

>DeLeoetal.(2009)

FALPQY

>Hai-Lunetal.(2013)

FCVLRP

>Hai-Lunetal.(2013)

IWHHT

>Contrerasetal.(2013)

RYLGY

>DeLeoetal.(2009)

TTMPLW

>DeLeoetal.(2009)

TVVPG

>DeLeoetal.(2009)

AVPYPQR

>DeLeoetal.(2009)

FPQYLQY

>DeLeoetal.(2009)

GGVIPN


KVLPVP

>Duanetal.(2014)

KVREGT


PYVRYL

31

>R.Baltietal.(2015)

STHGVW

>Quirósetal.(2009)

LHLPLP


YAKPVA

>Goudaetal.(2006)

YLAGRQ

>R.Baltietal.(2015)

AFVGYVLP

>DeLeoetal.(2009)

APGAGVY

>Contrerasetal.(2013)

AYFYPEL

>R.Baltietal.(2015)

EKSYELP

>Chenetal.(2010)

LLLAHLL

>Chenetal.(2010)

PKDLREN

>Hai-Lunetal.(2013)

PTHIKWGD

>DeLeoetal.(2009)

ALKAWSVAR

>ZHONG-JIQIAN(2007)

IVGRPRHEE

>Hai-Lunetal.(2013)

IVGRPRHEE

>DeLeoetal.(2009)

RPKHPIKHQ

32

>Terashimaetal.(2010)

VTVNPYKWLP

>LUetal.(2016)

YPFPGPIPN

>Hai-Lunetal.(2013)

EVMAGNLYPG

>Hai-Lunetal.(2013)

MEGAQEAQGD

>DeLeoetal.(2009)

FFVAPFPEVFGK

>Hai-Lunetal.(2013)

HERDPTHIKWGD

>Chenetal.(2010)

NHRNRMMDHVH

>Gómez-Ruizetal.(2007)

WQVLPNAVPAK

>DeLeoetal.(2009)

LVYPFPGPIPNSLPQNIPP

>Chenetal.(2010)

YQDPRLGPTGELDPATQPIVAVHNPVIV

búsqueda de péptidos inhibidores de la enzima convertidora...

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